CN104762306B - 一种海洋酯酶及其编码基因e32与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种海洋酯酶及其编码基因E32与应用。海洋酯酶基因E32，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述海洋酯酶基因E32编码的海洋酯酶E32，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明所述的海洋酯酶E32能降解短链和中长链的pNP酯类(C2‑C12)，具有通过分解转化生产短链或中长链脂肪酸酯类风味物质的应用潜力。

Description

一种海洋酯酶及其编码基因E32与应用

技术领域

本发明涉及一种海洋酯酶及其编码基因E32与应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

酯酶(esterases)是一种能催化酯键的水解与合成的水解酶，水解时催化酯键产生甘油和短链脂肪酸(≤10个碳原子)；合成时，把酸的羧基与醇的羟基脱水缩合，产物为酯类及其他香味物质。酯酶广泛存在于动物、植物和微生物中。微生物资源丰富，并且利用微生物发酵产酶具有便于工业化生产、易纯化等优点，因此微生物来源的酯酶已被广泛应用于制药业、造纸业、化妆品生产、食品加工以及食品添加剂等领域。

目前，微生物酶法生产风味物质(flavors)在国际上已引起极大重视。风味物质已被广泛应用于食品、化妆品、洗涤剂和制药业中，其每年在国际市场上的需求量超过220亿美元。现在，主要通过化学合成的方法或从原材料中提取的方法来生产风味物质。化学合成的方法，其工艺复杂、反应条件剧烈、产物不均一、依赖有毒溶剂且能耗高，易造成环境污染、资源浪费，且生产成本高。从原材料中提取风味物质的方法，因其在原材料中的含量较低，因此也同样存在高生产成本的问题。但是，通过微生物酶法生产风味物质具有反应条件温和、不发生副反应以及产物单一等化学合成方法无法比拟的优点，并且可以通过制备全细胞催化剂以及循环利用来降低生产成本。因此，近年来采用生物合成风味物质逐渐成为研究热点。

短链或者中长链的脂肪酸酯，因其果香味和高挥发性被普遍地用作一类重要的风味物质。而酯酶则可以通过分解转化或合成生产这类风味物质。酯酶作为生物催化剂，具有不需要辅因子、能稳定存在于有机溶剂中、高区域选择性和高立体选择性等优点。虽然酯酶存在于所有生物中，但是具有商业价值的酯酶主要来源于微生物类群。根据生化性质和氨基酸序列，微生物来源的酯类水解酶(包括酯酶和脂肪酶)主要分为8个家族，第I-VIII家族。这些酯类水解酶中，只有很小一部分应用到风味物质的工业生产中，还远远满足不了工业上对各种酯类水解酶的需求。

海洋微生物不仅数量巨大，且富含多种类群，其处于不同的温度、压力、盐浓度、营养物质等环境条件下，这为获取性质独特的具有工业潜力的新型酯酶提供了巨大的来源。而分子生物学、基因组测序技术和宏基因组技术的飞速发展，大大加快了海洋来源新型酯酶的发现，这为克隆酯酶基因，构建高产的基因工程菌，以实现工业化生产奠定了基础。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种海洋酯酶及其编码基因E32与应用。

一种海洋酯酶基因E32，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述海洋酯酶基因E32编码的海洋酯酶E32，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组表达载体，该表达载体包含有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的功能片段。

一种重组细胞，该宿主菌包含有上述重组表达载体或表达上述海洋酯酶E32。

上述海洋酯酶E32和/或上述海洋酯酶基因E32在水解制备风味物质中短链和中长链酯类及其衍生物的应用。

本发明海洋酯酶的基因E32来自南海海底表层沉积物样品E505宏基因组文库中大肠杆菌EPI300克隆子E32-4A的大片段质粒fosmid DNA。通过构建E32-4A克隆子中fosmid的亚克隆文库和后期测序，确定了该克隆子fosmid上携带的酯酶基因E32的核酸序列。根据E32基因序列设计特异性引物，利用PCR技术从E32-4A克隆子的fosmid DNA克隆了编码海洋酯酶E32的基因，构建了含海洋酯酶基因E32的表达载体以及含有该表达载体的大肠杆菌重组细胞。测序结果表明海洋酯酶基因E32为一个含有1,455个核苷酸的开放阅读框架，该开放阅读框架共编码484个氨基酸。因此酯酶E32是一个含有484个氨基酸的多肽。序列分析表明，海洋酯酶E32属于一个酯类水解酶新家族，E32是该新家族第一个被研究的酯酶。对纯化的海洋酯酶E32进行性质测定。结果表明该酶对短链和中长链的酯类表现出较强的降解活性。最适pH为9.0，且在pH 6.0-10.0范围内稳定存在。最适酶活温度为40℃，且在30-50℃范围内保持超过85％的活力。其为热稳定酯酶，对超过60℃的高温环境表现出较好的耐受性。E32对高浓度的NaCl也表现出很好的耐受性。

