CN104561059B - 一种海洋适冷酯酶及其编码基因e40与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种海洋适冷酯酶及其编码基因E40与应用。一种海洋适冷酯酶基因E40，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明所述的酯酶E40在0‑20℃具有较高的催化效率，应用于在低温或常温下能水解乳脂产生短链的脂肪酸，这些物质会增强奶制品的风味，并避免长时间的高温而影响食品的质量进而影响口味和营养成分组成；同时，用适冷酯酶E40处理饮食业产生的含酯废弃物和废水时，安全、高效，对环境保护有非常积极的意义。

Description

一种海洋适冷酯酶及其编码基因E40与应用

技术领域

本发明涉及一种海洋适冷酯酶及其编码基因E40与应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

酯类水解酶(lipolytic enzymes)包括酯酶(esterases)和脂肪酶(lipases)，其代表了一大类能催化酯键的水解与合成的水解酶。酯酶(esterase)通常作用于简单的酯类或低于10个碳原子的短链甘油酯，而脂肪酶(lipase)通常作用于难溶于水的长链甘油酯(≥10个碳原子)。酯类水解酶广泛存在于动物、植物和微生物中。微生物资源丰富，并且利用微生物发酵产酶具有便于工业化生产、易纯化等优点，因此微生物来源的酯类水解酶已经广泛应用于农业、食品酿造、医药化学、污水处理和生物修复等领域。微生物酯类水解酶的应用主要包括以下几个方面：

(1)食品加工方面：酿酒和食用醋的生产、食用油脂的精炼、面包专用粉和食品乳化剂的生产、天然抗氧化剂的生产、以及饮料添加剂等食品工业。

(2)精细化工方面：合成药品、农用化学品、风味化合物以及化妆品的主要中间产物等。

(3)环境治理方面：对菊酯类杀虫剂等农药具有高效降解能力，减少农药污染，增强食品安全。

根据生化性质和氨基酸序列，微生物来源的酯类水解酶主要分为8个家族，第I-VIII家族。其中，第I家族以脂肪酶为主，第IV家族以酯酶为主，其它家族包含酯酶和脂肪酶。第IV家族细菌酯类水解酶与哺乳动物来源的激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitivelipase，HSL)在序列上表现出很高的相似性，因此该家族也被称为细菌HSL家族。细菌HSL家族酯酶因其在嗜热微生物、超嗜热微生物以及热液口等极端环境中多次被发现，而受到越来越多的关注。这些来自高温环境中的HSL酯酶表现出对环境的适应性，为热稳定性极强的嗜热酶。到目前为止，该家族已经有多个酶蛋白被研究，并且该家族已有超过20个蛋白的晶体结构被解析。已报道的细菌HSL酯酶主要为热稳定的中温酶和嗜热酶，而对低温酯酶和适冷酯酶鲜有报道。

在酯酶中，适冷酯酶由于在低温下具有很高的活性，因此在食品风味剂的生产、饮食业含酯废物和废水的处理等行业中比中高温酯酶更具优越性，已经受到研究者的广泛关注。随着分子生物学和宏基因组学的发展，越来越多的研究人员从不同环境样品中筛选产酯类水解酶微生物，克隆酯类水解酶基因，构建高产的基因工程菌，为后续的工业化生产打下基础。环境样品主要来自土壤以及海洋，特别是海洋环境样品。海洋中大部分区域处于低温、高压以及寡营养等环境中，微生物在这样的环境中会形成与环境相适应的独特的生理结构和代谢方式。因此，海洋微生物为适冷酯酶的发现提供了巨大的资源。并且，宏基因组技术能从不同海洋环境中获取多种酯酶而不依赖于海洋微生物菌株的培养，这大大丰富了微生物酯酶的种类，也为获取新型适冷酯酶提供了广阔的来源。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种海洋适冷酯酶及其编码基因E40与应用。

一种海洋适冷酯酶基因E40，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述基因编码的海洋适冷酯酶E40，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

