CN110656096B - 一种降低水解副反应程度的环糊精葡萄糖基转移酶突变体 - Google Patents

一种降低水解副反应程度的环糊精葡萄糖基转移酶突变体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降低水解副反应程度的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。本发明是通过将编码突变体A133V的基因转入大肠杆菌BL21(DE3)异源表达，获得重组菌BL21(DE3)/pET20b(+)‑A133V，利用该重组菌发酵产酶突变体A133V，其转苷活性与水解活性比例为野生酶的2.5‑2.6倍，大大提升了转苷活性与水解活性的比例，对于工业化生产具有重要的应用价值。

Description

一种降低水解副反应程度的环糊精葡萄糖基转移酶突变体
技术领域
本发明涉及一种降低水解副反应程度的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。
背景技术
环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)是一种多功能酶，它能催化四种反应，包括：三种转糖苷反应(歧化反应、环化反应、偶合反应)和水解反应。CGTase可通过环化反应将淀粉转化为环糊精，环糊精能与许多客体分子形成包合物，从而改变客体分子的物理和化学性质，在食品、香料、医药、农药、化工等行业中有着广泛应用。CGTase还可通过偶合和歧化反应，先将淀粉或环糊精这些糖分子作为供体转移到各种受体分子上，从而改善受体分子的性质，如CGTase催化低聚糖转移到蔗糖或果糖上可以制备难蚀性的偶合糖，催化甜菊苷、橙皮苷、芸香苷、L-抗坏血酸、鼠李糖等糖基化，显著提高这些物质的使用性能。
CGTase凭借优异的转苷性能在食品和医药等领域应用广泛，然而CGTase还能够通过水解反应将淀粉底物水解成葡萄糖和麦芽糖等小分子糖，降低淀粉的利用率，不利于转苷产物产量的提升，同时小分子糖副产物的存在，还容易产生产物抑制，导致转化率低。
目前，在CGTase催化歧化和水解反应方面的研究，主要集中于歧化反应到水解反应的转变，而如何削弱水解反应强化歧化反应的研究甚少，仅见于个别报道。RonanM.KELLY等通过来源于Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes的CGTase的定向进化以降低其水解副反应程度，获得了位于活性中心外部区域的突变体S77P和W239L，其歧化/水解比值分别提高2倍和1.2倍。
因此，提供一种进一步降低环糊精葡萄糖基转移酶的水解副反应程度的方法及突变体，提升转苷活性与水解活性的比例，将更加有利于工业化生产。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，含SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第133位的丙氨酸(Ala)突变为缬氨酸(Val)，命名为A133V。
在一种实施方式中，编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。
在一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为pUC系列载体、pET系列载体或pGEX系列载体中的任意一种。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为pET20b(+)。
本发明的第四个目的是提供表达所述突变体的细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞为细菌或真菌细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或短小芽孢杆菌。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
在本发明的一种实施方式中，所述细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
本发明的第五个目的是提供一种降低环糊精葡萄糖基转移酶水解活性的方法，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第133位的丙氨酸(Ala)突变为缬氨酸(Val)。
本发明的第六个目的是提供上述环糊精葡萄糖基转移酶的突变体在食品、制药或化工领域的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种转苷活性与水解活性比例提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体A133V，将编码该突变体的基因转入大肠杆菌BL21(DE3)异源表达，获得重组菌BL21(DE3)/pET20b(+)-A133V，该重组菌发酵产酶突变体A133V，其转苷活性与水解活性比例是野生酶的2.5-2.6倍，大大提升了转苷活性与水解活性的比例，对于工业化生产具有重要的应用价值。
具体实施方式
(一)培养基
LB培养基：胰蛋白胨10g·L-1，酵母粉5g·L-1，氯化钠10g·L-1。
TB培养基：胰蛋白胨12g·L-1，酵母粉24g·L-1，甘油5g·L-1，KH2PO4 2.31g·L-1，K2HPO4·3H2O 16.43g·L-1，甘氨酸7.5g·L-1。
(二)酶活的定义及检测方法
1.歧化活性酶活的定义：一个酶活单位(U)定义为在该条件下1min内转化1μmolEPS所需要的酶量。
歧化活性酶活的测定步骤：
(1)预热：取0.6mL含有终浓度4mmol/L的EPS和20mmol/L的麦芽糖溶液于50℃保温10min。
(2)反应：加入0.1mL适当稀释的酶液，反应10min，沸水加热10min终止反应。向体系中加入0.1mL去离子水，然后加入0.1mLα-葡萄糖苷酶于60℃反应60min。
(3)测量：向上述反应液中加入0.1mL 1mol/LNa2CO3溶液将pH调节到8.0以上，在401nm处测定吸光值并计算酶活力。
2.水解活性酶活定义：利用DNS法测定还原糖的方法测定水解活力。一个酶活单位(U)定义为在该测定条件下每分钟生成1μmol麦芽糖当量的还原糖所需要的酶量。
