CN104845926B

CN104845926B - 一种有利于重组蛋白胞外分泌的基因敲除大肠杆菌及其应用

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Publication number: CN104845926B
Application number: CN201510289464.3A
Authority: CN
Inventors: 何冰芳; 朱芸; 储建林; 周有治; 吴斌; 柏中中; 钦松; 姜天玥
Original assignee: Nanjing Tech University
Current assignee: Nanjing Tech University
Priority date: 2015-05-29
Filing date: 2015-05-29
Publication date: 2017-12-22
Anticipated expiration: 2035-05-29
Also published as: CN104845926A

Abstract

本发明提供一种有利于重组蛋白胞外分泌的基因敲除大肠杆菌及其应用，涉及改造大肠杆菌遗传组基因领域。本发明有利于重组蛋白胞外分泌的基因敲除大肠杆菌，是通过敲除大肠杆菌中脂多糖合成的相关基因后获得。本发明还提供所述基因敲除大肠杆菌的构建方法及所述基因敲除大肠杆菌在制备胞外可溶性蛋白方面的应用。本发明基因敲除大肠杆菌的制备方法简单，效率高，成本低，敲除脂多糖合成的相关基因后增加了细胞外膜的通透性，从而显著增强重组蛋白的胞外分泌。

Description

一种有利于重组蛋白胞外分泌的基因敲除大肠杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及改造大肠杆菌遗传组基因领域，具体涉及一种有利于重组蛋白胞外分泌的基因敲除大肠杆菌及其应用。

背景技术

大肠杆菌体系适合于生产翻译后无需修饰加工的蛋白质。由于大肠杆菌缺乏蛋白折叠过程中需要的辅助因子，中间体易于大量积聚形成包涵体沉淀，为了获得有活性的蛋白必须将包涵体进行复性等繁琐过程。果糖苷酶采用大肠杆菌体系进行表达，胞内表达量较大易于形成包涵体，胞外表达量非常少，显著增加了下游成本。

脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰氏阴性细菌特有的结构和功能分子，是细胞外膜主要组成部分。LPS一般由三部分组成，由内向外依次是疏水性的类脂A、核心寡糖和由重复性糖单元构成的O-抗原。大肠杆菌BL21(DE3)的LPS中不含有O-抗原。作为细胞最外层的屏障，LPS的组成与细胞结构的完整性、外膜的通透性的维持、菌膜的形成能力、细菌的抗干燥能力和耐热性均密切相关。waaF为大肠杆菌BL21(DE3)中脂多糖庚糖转移酶Ⅱ(ADP-heptose:LPS heptosyltransferase II)的基因，该酶的作用是将庚糖Ⅱ连接到庚糖Ⅰ上，从而完善脂多糖中核心寡糖的结构。msbB为大肠杆菌BL21(DE3)中用于类脂A生物合成的十四烷酸转移酶(lipidAbiosynthesis(KDO)₂-(lauroyl)-lipid IV_A acyltransferase)的基因，该酶的作用是将十四烷酸添加到类脂A的C3’位上，成为一条次级脂肪酸链。

发明内容

本发明提供一种有利于重组蛋白胞外分泌的基因敲除大肠杆菌，能够显著提高重组蛋白在胞外的表达量，减少无活性包涵体的表达量，易于重组蛋白的纯化，显著降低生产成本。

本发明的另一目的是提供上述基因敲除大肠杆菌的制备方法，该方法简单，效率高，成本低。

本发明的再一目的是提供所述基因敲除大肠杆菌在制备胞外可溶性蛋白方面的应用。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

