CN104651332B - 嗜热细菌海藻糖合酶c端片段提高海藻糖合酶酶活的方法 - Google Patents

嗜热细菌海藻糖合酶c端片段提高海藻糖合酶酶活的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了嗜热细菌海藻糖合酶C端片段提高海藻糖合酶酶活的方法。本发明运用分子生物学技术在表达恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌来源的海藻糖合酶的同时，将这四种不同来源的海藻糖合酶的C端连接嗜热细菌来源海藻糖合酶C端基因片段在大肠杆菌中融合表达。在嗜热细菌来源海藻糖合酶C端基因片段的作用下，提高了海藻糖合酶催化活性。本发明将改造后的海藻糖合酶和在大肠杆菌中表达，提高了海藻糖合酶的酶活。

Description

嗜热细菌海藻糖合酶C端片段提高海藻糖合酶酶活的方法
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体涉及嗜热细菌来源的海藻糖合酶基因和其C端截短片段，涉及恶臭假单胞菌来源的海藻糖合酶基因和其截短片段，涉及谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌三种来源的海藻糖合酶基因，还涉及含这些海藻糖合酶基因的重组表达载体和应用。
背景技术
海藻糖是由两分子葡萄糖以1，1-糖苷键连接而成的非还原性双糖，广泛存在于细菌、酵母、丝状真菌、植物、昆虫、无脊椎动物等生物体体内。海藻糖对生物体具有非常重要的生物学意义，是蛋白质和生物膜分子在脱水、高温、氧自由基、低温等恶劣环境中的稳定剂和保护剂。又因为海藻糖具有甜度适中，性质稳定，不易分解，无还原性等特殊性质，因此被广泛应用于食品加工业、医药业、农业、生化制品业和化妆品产业中。
海藻糖在生物体内的合成途径主要有以下5种：(1)TPS/TPP途径，亦称为OtsA/OtsB途径：该途径由6-磷酸海藻糖合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase，TPS)催化尿苷二磷酸葡萄糖和6-磷酸葡萄糖合成6-磷酸海藻糖，再在6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(Trehalose-6-phosphate phosphatase，TPP)作用下生成海藻糖。(2)TreS途径：由海藻糖合酶(Trehalose synthase，Tres)催化麦芽糖分子内部发生重排反应，将α，α-1,4-糖苷键连接的麦芽糖转化为α，α-1,1-糖苷键连接的海藻糖。(3)TreY/TreZ途径：由麦芽寡糖基海藻糖合成酶(Maltooligosyltrehalose synthase，TreY)催化麦芽糊精形成麦芽寡糖基海藻糖，然后由麦芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyltrehalose trehalohydrolase，TreZ)水解麦芽寡糖基海藻糖形成海藻糖。(4)TreT途径：由海藻糖葡糖基转移合成酶(Trehalose glycosyltransferring synthase，TreT)催化NDP-葡萄糖(ADP-，UDP-和GDP-葡萄糖)和葡萄糖聚合生成海藻糖。(5)TreP途径：由海藻糖磷酸化酶(Trehalosephosphorylase，TreP)催化D-葡萄糖与1-磷酸葡萄糖合成海藻糖。
在海藻糖的工业生产中，海藻糖合酶与其它海藻糖合成酶相比具有更大的优势，只需要一种酶一步反应就能够获得海藻糖，简单，快捷，而且其生产原料为更加廉价的麦芽糖。因此，各国科学家更加关注海藻糖合酶，并对其进行了更为深入的研究。
早在1995年，日本的Nishimoto等从脂肪杆菌属的Pimelobacter sp.R48中最早发现并提纯了海藻糖合成酶。随后不久，Tsusaki等人分别从Pimelobacter sp.R48和水生栖热菌(Thermus aquaticus ATCC33923)中克隆得到了海藻糖合酶的基因。随后，在结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis),耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis),施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri CJ38)和嗜热嗜酸的干热嗜酸菌(Picrophilus torridus)等中也发现了海藻糖合酶的存在。
大肠杆菌近年来已被广泛用于工业化生产各种异源蛋白，被认为是最有效的蛋白表达系统之一。因其工程菌体系遗传背景清晰，具有易培养，密度高、蛋白表达量高、培养成本低、不易染菌等特点，成为了工业化生产酶的优质选择。
目前，国内外有很多成功实例采用大肠杆菌对不同来源的海藻糖合酶基因进行异源表达，De Smet等人(2000)克隆并在大肠杆菌中异源表达了结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的海藻糖合酶，并对其反应的最适条件做了研究；韩国的Lee等人(2005)利用大肠杆菌malPQ缺陷菌株和MacConkey培养基，对施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri CJ38)的基因组文库进行筛选，得到了海藻糖合酶的基因，并将其成功表达于大肠杆菌中；我国的黄日波等人(2004)先后从褐色喜热裂孢菌(Thermobifidafusca)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和耐放射异球菌(Deinococcusradiodurans)中克隆得到了海藻糖合酶的基因，通过这些基因在大肠杆菌中的异源表达，将其应用于海藻糖的酶法生产中，并取得了较好的成果；李明春等人(2008)克隆得到了红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)的海藻糖合酶基因，并将其异源表达于大肠杆菌中。
嗜热菌属来源的海藻糖合酶是一种耐热酶，它有一个相对更高耐热性和热稳定性，并且比其他已知的常温来源的海藻糖合酶有更好的转化率。台湾的chen等人(2007)发现嗜热细菌来源的海藻糖合酶基因比其它来源的海藻糖合酶多一个特殊的C端片段，C端片段的去除或与其他海藻糖合酶基因融合表达都对海藻糖的生成产生很大影响，也影响了酶的耐热性和热稳定性，证实C端片段对在海藻糖合酶催化时起着重要的作用。综上所述，在大肠杆菌中表达恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌这四种来源的海藻糖合酶基因，还未有将其与嗜热细菌海藻糖合酶C端片段融合表达的方法提高其海藻糖产量。
本发明提供三种常温来源包括恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌和天蓝色链霉菌，和嗜热来源包括海栖热袍菌的海藻糖合酶基因，分别与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端片段在大肠杆菌体系中进行融合表达，并且利用相应的方法对酶学性质进行研究，对海藻糖的产量进行测定。测定结果发现嗜热细菌来源的海藻糖合酶基因更有利于在大肠杆菌中表达，比较这五种不同来源海藻糖合酶基因序列，嗜热细菌来源的比其他四种来源的海藻糖合酶基因多出了C端嗜热部分，对嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端嗜热片段截短后，除了降低了酶反应温度外，还影响了酶催化活性，实验证明C端嗜热片段确实对酶活有一定增强效果。
本发明提供了四种不同来源的海藻糖合酶与嗜热细菌来源的海藻糖合酶基因C端片段融合表达的形式，实验证明嗜热细菌来源的海藻糖合酶基因C端片段对海藻糖合酶催化活性的提高有很好的效果。此反应不但能提高海藻糖合酶酶活，进而提高海藻糖的产量，这种具有优良效果的四种不同来源的海藻糖合酶与嗜热细菌来源的海藻糖合酶基因C端片段融合表达从未被提及或公开过。
本发明中所引述的文献、著作、专利和专利申请公开书，其中全部或局部都明确地和独立地都在本专利申请书引用参考。
发明内容
本发明的目的在于提供嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端片段；提供恶臭假单胞菌来源的海藻糖合酶截短片段和谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌三种来源的海藻糖合酶基因；提供这四种海藻糖合酶基因片段和嗜热来源海藻糖合酶C端片段融合表达的蛋白应用。
本发明的技术方案如下：
一种将海藻糖合酶基因与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端嗜热片段融合表达的方法，其步骤如下：
(1)嗜热细菌海藻糖合酶基因编码区的克隆及其在大肠杆菌中的表达
将恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌总DNA根据已知的海藻糖合酶基因编码区序列，设计一对上下游引物，设计的引物为：
恶臭假单胞菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22treSBamHF:5’
-GGGAAAGGATCCGGCCAAGCGTTCCCGCC-3’(下划线为BamHI酶切位点)，
下游引物22treSXhoR:5’-GGGAAACTCGAGTGACTCTCCCCAGGTACTGATC-3’(下划线为XhoI酶切位点)；
谷氨酸棒杆菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22cgtreSNcoF：5’
-GGGAAACCATGGGCACTGATACCTCTCCGTTGAATTCTCA-3’(下划线为NcoI酶切位点)，
下游引物：22cgtreSHindR：
