CN111534498B

CN111534498B - 歧化比活和aa-2g产量提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体

Info

Publication number: CN111534498B
Application number: CN202010466165.3A
Authority: CN
Inventors: 吴敬; 王蕾; 陶秀梅; 宿玲恰; 孔德民
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2020-05-28
Filing date: 2020-05-28
Publication date: 2022-03-25
Anticipated expiration: 2040-05-28
Also published as: CN111534498A

Abstract

本发明公开了歧化比活和AA‑2G产量提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。本发明将来源于PaenibacillusmaceransJFB05‑01的环糊精葡萄糖基转移酶进行突变，得到的突变体歧化比活性显著提高，其中，突变体Y195F/Y260F生产AA‑2G产量为22g/L，较野生酶提高46.7％，提高转化率，降低生产成本，适于工业化生产。

Description

歧化比活和AA-2G产量提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体

技术领域

本发明涉及歧化比活和AA-2G产量提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。

背景技术

维生素C(Vitamin C，VC)，又称L-抗坏血酸(L-AscorbicAcid，L-AA)，是一种水溶性维生素，在保持和促进人体健康以及动物生长方面具有重要的作用。但由于本身化学结构极不稳定，限制了应用范围。研究发现，VC糖基衍生物2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸(AA-2G)具有安全、稳定性强和在体内易降解产生L-AA等优点，能更好地为人体和动物吸收和利用，因而更具优势。

目前，AA-2G主要通过糖基转移酶生物催化生成，其中环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)是最常用的催化酶。现有技术针对环糊精葡萄糖基转移酶的基因改造和高效表达研究较多，但是实现环糊精葡萄糖基转移酶在工业化生产中仍存在很大的问题，例如酶的歧化活性较低，酶催化制备AA-2G的转化率低等。CGTase具有以分子间转糖基反应制备特定产物的优良应用性能，其受体分子具有广谱性，但针对不同受体，获得的转化率差异很大，通常以糖类分子作为天然受体分子——葡萄糖或麦芽糖等，其转化率明显高于非糖类分子，如本研究中的VC。在以麦芽糊精为糖基供体制备AA-2G的反应体系中，存在较多的葡萄糖和麦芽糖，而与VC相比，小分子糖具有做受体的优势，从而与VC竞争，导致转化率低。通过对CGTase受体底物结合亚位点进行改造，提高CGTase的歧化活性以及对VC做受体的底物特异性，从而提高AA-2G的转化率，降低酶的成本，将推动L-AA糖基衍生物相关行业的快速发展。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，本发明通过对来源于PaenibacillusmaceransJFB05-01的环糊精葡萄糖基转移酶进行改造，以获得歧化活力提高的突变体，将突变体应用于AA-2G的生产，以提高AA-2G的产量。

本发明提供一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，所述突变体是以来源于PaenibacillusmaceransJFB05-01的环糊精葡萄糖基转移酶为亲本，将亲本的第195位、260位的一个或两个位点进行突变。

在本发明的一种实施方式中，所述亲本的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于亲本，将亲本第195位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，并命名为Y195F，氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于亲本，将亲本第260位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，并命名为Y260F，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于亲本，将亲本第195位和260位的酪氨酸突变为苯丙氨酸，并命名为Y195F/Y260F，氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。

本发明提供一种编码所述突变体Y195F的基因。

本发明提供一种编码所述突变体Y260F的基因。

本发明提供一种编码所述突变体Y195F/Y260F的基因。

本发明提供一种携带编码所述突变体的基因的重组表达载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组表达载体为pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC3K或pPIC9K系列中的任意一种。

在本发明的一种实施方式中，所述pET系列载体包括pET-15或pET-19或pET-20或pET-24或pET-28或pET-32，所述Duet系列载体包括pRSFDuet-1或pACYCDuet-1，所述pGEX系列载体包括pGEX-4T-2或pGEX-6P。

本发明提供一种携带编码所述突变体的基因的微生物细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞为重组原核细胞或真核细胞；所述原核细胞为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞的构建方法为将携带编码所述突变体酶的基因的重组表达载体通过电击法或化学转化法转入宿主细胞。