本发明提供有利于重组蛋白胞外分泌的基因敲除大肠杆菌，是通过敲除大肠杆菌中脂多糖合成的相关基因后获得。

在本发明中，所述脂多糖合成的相关基因是脂多糖庚糖转移酶Ⅱ的基因waaF。

在本发明中，所述脂多糖合成的相关基因还可以是十四烷酸转移酶的基因msbB。

在本发明中，所述脂多糖合成的相关基因也可以是脂多糖庚糖转移酶Ⅱ的基因waaF和十四烷酸转移酶的基因msbB。

本发明还提供所述基因敲除大肠杆菌的构建方法，包括如下步骤：

(1)构建两端为待敲除靶基因同源片段、中间为抗性片段的打靶片段；所述抗性片段是在抗性标记基因两端分别连接dif位点后得到；

(2)将pKD46质粒导入大肠杆菌，得到含有pKD46质粒的大肠杆菌；

(3)所述打靶片段与表达Red同源重组酶且含有pKD46质粒的大肠杆菌进行同源重组，抗性筛选、消除抗性标记基因，得到所述基因敲除大肠杆菌。

本发明还提供所述基因敲除大肠杆菌在制备胞外可溶性蛋白方面的应用。

优选的技术方案中，将所述蛋白的编码基因插入表达载体，然后转化至所述基因敲除大肠杆菌中，获得制备所述蛋白的重组菌。

在本发明中，所述蛋白优选为果糖苷酶或青霉素G酰化酶。

优选的技术方案中，诱导培养所述重组菌，将发酵液离心取上清液，得到所述可溶性蛋白。

本发明，首先构建线性打靶片段，包括含有庆大霉素抗性基因及两个dif位点的抗性片段dif-Gm^r-dif，以及抗性片段两侧分别是200bp左右的目标敲除基因的同源臂。然后，通过电转化将线性打靶片段导入已经诱导表达三种Red同源重组酶Exo、Beta和Gam的出发菌株E.coli BL21(DE3)中，实现线性打靶片段在大肠杆菌基因组中的重组。最后，利用自身的Xer重组系统实现目标基因突变后抗性基因的消除，得到有利于重组蛋白胞外分泌的基因敲除大肠杆菌。上述基因敲除大肠杆菌的制备方法简单，效率高，成本低。本发明大肠杆菌由于敲除脂多糖合成的相关基因增加了细胞外膜的通透性，从而增强重组蛋白的胞外分泌，进而极大简化下游复性及分离纯化工艺，减少表达蛋白对宿主菌的毒性和代谢负担，最终提高可溶性重组蛋白的产量和纯度。

附图说明

图1为PCR法鉴定目标基因是否被敲除的琼脂糖凝胶电泳图，其中：1.waaF基因敲除菌用鉴定引物waaF-IF和waaF-IR进行菌落PCR；2.出发菌株Escherichia coli BL21(DE3)用鉴定引物waaF-IF和waaF-IR进行菌落PCR；3.msbB基因敲除菌用鉴定引物msbB-IF和msbB-IR进行菌落PCR；4.出发菌株Escherichia coli BL21(DE3)用鉴定引物msbB-IF和msbB-IR进行菌落PCR。

图2为果糖苷酶在对照菌株及基因敲除突变菌株中胞外表达效果的SDS-PAGE比较图，其中：1.Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)-Fru；2.Escherichia coli BL21(DE3)::ΔmsbB/pET22b(+)-Fru；3.Escherichia coli BL21(DE3)::ΔwaaF/pET22b(+)-Fru。

图3为果糖苷酶在对照菌株及基因敲除突变菌株中胞内表达效果的SDS-PAGE比较图，其中：1.Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)-Fru；2.Escherichia coli BL21(DE3)::ΔmsbB/pET22b(+)-Fru；3.Escherichia coli BL21(DE3)::ΔwaaF/pET22b(+)-Fru。

图4不同诱导表达时间对各菌株胞外青霉素G酰化酶PGA活力的影响，其中：■-Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)-pga；○-Escherichia coli BL21(DE3)::ΔmsbB/pET22b(+)-pga；▲-Escherichia coli BL21(DE3)::ΔwaaF/pET22b(+)-pga。

