CN110343654B - 一种产蔗糖磷酸化酶的基因工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种产蔗糖磷酸化酶的基因工程菌，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，以pET‑28a为载体构建重组质粒pET‑28a‑SPase，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，构建得到重组大肠杆菌，发酵产重组蔗糖磷酸化酶，得到高产蔗糖磷酸化酶的大肠杆菌菌株，其发酵胞内破壁上清酶活为504.19U/mL，比酶活为145.19U/mg，其稳定的产酶性可以为进一步的理论研究和实际生产应用打下基础，实践应用意义重大。

Description

一种产蔗糖磷酸化酶的基因工程菌

技术领域

本发明涉及一种产蔗糖磷酸化酶的基因工程菌，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

蔗糖磷酸化酶(EC 2.4.1.7，Sucrose phosphorylase，以下简称SPase)主要能够催化两种类型反应：一种是以磷酸化的葡萄糖当作供体转移到不同的物质，如以D-果糖为受体合成蔗糖；另外的一种催化方式是把蔗糖磷酸化酶分解蔗糖得到的葡萄糖基转移至不同类型的受体，如无机磷酸，含酚羟基、醇羟基及羧基的物质，催化合成多种糖苷。

蔗糖磷酸化酶主要分布在细菌中。根据文献报道该酶主要存在于肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides、变异链球菌Stococcus mutans、嗜糖假单胞菌Pseudomonassaccharophila、长双歧杆菌Bifidobacterium longum、青春双歧杆菌Bifidobacteriumadolescentis 等微生物中。Leuconostoc mescnteroides可以合成蔗糖磷酸化酶[GoedlC.,Schwarz A.,Minain A.,et al.Recombinant sucrose phosphorylase fromLeuconostoc mesenteroides:Characterization,kinetic studies oftransglucosylation,and application of immobilised enzyme for production of d-glucose 1-phosphate[J].Journal of Biotechnol,2007,129(1):77-86.]。

目前，蔗糖磷酸化酶主要分布在细菌微生物中，植物细胞中有少量分布，该酶主要通过生物发酵获得，野生型菌株中的复杂代谢调控机制使得蔗糖磷酸化酶的产量较低，仅通过野生型菌株发酵生产蔗糖磷酸化酶，难以满足工业应用的要求。现有的通过构建基因工程菌来发酵生产蔗糖磷酸化酶，在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌中异源表达蔗糖磷酸化酶均有文献报道，但存在表达量不高，酶活力不高等问题。因此，提供一种酶活力高、稳定性好的蔗糖磷酸化酶工程菌株，对于其工业化生产有重要的应用价值。

发明内容

本发明第一个目的是提供一种产蔗糖磷酸化酶的基因工程菌，是将来源于Leuconostoc mesenteroides的蔗糖磷酸化酶的基因异源表达。所述编码蔗糖磷酸化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET系列质粒为载体，以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET-28a质粒为载体。

本发明第二个目的是提供一种构建表达蔗糖磷酸化酶的重组大肠杆菌的方法，是将SEQ ID NO.2所示基因与载体连接，转化至大肠杆菌中。

在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。

在本发明的一种实施方式中，所述方法包括以下步骤：扩增SEQ ID NO.2所示的基因，酶切后，连接到载体pET-28a上，将重组质粒pET-28a-SPase转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布具有抗性的平板培养基，获得制备蔗糖磷酸化酶的工程菌。

本发明第三个目的是提供一种产蔗糖磷酸化酶的方法，是应用上述基因工程菌进行发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述培养基为TB培养基。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将大肠杆菌SPL0224单菌落接种于LB液体培养基中，于35-39℃，200-220r/min培养8-12h后，按1-5％(V/V)接种量接入到TB液体培养基中，于35-39℃，200-220r/min培养至菌密度OD600达到0.5-0.7后，加入IPTG诱导剂于23-27℃，200-220r/min诱导20-30h后收集菌液，离心收集菌体，重悬后破碎菌体，离心收集上清，即为蔗糖磷酸化酶粗酶液。

在本发明的一种实施方式中，将诱导后收集的菌液于4℃，7000r/min的低温冷冻离心机中离心15min，收集菌体。菌体用50mmol/L K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液(pH 6.5)洗两次后收集菌体。将收集好的湿菌体加入缓冲液制成菌悬液，放在冰上并固定好，然后用超声波破碎菌体。超声波破碎仪工作时间：2s，间歇时间：4s，总时间：30min。将破碎后的液体于4℃，7000r/min的低温冷冻离心机下离心30min收集上清即为蔗糖磷酸化酶粗酶液。

