CN113308446A

CN113308446A - 一种海藻糖转化率提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体及其应用

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Publication number: CN113308446A
Application number: CN202110573135.7A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 宿玲恰; 陈春; 夏伟
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2021-05-25
Filing date: 2021-05-25
Publication date: 2021-08-27
Anticipated expiration: 2041-05-25
Also published as: CN113308446B

Abstract

本发明公开了一种海藻糖转化率提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体是通过将麦芽寡糖基海藻糖合成酶的氨基酸第47位点进行突变，得到了与亲本麦芽寡糖基海藻糖合成酶海藻糖转化率更高的突变体。本发明的麦芽寡糖基海藻糖合成酶S47P、S47Q、S47D、S47V、S47L、S47N和S47A的海藻糖转化率得到提高，相对野生型分别提高0.9％、1.0％、1.6％、2.1％、3.3％、6.0％和8.0％。

Description

一种海藻糖转化率提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及一种海藻糖转化率提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体及其应用，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

海藻糖(Trehalose)是一种自然界中广泛存在的二糖，由两个葡萄糖通过α,α-1,1-糖苷键连接而成，因为其独特的高保湿性，热酸稳定性和安全性，被广泛应用于食品，农业，医药，化妆品。从20世纪80年代开始，各国相继开展了海藻糖生理生化和分子生物学的研究，该糖现已成为国际上最近开发的主要低聚糖之一。

目前，生产海藻糖的方法主要有三种，分别是酸化酶法、海藻糖合酶单酶法、MTSase和MTHase双酶法。其中，MTSase和MTHase双酶法采用液化后的淀粉作为底物，两个酶协同反应，生产海藻糖，该方法生产海藻糖的转化率较高，副产物较少，并用廉价的淀粉作为底物，降低了成本，因而得到了广泛的应用。

在应用MTSase和MTHase双酶法制备海藻糖的过程中，淀粉经过高温液化后加入支链淀粉酶作用生成麦芽糊精；麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)作用于底物还原性末端的α,α-1,4-糖苷，产生α,α-1,1-糖苷键的分子内转糖苷作用，形成中间产物麦芽寡糖基海藻糖；麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTHase)则专一的内切该中间产物中麦芽寡糖基与海藻糖相连的α,α-1,4-糖苷键，使之分解产生海藻糖和减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖，减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖作为新底物进行下一轮反应，如此反复交替进行两种酶反应就可以将麦芽寡糖转化成主要为海藻糖，以及少量葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的产物。

工业上，碎米加工制备大米蛋白粉后会产生大量的淀粉液化液，剩余的液化液可以作为生产海藻糖的底物，这样不仅解决了液化液的去向问题，可以将液化液转化成工业价值更高的海藻糖，同时原料碎米也可以得到更充分的利用，降低生产成本，这在工业上具有十分重要的意义。在大米蛋白粉制备中，为了减少板框过滤压力，通常大米淀粉液化液DE值在16左右，造成组分含有较多的低分子量麦芽寡糖。但是，目前MTSase普遍对低分子量麦芽寡糖底物利用不足，导致以该底物制备海藻糖转化率偏低。因而需要改造MTSase以提高海藻糖转化率。

发明内容

为了解决现有技术当中存在的以大米淀粉液化液为底物时，海藻糖的转化率偏低，本发明利用基因工程和酶工程的手段，提高麦芽寡糖基海藻糖合成酶制备海藻糖时的海藻糖转化率，为其工业化生产创造条件。

本发明提供了一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第47氨基酸进行突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，这些突变体与其亲代的麦芽寡糖基海藻糖合成酶相比，海藻糖转化率得到提高。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第47位氨基酸由丝氨酸突变为脯氨酸得到的，命名为S47P。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第47位氨基酸由丝氨酸突变为谷氨酰胺得到的，命名为S47Q。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第47位氨基酸由丝氨酸突变为天冬氨酸得到的，命名为S47D。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第47位氨基酸由丝氨酸突变为缬氨酸得到的，命名为S47V。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第47位氨基酸由丝氨酸突变为亮氨酸得到的，命名为S47L。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第47位氨基酸由丝氨酸突变为天冬酰胺得到的，命名为S47N。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第47位氨基酸由丝氨酸突变为丙氨酸得到的，命名为S47A，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的来源为分支节杆菌(Arthrobacter ramosus)。

在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，编码所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明还提供了编码上述麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的基因。