图5青霉素G酰化酶PGA在重组菌株中胞外表达产物的SDS-PAGE图，其中：M:Protein marker；1,4和7:Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)-pga；2,5和8:Escherichia coli BL21(DE3)::ΔmsbB/pET22b(+)-pga；3,6和9:Escherichiacoli BL21(DE3)::ΔwaaF/pET22b(+)-pga。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步阐述，其目的是更好理解本发明内容。因此，所举之例并不限制本发明的保护范围。此外，在所列实施例中如无特别说明均采用如下材料：

(1)菌种及引物：

出发菌株为Escherichia coli BL21(DE3)(本实验室保藏，可以通过商业途径购买)。

抗性片段dif-Gm^r-dif的结构：在庆大霉素抗性标记基因两端分别连接一个dif位点。含有抗性片段dif-Gm^r-dif的打靶片段与含有pKD46质粒的大肠杆菌进行同源重组后，在42℃条件下进行培养时，会进行Xer重组，消除抗性片段dif-Gm^r-dif中的庆大霉素抗性标记基因和一个dif位点。抗性片段dif-Gm^r-dif和基因敲除辅助质粒pKD46为“大肠杆菌基因删除试剂盒”内试剂，“大肠杆菌基因删除试剂盒”购自江苏锐阳生物科技有限公司)。dif位点基因序列如SEQ ID NO:15所示。

waaF基因克隆引物是waaF-F(序列如SEQ ID NO:3所示)和waaF-R(序列如SEQ IDNO:4所示)，waaF基因反向PCR引物是fxwaaF-F(序列如SEQ ID NO:5所示)和fxwaaF-R(序列如SEQ ID NO:6所示)，waaF基因鉴定引物是waaF-IF(序列如SEQ ID NO:7所示)和waaF-IR(序列如SEQ ID NO:8所示)。msbB基因克隆引物是msbB-F(序列如SEQ ID NO:9所示)和msbB-R(序列如SEQ ID NO:10所示)，msbB基因反向PCR引物是fxmsbB-F(序列如SEQ ID NO:11所示)和fxmsbB-R(序列如SEQ ID NO:12所示)，msbB基因鉴定引物是msbB-IF(序列如SEQID NO:13所示)和msbB-IR(序列如SEQ ID NO:14所示)。

(2)培养基

LB固体培养基的成分及浓度：20g/L琼脂，10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取粉，10g/LNaCl，pH 7.0；

LB液体培养基的成分及浓度：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取粉，10g/L NaCl，pH7.0。

SOC培养基的成分及浓度：20g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取粉，10mM NaCl，2.5mMKCl，10mM MgSO₄，10mM MgCl₂，20mM葡萄糖。

发酵培养基的成分及浓度：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取粉，10g/L NaCl，1g/L葡萄糖，pH 7.0。

所用试剂均为市售品。

实施例一

本实施例说明敲除waaF基因的大肠杆菌的构建过程，具体包括以下步骤：

(1)先将大肠杆菌BL21(DE3)中脂多糖庚糖转移酶Ⅱ的基因waaF(SEQ ID NO:1)用waaF基因克隆引物waaF-F和waaF-R进行PCR克隆，并连接到pMD18T载体上构建重组质粒，命名为pMD18T-waaF；

(2)以步骤(1)获得的pMD18T-waaF重组质粒为模板，用反向引物fxwaaF-F和fxwaaF-R进行反向PCR，去除waaF中部部分序列，分别扩增waaF基因两端长约220bp的同源序列，再将反向PCR产物与抗性片段dif-Gm^r-dif连接，即在抗性片段dif-Gm^r-dif的两端分别连接waaF基因的同源序列，得到融合基因H1-dif-Gm^r-dif-H2(H1和H2分别为waaF两端的同源序列)。将融合基因插入pMD18T载体，构建获得含有突变盒片段的重组质粒；

(3)将含有突变盒片段的重组质粒采用EcoR Ⅰ和HindⅢ进行双酶切，使重组质粒线性化。以该线性化片段为模板，用waaF基因克隆引物waaF-F和waaF-R进行PCR扩增并用PCR产物纯化试剂盒纯化，得到两端各带有220bp的waaF同源序列及中间为抗性片段的waaF基因打靶片段，浓度为100ng/μl；