本发明的第四个目的是提供上述基因工程菌在食品、化妆品或制药领域中的应用。

本发明的有益效果

本发明将SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，以pET-28a为载体构建重组质粒pET-28a-SPase，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，构建得到重组大肠杆菌，发酵产重组蔗糖磷酸化酶，其发酵胞内破壁上清酶活为504.19U/mL，比酶活为145.19U/mg，其稳定的产酶性可以为进一步的理论研究和实际生产应用打下基础，实践应用意义重大。

附图说明

图1为PCR得到蔗糖磷酸化酶基因片段。

图2为pET-28a-SPase载体构建图。

图3为pET-28a-SPase载体酶切验证图，第1泳道为marker，后面2、3、4泳道为pET-28a-SPase载体酶切后的条带。

图4为重组菌Escherichia coli SPL01摇瓶发酵胞内破壁上清SDS-PAGE电泳图，第1泳道为marker，第2泳道为重组菌摇瓶发酵胞内破壁上清，可看到图中55KDa处有明显的条带与蔗糖磷酸化酶一致，表明可以获得蔗糖磷酸化酶。

图5为重组菌Escherichia coli SPL02摇瓶发酵胞内破壁上清SDS-PAGE电泳图，第1泳道为marker，第2泳道为重组菌摇瓶发酵胞内破壁上清，可看到图中55KDa处有明显的条带与蔗糖磷酸化酶一致，表明可以获得蔗糖磷酸化酶。

具体实施方式

实施例1Escherichia coli SPL01基因工程菌的构建

一、引物设计

根据Leuconostoc mesenteroides ATCC12291的SPase基因序列(GenBankAccession NO.D90314)，用DNAMAN设计扩增SPase基因的一对引物，分别引入NcoI、XhoI限制性酶切位点(下划线标出)，并加入保护碱基。上下游引物如下：

上游引物：5’-AATTACCGCCATGGATGGAAATTC AAAACAAAGC-3’

下游引物：5’-AATTACCGCTCGAGTTAGTTCTGA GTCAAATTAT C-3’

二、PCR扩增肠膜明串珠菌SPase片段

⑴肠膜明串珠菌基因组DNA提取

①将肠膜明串珠菌Leuconostoc mesenteroides ATCC 12291划线活化后，接种单菌落于5ml MRS培养基30℃过夜培养；

②取1mL菌液离心收集菌体，加入600μL生理盐水，混匀后12000r/min，离心1min去上清，再加入600μL生理盐水混匀后，加入9μL溶菌酶，37℃放置1h；

③加入50μL 10％的SDS溶液，轻轻混匀，再加入600μL苯酚，几滴氯仿摇晃分层，8000r/min离心5min，取上清于新的EP管中；

④加入600μL氯仿摇晃分层，8000r/min离心5min，取上清于新的EP管中；

⑤加入2.5倍体积的无水乙醇，离心5min，倒掉上清，沉淀用100μL无菌水溶解，提取得到肠膜明串珠菌基因组DNA，-20℃保存备用。

⑵PCR扩增SPase基因

以肠膜明串珠菌基因组DNA作为模板，利用上下游引物进行PCR扩增，扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，如图1所示。

三、基因表达载体的构建及转化

将PCR扩增后的SPase基因和pET-28a载体用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切，酶切后产物用Solution I连接，然后将重组载体pET-28a-SPase(见图2)转入大肠杆菌BL21(DE3)中表达。

挑取4个转化子提质粒用NcoI、XhoI进行酶切验证，如图3所示。

实施例2重组蔗糖磷酸化酶的制备

将重组菌株单菌落接种于含Kana的LB液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养后，按1％接种量接入到含Kana的TB液体培养基中，于37℃，200r/min培养至菌密度OD₆₀₀达到0.6后，加入IPTG诱导剂于25℃，200r/min诱导24h后收集菌液。将菌液于4℃，7000r/min的低温冷冻离心机中离心15min，收集菌体。菌体用50mmol/L K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液(pH6.5)洗两次后收集菌体。将收集好的湿菌体加入50mmol/L K₂HPO₄/KH₂PO₄缓冲液(pH 6.5)缓冲液制成菌悬液，放在冰上并固定好，然后用超声波破碎菌体。超声波破碎仪工作时间：2s，间歇时间：4s，总时间：30min。将破碎后的液体于4℃，7000r/min的低温冷冻离心机下离心30min收集上清即为蔗糖磷酸化酶粗酶液。

SDS-PAGE检测：吸取10μL粗酶液样品用SDS-PAGE检测(12％分离胶，5％浓缩胶)，如图4所示，可以清楚的看到图中55KDa处有明显的条带与蔗糖磷酸化酶一致，表明可以获得蔗糖磷酸化酶。