5；-GGGAAAAAGCTTTTCCATATCGTCCTTTTCATCGGC-3’(下划线为HindIII酶切位点)；
天蓝色链霉菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22sctreSBamHF：5’
-GGGAAAGGATCCGCACCGTCAACGAGCCCGTAC-3’(下划线为BamHI酶切位点)，
下游引物22sctreSHindR：5’-GGGAAAAAGCTTAGCGCGGCGGCCG-3’(下划线为HindIII酶切位点)；
海栖热袍菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22tmtreSEcoRF：5’
-GGGAAAGAATTCGGATGTTGTGTTGAGAGAGCGAAGC-3’(下划线为EcoRI酶切位点)，
下游引物22tmtreSSalR：5’
-GGGAAAGTCGACCCTCAACAGATCTAAGAAGAGTTTCAGATAGTT-3’(下划线为BamHI酶切位点)；
PCR反应体系为50μL：基因组模板DNA1μL，上下游引物各2μL，dNTP Mix 3μL，2×PrimeSTAR GC Buffering 25μL，DMSO 0.75μL，ddH2O 15.65μL，PrimeSTAR 0.6μL；PCR反应条件为98℃预变性1min，进行98℃12s，65℃10s，72℃x s，共9个循环，然后进行98℃12s，57℃30s，72℃x s，共21个循环，最后72℃延伸3min；x根据片段长度设定1min延伸1000bp。切胶回收PCR产物并将其克隆至pET-22b上；对所获得的海藻糖合酶进行测序，构建pET-22b-pptreS、pET-22b-cgtreS、pET-22b-sctreS和pET-22b-tmtreS质粒并实现其在大肠杆菌中的表达；
(2)恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌来源的海藻糖合酶与其融合连接的嗜热细菌海藻糖合酶C端嗜热片段基因编码区的克隆及pET-22b-pptreS565-tttreSC、pET-22b-cgtreS-tttreSC、pET-22b-sctreS-tttreSC和pET-22b-tmtreS-tttreSC重组质粒的构建；
根据已知的嗜热细菌来源的海藻糖合酶基因C端嗜热片段编码区序列和恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌四种来源的海藻糖合酶基因编码区序列，分别设计一对上下游引物，设计的引物为：
恶臭假单胞菌来源的去掉其C端后的1696bp，并与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端1239bp基因融合表达的海藻糖合酶基因片段的上游引物EchouABamHF：5’
-GGGAAAGGATCCGGCCAAGCGTTCCCGCCCGGCAGCC-3’(下划线为BamHI酶切位点)，
下游引物EchouAlinkerR：5’
-GGCGGCGGCTCCGGCTCCGGGCATGCGGTCATGG-3’；
嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端的1239bp，并与恶臭假单胞菌来源的去掉其C端后的1696bp的海藻糖合酶基因片段融合表达的海藻糖合酶C端基因片段的上游引物EchouBlinkerF：5’-GGAGCCGGAGCCGCCGCCTGGGCCGAGGAGCCCG-3’，
下游引物EchouBHindR：5’
-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’(下划线为HindIII酶切位点)；
谷氨酸棒杆菌来源的，并与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端1239bp基因融合表达的海藻糖合酶基因片段的上游引物GuansuanANcoF：5’
-GGGAAACCATGGGACTGATACCTCTCCGTTGAATTCTCAGCCG-3’(下划线为NcoI酶切位点)，
下游引物GuansuanAlinkerR：5’
-GGCGGCGGCTCCGGCTCCTTCCATATCGTCCTTT-3’；
嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端的1239bp，并与谷氨酸棒杆菌来源的海藻糖合酶基因片段融合表达的海藻糖合酶C端基因片段的上游引物GuansuanBlinkerF：5’
-GGAGCCGGAGCCGCCGCCTGGGCCGAGGAGCCCG-3’，
下游引物GuansuanBHindR：5’
-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’(下划线为HindIII酶切位点)；
天蓝色链霉菌来源的，并与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端1239bp基因融合表达的海藻糖合酶基因片段的上游引物TianlanseABamHF：5’
-GGGAAAGGATCCGACCGTCAACGAGCCCGTACCTGACACCTTCGAG-3’(下划线为BamHI酶切位点)，
下游引物TianlanseAlinkerR：5’
-GGCGGCGGCTCCGGCTCCAGCGCGGCGGCCGATG-3’；
嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端的1239bp，并与天蓝色链霉菌来源的海藻糖合酶基因片段融合表达的海藻糖合酶C端基因片段的上游引物TianlanseBlinkerF：5’
-GGAGCCGGAGCCGCCGCCTGGGCCGAGGAGCCCG-3’，
下游引物TianlanseBHindR：5’
-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’(下划线为HindIII酶切位点)；
海栖热袍菌来源的，并与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端1239bp基因融合表达的海藻糖合酶基因片段的上游引物HaixiABamHF：5’
-GGGAAAGGATCCGGATGTTGTGTTGAGAGAGCGAAGCATAGAGG-3’(下划线为BamHI酶切位点)，
下游引物HaixiAlinkerR：5’
-GGCGGCGGCTCCGGCTCCCCTCAACAGATCTAAG-3’；
嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端的1239bp，并与海栖热袍菌来源的海藻糖合酶基因片段融合表达的海藻糖合酶C端基因片段的上游引物HaixiBlinkerF：5’
-GGAGCCGGAGCCGCCGCCTGGGCCGAGGAGCCCGCCCCCGAG-3’，
下游引物HaixiBHindR：5’
-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’(下划线为HindIII酶切位点)；
PCR反应体系为50μL：基因组模板DNA 1μL，上下游引物各2μL，dNTP Mix3μL，2×PrimeSTAR GC Buffering 25μL，DMSO 0.75μL，ddH2O 15.65μL，PrimeSTAR 0.6μL。
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的恶臭假单胞菌来源海藻糖合酶基因片段的上游引物EchouABamHF：5’-GGGAAAGGATCCGGCCAAGCGTTCCCGCCCGGCAGCC-3’(下划线为BamHI酶切位点)，
下游引物EchouBHindR：
5’-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’(下划线为HindIII酶切位点)；
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的谷氨酸棒杆菌来源海藻糖合酶基因片段的上游引物GuansuanANcoF：
5’-GGGAAACCATGGGACTGATACCTCTCCGTTGAATTCTCAGCCG-3’(下划线为NcoI酶切位点)，
下游引物GuansuanBHindR：
5’-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’(下划线为HindIII酶切位点)；
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的天蓝色链霉菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物TianlanseABamHF：
5’-GGGAAAGGATCCGACCGTCAACGAGCCCGTACCTGACACCTTCGAG-3’(下划线为BamHI酶切位点)，
下游引物TianlanseBHindR：
5’-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’(下划线为HindIII酶切位点)；
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的海栖热袍菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物HaixiABamHF：
5’-GGGAAAGGATCCGGATGTTGTGTTGAGAGAGCGAAGCATAGAGG-3’(下划线为BamHI酶切位点)，
下游引物HaixiBHindR：
5’-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’(下划线为HindIII酶切位点)；