(4)将基因敲除辅助质粒pKD46通过电转化导入大肠杆菌BL21(DE3)中。利用10mM的L-阿拉伯糖诱导含质粒pKD46的大肠杆菌BL21(DE3)2h，表达三种Red同源重组酶Exo、Beta和Gam，然后将诱导后的菌液制备电转化感受态细胞；

(5)将步骤(3)所得纯化后的waaF基因打靶片段通过电转化导入到步骤(4)获得的感受态细胞之中，在SOC培养基中恢复3h，使用含50μg/ml庆大霉素的LB固体培养基筛选发生同源重组的突变菌株，并使用鉴定引物waaF-IF和waaF-IR进行PCR和测序以确定waaF基因区域发生正确的替换突变，即得带庆大霉素抗性的敲除waaF基因的大肠杆菌。从图1可以看出，waaF基因被成功替换。

(6)挑取步骤(5)所得带有庆大霉素抗性的waaF基因敲除的大肠杆菌单菌落，转接入装有30ml LB液体培养基的250ml锥形瓶中，在42℃、转速为200rpm的摇床内培养12小时，再以1/150(体积比)的接种量转接入装有30ml LB液体培养基的250ml锥形瓶中，在42℃、转速为200rpm的摇床内培养12小时，采用上述相同方法再转接3代，将所得菌液稀释涂布于LB固体培养基，37℃培养12小时，再将所得单菌落同时转接到LB固体培养基和含50μg/ml庆大霉素的LB固体培养基进行标记抗性测试，并用鉴定引物waaF-IF和waaF-IR进行PCR和测序以确定庆大霉素抗性标记基因和一个dif位点基因消除，得到敲除waaF基因的大肠杆菌。

实施例二

本实施例说明采用敲除waaF基因的大肠杆菌构建果糖苷酶生产菌的方法。

将带有自身信号肽的果糖苷酶的基因片断Fru(公开于专利号为ZL201210185733.8、名称为一种耐有机溶剂糖苷酶Fru6及其基因和应用的发明专利中,序列如该专利中SEQ ID NO：1所示)克隆到质粒pET22b(+)中，得到重组质粒pET22b(+)-Fru，再转化到敲除waaF基因的大肠杆菌菌株(实施例一制备)中，得到Escherichia coli BL21(DE3)::ΔwaaF/pET22b(+)-Fru。

实施例三

本实施例说明采用敲除waaF基因的大肠杆菌构建青霉素G酰化酶生产菌的方法。

将来源于大肠杆菌的青霉素G酰化酶的基因片段pga(Cheng TF等.ProteinExpression and Purification,2006,46(1):107-113.)克隆到质粒pET22b(+)中，得到重组质粒pET22b(+)-pga，再转化到敲除waaF基因的大肠杆菌菌株(实施例一制备)中，得到Escherichia coli BL21(DE3)::ΔwaaF/pET22b(+)-pga。

实施例四

本实施例说明敲除msbB基因的大肠杆菌的构建过程，具体包括以下步骤：

(1)先将大肠杆菌BL21(DE3)中与类脂A生物合成相关的十四烷酸转移酶的基因msbB(SEQ ID NO:2)用msbB基因克隆引物msbB-F和msbB-R进行PCR克隆，并连接到pMD18T载体上构建重组质粒，命名为pMD18T-msbB；

(2)以步骤(1)获得的pMD18T-msbB重组质粒为模板，用反向引物fxmsbB-F和fxmsbB-R进行反向PCR，去除msbB中部部分序列，分别扩增msbB两端长约220bp的同源片段，再将反向PCR产物与抗性片段dif-Gm^r-dif相连，即在抗性片段dif-Gm^r-dif的两端分别连接msbB基因的同源序列，得到融合基因H3-dif-Gm^r-dif-H4(H3和H4分别为msbB两端的同源序列)。将融合基因H3-dif-Gm^r-dif-H4插入pMD18T载体，构建含有突变盒片段的重组质粒；