实施例3重组蔗糖磷酸化酶的酶活测定

在磷酸缓冲液中，蔗糖磷酸化酶能够催化蔗糖和无机磷酸生成葡萄糖-1-磷酸和D-果糖，可以先进行蔗糖水解反应，然后用DNS检测生成的D-果糖的含量，从而测定蔗糖磷酸化酶的活力[Choi H.C.,Seo D.H.,Jung J.H.,et al.Developmemt of new assay forsucrose phosphorylase and its application to the characterization ofBifidobacterium longumSJ32sucrose phosphorylase[J].Food Science andBiotechnology,2011,20(2):513-518.]。

酶活测定方法参照[吴敬,吴丹,朱洁,等.一种表达L.mesenteroides来源的蔗糖磷酸化酶重组枯草芽孢杆菌.中国发明专利申请,申请号:201710637427.6,公开号:CN107236696A]。测定步骤包括：5％蔗糖溶液500μL，蔗糖磷酸化酶粗酶液50μL，50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 6.5)450μL，30℃准确反应10min后，加入1.5mL DNS煮沸15min后迅速置于冷水中冷却，540nm处测定吸光值，以空载为对照。

将每分钟水解蔗糖生成1μmol的果糖所需酶量定义为蔗糖磷酸化酶的一个酶活力单位(U)。

酶活计算方法：

其中，A：吸光值、b：截距、n：稀释倍数、M：果糖分子质量、k：斜率。

蛋白含量测定：Brandford法测定所制备酶液中蛋白质的含量。

结果显示，比酶活为7.82U/mg。

实施例4 Escherichia coli SPL02基因工程菌的构建

(1)基因的优化：来源于Leuconostoc mesenteroides ATCC 12291的Sucrosephosphorylase(GenBank Accession NO.D90314)进行分析优化，获得SEQ ID NO.2所示基因序列，用DNAMAN与原序列进行比对，Identity＝78.07％，并将两个酶切位点NcoI、XhoI加到经过优化后的蔗糖磷酸化酶两端，经过合成得到SPase基因(SEQ ID NO.2所示基因序列)。

(2)基因工程菌的构建：将合成的SPase基因(SEQ ID NO.2所示基因序列)和pET-28a载体用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切，酶切后产物用Solution I连接，然后将重组载体pET-28a-SPase转入大肠杆菌BL21(DE3)中表达。

采用实施例2～3相同策略制备重组蔗糖磷酸化酶并测定其酶活，区别在于重组菌为Escherichia coli SPL02基因工程菌，粗酶液样品用SDS-PAGE检测(12％分离胶，5％浓缩胶)，如图5所示，可以清楚的看到图中55KDa处有明显的条带与蔗糖磷酸化酶一致，表明可以获得蔗糖磷酸化酶。酶活测定结果显示，酶活为504.19U/mL，比酶活为145.19U/mg。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种产蔗糖磷酸化酶的基因工程菌