PCR反应体系为50μL：四种来源的海藻糖合酶基因片段DNA 1μL，嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端基因片段1μL，上下游引物各2μL，dNTP Mix 3μL，2×PrimeSTAR GCBuffering 25μL，DMSO 0.75μL，ddH2O 14.65μL，PrimeSTAR 0.6μL。
PCR反应条件为98℃预变性1min，进行98℃12s，72℃10s，72℃x s，共9个循环，然后进行98℃12s，72℃30s，72℃x s，共21个循环，最后72℃延伸3min，x根据片段长度设定1min延伸1000bp。切胶回收PCR产物并将其克隆至pET-22b上；对所获得的海藻糖合酶进行测序，构建pET-22b-pptreS565-tttreSC、pET-22b-cgtreS-tttreSC、pET-22b-sctreS-tttreSC和pET-22b-tmtreS-tttreSC质粒并实现其在大肠杆菌中的表达；
(3)恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌来源的海藻糖合酶与其融合连接的嗜热细菌海藻糖合酶C端嗜热片段在大肠杆菌中诱导表达海藻糖合酶
分别将pET-22b-pptreS565-tttreSC、pET-22b-cgtreS-tttreSC、pET-22b-sctreS-tttreSC和pET-22b-tmtreS-tttreSC重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta(DE3)中，诱导表达海藻糖合酶。
进一步，步骤(1)中，分别使用的各上下游引物PCR反应后的产物：
恶臭假单胞菌来源的海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.3，其氨基酸序列如序列表No.4。
谷氨酸棒杆菌来源的海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.7，其氨基酸序列如序列表No.8。
天蓝色链霉菌来源的海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.11，其氨基酸序列如序列表No.12。
海栖热袍菌来源的海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.15，其氨基酸序列如序列表No.16。
进一步，步骤(2)中，使用的上下游引物PCR反应后的产物：
未与嗜热细菌海藻糖合酶C端融合连接的恶臭假单胞菌来源海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.19，其氨基酸序列如序列表No.20。
未与恶臭假单胞菌海藻糖合酶基因融合连接的嗜热细菌来源海藻糖合酶C端基因编码区测序结果如序列表No.23，其氨基酸序列如序列表No.24。
未与嗜热细菌海藻糖合酶C端融合连接的谷氨酸棒杆菌来源海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.27，其氨基酸序列如序列表No.28。
未与谷氨酸棒杆菌海藻糖合酶基因融合连接的嗜热细菌来源海藻糖合酶C端基因编码区测序结果如序列表No.31，其氨基酸序列如序列表No.32。
未与嗜热细菌海藻糖合酶C端融合连接的天蓝色链霉菌来源海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.35，其氨基酸序列如序列表No.36。
未与天蓝色链霉菌海藻糖合酶基因融合连接的嗜热细菌来源海藻糖合酶C端基因编码区测序结果如序列表No.39，其氨基酸序列如序列表No.40。
未与嗜热细菌海藻糖合酶C端融合连接的海栖热袍菌来源海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.43，其氨基酸序列如序列表No.44。
未与海栖热袍菌海藻糖合酶基因融合连接的嗜热细菌来源海藻糖合酶C端基因编码区测序结果如序列表No.47，其氨基酸序列如序列表No.48。
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的恶臭假单胞菌来源海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.51。其氨基酸序列如序列表No.52。
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的谷氨酸棒杆菌来源海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.55，其氨基酸序列如序列表No.56。
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的天蓝色链霉菌来源海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.59，其氨基酸序列如序列表No.60。
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的海栖热袍菌来源海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.63，其氨基酸序列如序列表No.64。
进一步，其特征是，步骤(3)中，使用的pET-22b-pptreS565-tttreSC、pET-22b-cgtreS-tttreSC、pET-22b-sctreS-tttreSC和pET-22b-tmtreS-tttreSC，表达条件是：诱导时间10～50h，诱导温度4～16℃，诱导剂IPTG终浓度为0.2～1.0mM/L。
所述的方法，步骤(3)中，所述优化的表达条件是：诱导表达时间24h，诱导温度16℃，诱导剂IPTG终浓度为0.5mM/L。
本发明将在大肠杆菌转化四种含有改造后的海藻糖合酶质粒pET-22b-pptreS565-tttreSC、pET-22b-cgtreS-tttreSC、pET-22b-sctreS-tttreSC和pET-22b-tmtreS-tttreSC，使海藻糖合酶有效表达，提高海藻糖合酶的酶催化水平，进而提高海藻糖产量。
附图说明
图1为恶臭假单胞菌的海藻糖合酶基因片段编码区的克隆；M：DNA标准分子量；1：质粒pET-22b；2：PCR扩增产物。
图2为谷氨酸棒杆菌的海藻糖合酶基因片段编码区的克隆；M：DNA标准分子量；1：PCR扩增产物。
图3为天蓝色链霉菌的海藻糖合酶基因片段编码区的克隆；M：DNA标准分子量；1：PCR扩增产物。
图4为海栖热袍菌的海藻糖合酶基因片段编码区的克隆；M：DNA标准分子量；1：PCR扩增产物。
图5为恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌四种来源的海藻糖合酶基因片段以及其对应连接的嗜热细菌海藻糖合酶C端基因片段编码区的克隆；M：DNA标准分子量；1：质粒pET-22b；2-3：恶臭假单胞菌PCR扩增产物；4：谷氨酸棒杆菌PCR扩增产物；5：天蓝色链霉菌PCR扩增产物；6：海栖热袍菌PCR扩增产物；7：嗜热细菌海藻糖合酶C端片段PCR扩增产物。
图6为恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌四种来源的海藻糖合酶基因片段与其对应的嗜热细菌海藻糖合酶C端基因片段连接后的基因编码区的克隆；M：DNA标准分子量；1-2：带有嗜热细菌海藻糖合酶C端片段的恶臭假单胞菌海藻糖合酶PCR扩增产物；3：带有嗜热细菌海藻糖合酶C端片段的谷氨酸棒杆菌海藻糖合酶PCR扩增产物；4：带有嗜热细菌海藻糖合酶C端片段的天蓝色链霉菌海藻糖合酶PCR扩增产物；带有嗜热细菌海藻糖合酶C端片段的海栖热袍菌海藻糖合酶PCR扩增产物。
图7为四种来源的重组海藻糖合酶的SDS-PAGE电泳分析；M：DNA标准分子量；L1-L2：重组恶臭假单胞菌来源海藻糖合酶；L3：重组谷氨酸棒杆菌来源海藻糖合酶；L4：重组天蓝色链霉菌来源海藻糖合酶；L5：重组海栖热袍菌来源海藻糖合酶。
图8为恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌来源的海藻糖合酶酶活和与嗜热细菌海藻糖合酶C端片段融合表达后的海藻糖合酶酶活比较。
具体实施方式
通过以下的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细解释及阐述。
实施例1恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌来源的海藻糖合酶基因编码区的克隆及在大肠杆菌中的融合表达
1、引物设计及PCR反应
恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NBRC14164,谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032,天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)ATCC 23899、海栖热袍菌(Thermotoga maritime)MSB8和嗜热细菌(Thermusthermophilus)HB27基因组由美国乔治亚大学闫亚军老师提供，这些菌株可购置于中国普通微生物菌种保藏中心。
根据已知的恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌四种来源的海藻糖合酶基因编码区序列，分别设计一对上下游引物，设计的引物为：
恶臭假单胞菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22treSBamHF:5’-GGGAAAGGATCCGGCCAAGCGTTCCCGCC-3’(下划线为BamHI酶切位点)，
下游引物22treSXhoR:5’-GGGAAACTCGAGTGACTCTCCCCAGGTACTGATC-3’(下划线为XhoI酶切位点)；