一种重组表达载体，该表达载体包含有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的功能片段。

一种重组细胞，该宿主菌包含有上述重组表达载体或表达上述海洋适冷酯酶E40。

上述海洋适冷酯酶E40和/或上述海洋适冷酯酶基因E40在食品风味剂的生产、饮食业含酯废物和废水处理中水解短碳链酯类及其衍生物的应用。

本发明海洋适冷酯酶的基因E40来自南海海底沉积物样品E505宏基因组文库中大肠杆菌EPI300克隆子E40-6B的大片段质粒fosmid DNA。通过构建E40-6B克隆子中fosmid的亚克隆文库和后期测序，确定了该克隆子fosmid上携带的酯酶基因E40的核酸序列。根据E40基因序列设计特异性引物，利用PCR技术从E40-6B克隆子的fosmid DNA克隆了编码海洋适冷酯酶E40的基因，构建了含海洋适冷酯酶基因E40的表达载体以及含有该表达载体的大肠杆菌重组细胞。测序结果表明酯酶基因E40为一个含有894个核苷酸的开放阅读框架，该开放阅读框架共编码297个氨基酸。因此酯酶E40是一个含有297个氨基酸的多肽。序列分析表明，酯酶E40属于细菌HSL家族。对纯化的酯酶E40进行性质测定。结果表明该酶对短碳链酯类表现出较强的降解活性。最适pH为8.0，且在pH 5.0-9.0范围内稳定存在。最适酶活温度为45℃，且在超过30℃的环境下很不稳定。其稳定存在于0-20℃中，在0℃仍保留约10％的活力，在20℃保留40％的活力，这表明酯酶E40是一个新型的HSL家族的适冷酯酶。

有益效果

1、本发明所述的酯酶E40在0-20℃具有较高的催化效率，应用于在低温或常温下能水解乳脂产生短链的脂肪酸，这些物质会增强奶制品的风味，并避免长时间的高温而影响食品的质量进而影响口味和营养成分组成；同时，用适冷酯酶E40处理饮食业产生的含酯废弃物和废水时，安全、高效，对环境保护有非常积极的意义。

2、本发明所述的酯酶E40在低温下有较高酶活性，中高温下极不稳定，中温下很快就可以完全失活，从而保证了其使用的安全性。

附图说明

图1、提取的大肠杆菌EPI300克隆子E40-6B的fosmid DNA的电泳图；

其中：1、大肠杆菌EPI300克隆子E40-6B的fosmid DNA，M、DNA分子量标记(marker)；

图2、通过PCR扩增克隆的编码适冷酯酶E40的基因片段的电泳图；

其中：1和2、扩增的DNA片段，M、DNA分子量标记(marker)；

图3、在大肠杆菌中进行异源表达和纯化的适冷酯酶E40电泳图；

其中：1、含空质粒pET28a的大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达菌体超声波破碎后的上清液电泳图，为阴性对照，2、含重组表达质粒的大肠杆菌BL21经IPTG诱导表达菌体超声波破碎后的上清液电泳图，3和4、上清液经过镍柱亲和层析纯化后的纯酯酶E40电泳图，M、蛋白质分子量标记(marker)；

图4、适冷酯酶E40的底物特异性分析；

图5、适冷酯酶E40的酶活温度曲线；

其中：实线代表温度对酶活性的影响，虚线代表温度对酶稳定性的影响；

图6、适冷酯酶E40的酶活pH曲线；

其中：实线代表pH对酶活性的影响，虚线代表pH对酶稳定性的影响。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1

一种海洋适冷酯酶基因E40，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。上述基因编码一种海洋适冷酯酶E40，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

基因E40共894bp，其中含有一个894bp的开放阅读框架，其编码适冷酯酶E40，起始密码子位于1bp，终止密码子位于892bp，共编码297个氨基酸。

实施例2：适冷酯酶E40编码基因序列的测定

菌种来源：南海海底沉积物样品E505宏基因组文库中大肠杆菌EPI300克隆子E40-6B。

具体步骤如下：

1.1大肠杆菌EPI300克隆子E40-6B中大片段质粒fosmid的提取，参照OMEGA公司BAC/PAC DNA提取试剂盒说明书

(1)取1.5-5ml克隆子E40-6B菌液，13,000rpm离心3min,弃上清，收集菌体，尽可能的吸净上清；

(2)向步骤(1)制得的菌体中加入200μl添加了RNase A的缓冲液T1重悬细胞，震荡混匀，得重悬液；

(3)向步骤(2)制得的重悬液中加入200μl缓冲液T2，通过轻柔地颠倒5-10次进行混匀，以获得清亮的裂解液，室温放置5min；

(4)向步骤(3)制得的裂解液中加入200μl预冷的缓冲液T3，通过轻柔地颠倒15-20次进行混匀直到形成白色的絮状沉淀，冰浴5min；

(5)将步骤(4)制得的混合液，于4℃条件下，13,000rpm离心10min；

(6)将离心后的上清液转移至新的1.5ml离心管中，加入200μl经异丙醇稀释的BAC结合缓冲液，立刻剧烈颠倒3-5次充分混匀；

(7)将步骤(6)中制得的混合液加入到洗脱柱DNA MicroElute column中；

(8)13,000rpm离心30sec，弃废液；

(9)向洗脱柱中加入750μl漂洗液SPW，13,000rpm离心30sec，弃废液；

(10)将吸附柱放回空的收集管中，13,000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应；

(11)取出吸附柱放入一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜的中间部位加20-50μl洗脱缓冲液EB或无菌水，室温放置5min，13,000rpm离心2min；