水解活性酶活的测定步骤：
(1)预热：取1mL预先配置好的1％的麦芽糊精DE9-13(50mM，pH 5.5的磷酸缓冲液配制)，加入0.9mL缓冲液(50mM，pH 5.5)50℃保温10min。
(2)反应：加入0.1mL适当稀释的酶液，反应10min，3mL DNS终止反应，沸水煮沸7min，立即置于冰水中冷却。向上述反应体系中加入蒸馏水定容到15mL，混匀。
(3)测量：在540nm下测量其吸光值并计算酶活力。
实施例1环糊精葡萄糖基转移酶突变体的制备
基于酶与底物相互作用分析，设计底物结合区域的突变体A133V(氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码突变体A133V的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)和S74P(氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码突变体S74P的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)，期望减弱酶与水分子的结合，强化与糖分子的结合，提升转苷活性与水解活性的比例。
根据编码氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的基因序列，设计并合成引入A133V和S74P突变的引物(见表1)，对环糊精葡萄糖基转移酶进行定点突变，测定DNA编码序列，鉴别出第133位的Ala密码子变成Val密码子，或第74位的Ser密码子变成Pro密码子。将突变体基因置于适当的表达载体并导入枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或短小芽孢杆菌中进行表达，得到单突变环糊精葡萄糖基转移酶。
表1引入突变的定点突变引物
A133V正向引物 GATTATCGACTTT<u>GTA</u>CCGAACCACACCTC
A133V反向引物 GAGGTGTGGTTCGG<u>TAC</u>AAAGTCGATAATC
S74P正向引物 ACTGCGATTTGGATCCCTCAGCCGGTTGAGAAC
S74P反向引物 GTTCTCAACCGGCTGAGGGATCCAAATCGCAGT
实施例2构建重组表达载体
以表达载体cgt/pET20b(+)(构建方法已公开于专利CN104531629B中)为模板，利用快速PCR技术引入突变位点。
PCR反应体系均为：5×PS buffer 10μL，dNTPs Mix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，Primerstar HS(5U/μL)0.5μL，加入双蒸水至50μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后30个循环(98℃10s，55℃5s，72℃8min)；72℃继续延伸10min。
PCR产物经DpnⅠ消化，转化大肠杆菌JM109感受态，感受态细胞在LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)培养过夜后，挑克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，所有突变质粒均测序正确，得到重组菌BL21(DE3)/pET20b(+)/cgt-A133V、BL21(DE3)/pET20b(+)/cgt-S74P。
利用类似的方法，以pHYα/βCGTd4-sp1-βN(构建方法公开于专利CN108384741A中)为模板，构建突变质粒，并转入枯草芽孢杆菌WSH13(构建方法公开于专利CN108384741A中)中，得到重组菌WSH13/pHYα/βCGTd4-sp1-βN-A133V、WSH13/pHYα/βCGTd4-sp1-βN-S74P。
实施例3重组菌株的发酵
分别挑取重组菌株BL21(DE3)/pET20b(+)/cgt-A133V、BL21(DE3)/pET20b(+)/cgt-S74P于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)生长8-10h进行种子发酵，按5％接种量(V/V)将种子发酵液接种到TB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，在25℃，200rpm中培养60h后，将培养液于4℃、8000rpm离心10min除菌体，收集离心后的上清液得到粗酶液。以类似的方法进行重组菌WSH13/pHYα/βCGTd4-sp1-βN-A133V、WSH13/pHYα/βCGTd4-sp1-βN-S74P的发酵培养。
测定突变体A133V、S74P转苷与水解酶活(见表1)，转苷活性/水解活性比值提高为野生型的2.5-2.6倍。而突变体S74P的转苷活性/水解活性比值与野生型酶接近，未发生明显变化。
表1环糊精葡萄糖转移酶突变体的酶活
Figure BDA0002274996210000051
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种降低水解副反应程度的环糊精葡萄糖基转移酶突变体
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 680
<212> PRT
<213> Geobacillus stearothermophilus
<400> 1
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gaaatcgaca actaccgtcc ggtgttcacc tttggcgaat ggtttctgtc tgaaaacgaa 780
gttgatgcga acaaccacta tttcgcaaac gagtctggca tgagcctgct ggatttccgt 840
tttggtcaga aactgcgtca ggttctgcgc aacaactctg acaactggta cggttttaac 900
cagatgatcc aggacaccgc atctgcgtac gatgaagttc tggatcaggt gaccttcatt 960