谷氨酸棒杆菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22cgtreSNcoF：
5’-GGGAAACCATGGGCACTGATACCTCTCCGTTGAATTCTCA-3’(下划线为NcoI酶切位点)，
下游引物：22cgtreSHindR：
5；-GGGAAAAAGCTTTTCCATATCGTCCTTTTCATCGGC-3’(下划线为HindIII酶切位点)；
天蓝色链霉菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22sctreSBamHF：
5’-GGGAAAGGATCCGCACCGTCAACGAGCCCGTAC-3’(下划线为BamHI酶切位点)，
下游引物22sctreSHindR：5’-GGGAAAAAGCTTAGCGCGGCGGCCG-3’(下划线为HindIII酶切位点)；
海栖热袍菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22tmtreSEcoRF：
5’-GGGAAAGAATTCGGATGTTGTGTTGAGAGAGCGAAGC-3’(下划线为EcoRI酶切位点)，
下游引物22tmtreSSalR：
5’-GGGAAAGTCGACCCTCAACAGATCTAAGAAGAGTTTCAGATAGTT-3’(下划线为BamHI酶切位点)；
PCR反应体系为50μL：基因组模板DNA 1μL，上下游引物各2μL，dNTP Mix 3μL，2×PrimeSTAR GC Buffering 25μL，DMSO 0.75μL，ddH2O 15.65μL，PrimeSTAR0.6μL。
PCR反应条件为98℃预变性1min，进行98℃12s，65℃10s，72℃x s，共9个循环，然后进行98℃12s，56℃30s，72℃x s，共21个循环，最后72℃延伸3min，x根据片段长度设定1min延伸1000bp。反应结束后将PCR产物进行1％琼脂糖(1g/100mL)电泳，结果表明，在正确位置上有一特异性条带(图1-图4)。
2、PCR产物回收及纯化
采用OMEGA公司MicroElute Gel Extraction Kit柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，具体操作步骤为：
按照步骤1所述，制备100μLPCR反应液，电泳后切胶，步骤如下：
a、PCR产物经1％(1g/100mL)琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯光下用刀片切下目的基因条带，再将切下的胶置于1.5mL离心管中，称量其重量，加入等重量的BindingBuffer，放于65℃水浴中至胶完全溶化。
b、将胶溶液全部移至吸附柱中，静置10min，12000rpm离心1min
c、将离心下来的收集管中液体再次移至吸附柱中，静置5min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体。
d、向吸附柱中加入700μL SPW Wash Buffer，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复此步骤一次。
e、将空吸附柱于12000rpm离心3min，室温晾干15min。
f、向空吸附柱中加入30μL超纯水，室温静置5min，12000rpm离心3min。
g、离心管中的溶液即为回收的DNA片段的水溶液。
h、取3μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，在正确的位置有明显条带，剩余DNA样品于-20℃贮存。
3、pET-22b质粒小量提取
采用OMEGA公司Plamid Mini kit I试剂盒小量提取质粒，具体操作步骤为：
将实验室保存的含有pET-22b质粒的大肠杆菌DH5α接种到到4mL含有氨苄青霉素(100μg/mL)的液体LB培养基中，振荡培养16h左右。取出菌液加到2mL离心管中，常温，12000rpm离心1min，弃尽上清。加入250μL溶液I，吹打混匀。加入250μL溶液II，上下轻轻颠倒数次，混匀，常温静置2min。加入350μL溶液III，上下轻轻颠倒数次，使裂解物分散均匀，常温静置2min，常温12000rpm离心10min。转移上清至吸附柱中，静置5min，常温，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。再加入500μLHB Buffer到吸附柱中，静置5min，常温，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。加入700μL DNA Wash Buffer到吸附柱中，常温12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复此步骤一次。然后将空吸附柱于12000rpm离心3min，室温晾干15min。向空吸附柱中加入30μL超纯水，室温静置5min，12000rpm离心3min。离心管中的溶液即为质粒DNA水溶液。取3μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，在正确的位置有明显条带，剩余DNA样品于-20℃贮存。
4、海藻糖合酶基因的克隆
a、PCR切胶回收产物和pET-22b质粒的双酶切
分别将恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌来源海藻糖合酶PCR切胶回收产物和pET-22b质粒分别用限制性内切酶BamHI和XhoI、NcoI和HindIII、BamHI和HindIII、EcoRI和SalI双酶切。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后回收备用(胶回收采用OMEGA公司MicroElute Gel Extraction Kit柱式DNA胶回收试剂盒方法进行)。
PCR切胶回收产物和pET-22b质粒的酶切体系均为30μL：DNA片段和质粒均为20μL，ddH2O 5μL，酶I 1μL，酶II 1μL，10×buffer 3μL。以上操作在冰上进行，混匀后在水浴锅上于37℃反应1h。
b、DNA连接反应
将凝胶回收后的双酶切PCR产物(由步骤2获得)和pET-22b载体连接，连接体系为10μL：双酶切后的PCR产物5μL，双酶切后的pET-22b 3μL，10×Buffer 1μL，T4连接酶1μL。以上操作在冰上进行，混匀后在金属浴上于22℃连接1h。
c、大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化
将b中的10μL连接产物与50μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞混合，冰浴30min；42℃热激90s，立即重置于冰上2min，再加入500μL LB液体培养基，37℃培养40min；涂布于LB固体平板(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜。
d、菌落PCR初步鉴定
用移液枪挑取少量单菌落至含20μL灭菌水的PCR管中，混匀后取出10μL保存，其余的分别加入四种来源的重叠PCR扩增DNA片段的上下游引物各1μL、0.5μL水和12.5rTaq。
混合均匀后，按以下条件进行PCR反应：95℃30s，56℃30s，72℃2min54s，共35个循环，最后再72℃延伸7min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测验证。验证正确的菌落。
e、DNA测序及检验实验的正确性
将菌落PCR鉴定为阳性克隆的无菌水保存的菌进行4mL试管12～16h培养，并送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA测序。将测序后获得的序列用DNAMAN软件进行比对以验证序列的正确性和该方法的可靠性。测序结果表明，所获得的DNA片段含有改造后的海藻糖合酶基因编码区。该四种来源海藻糖合酶基因编码区序列全长分别为2952bp、3072bp、2973bp和2478bp，分别编码984个氨基酸、1024个氨基酸、991个氨基酸和826个氨基酸。成功构建的质粒命名为pET-22b-pptreS565-tttreSC、pET-22b-cgtreS-tttreSC、pET-22b-sctreS-tttreSC和pET-22b-tmtreS-tttreSC。
恶臭假单胞菌来源的海藻糖合酶基因编码区测序结果见序列表No.3。
其氨基酸序列见序列表No.4。
谷氨酸棒杆菌来源的海藻糖合酶基因编码区测序结果见序列表No.7。
其氨基酸序列见序列表No.8。
天蓝色链霉菌来源的海藻糖合酶基因编码区测序结果见序列表No.11。
其氨基酸序列见序列表No.12。
海栖热袍菌来源的海藻糖合酶基因编码区测序结果见序列表No.15。
其氨基酸序列见序列表No.16。
5、海藻糖合酶基因在大肠杆菌中的表达
a、将保藏好的测序正确的DH5α菌株接菌于4mL试管，过夜培养，提取重组质粒pET-22b-pptreS、pET-22b-cgtreS、pET-22b-sctreS和pET-22b-tmtreS，采用OMEGA公司PlamidMini kit I试剂盒小量提取质粒，具体操作步骤参见pET-22b质粒的小量提取。
b、分别将a中的10μL重组质粒与50μL的大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞混合，冰浴30min；42℃热激90s，立即重置于冰上2min，再加入500μL LB液体培养基，37℃培养40min；涂布于LB固体平板(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜。
c、海藻糖合酶基因在大肠杆菌中的表达