本发明还提供了携带上述基因的重组质粒。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒以pUC质粒载体、pET质粒载体或pGEX质粒载体为表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组质粒以pET24a质粒载体为表达载体。

本发明还提供了携带上述基因或上述重组质粒的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞的宿主细胞为细菌或真菌。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞的宿主细胞为大肠杆菌。

本发明还提供一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的制备方法，包括如下步骤：

(1)根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含有编码突变体的基因的质粒载体；

(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；

(3)挑选阳性克隆宿主细胞进行发酵培养，发酵结束后，将发酵获得的发酵液进行离心，收集细胞，细胞破壁上清液即为突变体麦芽寡糖基海藻糖合成酶的粗酶液。

本发明还提供了上述麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，或上述基因，或上述重组质粒，或上述宿主细胞在生产海藻糖中的应用。

本发明还提供了一种生产海藻糖的方法，所述方法包括以下步骤：

(1)向大米淀粉溶液中加入α-淀粉酶，得到经液化的大米淀粉溶液；

(2)分别向得到经液化的大米淀粉溶液添加普鲁兰酶、环糊精葡萄糖基转移酶、4-α糖基转移酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶进行酶催化反应，得到反应液；

(3)将上述麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体添加至反应液中，制备得到海藻糖。

在本发明的一种实施方式中，所述经液化的大米淀粉溶液的DE值为16～20。

在本发明的一种实施方式中，以大米淀粉为底物，将α-淀粉酶添加至大米淀粉溶液中，添加量为5U/g淀粉，于90-100℃的条件下高温液化至DE值为16，得到经液化的大米淀粉溶液；分别将普鲁兰酶、环糊精葡萄糖基转移酶、4-α糖基转移酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶分别按照5U/g淀粉、2U/mL、0.5U/mL、2.5U/mL的添加量添加至经液化的大米淀粉溶液中，于45℃，150r/min的条件下反应36h，得到反应液；将上述麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体按照2.5U/mL的添加量添加至反应液中，于45℃，150r/min的条件下反应36h，得到海藻糖。

在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶来源于Bacillus licheniformis，所述α-淀粉酶的GI:1917924695。

在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶来源于Bacillus deramificans，所述普鲁兰酶的GI:1007355861。

在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶来源于Paenibacillusmacerans，所述环糊精葡萄糖基转移酶的GI:675476791。

在本发明的一种实施方式中，所述4-α糖基转移酶来源于Thermus aquaticus，所述4-α糖基转移酶的GI:6225654。

在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶的来源为分支节杆菌Arthrobacter ramosus，所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶的GI:13537130。

在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的来源为分支节杆菌Arthrobacter ramosus，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的GI:13537129。

有益效果

(1)本发明提供了一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，采用本发明提供的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，实现了麦芽寡糖基海藻糖合成酶海藻糖转化率的提高。

(2)采用本发明的制备方法，麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体S47P、S47Q、S47D、S47V、S47L、S47N和S47A的海藻糖转化率别野生性得到提高，分别比野生型提高0.9％、1.0％、1.6％、2.1％、3.3％、6.0％和8.0％。

附图说明

图1：野生型MTSase、MTSase突变体S47G、S47A、S47V、S47P、S47N、S47D、S47L、S47Q、S47F和S47W在45℃的制备得到海藻糖转化率。

图2：野生型MTSase、不同的MTSase突变体制备得到海藻糖浓度图。

图3：含有野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶的粗酶液和含有麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的粗酶液的琼脂糖凝胶电泳图；其中，M：蛋白Marker；1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12分别代表野生型、S47G、S47A、S47V、S47P、S47N、S47D、S47L、S47Q、野生型、S47F和S47W。

图4：野生型MTSase、不同的MTSase突变体热稳定分析图。

具体实施方式

下述实施例涉及的α-淀粉酶(来源于Bacillus licheniformis)、麦芽寡糖基海藻糖合成酶(来源于Arthrobacter ramosus)、普鲁兰酶(来源于Bacillus deramificans)、环糊精葡萄糖基转移酶(来源于Paenibacillus macerans)、糖基转移酶(来源于Thermusaquaticus)购自诺维信公司。