有益效果

1、本发明所述的海洋酯酶E32能降解短链和中长链的的pNP酯类(C2-C12)，具有通过分解转化生产短链或中长链脂肪酸酯类风味物质的应用潜力；

2、本发明所述的海洋酯酶E32能在30-50℃和pH 7.0-10.0范围内保持很高的酶活力，且对高温、高盐以及强碱表现出很好的耐受性，这为其更好地应用于工业生产奠定了基础。

附图说明

图1、以海洋酯酶E32及其同源序列以及已知的酯类水解酶家族代表序列构建的系统发生树；

图2、通过PCR扩增克隆的编码海洋酯酶E32的基因片段的电泳图；

其中：泳道1和泳道2为扩增的DNA片段，M泳道为DNA分子量标记(marker)；

图3、在大肠杆菌中进行异源表达和纯化的海洋酯酶E32电泳图；

其中：泳道1、含空质粒pET22b的大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达菌体超声波破碎后的上清液电泳图，为阴性对照，泳道2、含重组表达质粒的大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达菌体超声波破碎后的上清液电泳图，泳道3、上清液经过镍柱亲和层析的穿过液，泳道4和泳道5、上清液经过镍柱亲和层析纯化后的纯酯酶E32电泳图，泳道M、蛋白质分子量标记(marker)；

图4、海洋酯酶E32的底物特异性分析；

图5、海洋酯酶E32的酶活温度曲线；

其中：(A)温度对酶活性的影响，(B)温度对酶稳定性的影响；

图6、海洋酯酶E32的酶活pH曲线；

其中：(A)pH对酶活性的影响，(B)pH对酶稳定性的影响；

图7、不同浓度的NaCl对海洋酯酶E32酶活性的影响曲线。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

培养基：

LB液体培养基：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，蒸馏水配制。

LB固体平板：1wt％蛋白胨，0.5wt％酵母粉，1wt％NaCl，1.5wt％琼脂，蒸馏水配制。

实施例1：海洋酯酶E32编码基因序列的获取及其序列分析

菌种来源：南海海底沉积物样品E505宏基因组文库中大肠杆菌EPI300克隆子E32-4A。

具体步骤如下：

1.1亚克隆文库的构建

用OMEGA公司的BAC/PAC DNA提取试剂盒按照其说明提取大肠杆菌EPI300克隆子E32-4A中的大片段质粒fosmid。然后用限制性内切酶Sau3AI(购自Fermentas公司)对提取到的fosmid进行部分消化，以获取2,000-5,000bp的DNA片段，将其连接到经BamHI消化及去磷酸化处理的pUC19质粒(购自NEB公司)上。连接反应液电转E.coli Top10感受态细胞，涂布含有100μg/ml氨苄青霉素和1％(v/v)三丁酸甘油酯(购自Sigma公司)的LB固体平板，37℃倒置培养12-16h，构建成酯类水解酶活性克隆子E32-4A的fosmid DNA的亚克隆文库。

1.2酯类水解酶基因序列的确定

选取固体平板上产生透明降解圈的亚克隆，提取质粒并以载体特异性引物M13F/R进行测序。用GeneMark软件预测DNA序列上可能的开放阅读框架。用BLASTX在NCBI nr库中对预测的开放阅读框架进行相似性搜索，以确定克隆子E32-4A上携带的酯酶基因序列E32，基因E32共1,455bp，其中含有一个1,455bp的开放阅读框架，其编码海洋酯酶E32，起始密码子位于1bp，终止密码子位于1,453bp，共编码484个氨基酸。获得的海洋酯酶E32编码基因E32的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。海洋酯酶E32的氨基酸的蛋白，序列如SEQ ID NO.2所示。

1.3海洋酯酶E32的序列分析

GenBank中，与海洋酯酶E32最相似的序列为来源于Alcanivorax dieselolei B5的a/β折叠家族水解酶(YP_006818787)，序列相似性为68％。该蛋白是基于B5菌株全基因组预测的序列，其生化性质尚未被研究。与海洋酯酶E32相似的其它序列多来源于极端环境微生物的假想蛋白。并且，与海洋酯酶E32序列相似性超过30％的同源蛋白中，没有一个蛋白的生化性质被表征，这表明海洋酯酶E32是一个新型的海洋酯酶，其所在的蛋白家族很可能是一个酯类水解酶新家族。