分别挑取步骤c中平板上长出的单菌落，接种于装有4mL LB的试管中(含100μg/mL氨苄青霉素)，于37℃。200rpm振荡培养过夜，转接于装有50mL TB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)的250mL三角瓶中，于37℃，220rpm培养至OD600为0.6～0.8。添加IPTG至终浓度为0.5mM/L，于16℃，180rpm继续培养30h。平行发酵数瓶菌液，培养24h后取菌液置于50mL离心管中，4℃，6000rpm离心10min，倒掉上清，收集菌体。将离心后的菌体用10mL 1×PBS磷酸盐缓冲液重悬，置于冰上进行超声破碎，功率采用130KW，超声3s，间歇5s，总共20min，然后采用SDS-PAGE电泳和活性检测确定重组蛋白的表达和酶活力，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。
d、海藻糖合酶活性检测
在50℃条件下，以过量的浓度为20％的麦芽糖溶液为底物，反应30分钟，单位体积内每分钟转化生成1μmol海藻糖的量为1个酶活单位U。
吸取1mL的粗酶液，加入到250mL三角瓶中，然后加入20mL麦芽糖溶液(20％)，50℃振荡反应30min，100℃沸水浴10min灭活。以标准空白样为空白对照，高效液相色谱测定海藻糖生成量。结果表明，对所长出的重组子进行诱导表达后酶活测定，恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌来源的海藻糖合酶的酶活力分别为3247U、1874U、2280U和1294U。
实施例2恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌来源的海藻糖合酶与其融合连接的嗜热细菌海藻糖合酶C端嗜热片段基因编码区的克隆及在大肠杆菌中的融合表达
1、引物设计及PCR反应
恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)NBRC14164,谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)ATCC 13032,天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)ATCC 23899、海栖热袍菌(Thermotoga maritime)MSB8和嗜热细菌(Thermusthermophilus)HB27基因组由美国乔治亚大学闫亚军老师提供，这些菌株可购置于中国普通微生物菌种保藏中心。
根据已知的嗜热细菌来源的海藻糖合酶基因C端嗜热片段编码区序列和恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌四种来源的海藻糖合酶基因编码区序列，分别设计一对上下游引物，设计的引物为：
恶臭假单胞菌来源的去掉其C端后的1696bp，并与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端1239bp基因融合表达的海藻糖合酶基因片段的上游引物EchouABamHF：
5’-GGGAAAGGATCCGGCCAAGCGTTCCCGCCCGGCAGCC-3’(下划线为BamHI酶切位点)，
下游引物EchouAlinkerR：
5’-GGCGGCGGCTCCGGCTCCGGGCATGCGGTCATGG-3’；
嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端的1239bp，并与恶臭假单胞菌来源的去掉其C端后的1696bp的海藻糖合酶基因片段融合表达的海藻糖合酶C端基因片段的上游引物EchouBlinkerF：5’-GGAGCCGGAGCCGCCGCCTGGGCCGAGGAGCCCG-3’，
下游引物EchouBHindR：
5’-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’(下划线为HindIII酶切位点)；
谷氨酸棒杆菌来源的，并与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端1239bp基因融合表达的海藻糖合酶基因片段的上游引物GuansuanANcoF：
5’-GGGAAACCATGGGACTGATACCTCTCCGTTGAATTCTCAGCCG-3’(下划线为NcoI酶切位点)，
下游引物GuansuanAlinkerR：
5’-GGCGGCGGCTCCGGCTCCTTCCATATCGTCCTTT-3’；
嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端的1239bp，并与谷氨酸棒杆菌来源的海藻糖合酶基因片段融合表达的海藻糖合酶C端基因片段的上游引物GuansuanBlinkerF：
5’-GGAGCCGGAGCCGCCGCCTGGGCCGAGGAGCCCG-3’，
下游引物GuansuanBHindR：
5’-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’(下划线为HindIII酶切位点)；
天蓝色链霉菌来源的，并与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端1239bp基因融合表达的海藻糖合酶基因片段的上游引物TianlanseABamHF：
5’-GGGAAAGGATCCGACCGTCAACGAGCCCGTACCTGACACCTTCGAG-3’(下划线为BamHI酶切位点)，
下游引物TianlanseAlinkerR：
5’-GGCGGCGGCTCCGGCTCCAGCGCGGCGGCCGATG-3’；
嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端的1239bp，并与天蓝色链霉菌来源的海藻糖合酶基因片段融合表达的海藻糖合酶C端基因片段的上游引物TianlanseBlinkerF：
5’-GGAGCCGGAGCCGCCGCCTGGGCCGAGGAGCCCG-3’，
下游引物TianlanseBHindR：
5’-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’(下划线为HindIII酶切位点)；
海栖热袍菌来源的，并与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端1239bp基因融合表达的海藻糖合酶基因片段的上游引物HaixiABamHF：
5’-GGGAAAGGATCCGGATGTTGTGTTGAGAGAGCGAAGCATAGAGG-3’(下划线为BamHI酶切位点)，
下游引物HaixiAlinkerR：
5’-GGCGGCGGCTCCGGCTCCCCTCAACAGATCTAAG-3’；
嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端的1239bp，并与海栖热袍菌来源的海藻糖合酶基因片段融合表达的海藻糖合酶C端基因片段的上游引物HaixiBlinkerF：
5’-GGAGCCGGAGCCGCCGCCTGGGCCGAGGAGCCCGCCCCCGAG-3’，
下游引物HaixiBHindR：
5’-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’(下划线为HindIII酶切位点)；
PCR反应体系为50μL：基因组模板DNA 1μL，上下游引物各2μL，dNTP Mix 3μL，2×PrimeSTAR GC Buffering 25μL，DMSO 0.75μL，ddH2O 15.65μL，PrimeSTAR 0.6μL。
PCR反应条件为98℃预变性1min，进行98℃12s，72℃10s，72℃x s，共9个循环，然后进行98℃12s，72℃30s，72℃x s，共21个循环，最后72℃延伸3min，x根据片段长度设定1min延伸1000bp。反应结束后将PCR产物进行1％琼脂糖(1g/100mL)电泳，结果表明，在正确位置上有一特异性条带(图5)。
2、PCR产物回收及纯化
采用OMEGA公司MicroElute Gel Extraction Kit柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，具体操作步骤为：
按照步骤1所述，制备100μLPCR反应液，电泳后切胶，步骤如下：
a、PCR产物经1％(1g/100mL)琼脂糖凝胶电泳分离后，在紫外灯光下用刀片切下目的基因条带，再将切下的胶置于1.5mL离心管中，称量其重量，加入等重量的BindingBuffer，放于65℃水浴中至胶完全溶化。
b、将胶溶液全部移至吸附柱中，静置10min，12000rpm离心1min
c、将离心下来的收集管中液体再次移至吸附柱中，静置5min，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体。
d、向吸附柱中加入700μL SPW Wash Buffer，12000rpm离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复此步骤一次。
e、将空吸附柱于12000rpm离心3min，室温晾干15min。
f、向空吸附柱中加入30μL超纯水，室温静置5min，12000rpm离心3min。
g、离心管中的溶液即为回收的DNA片段的水溶液。
h、取3μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，在正确的位置有明显条带，剩余DNA样品于-20℃贮存。
3、重叠PCR引物设计及PCR反应
将切胶回收的恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌这四种来源的海藻糖合酶基因片段分别与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端片段利用重叠PCR技术，把这两部分用连接肽连在一起构成带有嗜热细菌来源海藻糖合酶C端的海藻糖合酶，根据上述的上下游引物，分别采用四种来源的海藻糖合酶上游引物和与其融合连接的嗜热细菌来源的海藻糖合酶下游引物，采用的引物为：