下述实施例涉及的培养基如下：

LB液体培养基：

每100mL体系中需添加0.5g酵母提取物、1.0g胰蛋白胨和1.0g NaCl。

LB固体培养基：

在LB液体培养基基础上100mL添加2.0g琼脂粉。

TB液体发酵培养基：

每1L体系中需添加5.0g甘油、24.0g酵母粉、12.0g蛋白胨、7.5g甘氨酸、16.4gK₂HPO₄·3H₂O和2.3g KH₂PO₄。

下述实施例中涉及的检测方法如下：

麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶活检测方法：

预热：取1.9mL的0.4％麦芽六糖溶液(pH 6.0磷酸盐缓冲液)于具塞试管中，置于45℃水浴锅中预热10min。

反应：加入0.1mL稀释后的发酵胞内粗酶液，振荡均匀，准确计时10min，加入3mLDNS，振荡均匀，终止反应；煮沸7min，冷却。

测量：向上述反应体系中加入蒸馏水并定容至15mL，混匀；在540nm波长下测定吸光值并计算酶活力。

酶活定义：单位酶活相当于每分钟转化一微摩尔麦芽六糖变为麦芽四糖基海藻糖所需要的酶量。

海藻糖转化率检测方法：

将反应产物稀释沉淀后用高效液相色谱(HPLC)测定其中海藻糖含量，计算转化率。

计算公式＝海藻糖质量/大米淀粉质量*100/％

HPLC检测条件：流动相(乙腈：水＝80：20)；流速：0.8mL/min，柱温40℃，NH2柱(APS-2HYPERSIL，Thermo Scientific)，示差折光检测器(RID)。

实施例1：野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶的表达

具体实施方式如下：

(1)化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因treY，将treY基因与表达载体pET24a经过Hind III和Nde I双酶切后连接，转入大肠杆菌BL21(DE3)，得到BL21(DE3)/pET24a-treY。

将得到的重组菌BL21(DE3)/pET24a-treY的单菌落接种于LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)中生长10h，得到种子液，将得到的种子液按5％(v/v)接种量接入TB液体发酵培养基(含100mg/L卡那霉素)中，在37℃培养2h后，加入0.1mmol/L终浓度的IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)进行诱导，并在32℃摇床继续培养发酵24h得到发酵液；将发酵液于4℃、12000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，菌体沉淀用20mmol/L的pH 6.0的磷酸盐缓冲液重新悬浮，混匀；用超声波细胞粉碎机破碎菌体悬浮液的细胞壁(超声细胞破碎机的工作条件：ψ6工作探头，工作时间10min，工作2s停3s，工作功率为20％)，然后12000rpm离心10min，离心后上清即为野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶发酵胞内粗酶液。

实施例2：麦芽寡糖基海藻糖合成酶单突变体的制备及表达

(1)突变体的制备

根据核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的编码麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因序列，分别设计并合成引入S47G、S47A、S47V、S47P、S47N、S47D、S47L、S47Q、S47F和S47W突变的引物，对麦芽寡糖基海藻糖合成酶基因treY进行定点突变，分别测序确认麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的编码基因是否正确；将携带突变体基因的载体导入大肠杆菌中进行表达，得到单突变麦芽寡糖基海藻糖合成酶。

定点突变体编码基因的PCR扩增：利用快速PCR技术，以携带编码野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶的基因的表达载体pET-24a(+)-treY为模板。

引入S47G突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CAGGTTCTGGACATGGCTATGATGTTGTG-3’

反向引物：5’-CACAACATCATAGCCATGTCCAGAACCTG-3’

引入S47A突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CAGGTTCTGCACATGGCTATGATGT-3’

反向引物：5’-ACATCATAGCCATGTGCAGAACCTG-3’

引入S47V突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CAGGTTCTGTGCATGGCTATGATGTTGTGGAT-3’

反向引物：5’-ATCCACAACATCATAGCCATGCACAGAACCTG-3’

引入S47P突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-AGGTTCTCCACATGGCTATGATGTTG-3’

反向引物：5’-CAACATCATAGCCATGTGGAGAACCT-3’

引入S47N突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CAGGTTCTAATCATGGCTATGATGTTGTGGAT-3’

反向引物：5’-ATCCACAACATCATAGCCATGATTAGAACCTG-3’

引入S47D突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CAGGTTCTGATCATGGCTATGATGTTGTGG-3’

反向引物：5’-CCACAACATCATAGCCATGATCAGAACCTG-3’

引入S47L突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CAGGTTCTCTGCATGGCTATGATGTTGTGGAT-3’

反向引物：5’-ATCCACAACATCATAGCCATGCAGAGAACCTG-3’

引入S47Q突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CAGGTTCTCAACATGGCTATGATGTTGTGG-3’

反向引物：5’-CCACAACATCATAGCCATGTTGAGAACCTG-3’