gataaccatg acatggatcg ttttatgatt gatggtggcg acccgcgtaa ggttgatatg 1020
gctctggcgg tgctgctgac ctctcgtggt gttccgaaca tctattatgg tactgaacag 1080
tacatgaccg gtaacggcga tccgaacaac cgtaaaatga tgtcttcttt caacaaaaac 1140
acccgtgcgt atcaggttat tcagaaactg tcctctctgc gtcgtaacaa cccggctctg 1200
gcgtatggtg acaccgaaca gcgttggatc aacggtgatg tgtacgtgta cgagcgtcag 1260
ttcggtaagg atgttgtgct ggtggcggtg aaccgtagct cttcctctaa ctattctatc 1320
accggtctgt ttaccgcgct gccggctggc acctacaccg atcagctggg cggtctgctg 1380
gacggtaaca ccattcaggt tggctctaac ggttctgtta acgctttcga cctgggtccg 1440
ggtgaagttg gtgtttgggc gtactctgcg accgagtcta ctccgattat cggccacgtt 1500
ggcccgatga tgggtcaggt gggtcatcag gtgaccatcg acggtgaagg ttttggcact 1560
aacactggta ccgtgaaatt cggtactact gcagcgaacg ttgtttcctg gagcaacaac 1620
cagatcgtgg ttgctgttcc gaacgtgtct ccgggtaaat ataacattac cgttcagtcc 1680
tctagcggtc agacctctgc ggcttacgac aactttgagg tgctgaccaa cgatcaggtt 1740
tccgtgcgct ttgttgtgaa caacgcgact actaacctgg gccagaacat ttacatcgtg 1800
ggtaacgttt atgaactggg caactgggac acctccaagg cgattggtcc gatgttcaac 1860
caggtggttt attcttaccc gacttggtat atcgatgttt ctgtgccgga gggtaaaact 1920
atcgagttta aattcatcaa aaaagactct cagggcaacg tgacttggga aagcggttcc 1980
aaccatgttt atactacccc gaccaacact accggcaaaa ttatcgttga ctggcagaac 2040
taa 2043
<210> 4
<211> 680
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 4
Ala Gly Asn Leu Asn Lys Val Asn Phe Thr Ser Asp Val Val Tyr Gln
1 5 10 15
Ile Val Val Asp Arg Phe Val Asp Gly Asn Thr Ser Asn Asn Pro Ser
20 25 30
Gly Ala Leu Phe Ser Ser Gly Cys Thr Asn Leu Arg Lys Tyr Cys Gly
35 40 45
Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr
50 55 60
Asp Met Gly Val Thr Ala Ile Trp Ile Pro Gln Pro Val Glu Asn Val
65 70 75 80
Phe Ser Val Met Asn Asp Ala Ser Gly Ser Ala Ser Tyr His Gly Tyr
85 90 95
Trp Ala Arg Asp Phe Lys Lys Pro Asn Pro Phe Phe Gly Thr Leu Ser
100 105 110
Asp Phe Gln Arg Leu Val Asp Ala Ala His Ala Lys Gly Ile Lys Val
115 120 125
Ile Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala Ser Glu Thr Asn
130 135 140
Pro Ser Tyr Met Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn Gly Thr Leu Leu
145 150 155 160
Gly Gly Tyr Thr Asn Asp Ala Asn Met Tyr Phe His His Asn Gly Gly
165 170 175
Thr Thr Phe Ser Ser Leu Glu Asp Gly Ile Tyr Arg Asn Leu Phe Asp
180 185 190
Leu Ala Asp Leu Asn His Gln Asn Pro Val Ile Asp Arg Tyr Leu Lys
195 200 205
Asp Ala Val Lys Met Trp Ile Asp Met Gly Ile Asp Gly Ile Arg Met
210 215 220
Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys Ser Leu Met Asp
225 230 235 240
Glu Ile Asp Asn Tyr Arg Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu
245 250 255
Ser Glu Asn Glu Val Asp Ala Asn Asn His Tyr Phe Ala Asn Glu Ser
260 265 270
Gly Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Gly Gln Lys Leu Arg Gln Val