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的恶臭假单胞菌来源海藻糖合酶基因片段的上游引物EchouABamHF：5’-GGGAAAGGATCCGGCCAAGCGTTCCCGCCCGGCAGCC-3’(下划线为BamHI酶切位点)，
下游引物EchouBHindR：
5’-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’(下划线为HindIII酶切位点)；
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的谷氨酸棒杆菌来源海藻糖合酶基因片段的上游引物GuansuanANcoF：
5’-GGGAAACCATGGGACTGATACCTCTCCGTTGAATTCTCAGCCG-3’(下划线为NcoI酶切位点)，
下游引物GuansuanBHindR：
5’-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’(下划线为HindIII酶切位点)；
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的天蓝色链霉菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物TianlanseABamHF：
5’-GGGAAAGGATCCGACCGTCAACGAGCCCGTACCTGACACCTTCGAG-3’(下划线为BamHI酶切位点)，
下游引物TianlanseBHindR：
5’-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’(下划线为HindIII酶切位点)；
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的海栖热袍菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物HaixiABamHF：
5’-GGGAAAGGATCCGGATGTTGTGTTGAGAGAGCGAAGCATAGAGG-3’(下划线为BamHI酶切位点)，
下游引物HaixiBHindR：
5’-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’(下划线为HindIII酶切位点)；
PCR反应体系为50μL：四种来源的海藻糖合酶基因片段DNA 1μL，嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端基因片段1μL，上下游引物各2μL，dNTP Mix 3μL，2×PrimeSTAR GCBuffering 25μL，DMSO 0.75μL，ddH2O 14.65μL，PrimeSTAR 0.6μL。
PCR反应条件同上述，反应结束后将PCR产物进行1％琼脂糖(1g/100mL)电泳，结果表明，在正确位置上有一特异性条带(图6)。
4、重叠PCR产物回收及纯化
采用OMEGA公司MicroElute Gel Extraction Kit柱式DNA胶回收试剂盒回收PCR产物，具体操作步骤同步骤2。
5、pET-22b质粒小量提取
采用OMEGA公司Plamid Mini kit I试剂盒小量提取质粒，具体操作步骤为：
将实验室保存的含有pET-22b质粒的大肠杆菌DH5α接种到到4mL含有氨苄青霉素(100μg/mL)的液体LB培养基中，振荡培养16h左右。取出菌液加到2mL离心管中，常温，12000rpm离心1min，弃尽上清。加入250μL溶液I，吹打混匀。加入250μL溶液II，上下轻轻颠倒数次，混匀，常温静置2min。加入350μL溶液III，上下轻轻颠倒数次，使裂解物分散均匀，常温静置2min，常温12000rpm离心10min。转移上清至吸附柱中，静置5min，常温，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。再加入500μLHB Buffer到吸附柱中，静置5min，常温，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体。加入700μL DNA Wash Buffer到吸附柱中，常温12000rpm离心1min，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一收集管中，重复此步骤一次。然后将空吸附柱于12000rpm离心3min，室温晾干15min。向空吸附柱中加入30μL超纯水，室温静置5min，12000rpm离心3min。离心管中的溶液即为质粒DNA水溶液。取3μL进行琼脂糖凝胶电泳检测，在正确的位置有明显条带，剩余DNA样品于-20℃贮存。
6、海藻糖合酶基因的克隆
a、重叠PCR切胶回收产物和pET-22b质粒的双酶切
分别将恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌来源海藻糖合酶重叠PCR切胶回收产物和pET-22b质粒均用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切，将谷氨酸棒杆菌来源海藻糖合酶重叠PCR产物切胶回收产物和pET-22b质粒均用限制性内切酶NcoI和HindIII双酶切。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后回收备用(胶回收采用OMEGA公司MicroElute Gel Extraction Kit柱式DNA胶回收试剂盒方法进行)。
重叠PCR切胶回收产物和pET-22b质粒的酶切体系均为30μL：DNA片段和质粒均为20μL，ddH2O 5μL，酶I 1μL，酶II 1μL，10×buffer 3μL。以上操作在冰上进行，混匀后在水浴锅上于37℃反应1h。
b、DNA连接反应
将凝胶回收后的双酶切PCR产物(由步骤2获得)和pET-22b载体连接，连接体系为10μL：双酶切后的重叠PCR产物5μL，双酶切后的pET-22b 3μL，10×Buffer 1μL，T4连接酶1μL。以上操作在冰上进行，混匀后在金属浴上于22℃连接1h。
c、大肠杆菌DH5α感受态细胞的转化
将b中的10μL连接产物与50μL的大肠杆菌DH5α感受态细胞混合，冰浴30min；42℃热激90s，立即重置于冰上2min，再加入500μL LB液体培养基，37℃培养40min；涂布于LB固体平板(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜。
d、菌落PCR初步鉴定
用移液枪挑取少量单菌落至含20μL灭菌水的PCR管中，混匀后取出10μL保存，其余的分别加入四种来源的重叠PCR扩增DNA片段的上下游引物各1μL、0.5μL水和12.5rTaq。
混合均匀后，按以下条件进行PCR反应：95℃30s，72℃30s，72℃2min54s，共35个循环，最后再72℃延伸7min。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测验证。验证正确的菌落。
e、DNA测序及检验实验的正确性
将菌落PCR鉴定为阳性克隆的无菌水保存的菌进行4mL试管12～16h培养，并送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行DNA测序。将测序后获得的序列用DNAMAN软件进行比对以验证序列的正确性和该方法的可靠性。测序结果表明，所获得的DNA片段含有改造后的海藻糖合酶基因编码区。该四种来源海藻糖合酶基因编码区序列全长分别为2952bp、3072bp、2973bp和2478bp，分别编码984个氨基酸、1024个氨基酸、991个氨基酸和826个氨基酸。成功构建的质粒命名为pET-22b-pptreS565-tttreSC、pET-22b-cgtreS-tttreSC、pET-22b-sctreS-tttreSC和pET-22b-tmtreS-tttreSC。
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的恶臭假单胞菌来源海藻糖合酶基因编码区测序结果见序列表No.51。
其氨基酸序列见序列表No.52。
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的谷氨酸棒杆菌来源海藻糖合酶基因编码区测序结果见序列表No.55。
其氨基酸序列见序列表No.56。
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的天蓝色链霉菌来源海藻糖合酶基因编码区测序结果见序列表No.59。
其氨基酸序列见序列表No.60。
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的海栖热袍菌来源海藻糖合酶基因编码区测序结果见序列表No.63。
其氨基酸序列见序列表No.64。
7、海藻糖合酶基因在大肠杆菌中的表达
a、将保藏好的测序正确的DH5α菌株接菌于4mL试管，过夜培养，提取重组质粒pET-22b-pptreS565-tttreSC、pET-22b-cgtreS-tttreSC、pET-22b-sctreS-tttreSC和pET-22b-tmtreS-tttreSC，采用OMEGA公司Plamid Mini kit I试剂盒小量提取质粒，具体操作步骤参见pET-22b质粒的小量提取。
b、分别将a中的10μL重组质粒与50μL的大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞混合，冰浴30min；42℃热激90s，立即重置于冰上2min，再加入500μL LB液体培养基，37℃培养40min；涂布于LB固体平板(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜。