引入S47F突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-CAGGTTCTTTTCATGGCTATGATGTTGTGGA-3’

反向引物：5’-TCCACAACATCATAGCCATGAAAAGAACCTG-3’

引入S47W突变的定点突变引物为：

正向引物：5’-GGTTCTTGGCATGGCTATGATGTTGTGG-3’

反向引物：5’-CCACAACATCATAGCCATGCCAAGAACC-3’

PCR体系为：20μM正向引物和反向引物各0.5μL，dNTPMix 4μL，5×PS Buffer 10μL，2.5U/μL的PrimeStar聚合酶0.5uL，模板0.5μL，加双蒸水补齐50μL。

PCR条件为：94℃预变性4min，随后进行25个循环(94℃10s，55℃5s，72℃7min40s)72℃延伸10min；最后4℃保温；PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

在验证正确的PCR产物中加入Dpn I进行消化，之后转化E.coli JM109感受态细胞得到转化产物，将转化产物涂布于含100mg/L卡那霉素的LB固体培养基中，37℃过夜培养，挑取阳性克隆接种至LB液体培养基中培养8h后，提取质粒并测序，测序正确即为：携带突变体S47G、S47A、S47V、S47P、S47N、S47D、S47L、S47Q、S47F和S47W的重组质粒，提取测序正确重组质粒，转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，分别得到能够表达突变体S47G、S47A、S47V、S47P、S47N、S47D、S47L、S47Q、S47F和S47W的重组菌株BL21(DE3)/pET24a-treY1、BL21(DE3)/pET24a-treY 2、BL21(DE3)/pET24a-treY 3、BL21(DE3)/pET24a-treY 4、BL21(DE3)/pET24a-treY 5、BL21(DE3)/pET24a-treY 6、BL21(DE3)/pET24a-treY 7、BL21(DE3)/pET24a-treY 8、BL21(DE3)/pET24a-treY 9、BL21(DE3)/pET24a-treY 10。

(2)突变体的表达

分别将步骤(1)得到的BL21(DE3)/pET24a-treY 1、BL21(DE3)/pET24a-treY 2、BL21(DE3)/pET24a-treY 3、BL21(DE3)/pET24a-treY 4、BL21(DE3)/pET24a-treY 5、BL21(DE3)/pET24a-treY 6、BL21(DE3)/pET24a-treY 7、BL21(DE3)/pET24a-treY 8、BL21(DE3)/pET24a-treY 9、BL21(DE3)/pET24a-treY 10接种于LB液体培养基(含100mg/L卡那霉素)培养10h得到种子液，将种子液按5％(v/v)的接种量接入TB液体发酵培养基(含100mg/L卡那霉素)，在37℃培养2h后，加入0.1mmol/L终浓度的IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)进行诱导，并在32℃摇床继续培养发酵24h，得到发酵液；将得到的发酵液于4℃、12000rpm离心10min，弃上清，收集菌体，将收集的菌体用20mmol/L的pH6.0的磷酸盐缓冲液重新悬浮后，混匀；用超声波细胞粉碎机破碎菌体悬浮液的细胞壁(超声细胞破碎机的工作条件：ψ6工作探头，工作时间10min，工作2s停3s，工作功率为20％)得到细胞破碎液，然后将细胞破碎液12000rpm离心10min，离心后的上清即为含有麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的发酵胞内粗酶液，分别得到含有S47G的粗酶液、含有S47A的粗酶液、含有S47V的粗酶液、含有S47P的粗酶液、含有S47N的粗酶液、含有S47D的粗酶液、含有S47L的粗酶液、含有S47Q的粗酶液、含有S47F的粗酶液和含有S47W的粗酶液。

分别对上述粗酶液及野生型的粗酶液进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图3所示。由图3可知，在83Kda处有蛋白条带，证明麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体得到了表达。

实施例3：麦芽寡糖基海藻糖合成酶酶活力分析

具体步骤如下：

分别检测实施例1和实施例2获得的含有野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶的发酵胞内粗酶液、含有S47G的发酵胞内粗酶液、含有S47A的发酵胞内粗酶液、含有S47V的发酵胞内粗酶液、含有S47P的发酵胞内粗酶液、含有S47N的发酵胞内粗酶液、含有S47D的发酵胞内粗酶液、含有S47L的发酵胞内粗酶液、含有S47Q的发酵胞内粗酶液、含有S47F的发酵胞内粗酶液和含有S47W的发酵胞内粗酶液的酶活。