(3)将含有突变盒片段的重组质粒采用EcoR Ⅰ和HindⅢ进行双酶切，使重组质粒线性化。以该线性化片段为模板，用msbB基因克隆引物msbB-F和msbB-R进行PCR扩增并用PCR产物纯化试剂盒纯化，得到两端各带有约220bp的msbB同源序列、中间为抗性片段的msbB基因的打靶片段，浓度为100ng/μl；

(5)将步骤(3)所得纯化后的msbB基因打靶片段通过电转化导入到步骤(4)获得的感受态细胞之中，在SOC培养基中恢复3h，使用含50μg/ml庆大霉素的LB固体培养基筛选发生同源重组的突变菌株，并使用鉴定引物msbB-IF和msbB-IR进行PCR并测序扩增的序列，以确定msbB基因区域发生正确的替换突变，得到带庆大霉素抗性的敲除msbB基因的大肠杆菌。从图1看出，msbB基因被成功替换。

(6)挑取步骤(5)所得带有庆大霉素抗性的敲除msbB基因的大肠杆菌单菌落，转接入LB液体培养基中，在42℃、转速为200rpm的摇床内培养12小时，再以1/150(体积比)的接种量转接入LB液体培养基中，在42℃、转速为200rpm的摇床内培养12小时，然后按照相同方法再转接3代，将所得菌液稀释涂布于LB固体培养基，37℃培养12小时，再将所得单菌落同时转接到LB固体培养基和含50μg/ml庆大霉素的LB固体培养基中进行标记抗性测试，并用鉴定引物msbB-IF和msbB-IR进行PCR、测序扩增序列，以确定庆大霉素抗性标记基因和一个dif位点基因消除，得到敲除msbB基因的大肠杆菌。

实施例五

本实施例说明采用敲除msbB基因的大肠杆菌构建果糖苷酶生产菌的方法。

将带有自身信号肽的果糖苷酶Fru的基因片断(序列同实施例二)克隆到质粒pET22b(+)中，得到重组质粒pET22b(+)-Fru，再转化到敲除msbB基因的大肠杆菌菌株(实施例四制备)中，即得到Escherichia coli BL21(DE3)::ΔmsbB/pET22b(+)-Fru。另外，将重组质粒pET22b(+)-Fru转化到Escherichia coli BL21(DE3)中，得到Escherichia coliBL21(DE3)/pET22b(+)-Fru，作为对照菌株。

实施例六

本实施例说明采用敲除msbB基因的大肠杆菌构建青霉素G酰化酶生产菌的方法。

将来源于大肠杆菌的青霉素G酰化酶的基因片段pga(序列同实施例三)克隆到质粒pET22b(+)中，得到重组质粒pET22b(+)-pga，再转化到敲除msbB基因的大肠杆菌菌株(实施例四制备)中，得到Escherichia coli BL21(DE3)::ΔmsbB/pET22b(+)-pga。另外，将重组质粒pET22b(+)-pga转化到Escherichia coli BL21(DE3)中，得到Escherichia coliBL21(DE3)/pET22b(+)-pga，作为对照菌株。

实施例七基因敲除菌株在制备果糖苷酶方面的应用

分别采用Escherichia coli BL21(DE3)::ΔwaaF/pET22b(+)-Fru、Escherichiacoli BL21(DE3)::ΔmsbB/pET22b(+)-Fru和对照菌株制备果糖苷酶，具体方法如下：先使用含100μg/ml Amp(氨苄青霉素)的LB固体培养基活化菌株，12小时后挑单菌落接种到含100μg/ml Amp的发酵培养基中(250ml三角瓶中装液量为30ml，下同)，在37℃、转速为200rpm的摇床内培养12小时，再将菌液接种到含100μg/ml Amp的发酵培养基中，在37℃、转速为200rpm的摇床内培养，在菌体浓度OD₆₀₀达到1.0左右时加入终浓度为1mM的IPTG，诱导发酵4小时后终止发酵。取1ml发酵液作为样品，检测OD₆₀₀，然后离心取上清作为胞外酶液，沉淀用1ml ddH₂O重悬后超声破碎，再次离心取上清作为胞内酶液。分别对各菌株的胞外、胞内酶液进行果糖苷酶活力检测和SDS-PAGE电泳。