为了确定海洋酯酶E32的进化位置，发明人从NCBI nr库中下载已报道酯类水解酶家族的代表序列以及酯酶E32的同源序列。通过MUSCLE软件对获得的同源序列进行多重比对分析。选择JTT模型，用MEGA6.0构建微生物来源酯类水解酶的进化树，如图1所示。在进化树上，海洋酯酶E32及其同源序列没有聚于已报道的酯类水解酶家族分支内，而是单独聚簇，组成了一个独立的分支，这表明海洋酯酶E32所在的家族是一个酯类水解酶新家族，而海洋酯酶E32是该新家族中第一个被研究的蛋白。此外，SignalP 4.0预测表明，海洋酯酶E32的N端1-23位氨基酸为信号肽序列。

实施例2：海洋酯酶E32的克隆、异源表达及分离纯化

2.1利用PCR基因对E32序列进行扩增

(1)根据基因E32序列设计两条特异性引物：

32F：CGGCATATGGACAGCAGCTCCAGCATCGCC(SEQ ID NO.3)(引物32F已去掉N端信号肽序列)，用下划线标出的是NdeI酶切位点；

32R：GCCAAGCTTCGGGGGAGTGGTGC(SEQ ID NO.4)，用下划线标出的是HindIII酶切位点；

引物由上海生工生物技术有限公司合成。

(2)以32F和32R为引物，以基因E32所在的fosmid为模板，用FastPfu DNA聚合酶(购自Transgen公司)扩增目的基因片段；

PCR反应条件为：95℃预变性2min；然后95℃变性20sec，55℃退火20sec，72℃延伸1min，30个循环后；72℃延伸10min。

(3)对PCR扩增产物进行1wt％琼脂糖凝胶电泳，结果表明获得一条约1,500bp的DNA片段(如图2)。然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段。

(4)用限制性内切酶NdeI和HindIII对回收片段和质粒pET22b进行双酶切反应。回收片段酶切反应体系如下：

质粒pET22b酶切反应体系如下：

酶切反应置于37℃水浴中反应2个小时。对酶切产物进行1wt％琼脂糖凝胶电泳，然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段。

(5)将经过双酶切的E32基因片段连接到pET22b载体上。连接反应体系：

载体pET22b 1μl

外源DNA片段 4μl

Solution I 5μl；

盖紧盖子，手指轻弹离心管，混匀样品，在离心机上转2sec，把样品集中在管底，16℃过夜连接。

(6)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌DH5α感受态。

(7)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组pET22b载体转至大肠杆菌DH5α感受态。

(8)转化的大肠杆菌DH5α涂布于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基，37℃过夜培养。挑选阳性克隆子，转接至LB液体培养基中培养，提取质粒，进行NdeI/HindIII双酶切，通过酶切验证正确的质粒送北京华大基因公司测序。

2.2重组表达载体pET22b-E32转化到大肠杆菌BL21(DE3)中

(1)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌BL21感受态；

(2)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组pET22b载体转至大肠杆菌BL21感受态；

(3)将转化的大肠杆菌BL21涂于含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃过夜培养。

2.3基因E32在大肠杆菌中诱导表达与纯化

(1)在平板上挑取单菌落，接于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养；

(2)按1％(v/v)接种量转接到100ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养2-3h；

(3)按1％(v/v)接种量转接到1,000ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀为0.6，加入IPTG至终浓度为1mM，继续在20℃摇床培养20h；

(4)收集经过IPTG诱导表达的LB培养液，12,000rpm离心10min，收集菌体；

(5)用含100mM NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)悬浮菌体；

(6)将重新悬浮的菌液进行超声波破碎(600W，10min)；

(7)将破碎后的菌液12,000rpm离心30min，收集上清液；

(8)将上清液按照说明书的要求进行镍柱亲和层析；

(9)层析后收集的样品用SDS-PAGE检测纯度，证明已经获得海洋酯酶E32的电泳纯酶(如图3)。用50mM的Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液4℃透析3-4次。最后置于-20℃保存备用。

实施例4：海洋酯酶E32的性质测定

3.1底物特异性分析

用异丙醇配制不同碳链长度的pNP酯底物，C2-C16(购自Sigma公司)。标准反应为：20μl 10mM pNPC4底物与960μl 50mM Tris-HCl(pH 8.0)混合液于40℃预热3min后，加入20μl稀释好的酶液并于40℃反应5min，立即加100μl 20wt％SDS(十二烷基硫酸钠)终止反应，测定OD₄₀₅值。以不加酶液的反应作为空白对照。标准曲线以不同浓度的pNP(购自Sigma公司)来绘制。酶活力定义为，在一定温度下，每分钟催化pNP酯底物水解产生1μM pNP所需的酶量为一个酶活力单位(U)。结果表明，海洋酯酶E32能降解C2-C12底物，其中对C4底物的降解能力最强，比活力为54U/mg(如图4)。

3.2最适温度及温度稳定性分析

最适反应温度的测定：以pNPC4为底物，在50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中，分别检测海洋酯酶E32在0℃、10℃、20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、60℃和70℃下的酶活。最高酶活定义为100％。结果表明该酶的最适酶活温度为40℃，其在30-50℃保留超过85％的高活力(如图5A)。