检测结果为：野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶(WT)和突变体S47G、S47A、S47V、S47P、S47N、S47D、S47L、S47Q、S47F和S47W的酶活分别为186U/mL、103U/mL、188U/mL、180U/mL、175U/mL、170U/mL、180U/mL、190U/mL、183U/mL、54U/mL和36U/mL。

实施例4：麦芽寡糖基海藻糖合成酶热稳定性分析

具体步骤如下：

分别检测实施例1和实施例2获得的含有野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶的发酵胞内粗酶液、含有S47G的发酵胞内粗酶液、含有S47A的发酵胞内粗酶液、含有S47V的发酵胞内粗酶液、含有S47P的发酵胞内粗酶液、含有S47N的发酵胞内粗酶液、含有S47D的发酵胞内粗酶液、含有S47L的发酵胞内粗酶液、含有S47Q的发酵胞内粗酶液、含有S47F的发酵胞内粗酶液和含有S47W的发酵胞内粗酶液热处理后的残留酶活。

检测方法如下：

分别将野生型、S47G、S47A、S47V、S47P、S47N、S47D、S47L、S47Q、S47F和S47W粗酶液置于58℃恒温水浴中热处理10min，10min后，以未经热处理的含有野生型、S47G、S47A、S47V、S47P、S47N、S47D、S47L、S47Q、S47F和S47W粗酶液的酶活为100％，检测经热处理后的野生型、S47G、S47A、S47V、S47P、S47N、S47D、S47L、S47Q、S47F和S47W残留酶活，结果如图4所示。

由图4可知，野生型、S47G、S47A、S47V、S47P、S47N、S47D、S47L、S47Q、S47F和S47W的残留酶活分别为43.4％、18.5％、30.5％、26.4％、53.0％、40.5％、41.1％、13.5％、43.7％、9.4％和27.6％。其中，S47G、S47A、S47V、S47L、S47F和S47W相对野生型残留酶活下降十分显著，分别为野生型的42.5％、70.0％、60.8％、31.1％、21.6％和63.7％；S47N和S47D相对野生型残留酶活轻微下降，为野生型的93～94％左右；S47Q相对野生型残留酶活几乎没有变化；S47P相对野生型残留酶活提高了22.1％。

实施例5：麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的加酶量以及海藻糖转化率分析

具体步骤如下：

(1)以大米淀粉为底物，将α-淀粉酶添加至大米淀粉溶液中，于90-100℃的条件下高温液化成DE值为16，得到经液化的大米淀粉溶液；

(2)分别将普鲁兰酶、环糊精葡萄糖基转移酶、4-α糖基转移酶和麦芽寡糖基海藻糖合成酶分别按照5U/g淀粉、2U/mL、0.5U/mL、2.5U/mL的添加量，添加至经液化的大米淀粉溶液中，于45℃，150r/min的条件下反应36h，得到反应液1；

(3)分别将上述麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体S47G、S47A、S47V、S47P、S47N、S47D、S47L、S47Q、S47F和S47W按照2.5U/mL的添加量添加至反应液1中，于45℃，150r/min的条件下反应36h，得到反应液2；将反应液2煮沸15min，使酶失活，12000rpm离心30min得到上清液，采用高效液相色谱检测海藻糖的产量，并计算海藻糖转化率，结果如图1～图2所示。

由图1～图2可知，分别以野生型麦芽寡糖基海藻糖合成酶、S47G、S47A、S47V、S47P、S47N、S47D、S47L、S47Q、S47F和S47W为催化剂，制备得到的海藻糖产量分别为99.8g/L、95.7g/L、111.8g/L、102.9g/L、101.1g/L、108.7g/L、102.1g/L、104.7g/L、101.5g/L、92.4g/L、90g/L，其转化率分别为66.5％、63.8％、74.5％、68.6％、67.4％、72.5％、68.1％、69.8％、67.5％、61.6％和60.0％。

其中S47G、S47F和S47W的海藻糖转化率有所下降，分别相对野生型下降了2.7％、4.9％和6.5％。

而S47P、S47Q、S47D、S47V、S47L、S47N和S47A的海藻糖转化率得到提高，相对野生型分别提高0.9％、1.0％、1.6％、2.1％、3.3％、6.0％和8.0％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种海藻糖转化率提高的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体及其应用

<130> BAA210597A

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 757

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Pro Ala Ser Thr Tyr Arg Leu Gln Ile Ser Ala Glu Phe Thr Leu