检测果糖苷酶活力的具体方法：(1)底物溶液的配制：采用pH 6.5、0.05mol/LNa₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲配制342g/L蔗糖溶液，作为底物溶液。(2)反应体系：取50μL胞外/胞内酶液加入950μL底物溶液中，置于30℃中反应30min后，立即取出置于煮沸的沸水中，煮沸5min终止反应。然后取出100μL加到900μL的ddH₂O中稀释10倍后，用生物传感分析仪进行测定。酶活力定义：在30℃条件下，每分钟水解生成1μg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位(U,即μg·min^-1)。

经检测，Escherichia coli BL21(DE3)::ΔmsbB/pET22b(+)-Fru诱导后，胞外酶液的果糖苷酶活为1350U/ml，胞内酶液的果糖苷酶活为5501U/ml(表1)。Escherichia coliBL21(DE3)::ΔwaaF/pET22b(+)-Fru诱导后，胞外酶液的果糖苷酶活为2430U/ml，胞内酶液的果糖苷酶活为2346U/ml(表1)。对照菌株Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)-Fru诱导后，胞外酶液的果糖苷酶酶活为230U/ml，胞内酶液的果糖苷酶酶活为8434U/ml。上述结果说明：果糖苷酶在出发菌株Escherichia coli BL21(DE3)中胞外表达量占总表达量的2.6％，在敲除msbB基因的大肠杆菌中胞外表达量占总表达量的19.7％，在敲除waaF基因的大肠杆菌中胞外表达量占总表达量的50.9％，说明敲除msbB或waaF基因的大肠杆菌均能显著提高果糖苷酶的胞外表达量。

SDS-PAGE电泳结果：从图2可以看出，果糖苷酶的胞外表达量在以下三种菌株中依次明显增大，即Escherichia coli BL21(DE3)＜Escherichia coli BL21(DE3)::ΔmsbB＜Escherichia coli BL21(DE3)::ΔwaaF，说明敲除msbB或waaF基因的大肠杆菌均能显著提高果糖苷酶的胞外表达量；从图3可以看出，果糖苷酶的胞内表达量在以下三种菌株中依次明显减小，即Escherichia coli BL21(DE3)＞Escherichia coli BL21(DE3)::ΔmsbB＞Escherichia coli BL21(DE3)::ΔwaaF，说明敲除msbB或waaF基因的大肠杆菌还能同时降低果糖苷酶的胞内表达量，推测更多的果糖苷酶渗漏到了培养基中。

表1 果糖苷酶FRU在对照菌株及基因敲除突变菌株中表达的酶活比较

实施例八基因敲除菌株在制备青霉素G酰化酶方面的应用

分别采用Escherichia coli BL21(DE3)::ΔwaaF/pET22b(+)-pga、Escherichiacoli BL21(DE3)::ΔmsbB/pET22b(+)-pga和对照菌株Escherichia coli BL21(DE3)/pET22b(+)-pga制备青霉素G酰化酶PGA(含两个亚基，其中α亚基分子量约25kDa，β亚基分子量约62kDa))，具体方法如下：先使用含100μg/ml氨苄青霉素的LB固体培养基活化菌株，12小时后挑单菌落接种到含100μg/ml Amp的发酵培养基中(250ml三角瓶中装液量为30ml，下同)，在37℃、转速为200rpm的摇床内培养12小时，再将菌液接种到含100μg/ml Amp的发酵培养基中，在37℃、转速为200rpm的摇床内培养，在菌体浓度OD₆₀₀达到1.0左右时加入终浓度为5g/L的乳糖，25℃诱导发酵24小时后终止发酵。取1ml发酵液作为样品，离心取上清作为胞外酶液。分别对各菌株的胞外酶液进行青霉素G酰化酶活力检测和SDS-PAGE电泳。