275 280 285
Leu Arg Asn Asn Ser Asp Asn Trp Tyr Gly Phe Asn Gln Met Ile Gln
290 295 300
Asp Thr Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Val Leu Asp Gln Val Thr Phe Ile
305 310 315 320
Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Met Ile Asp Gly Gly Asp Pro Arg
325 330 335
Lys Val Asp Met Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val Pro
340 345 350
Asn Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp Pro
355 360 365
Asn Asn Arg Lys Met Met Ser Ser Phe Asn Lys Asn Thr Arg Ala Tyr
370 375 380
Gln Val Ile Gln Lys Leu Ser Ser Leu Arg Arg Asn Asn Pro Ala Leu
385 390 395 400
Ala Tyr Gly Asp Thr Glu Gln Arg Trp Ile Asn Gly Asp Val Tyr Val
405 410 415
Tyr Glu Arg Gln Phe Gly Lys Asp Val Val Leu Val Ala Val Asn Arg
420 425 430
Ser Ser Ser Ser Asn Tyr Ser Ile Thr Gly Leu Phe Thr Ala Leu Pro
435 440 445
Ala Gly Thr Tyr Thr Asp Gln Leu Gly Gly Leu Leu Asp Gly Asn Thr
450 455 460
Ile Gln Val Gly Ser Asn Gly Ser Val Asn Ala Phe Asp Leu Gly Pro
465 470 475 480
Gly Glu Val Gly Val Trp Ala Tyr Ser Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ile
485 490 495
Ile Gly His Val Gly Pro Met Met Gly Gln Val Gly His Gln Val Thr
500 505 510
Ile Asp Gly Glu Gly Phe Gly Thr Asn Thr Gly Thr Val Lys Phe Gly
515 520 525
Thr Thr Ala Ala Asn Val Val Ser Trp Ser Asn Asn Gln Ile Val Val
530 535 540
Ala Val Pro Asn Val Ser Pro Gly Lys Tyr Asn Ile Thr Val Gln Ser
545 550 555 560
Ser Ser Gly Gln Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Asn Phe Glu Val Leu Thr
565 570 575
Asn Asp Gln Val Ser Val Arg Phe Val Val Asn Asn Ala Thr Thr Asn
580 585 590
Leu Gly Gln Asn Ile Tyr Ile Val Gly Asn Val Tyr Glu Leu Gly Asn
595 600 605
Trp Asp Thr Ser Lys Ala Ile Gly Pro Met Phe Asn Gln Val Val Tyr
610 615 620
Ser Tyr Pro Thr Trp Tyr Ile Asp Val Ser Val Pro Glu Gly Lys Thr
625 630 635 640
Ile Glu Phe Lys Phe Ile Lys Lys Asp Ser Gln Gly Asn Val Thr Trp
645 650 655
Glu Ser Gly Ser Asn His Val Tyr Thr Thr Pro Thr Asn Thr Thr Gly
660 665 670
Lys Ile Ile Val Asp Trp Gln Asn
675 680
<210> 5
<211> 2043
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 5
gcgggcaacc tgaacaaagt gaactttacc tctgacgttg tttatcagat cgttgttgat 60
cgctttgttg atggtaacac ttctaacaac ccgtctggcg cactgttttc ctctggctgt 120
accaacctgc gtaaatactg cggtggtgac tggcagggca ttattaacaa gattaacgat 180
ggttacctga ccgatatggg cgttactgcg atttggatcc ctcagccggt tgagaacgtt 240
ttctctgtta tgaacgacgc atccggtagc gcatcttatc acggttattg ggcgcgtgac 300
tttaaaaagc cgaacccgtt ctttggcacc ctgagcgatt tccagcgtct ggtggatgcg 360
gcgcatgcta aaggtattaa ggtgattatc gactttgcac cgaaccacac ctctccggcg 420
agcgaaacca acccgagcta catggaaaac ggtcgtctgt atgataacgg tactctgctg 480
ggtggttaca ccaacgatgc aaacatgtat tttcatcata acggtggcac caccttctct 540