1 5 10 15

Phe Asp Ala Ala Arg Ile Val Pro Tyr Leu His Arg Leu Gly Ala Asp

20 25 30

Trp Leu Tyr Leu Ser Pro Leu Leu Glu Ser Glu Ser Gly Ser Ser His

35 40 45

Gly Tyr Asp Val Val Asp His Ser Arg Val Asp Ala Ala Arg Gly Gly

50 55 60

Pro Glu Gly Leu Ala Glu Leu Ser Arg Ala Ala His Glu Arg Gly Met

65 70 75 80

Gly Val Val Val Asp Ile Val Pro Asn His Val Gly Val Ala Thr Pro

85 90 95

Lys Ala Asn Arg Trp Trp Trp Asp Val Leu Ala Arg Gly Gln Arg Ser

100 105 110

Glu Tyr Ala Asp Tyr Phe Asp Ile Asp Trp Glu Phe Gly Gly Gly Arg

115 120 125

Leu Arg Leu Pro Val Leu Gly Asp Gly Pro Asp Glu Leu Asp Ala Leu

130 135 140

Arg Val Asp Gly Asp Glu Leu Val Tyr Tyr Glu His Arg Phe Pro Ile

145 150 155 160

Ala Glu Gly Thr Gly Gly Gly Thr Pro Arg Glu Val His Asp Arg Gln

165 170 175

His Tyr Glu Leu Met Ser Trp Arg Arg Ala Asp His Asp Leu Asn Tyr

180 185 190

Arg Arg Phe Phe Ala Val Asn Thr Leu Ala Ala Val Arg Val Glu Asp

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Pro Arg Val Phe Asp Asp Thr His Arg Glu Ile Gly Arg Trp Ile Ala

210 215 220

Glu Gly Leu Val Asp Gly Leu Arg Val Asp His Pro Asp Gly Leu Arg

225 230 235 240

Ala Pro Gly Asp Tyr Leu Arg Arg Leu Ala Glu Leu Ala Gln Gly Arg

245 250 255

Pro Ile Trp Val Glu Lys Ile Ile Glu Gly Asp Glu Arg Met Pro Pro

260 265 270

Gln Trp Pro Ile Ala Gly Thr Thr Gly Tyr Asp Ala Leu Ala Gly Ile

275 280 285

Asp Arg Val Leu Val Asp Pro Ala Gly Glu His Pro Leu Thr Gln Ile

290 295 300

Val Asp Glu Ala Ala Gly Ser Pro Arg Arg Trp Ala Glu Leu Val Pro

305 310 315 320

Glu Arg Lys Arg Ala Val Ala Arg Gly Ile Leu Asn Ser Glu Ile Arg

325 330 335

Arg Val Ala Arg Glu Leu Gly Glu Val Ala Gly Asp Val Glu Asp Ala

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Leu Val Glu Ile Ala Ala Ala Leu Ser Val Tyr Arg Ser Tyr Leu Pro

355 360 365

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370 375 380

Ala Pro Gln Leu Glu Ala Asp Leu Ala Ala Val Gly Ala Ala Leu Ala

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Asp Pro Gly Asn Pro Ala Ala Leu Arg Phe Gln Gln Thr Ser Gly Met

405 410 415

Ile Met Ala Lys Gly Val Glu Asp Asn Ala Phe Tyr Arg Tyr Pro Arg

420 425 430

Leu Thr Ser Leu Thr Glu Val Gly Gly Asp Pro Ser Leu Phe Ala Ile

435 440 445

Asp Ala Ala Ala Phe His Ala Ala Gln Arg Asp Arg Ala Ala Arg Leu

450 455 460

Pro Glu Ser Met Thr Thr Leu Thr Thr His Asp Thr Lys Arg Ser Glu

465 470 475 480

Asp Thr Arg Ala Arg Ile Thr Ala Leu Ala Glu Ala Pro Glu Arg Trp

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Arg Arg Phe Leu Thr Glu Val Gly Gly Leu Ile Gly Thr Gly Asp Arg

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Val Leu Glu Asn Leu Ile Trp Gln Ala Ile Val Gly Ala Trp Pro Ala

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Ser Arg Glu Arg Leu Glu Ala Tyr Ala Leu Lys Ala Ala Arg Glu Ala