检测青霉素G酰化酶活力的具体方法：(1)底物溶液的配制：采用pH 7.5、50mmol/LNa₂HPO₄-NaH₂PO₄缓冲液配制2g/LNIPAB(2-硝基-5-苯乙酰胺基苯甲酸)溶液。(2)反应体系：先加200μL稀释适当倍数的酶液，以灭活的酶液为空白对照，再加入200μL底物溶液，在酶标仪中进行反应，设定反应温度为37℃，反应时间为4min，在405nm检测反应结束时生成的ANBA的量。酶活定义：在37℃条件下，每分钟催化2-硝基-5-苯乙酰胺基苯甲酸(NIPAB)分解释放出1μmol 5-氨基-2-硝基苯甲酸(ANBA)所需的青霉素G酰化酶量为一个单位(U,即μmol·min^-1)。

从图4、5中可明显看到：以Escherichia coli BL21(DE3)为宿主菌时，仅有少量青霉素G酰化酶PGA分泌到胞外；在以敲除菌株Escherichia coli BL21(DE3)::ΔmsbB作为宿主菌时，对PGA的胞外分泌影响不显著；而以敲除菌株Escherichia coli BL21(DE3)::ΔwaaF作为宿主菌时，诱导表达12h后，PGA的胞外酶活大大提高，诱导表达24h达到了出发宿主菌中的4.1倍。表明waaF的敲除改变了大肠杆菌细胞外膜的通透性，使更多的PGA通过细胞外膜渗漏到了培养基中。

SEQUENCE LISTING

<110> 南京工业大学

<120> 一种有利于重组蛋白胞外分泌的基因敲除大肠杆菌及其应用

<130> 2015

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1047

<212> DNA

<213> Escherichia coli BL21(DE3)

<400> 1

atgaaaatac tggtgatcgg cccgtcttgg gttggcgaca tgatgatgtc gcaaagtctc 60

tatcgcacgc tccaggcgcg ctatccccag gcgataatcg atgtgatggc accggcatgg 120

tgccgtccat tattatcgcg gatgccggaa gttaacgaag ctattcctat gcctctcggt 180

cacggagcgc tggaaatcgg cgaacgccgt aaactgggtc atagcctgcg tgaaaagcgc 240

tacgaccgcg cctacgtctt acccaactcc ttcaaatctg cattagtgcc tttcttcgcg 300

ggtattcctc atcgcaccgg ctggcgcggc gagatgcgct acggtttact caacgatgta 360

cgcgtgctcg ataaagaagc ctggccgcta atggtggaac gctatgtcgc gctggcctat 420

gacaaaggcg tgatgcgtac cgcacaagat ctaccaaaac cgttgttatg gccgcaattg 480

caggtgagcg aaggtgaaaa atcatatacc tgtaatcaat tttcgctttc atcagaacgt 540

ccgatgattg gtttttgccc gggggcggag tttggtccgg caaaacgctg gccacattac 600

cactatgctg agctggcaaa gcagctgatt gatgaaggtt atcaggtggt tctgtttggc 660

tcggcgaaag atcatgaggc gggcaatgag attcttgccg ctttgaatac cgagcagcag 720

gcatggtgtc ggaacctggc gggggaaaca cagcttgatc aagcggttat cctgattgca 780

gcctgtaaag ccattgtcac taacgattct ggcctgatgc acgttgcggc ggcgctcaat 840

cgtccgctgg ttgccttgta tggtccgagt agcccggact tcacaccgcc gctatcccat 900

aaagcgcgcg tgatccgtct gattaccggc tatcacaaag tgcgtaaagg tgacgctgcg 960

gagggttatc accagagctt gatcgacatt actccccagc gcgtactgga agaactcaac 1020

gcgctattgt tacaagagga agtctga 1047

<210> 2

<211> 972

<212> DNA

<213> Escherichia coli BL21(DE3)