tctctggaag atggtattta ccgtaacctg ttcgacctgg cggatctgaa ccatcagaac 600
ccggttatcg atcgctatct gaaagatgcg gttaaaatgt ggatcgatat gggcattgac 660
ggtatccgta tggatgctgt taaacacatg ccgtttggtt ggcagaaatc cctgatggat 720
gaaatcgaca actaccgtcc ggtgttcacc tttggcgaat ggtttctgtc tgaaaacgaa 780
gttgatgcga acaaccacta tttcgcaaac gagtctggca tgagcctgct ggatttccgt 840
tttggtcaga aactgcgtca ggttctgcgc aacaactctg acaactggta cggttttaac 900
cagatgatcc aggacaccgc atctgcgtac gatgaagttc tggatcaggt gaccttcatt 960
gataaccatg acatggatcg ttttatgatt gatggtggcg acccgcgtaa ggttgatatg 1020
gctctggcgg tgctgctgac ctctcgtggt gttccgaaca tctattatgg tactgaacag 1080
tacatgaccg gtaacggcga tccgaacaac cgtaaaatga tgtcttcttt caacaaaaac 1140
acccgtgcgt atcaggttat tcagaaactg tcctctctgc gtcgtaacaa cccggctctg 1200
gcgtatggtg acaccgaaca gcgttggatc aacggtgatg tgtacgtgta cgagcgtcag 1260
ttcggtaagg atgttgtgct ggtggcggtg aaccgtagct cttcctctaa ctattctatc 1320
accggtctgt ttaccgcgct gccggctggc acctacaccg atcagctggg cggtctgctg 1380
gacggtaaca ccattcaggt tggctctaac ggttctgtta acgctttcga cctgggtccg 1440
ggtgaagttg gtgtttgggc gtactctgcg accgagtcta ctccgattat cggccacgtt 1500
ggcccgatga tgggtcaggt gggtcatcag gtgaccatcg acggtgaagg ttttggcact 1560
aacactggta ccgtgaaatt cggtactact gcagcgaacg ttgtttcctg gagcaacaac 1620
cagatcgtgg ttgctgttcc gaacgtgtct ccgggtaaat ataacattac cgttcagtcc 1680
tctagcggtc agacctctgc ggcttacgac aactttgagg tgctgaccaa cgatcaggtt 1740
tccgtgcgct ttgttgtgaa caacgcgact actaacctgg gccagaacat ttacatcgtg 1800
ggtaacgttt atgaactggg caactgggac acctccaagg cgattggtcc gatgttcaac 1860
caggtggttt attcttaccc gacttggtat atcgatgttt ctgtgccgga gggtaaaact 1920
atcgagttta aattcatcaa aaaagactct cagggcaacg tgacttggga aagcggttcc 1980
aaccatgttt atactacccc gaccaacact accggcaaaa ttatcgttga ctggcagaac 2040
taa 2043
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 6
gattatcgac tttgtaccga accacacctc 30
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 7
gaggtgtggt tcggtacaaa gtcgataatc 30
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
actgcgattt ggatccctca gccggttgag aac 33
<210> 9
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 9
gttctcaacc ggctgaggga tccaaatcgc agt 33

Claims (10)

1.一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.编码权利要求1所述突变体的基因。
3.携带权利要求2所述基因的载体。
4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体为pUC系列载体、pET系列载体或pGEX系列载体中的任意一种。
5.如权利要求3或4所述的载体，其特征在于，所述载体为pET20b(+)。
6.表达权利要求1所述突变体的细胞。
7.如权利要求6所述的细胞，其特征在于，所述细胞为枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或短小芽孢杆菌。
8.如权利要求6或7所述的细胞，其特征在于，所述细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
9.一种降低环糊精葡萄糖基转移酶水解活性的方法，其特征在于，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第133位的丙氨酸突变为缬氨酸。
10.权利要求1所述的突变体在食品、制药或化工领域的应用。
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