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1473

<212> DNA

<213> Leuconostoc mesenteroides

<400> 1

atggaaattc aaaacaaagc aatgttgatc acttatgctg attcgttggg caaaaactta 60

aaagatgttc atcaagtctt gaaagaagat attggagatg cgattggtgg ggttcatttg 120

ttgcctttct tcccttcaac aggtgatcgc ggttttgcgc cagccgatta tactcgtgtt 180

gatgccgcat ttggtgattg ggcagatgtc gaagcattgg gtgaagaata ctatttgatg 240

tttgacttca tgattaacca tatttctcgt gaatcagtga tgtatcaaga ttttaagaag 300

aatcatgacg attcaaagta taaagatttc tttattcgtt gggaaaagtt ctgggcaaag 360

gccggcgaaa accgtccaac acaagccgat gttgacttaa tttacaagcg taaagataag 420

gcaccaacgc aagaaatcac ttttgatgat ggcacaacag aaaacttgtg gaatactttt 480

ggtgaagaac aaattgacat tgatgttaat tcagccattg ccaaggaatt tattaagaca 540

acccttgaag acatggtaaa acatggtgct aacttgattc gtttggatgc ctttgcgtat 600

gcagttaaaa aagttgacac aaatgacttc ttcgttgagc cagaaatctg ggacactttg 660

aatgaagtac gtgaaatttt gacaccatta aaggctgaaa ttttaccaga aattcatgaa 720

cattactcaa tccctaaaaa gatcaatgat catggttact tcacctatga ctttgcatta 780

ccaatgacaa cgctttacac attgtattca ggtaagacaa atcaattggc aaagtggttg 840

aagatgtcac caatgaagca attcacaaca ttggacacgc atgatggtat tggtgtcgtt 900

gatgcccgtg atattctaac tgatgatgaa attgactacg cttctgaaca actttacaag 960

gttggcgcga atgtcaaaaa gacatattca tctgcttcat acaacaacct tgatatttac 1020

caaattaact caacttatta ttcagcattg ggaaatgatg atgcagcata cttgttgagt 1080

cgtgtcttcc aagtctttgc gcctggaatt ccacaaattt attacgttgg tttgttggca 1140

ggtgaaaacg atatcgcgct tttggagtca actaaagaag gtcgtaatat taaccgtcat 1200

tactatacgc gtgaagaagt taagtcagaa gttaagcgac cagttgttgc taacttattg 1260

aagctattgt catggcgtaa tgaaagccct gcatttgatt tggctggctc aatcacagtt 1320

gacacgccaa ctgatacaac aattgtggtg acacgtcaag atgaaaatgg tcaaaacaaa 1380

gctgtattaa cagccgatgc ggccaacaaa acttttgaaa tcgttgagaa tggtcaaact 1440

gttatgagca gtgataattt gactcagaac taa 1473

<210> 2

<211> 1473

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggaaatcc agaacaaagc tatgctgatc acctacgctg actctctggg taaaaacctg 60

aaagacgttc accaggttct gaaagaagac atcggtgacg ctatcggtgg tgttcacctg 120

ctgccgttct tcccgtctac cggtgaccgt ggtttcgctc cggctgacta cacccgtgtt 180

gacgctgctt tcggtgactg ggctgacgtt gaagctctgg gtgaagaata ctacctgatg 240

ttcgacttca tgatcaacca catctctcgt gaatctgtta tgtaccagga cttcaaaaaa 300

aaccacgacg actctaaata caaagacttc ttcatccgtt gggaaaaatt ctgggctaaa 360

gctggtgaaa accgtccgac ccaggctgac gttgacctga tctacaaacg taaagacaaa 420

gctccgaccc aggaaatcac cttcgacgac ggtactaccg aaaacctgtg gaacaccttc 480

ggtgaagaac agatcgacat cgacgttaac tctgctatcg ctaaagaatt tatcaaaacc 540

accctggaag acatggttaa acacggtgct aacctgatcc gtctggacgc tttcgcttac 600

gctgttaaaa aagttgacac caacgacttc ttcgttgaac cggaaatctg ggacaccctg 660

aacgaagttc gtgaaatcct gaccccgctg aaagctgaaa tcctgccgga aatccacgaa 720

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ccgatgacca ccctgtacac cctgtactct ggtaaaacca accagctcgc taaatggctg 840

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gttggtgcta acgttaaaaa aacctactct tctgcttctt acaacaacct ggacatctac 1020

cagatcaact ctacctacta ctctgctctg ggtaacgacg acgctgctta cctgctgtct 1080

cgtgttttcc aggttttcgc tccgggtatc ccgcagatat actacgttgg tctgctggct 1140

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aaactgctgt cttggcgtaa cgaatctccg gctttcgacc tggctggttc tatcaccgtt 1320

gacaccccga ccgacaccac catcgttgtt acccgtcagg acgaaaacgg tcagaacaaa 1380

gctgttctga ccgctgacgc tgctaacaaa accttcgaaa tcgttgaaaa cggtcagacc 1440

gttatgtctt ctgacaacct gacccagaac taa 1473

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aattaccgcc atggatggaa attcaaaaca aagc 34

<210> 4

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aattaccgct cgagttagtt ctgagtcaaa ttatc 35

Claims (8)

1.一种产蔗糖磷酸化酶的基因工程菌，其特征在于，是以大肠杆菌BL21（DE3）为宿主，以pET-28a为载体，将蔗糖磷酸化酶在大肠杆菌（Escherichia coli）中异源表达，编码 所述蔗糖磷酸化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种构建权利要求1所述基因工程菌的方法，其特征在于，是将SEQ ID NO.2所示基因与载体连接，转化至大肠杆菌中。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：扩增SEQ ID NO.2所示的基因，酶切后，连接到载体pET-28a上，获得重组质粒pET-28a-SPase，将重组质粒pET-28a-SPase转化表达宿主大肠杆菌BL21（DE3）细胞中，获得制备蔗糖磷酸化酶的基因工程菌。

4.一种产蔗糖磷酸化酶的方法，其特征在于，应用权利要求1所述的基因工程菌进行发酵。

5.如权利要求4所述方法，其特征在于，所述发酵中使用的培养基为TB培养基。

6.如权利要求4所述方法，其特征在于，所述方法是将权利要求1所述的基因工程菌单菌落接种于LB液体培养基中，于35-39℃，200-220 r/min培养8-12 h后获得种子液。

7.如权利要求6所述方法，其特征在于，将种子液按1-5%接种量接入到TB液体培养基中，于35-39℃，200-220 r/min培养至菌密度OD600达到0.5-0.7后，加入IPTG诱导剂于23-27℃，200-220 r/min诱导20-30 h后收集菌液，离心收集菌体，重悬后破碎菌体，离心收集上清，即为蔗糖磷酸化酶粗酶液。

8.权利要求1所述的基因工程菌在食品、化妆品或制药领域产蔗糖磷酸化酶中的应用。

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