c、海藻糖合酶基因在大肠杆菌中的表达
分别挑取步骤c中平板上长出的单菌落，接种于装有4mL LB的试管中(含100μg/mL氨苄青霉素)，于37℃。200rpm振荡培养过夜，转接于装有50mL TB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)的250mL三角瓶中，于37℃，220rpm培养至OD600为0.6～0.8。添加IPTG至终浓度为0.5mM/L，于16℃，180rpm继续培养30h。平行发酵数瓶菌液，培养24h后取菌液置于50mL离心管中，4℃，6000rpm离心10min，倒掉上清，收集菌体。将离心后的菌体用10mL 1×PBS磷酸盐缓冲液重悬，置于冰上进行超声破碎，功率采用130KW，超声3s，间歇5s，总共20min，然后采用SDS-PAGE电泳和活性检测确定重组蛋白的表达和酶活力，分析目的蛋白的表达量和菌液最佳收获时间。
d、海藻糖合酶活性检测
在最适条件下，以过量的浓度为20％的麦芽糖溶液为底物，反应30分钟，单位体积内每分钟转化生成1μmol海藻糖的量为1个酶活单位U。
吸取1mL的粗酶液，加入到250mL三角瓶中，然后加入20mL麦芽糖溶液(20％)，最适温度(恶臭假单胞菌来源海藻糖合酶是20℃，谷氨酸棒杆菌来源海藻糖合酶是20℃，天蓝色链霉菌来源海藻糖合酶是50℃，海栖热袍菌来源海藻糖合酶是30℃)振荡反应30min，100℃沸水浴10min灭活。以标准空白样为空白对照，高效液相色谱测定海藻糖生成量。结果表明，对所长出的重组子进行诱导表达后酶活测定，四种添加嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端基因片段的恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌来源的海藻糖合酶的酶活力分别为8204U、10461U、6255U和5915U。
实施例3嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端片段对恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌来源的海藻糖合酶酶活的影响
四种通过添加嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端基因片段的恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌来源的海藻糖合酶的酶活力和原始的海藻糖合酶相比分别提高了1.53倍、4.58倍、1.74倍和3.57倍。因此证明嗜热细菌来源的海藻糖合酶确实对其他四种来源的海藻糖合酶酶催化特性产生了一定影响，起着至关重要的作用。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应该理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (4)

1.嗜热细菌海藻糖合酶C端片段提高海藻糖合酶酶活的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)嗜热细菌海藻糖合酶基因编码区的克隆及其在大肠杆菌中的表达
将恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌总DNA根据已知的海藻糖合酶基因编码区序列，设计一对上下游引物，设计的引物为：
恶臭假单胞菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22treSBamHF:5’-GGGAAAGGATCCGGCCAAGCGTTCCCGCC-3’，下划线为BamHI酶切位点，
下游引物22treSXhoR:5’-GGGAAACTCGAGTGACTCTCCCCAGGTACTGATC-3’，下划线为XhoI酶切位点；
谷氨酸棒杆菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22cgtreSNcoF：5’-GGGAAACCATGGGCACTGATACCTCTCCGTTGAATTCTCA-3’，下划线为NcoI酶切位点，
下游引物：22cgtreSHindR：5；-GGGAAAAAGCTTTTCCATATCGTCCTTTTCATCGGC-3’，下划线为HindIII酶切位点；
天蓝色链霉菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22sctreSBamHF：5’-GGGAAAGGATCCGCACCGTCAACGAGCCCGTAC-3’，下划线为BamHI酶切位点，
下游引物22sctreSHindR：5’-GGGAAAAAGCTTAGCGCGGCGGCCG-3’，下划线为HindIII酶切位点；
海栖热袍菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物22tmtreSEcoRF：5’-GGGAAAGAATTCGGATGTTGTGTTGAGAGAGCGAAGC-3’，下划线为EcoRI酶切位点，
下游引物22tmtreSSalR：5’-GGGAAAGTCGACCCTCAACAGATCTAAGAAGAGTTTCAGATAGTT-3’，下划线为BamHI酶切位点；
PCR反应体系为50μL：基因组模板DNA 1μL，上下游引物各2μL，dNTP Mix 3μL，2×PrimeSTAR GC Buffering 25μL，DMSO 0.75μL，ddH2O 15.65μL，PrimeSTAR 0.6μL；PCR反应条件为98℃预变性1min，进行98℃12s，65℃10s，72℃x s，共9个循环，然后进行98℃12s，57℃30s，72℃x s，共21个循环，最后72℃延伸3min；x根据片段长度设定1min延伸1000bp；切胶回收PCR产物并将其克隆至pET-22b上；对所获得的海藻糖合酶进行测序，构建pET-22b-pptreS、pET-22b-cgtreS、pET-22b-sctreS和pET-22b-tmtreS质粒并实现其在大肠杆菌中的表达；
(2)恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌来源的海藻糖合酶与其融合连接的嗜热细菌海藻糖合酶C端嗜热片段基因编码区的克隆及pET-22b-pptreS565-tttreSC、pET-22b-cgtreS-tttreSC、pET-22b-sctreS-tttreSC和pET-22b-tmtreS-tttreSC重组质粒的构建；
根据已知的嗜热细菌来源的海藻糖合酶基因C端嗜热片段编码区序列和恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌四种来源的海藻糖合酶基因编码区序列，分别设计一对上下游引物，设计的引物为：
恶臭假单胞菌来源的去掉其C端后的1696bp，并与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端1239bp基因融合表达的海藻糖合酶基因片段的上游引物EchouABamHF：5’-GGGAAAGGATCCGGCCAAGCGTTCCCGCCCGGCAGCC-3’，下划线为BamHI酶切位点，
下游引物EchouAlinkerR：5’-GGCGGCGGCTCCGGCTCCGGGCATGCGGTCATGG-3’；
嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端的1239bp，并与恶臭假单胞菌来源的去掉其C端后的1696bp的海藻糖合酶基因片段融合表达的海藻糖合酶C端基因片段的上游引物EchouBlinkerF：5’-GGAGCCGGAGCCGCCGCCTGGGCCGAGGAGCCCG-3’，
下游引物EchouBHindR：5’-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’，下划线为HindIII酶切位点；
谷氨酸棒杆菌来源的，并与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端1239bp基因融合表达的海藻糖合酶基因片段的上游引物GuansuanANcoF：5’-GGGAAACCATGGGACTGATACCTCTCCGTTGAATTCTCAGCCG-3’，下划线为NcoI酶切位点，
下游引物GuansuanAlinkerR：5’-GGCGGCGGCTCCGGCTCC
TTCCATATCGTCCTTT-3’；
嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端的1239bp，并与谷氨酸棒杆菌来源的海藻糖合酶基因片段融合表达的海藻糖合酶C端基因片段的上游引物GuansuanBlinkerF：5’-GGAGCCGGAGCCGCCGCCTGGGCCGAGGAGCCCG-3’，
下游引物GuansuanBHindR：5’-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’，下划线为HindIII酶切位点；
天蓝色链霉菌来源的，并与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端1239bp基因融合表达的海藻糖合酶基因片段的上游引物TianlanseABamHF：5’-GGGAAAGGATCCGACCGTCAACGAGCCCGTACCTGACACCTTCGAG-3’，下划线为BamHI酶切位点，
下游引物TianlanseAlinkerR：5’-GGCGGCGGCTCCGGCTCCAGCGCGGCGGCCGATG-3’；
嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端的1239bp，并与天蓝色链霉菌来源的海藻糖合酶基因片段融合表达的海藻糖合酶C端基因片段的上游引物TianlanseBlinkerF：5’-GGAGCCGGAGCCGCCGCCTGGGCCGAGGAGCCCG-3’，
下游引物TianlanseBHindR：5’-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’，下划线为HindIII酶切位点；
海栖热袍菌来源的，并与嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端1239bp基因融合表达的海藻糖合酶基因片段的上游引物HaixiABamHF：5’-GGGAAAGGATCCGGATGTTGTGTTGAGAGAGCGAAGCATAGAGG-3’，下划线为BamHI酶切位点，
下游引物HaixiAlinkerR：5’-GGCGGCGGCTCCGGCTCCCCTCAACAGATCTAAG-3’；
嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端的1239bp，并与海栖热袍菌来源的海藻糖合酶基因片段融合表达的海藻糖合酶C端基因片段的上游引物HaixiBlinkerF：5’-GGAGCCGGAGCCGCCGCCTGGGCCGAGGAGCCCGCCCCCGAG-3’，
下游引物HaixiBHindR：5’-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’，下划线为HindIII酶切位点；
PCR反应体系为50μL：基因组模板DNA 1μL，上下游引物各2μL，dNTP Mix 3μL，2×PrimeSTAR GC Buffering 25μL，DMSO 0.75μL，ddH2O 15.65μL，PrimeSTAR 0.6μL；
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的恶臭假单胞菌来源海藻糖合酶基因片段的上游引物EchouABamHF：5’-GGGAAAGGATCCGGCCAAGCGTTCCCGCCCGGCAGCC-3’，下划线为BamHI酶切位点，
下游引物EchouBHindR：5’-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’，下划线为HindIII酶切位点；
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的谷氨酸棒杆菌来源海藻糖合酶基因片段的上游引物GuansuanANcoF：5’-GGGAAACCATGGGACTGATACCTCTCCGTTGAATTCTCAGCCG-3’，下划线为NcoI酶切位点，
下游引物GuansuanBHindR：5’-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’，下划线为HindIII酶切位点；
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的天蓝色链霉菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物TianlanseABamHF：5’-GGGAAAGGATCCGACCGTCAACGAGCCCGTACCTGACACCTTCGAG-3’，下划线为BamHI酶切位点，
下游引物TianlanseBHindR：5’-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’，下划线为HindIII酶切位点；
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的海栖热袍菌来源的海藻糖合酶基因片段的上游引物HaixiABamHF：5’-GGGAAAGGATCCGGATGTTGTGTTGAGAGAGCGAAGCATAGAGG-3’，下划线为BamHI酶切位点，
下游引物HaixiBHindR：5’-GGGAAAAAGCTTGGCTTTTCCGGCCTTGGCCTGCCAGCGCTCGT-3’，下划线为HindIII酶切位点；
PCR反应体系为50μL：四种来源的海藻糖合酶基因片段DNA 1μL，嗜热细菌来源的海藻糖合酶C端基因片段1μL，上下游引物各2μL，dNTP Mix 3μL，2×PrimeSTAR GC Buffering25μL，DMSO 0.75μL，ddH2O 14.65μL，PrimeSTAR 0.6μL；
PCR反应条件为98℃预变性1min，进行98℃12s，72℃10s，72℃x s，共9个循环，然后进行98℃12s，72℃30s，72℃x s，共21个循环，最后72℃延伸3min，x根据片段长度设定1min延伸1000bp；切胶回收PCR产物并将其克隆至pET-22b上；对所获得的海藻糖合酶进行测序，构建pET-22b-pptreS565-tttreSC、pET-22b-cgtreS-tttreSC、pET-22b-sctreS-tttreSC和pET-22b-tmtreS-tttreSC质粒并实现其在大肠杆菌中的表达；
(3)恶臭假单胞菌、谷氨酸棒杆菌、天蓝色链霉菌和海栖热袍菌来源的海藻糖合酶与其融合连接的嗜热细菌海藻糖合酶C端嗜热片段在大肠杆菌中诱导表达海藻糖合酶
分别将pET-22b-pptreS565-tttreSC、pET-22b-cgtreS-tttreSC、pET-22b-sctreS-tttreSC和pET-22b-tmtreS-tttreSC重组质粒转化到大肠杆菌Rosetta，DE3，中，诱导表达海藻糖合酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(1)中，分别使用的各上下游引物PCR反应后的产物：
恶臭假单胞菌来源的海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.3，其氨基酸序列如序列表No.4；
谷氨酸棒杆菌来源的海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.7，其氨基酸序列如序列表No.8；
天蓝色链霉菌来源的海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.11，其氨基酸序列如序列表No.12；
海栖热袍菌来源的海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.15，其氨基酸序列如序列表No.16；
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(2)中，使用的上下游引物PCR反应后的产物：
未与嗜热细菌海藻糖合酶C端融合连接的恶臭假单胞菌来源海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.19，其氨基酸序列如序列表No.20；
未与恶臭假单胞菌海藻糖合酶基因融合连接的嗜热细菌来源海藻糖合酶C端基因编码区测序结果如序列表No.23，其氨基酸序列如序列表No.24；
未与嗜热细菌海藻糖合酶C端融合连接的谷氨酸棒杆菌来源海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.27，其氨基酸序列如序列表No.28；
未与谷氨酸棒杆菌海藻糖合酶基因融合连接的嗜热细菌来源海藻糖合酶C端基因编码区测序结果如序列表No.31，其氨基酸序列如序列表No.32；
未与嗜热细菌海藻糖合酶C端融合连接的天蓝色链霉菌来源海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.35，其氨基酸序列如序列表No.36；
未与天蓝色链霉菌海藻糖合酶基因融合连接的嗜热细菌来源海藻糖合酶C端基因编码区测序结果如序列表No.39，其氨基酸序列如序列表No.40；
未与嗜热细菌海藻糖合酶C端融合连接的海栖热袍菌来源海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.43，其氨基酸序列如序列表No.44；
未与海栖热袍菌海藻糖合酶基因融合连接的嗜热细菌来源海藻糖合酶C端基因编码区测序结果如序列表No.47，其氨基酸序列如序列表No.48；
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的恶臭假单胞菌来源海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.51；其氨基酸序列如序列表No.52；
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的谷氨酸棒杆菌来源海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.55，其氨基酸序列如序列表No.56；
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的天蓝色链霉菌来源海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.59，其氨基酸序列如序列表No.60；
带有嗜热细菌海藻糖合酶C端的海栖热袍菌来源海藻糖合酶基因编码区测序结果如序列表No.63，其氨基酸序列如序列表No.64。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是，步骤(3)中，使用的pET-22b-pptreS565-tttreSC、pET-22b-cgtreS-tttreSC、pET-22b-sctreS-tttreSC和pET-22b-tmtreS-tttreSC，表达条件是：诱导时间10～50h，诱导温度4～16℃，诱导剂IPTG终浓度为0.2～1.0mM/L。
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