530 535 540

Gly Glu Ser Thr Asp Trp Ile Asp Gly Asp Pro Ala Phe Glu Glu Arg

545 550 555 560

Leu Thr Arg Leu Val Thr Val Ala Val Glu Glu Pro Leu Val His Glu

565 570 575

Leu Leu Glu Arg Leu Val Asp Glu Leu Thr Ala Ala Gly Tyr Ser Asn

580 585 590

Gly Leu Ala Ala Lys Leu Leu Gln Leu Leu Ala Pro Gly Thr Pro Asp

595 600 605

Val Tyr Gln Gly Thr Glu Arg Trp Asp Arg Ser Leu Val Asp Pro Asp

610 615 620

Asn Arg Arg Pro Val Asp Phe Ala Ala Ala Ser Glu Leu Leu Asp Arg

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Leu Asp Gly Gly Trp Arg Pro Pro Val Asp Glu Thr Gly Ala Val Lys

645 650 655

Thr Leu Val Val Ser Arg Ala Leu Arg Leu Arg Arg Asp Arg Pro Glu

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Leu Phe Thr Ala Tyr His Pro Val Thr Ala Arg Gly Ala Gln Ala Glu

675 680 685

His Leu Ile Gly Phe Asp Arg Gly Gly Ala Ile Ala Leu Ala Thr Arg

690 695 700

Leu Pro Leu Gly Leu Ala Ala Ala Gly Gly Trp Gly Asp Thr Val Val

705 710 715 720

Asp Val Gly Glu Arg Ser Leu Arg Asp Glu Leu Thr Gly Arg Glu Ala

725 730 735

Arg Gly Ala Ala Arg Val Ala Glu Leu Phe Ala Asp Tyr Pro Val Ala

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Leu Leu Val Glu Thr

755

<210> 2

<211> 2274

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atgccagctt ctacatatcg tttacagatt tcagccgagt tcaccttatt tgatgcagcc 60

cgtattgttc catatctgca tcgtttaggc gccgattggt tatatctgag tcctctgtta 120

gaaagtgaac caggttcttc acatggctat gatgttgtgg atcattcgag ggtggatgca 180

gctcgcggcg gtccggaagg tctggccgaa ctgtcacgcg cagcccatga acgcggtatg 240

ggcgttgttg tggatattgt tcctaatcat gtgggtgttg caacccctaa agctaatcgt 300

tggtggtggg atgttctggc acgcggtcag cgtagtgaat atgccgatta ttttgacatc 360

gattgggaat ttggtggcgg tcgcttacgc ttacctgtgt taggcgatgg tccggatgaa 420

ttagatgcac tgcgcgtgga tggcgatgaa ttagtgtatt atgaacatcg ttttcctatt 480

gcggaaggta cgggcggtgg aaccccacgc gaagttcatg atcgtcagca ttatgaatta 540

atgtcttggc gccgtgccga tcatgatttg aattatcgtc gcttcttcgc tgttaataca 600

ctggccgccg ttcgtgtgga agatcctcgc gtttttgatg atacacatcg cgaaatcggt 660

cgctggattg cggaaggctt agttgatggt cttcgcgtgg atcatccgga tggtctgcgt 720

gctccgggcg attatctgcg tcgtttagcc gaattagctc agggtcgtcc tatttgggtt 780

gaaaaaatca tcgaagggga tgaacgtatg ccacctcagt ggccaattgc gggtacaacc 840

ggctatgatg ccctggcagg catcgatcgt gttctggttg atccagcggg cgaacatcct 900

ctgacacaga ttgtggatga agctgccggc tctccacgtc gctgggcaga actggttcca 960

gaacgtaaac gtgcagttgc ccgtggtatc ttaaatagcg aaattcgtcg cgttgctcgc 1020

gaattaggcg aagttgcggg cgatgtggaa gatgccttag tggaaattgc tgctgctctg 1080

tcagtgtatc gtagctactt accatttggc cgtgaacatc tggatgaagc agttgctgcc 1140

gcacaggcag ctgccccaca gttagaagca gacttggctg ctgtgggcgc cgccctggcc 1200

gatccgggca atccggctgc gttacgcttt cagcagacct caggtatgat catggccaaa 1260

ggtgtggaag ataatgcctt ttatcgctat cctcgcctga cctcactgac ggaagtgggc 1320

ggtgaccctt cactgtttgc aatcgatgct gctgcctttc atgcggcaca gcgcgatcgt 1380

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gatactaggg cccgcatcac cgccttagca gaagctccgg aacgttggcg tcgctttctg 1500