<400> 2

atggaaacga aaaaaaataa tagcgaatac attcctgagt ttgataaatc ctttcgccac 60

ccgcgctact ggggagcatg gctgggcgta gcagcgatgg cgggtatcgc tttaacgccg 120

ccaaagttcc gtgatcccat tctggcacgg ctgggacgtt ttgccggacg actgggaaaa 180

agctcacgcc gtcgtgcgtt aatcaatctg tcgctctgct ttccagaacg tagtgaagct 240

gaacgcgaag cgattgttga tgagatgttt gccaccgcgc cgcaagcgat ggcaatgatg 300

gctgagttgg caatacgcgg gccggagaaa attcagccgc gcgttgactg gcaagggctg 360

gagatcatcg aagagatgcg gcgtaataac gagaaagtta tctttctggt gccgcacggt 420

tgggccgtcg atattcctgc catgctgatg gcctcgcaag ggcagaaaat ggcagcgatg 480

ttccataatc agggcaaccc ggtttttgat tatgtctgga acacggtgcg tcgtcgcttt 540

ggcggtcgtc tgcatgcgag aaatgacggt attaaaccat tcatccagtc ggtacgtcag 600

gggtactggg gatattattt acccgatcag gatcatggcc cagagcacag cgaatttgtg 660

gatttctttg ccacctataa agcgacgttg cccgcgattg gtcgtttgat gaaagtgtgc 720

cgtgcgcgcg ttgtaccgct gtttccgatt tatgatggca agacgcatcg tctgacgatt 780

caggtgcgcc caccgatgga tgatctgtta gaggcggatg atcatacgat tgcgcggcgg 840

atgaatgaag aagtcgagat ttttgttggt ccgcgaccag aacaatacac ctggatacta 900

aaattgctga aaactcgcaa accgggcgaa atccagccgt ataagcgcaa agatctttat 960

cccatcaaat aa 972

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> waaF-F

<400> 3

ttgctgaagg tgtaacgga 19

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> waaF-R

<400> 4

ccgtcagact tcctcttgta a 21

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> fxwaaF-F

<400> 5

tggttgcctt gtatggtcc 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> fxwaaF-R

<400> 6

tgaccgagag gcataggaa 19

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> waaF-IF

<400> 7

ttgctgaagg tgtaacgga 19

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> waaF-IR

<400> 8

ccgtcagact tcctcttgta a 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> msbB-F

<400> 9

acttgaactt atcatcaggc g 21

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> msbB-R

<400> 10

tccgaaactg gaaaagcat 19

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> fxmsbB-F

<400> 11

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<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> fxmsbB-R

<400> 12

gatgatctgt tagaggcgg 19

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> msbB-IF

<400> 13

acttgaactt atcatcaggc g 21

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> msbB-IR

<400> 14

tccgaaactg gaaaagcat 19

<210> 15

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> dif

<400> 15

gggatttaac ataatataca ttatgcgcac caggcctccc 40

Claims

1.一种有利于重组蛋白胞外分泌的基因敲除大肠杆菌，其特征在于是通过敲除大肠杆菌BL21(DE3)中脂多糖庚糖转移酶Ⅱ的基因waaF后获得。

2.权利要求1所述基因敲除大肠杆菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）构建两端为待敲除靶基因同源片段、中间为抗性片段的打靶片段；所述抗性片段是在抗性标记基因两端分别连接dif位点后得到；

（2）将pKD46质粒导入大肠杆菌，得到含有pKD46质粒的大肠杆菌；

（3）所述打靶片段与表达Red同源重组酶且含有pKD46质粒的大肠杆菌进行同源重组，抗性筛选、消除抗性标记基因，得到所述基因敲除大肠杆菌。

3.权利要求1所述基因敲除大肠杆菌在制备胞外可溶性蛋白方面的应用，所述蛋白为果糖苷酶或青霉素G酰化酶。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于将所述蛋白的编码基因插入表达载体，然后转化至权利要求1所述基因敲除大肠杆菌中，获得制备所述蛋白的重组菌。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于诱导培养所述重组菌，将发酵液离心取上清液，得到所述可溶性蛋白。