(12)DNA置于-20℃冰箱保存，提取到的大片段fosmid DNA如图1所示。

1.2亚克隆文库的构建

用限制性内切酶Sau3AI(购自Fermentas公司)对提取到的fosmid进行部分消化，以获取1.5-5kbp的DNA片段，将其连接到经BamHI消化及去磷酸化处理的pUC19质粒(购自NEB公司)上。连接反应液电转E.coli Top10感受态细胞，涂布含有100μg/ml氨苄青霉素和1％(v/v)三丁酸甘油酯(购自Sigma公司)的LB固体平板，37℃倒置培养12-16h，构建成酯类水解酶活性克隆子E40-6B的fosmid DNA的亚克隆文库。

1.3酯类水解酶基因序列的确定

选取固体平板上产生透明降解圈的亚克隆，提取质粒并以载体特异性引物M13F/R进行测序。用GeneMark软件(http://opal.biology.gatech.edu/GeneMark/)预测DNA序列上可能的开放阅读框架。用BLASTX在NCBI nr库中对预测的开放阅读框架进行相似性搜索，以确定克隆子E40-6B上携带的酯酶基因序列E40。因此，获得酯酶E40编码基因E40的序列为894bp，序列如SEQ ID NO.1所示。该基因编码一个297氨基酸的蛋白，序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例3：酯酶E40的克隆、异源表达及分离纯化

2.1利用PCR对E40基因序列进行扩增

(1)根据E40基因序列设计两条特异性引物：

40F：CGGCATATGGCCAAAAGCCCAGAGTT(SEQ ID NO.3)，用下划线标出的是NdeI酶切位点；

40R：GCCAAGCTTTCAGCCGATCTGCTTCCGC(SEQ ID NO.4)，用下划线标出的是HindIII酶切位点；

引物由上海生工生物技术有限公司合成。

(2)以40F和40R为引物，以E40所在的fosmid为模板，用FastPfu DNA聚合酶(购自Transgen公司)扩增目的基因片段。

PCR反应条件为：95℃预变性2min；然后95℃变性20sec；55℃退火20sec；72℃延伸20sec，30个循环后；72℃延伸10min。

(3)对PCR扩增产物进行1wt％琼脂糖凝胶电泳，结果表明获得一条约1,000bp的DNA片段(如图2)。然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段。

(4)用限制性内切酶NdeI和HindIII对回收片段和质粒pET28a进行双酶切。酶切反应体系如下：

放在37℃水浴中反应2个小时。对酶切产物进行1wt％琼脂糖凝胶电泳，然后用Omega公司的DNA回收试剂盒按照其说明回收扩增DNA片段。

(5)将经过双酶切的E40基因片段连接到pET28a载体上。连接反应体系：

载体pET28a 1μl

外源DNA片段 4μl

Solution I 5μl

盖紧盖子，手指轻弹离心管，混匀样品，在离心机上转2sec，把样品集中在管底，16℃水浴中连接过夜。

(6)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌DH5α感受态。

(7)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组pET28a载体转至大肠杆菌DH5α感受态。

(8)转化的大肠杆菌DH5α涂布于含50μg/ml卡那霉素的LB培养基，37℃过夜培养。挑选阳性克隆子，转接至LB液体培养基中培养，提取质粒，进行NdeI/HindIII双酶切，通过酶切验证正确的质粒送北京华大基因公司测序。

2.2重组表达载体pET28a-E40转化到大肠杆菌BL21(DE3)中

(1)按《分子克隆实验指南》上制备大肠杆菌感受态的方法制备大肠杆菌BL21感受态；

(2)按《分子克隆实验指南》上的热激转化方法将连接好的重组pET28a载体转至大肠杆菌BL21感受态；

(3)将转化的大肠杆菌BL21涂于含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃过夜培养。

2.3基因E40在大肠杆菌中诱导表达与纯化

(1)在平板上挑取单菌落，接于20ml含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃过夜培养；

(2)1％(v/v)接种量转接到含50μg/ml卡那霉素的新鲜LB培养基中，37℃培养至菌浓度OD为0.8，加入IPTG至终浓度为1mM，继续在20℃摇床培养20h；

(3)收集经过IPTG诱导表达的1,000ml LB培养液，12,000rpm离心10min，收集菌体；

(4)用100ml含100mM NaCl的50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)悬浮菌体；

(5)将重新悬浮的菌液进行超声波破碎(600W，10min)；

(6)将破碎后的菌液12,000rpm离心20min，收集上清液；

(7)将上清液按照说明书的要求进行镍柱亲和层析；

(8)层析后收集的样品用SDS-PAGE检测纯度，证明已经获得酯酶E40的电泳纯酶(如图3)。用50mM的Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液透析3-4次。最后置于-20℃保存备用。