acggaagtgg gcggtctgat tggtactggg gatcgcgttt tagaaaacct catctggcag 1560

gccattgtgg gtgcttggcc agcgagtcgc gaacgcctgg aagcgtacgc cttaaaagcc 1620

gctagagaag caggtgaaag taccgattgg attgatggag atccggcctt tgaagaacgc 1680

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ttagttgatg aactgaccgc cgcaggctat agtaatggct tagccgccaa actgttacag 1800

ttactggcac cgggtacacc agatgtgtat cagggtacgg aacgctggga tcgtagttta 1860

gttgatccag ataatcgtcg tccggttgat tttgcggcgg ccagtgaact gttagatcgc 1920

ttagatggcg gttggcgtcc accagtggat gaaacaggtg cagttaaaac actggttgtg 1980

tctcgcgcac tgcgcttacg tcgcgatcgt ccagaattat tcaccgcata tcatccagtg 2040

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gatgtgggtg aacgtagtct gcgcgatgaa ctgacgggtc gtgaagcccg cggcgcagcg 2220

cgggttgccg aactgtttgc agattatcca gttgcattac tggttgaaac ctaa 2274

<210> 3

<211> 757

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Pro Ala Ser Thr Tyr Arg Leu Gln Ile Ser Ala Glu Phe Thr Leu

1 5 10 15

Phe Asp Ala Ala Arg Ile Val Pro Tyr Leu His Arg Leu Gly Ala Asp

20 25 30

Trp Leu Tyr Leu Ser Pro Leu Leu Glu Ser Glu Ser Gly Ser Ala His

35 40 45

Gly Tyr Asp Val Val Asp His Ser Arg Val Asp Ala Ala Arg Gly Gly

50 55 60

Pro Glu Gly Leu Ala Glu Leu Ser Arg Ala Ala His Glu Arg Gly Met

65 70 75 80

Gly Val Val Val Asp Ile Val Pro Asn His Val Gly Val Ala Thr Pro

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Leu Arg Leu Pro Val Leu Gly Asp Gly Pro Asp Glu Leu Asp Ala Leu

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Arg Val Asp Gly Asp Glu Leu Val Tyr Tyr Glu His Arg Phe Pro Ile

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Ala Glu Gly Thr Gly Gly Gly Thr Pro Arg Glu Val His Asp Arg Gln

165 170 175

His Tyr Glu Leu Met Ser Trp Arg Arg Ala Asp His Asp Leu Asn Tyr

180 185 190

Arg Arg Phe Phe Ala Val Asn Thr Leu Ala Ala Val Arg Val Glu Asp

195 200 205

Pro Arg Val Phe Asp Asp Thr His Arg Glu Ile Gly Arg Trp Ile Ala

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225 230 235 240

Ala Pro Gly Asp Tyr Leu Arg Arg Leu Ala Glu Leu Ala Gln Gly Arg

245 250 255

Pro Ile Trp Val Glu Lys Ile Ile Glu Gly Asp Glu Arg Met Pro Pro

260 265 270

Gln Trp Pro Ile Ala Gly Thr Thr Gly Tyr Asp Ala Leu Ala Gly Ile

275 280 285

Asp Arg Val Leu Val Asp Pro Ala Gly Glu His Pro Leu Thr Gln Ile

290 295 300

Val Asp Glu Ala Ala Gly Ser Pro Arg Arg Trp Ala Glu Leu Val Pro

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690 695 700

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725 730 735

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740 745 750

Leu Leu Val Glu Thr

755

Claims

1.一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，其特征在于，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第47氨基酸进行突变得到的。

2.如权利要求1所述的一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，其特征在于，所述突变体是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的麦芽寡糖基海藻糖合成酶的第47位氨基酸由丝氨酸突变为脯氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、缬氨酸、亮氨酸、天冬酰胺或丙氨酸得到的。

3.编码权利要求1或2所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的基因。

4.携带权利要求3所述基因的重组质粒。

5.如权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒以pUC质粒载体、pET质粒载体或pGEX质粒载体为表达载体。

6.携带权利要求3所述基因，或权利要求4或5所述重组质粒的重组细胞。

7.如权利要求6所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞以细菌或真菌为宿主细胞。

8.权利要求1或2所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体，或权利要求3所述基因，或权利要求4或5所述重组质粒，或权利要求6或7所述的细胞在生产海藻糖中的应用。

9.一种生产海藻糖的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(3)将权利要求1或2所述的麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体添加至反应液中，制备得到海藻糖。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述经液化的大米淀粉溶液的DE值为16～20。