温度稳定性分析：酶液分别在40℃、60℃、70℃、80℃和90℃下温育，2h内每间隔15min取相同的酶量检测海洋酯酶E32在40℃、50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中的残余活力。0℃酶活定义为100％。结果表明海洋酯酶E32是热稳定酶。E32在40℃条件下很稳定，其在高温条件下也比较稳定。E32在70℃保温2h后，仍保留50％的酶活力；其在80℃保温2h后，仍保留约40％的酶活力(如图5B)。

3.3最适pH及pH稳定性分析

pNPC4底物在碱性条件下不稳定，酶反应完成后向反应体系中加入等体积的含2wt％SDS的2M Tris-HCl(pH 7.0)终止液以去除pH对反应的影响。

最适反应pH的测定：配制pH值在3.0-13.0范围内、间隔1个pH单位的Britton-Robinson缓冲液。测定E32在40℃、不同pH条件下的酶活，最高酶活定义为100％。结果表明海洋酯酶E32是碱性酯酶。E32的最适pH为9.0，其在pH 7.0-10.0范围内表现出超过80％的高活力(如图6A)。

pH稳定性分析：取1μl纯酶，加入119μl不同pH的缓冲液，以配制不同pH的E32，30℃温育1h后检测E32的残余活力。最高酶活定义为100％。结果表明E32在pH 6.0-10.0范围内表现出较强的稳定性；其在pH 11.0条件下保温1h后，仍保持高达65％的残余活力(如图6B)。

3.4对NaCl的耐受性分析

用50mM Tris-HCl(pH 8.0)配制5M NaCl母液。在不同NaCl浓度下，酯酶活性的测定方法为：1ml反应体系中，包括15μl酶液，20μl 10mM pNPC4底物，一定量的5M NaCl至需要的终浓度，加入适量50mM Tris-HCl(pH 8.0)补足1ml。反应体系于40℃反应5min，加入50μl0.4M三氯乙酸终止反应，再加入50μl 0.4M NaOH调回反应体系原始pH值。

NaCl对酶活性的影响：反应体系中分别含有终浓度为0、0.5M、1M、1.5M、2.0M、2.5M、3.0M、3.5M、4.0M、4.5M和4.8M的NaCl，检测海洋酯酶E32在不同NaCl浓度条件下的酶活。最高酶活定义为100％。结果表明该酶是耐盐酶。E32酶活性不受3.5M NaCl的影响；当盐浓度高达4.8M时，E32仍保留高达58％的酶活力(如图7)。

4.结果

通过构建亚克隆文库和后期测序，确定了大肠杆菌克隆子E32-4A中fosmid上所携带的酯酶基因E32的核酸序列。序列比对分析揭示出，与E32相似的蛋白多为基于基因组序列推测的假想蛋白且其生化性质尚未被表征，这表明E32是一个新型海洋酯酶。并且系统发育分析表明，E32所在的蛋白家族不同于已报道的酯类水解酶家族，是一个新家族(图1)。根据E32基因序列设计特异性引物，利用PCR技术从E32-4A克隆子的fosmid DNA克隆了编码新型海洋酯酶E32的基因片段(图2)，构建了含新型海洋酯酶基因E32的表达载体以及含有该表达载体的大肠杆菌重组细胞。

基因E32含有一个1,455bp的开放阅读框架，其编码新型海洋酯酶E32，起始密码子位于1bp，终止密码子位于1,453bp，共编码484个氨基酸。将基因E32在大肠杆菌中进行异源表达和纯化，获得成熟有活性的酯酶E32(图3)。对纯化的酯酶E32进行性质测定。结果表明该酶对碳链长度在2-12个碳原子的短链和中长链酯类表现出较强的降解活性(图4)。其在30-50℃范围内保持很高的酶活力，且对60-80℃的高温表现出很好的耐受性(图5)。其在pH7.0-10.0范围内保持高活力，且在pH 6.0-10.0范围内稳定存在(图6)。其对高盐也表现出很好的耐受性，其活性不受3.5M NaCl的影响(图7)。上述结果表明，基因E32编码的酯酶E32是一个耐盐的、热稳定的、新型碱性中温酯酶。

Claims (5)

1.一种海洋酯酶基因E32，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述海洋酯酶基因E32编码的海洋酯酶E32，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.一种重组表达载体，该表达载体包含有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的海洋酯酶基因E32。

4.一种重组细胞，该重组细胞包含有权利要求3所述重组表达载体或表达权利要求2所述海洋酯酶E32。

5.权利要求2所述海洋酯酶E32和/或权利要求1所述海洋酯酶基因E32在水解制备风味物质中短链和中长链酯类及其衍生物的应用。