实施例4：酯酶E40的性质测定

3.1底物特异性分析

用异丙醇配制不同碳链长度的pNP酯底物，C2-C16(购自Sigma公司)。标准反应为：20μl 10mM pNPC4底物与960μl 50mM Tris-HCl(pH 8.0)混合液于45℃预热3min后，加入20μl稀释好的酶液并于45℃反应5min，立即加100μl 20wt％SDS终止反应，测定OD₄₀₅值。以不加酶液的反应作为空白对照。标准曲线以不同浓度的pNP(购自Sigma公司)来绘制。酶活力定义为，在一定温度下，每分钟催化pNP酯底物水解产生1μM pNP所需的酶量为一个酶活力单位(U)。结果表明，E40对C4-C10底物表现出较高的活力，对C4底物的降解能力最强，比活力为372U/mg(如图4)。

3.2最适温度及温度稳定性分析

最适反应温度的测定：以pNPC4为底物，在50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲体系中，分别检测E40在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃、45℃、50℃、60℃和70℃下的酶活。最高酶活定义为100％。结果表明该酶的最适酶活温度为45℃，其在0-20℃低温仍保留10％-40％的高活力(如图5)。

温度稳定性分析：酶液分别在0℃、10℃、20℃、30℃、40℃和50℃下温育1h，然后取相同的酶量检测E40在45℃、50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲体系中的残余活力。0℃酶活定义为100％。结果表明该酶在0-20℃条件下稳定存在，在超过30℃的条件下变得很不稳定(如图5)。

3.3最适pH及pH稳定性分析

pNPC4底物在碱性条件下不稳定，酶反应完成后向反应体系中加入等体积的含2wt％SDS的2M Tris-HCl(pH 7.0)终止液以去除pH对反应的影响。

最适反应pH的测定：配制pH值在4.0-11.0范围内、间隔1个pH单位的Britton-Robinson缓冲液。测定E40在45℃、不同pH条件下的酶活，最高酶活定义为100％。结果表明该酶的最适pH为8.0(如图6)。

pH稳定性分析：取1μl纯酶，加入199μl不同pH的缓冲液，以配制不同pH的E40，4℃温育1h后检测E40的残余活力。最高酶活定义为100％。结果表明该酶在5.0-9.0的pH范围内表现出较强的稳定性(如图6)。

4.结果

利用试剂盒提取了大肠杆菌EPI300克隆子E40-6B的fosmid DNA(图1)。通过构建该fosmid DNA的亚克隆文库和后期测序，确定了大肠杆菌克隆子E40-6B中fosmid上所携带的酯酶基因E40的核酸序列。根据E40基因序列设计特异性引物，利用PCR技术从E40-6B克隆子的fosmid DNA克隆了编码海洋适冷酯酶E40的基因片段(图2)，构建了含海洋适冷酯酶基因E40的表达载体以及含有该表达载体的大肠杆菌重组细胞。

基因E40含有一个894bp的开放阅读框架，其编码适冷酯酶E40，起始密码子位于1bp，终止密码子位于892bp，共编码297个氨基酸。序列分析表明，酯酶E40属于细菌HSL家族。将基因E40在大肠杆菌中进行异源表达和纯化，获得成熟有活性的酯酶E40(图3)。对纯化的酯酶E40进行性质测定。结果表明该酶对碳链长度在4-10个碳原子的短碳链酯类表现出较强的降解活性(图4)。最适酶活温度为45℃，且在超过30℃的环境下很不稳定，在30℃温育1h后即丧失约80％的活力(图5)。其在0-20℃条件下稳定存在，在0℃仍保留约10％的活力，在20℃保留40％的活力(图5)。最适pH为8.0，且在pH 5.0-9.0范围内稳定存在(图6)。上述结果表明，基因E40编码的酯酶E40是一个新型的HSL家族的碱性适冷酯酶。

Claims (5)

1.一种海洋适冷酯酶基因E40，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述海洋适冷酯酶基因E40编码的海洋适冷酯酶E40，氨基酸序列如SEQID NO.2所示。

3.一种重组表达载体，该表达载体包含有如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的海洋适冷酯酶基因E40。

4.一种重组细胞，该重组细胞包含有权利要求3所述重组表达载体或表达权利要求2所述海洋适冷酯酶E40。

5.权利要求2所述海洋适冷酯酶E40和/或权利要求1所述海洋适冷酯酶基因E40在食品风味剂的生产、饮食业含酯废物和废水处理中水解短碳链酯类及其衍生物的应用。