本发明提供一种提高AA-2G产量的方法，所述方法为以麦芽糊精和抗坏血酸为底物，以突变体Y195F，和/或突变体Y260F，和/或突变体Y195F/Y260F为催化剂，生产AA-2G。

在本发明的一种实施方式中，所述突变体Y195F和/或突变体Y260F和/或突变体Y195F/Y260F的加酶量为2000～2500U/g麦芽糊精，在28～32℃反应20～25h。

本发明还要求保护所述突变体，或编码所述突变体Y195F的基因，或编码所述突变体Y260F的基因，或编码所述突变体Y195F/Y260F的基因，或表达载体，或微生物细胞，或提高AA-2G产量的方法在生物、化工领域制备AA-2G或其衍生产品中的应用。

本发明的有益效果：

本发明所得到的突变体Y195F、Y260F、Y195F/Y260F具有如下效果：

(1)歧化比活得到提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体，突变体Y195F、Y260F、Y195F/Y260F的歧化比活分别为257U·mg^-1、354U·mg^-1和375U·mg^-1，分别是是野生酶产量的1.9倍、2.6倍和2.8倍。

(2)利用得到的突变体做催化剂，使得的AA-2G产量得到提高，利用突变体Y195F、Y260F、Y195F/Y260F做催化剂，生产得到的AA-2G产量分别为20g/L、17g/L和22g/L，分别是是野生酶产量的1.3倍、1.1倍和1.5倍。

具体实施方式

LB培养基(g·L^-1)：胰蛋白胨10g·L^-1，酵母粉5g·L^-1，氯化钠10g·L^-1

TB培养基(g·L^-1)：胰蛋白胨12g·L^-1，酵母粉24g·L^-1，甘油5g·L^-1，KH₂PO₄2.31g·L^-1，K₂HPO₄·3H₂O 16.43g·L^-1，甘氨酸7.5g·L^-1

酶活定义：利用歧化反应测定歧化活力。一个酶活单位(U)定义为一个单位活性定义为每分钟转化1μmol EPS的酶量。

歧化活力测定步骤：

(1)预热：各取300uL的4mM 4-硝基苯基-α-D-麦芽七糖苷-4-6-O-亚乙基(EPS)和80mM麦芽糖(50mM，pH 5.5的磷酸缓冲液配制)，50℃保温10min。

(2)反应：加入0.1mL适当稀释的酶液，反应10min，加热终止反应，然后加入100μL去离子水及100μLα-葡萄糖苷酶在60℃条件下反应1h，

(3)测量：加入100μL 1M Na₂CO₃终止反应并调节pH至8.0左右显色，在401nm下测量样品的吸光度并计算酶活力。

实施例1：环糊精葡萄糖基转移酶单突突变体重组菌的制备

(1)环糊精葡萄糖基转移酶单突变

根据氨基酸序列位SEQ ID NO.2所示的环糊精葡萄糖基转移酶的核苷酸序列，设计并合成引入有Y195F和Y260F突变的引物，对环糊精葡萄糖基转移酶基因进行定点突变，分别得到在第195位和第260位进行突变的单突突变体。

利用快速PCR技术，以表达载体pET20b(+)/cgt为模板(该载体上已包含启动子和信号肽，信号肽之后为目的基因序列)，表达载体pET20b(+)/cgt的构建方法记载于李兆丰《软化类芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的表达及其产物特异性分析》(公开日2009年)的文献中。

引入Y195F突变的定点突变引物为：

正向引物：CAAGAACCTCTTCGACCTGGCGGAC，SEQ ID NO.6，

反向引物：GTCCGCCAGGTCGAAGAGGTTCTTG，SEQ ID NO.7；

引入Y260F突变的定点突变引物为：

正向引物：CGGGGAATGGTTCCTTGGCGCGGATCAAAC，SEQ ID NO.8，

反向引物：GTTTGATCCGCGCCAAGGAACCATTCCCCG，SEQ ID NO.9。

PCR反应体系均为：5×PS buffer 10μL，dNTPs Mix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA 1μL，Primerstar HS(5U/μL)0.5μL，加入双蒸水至50μL。

PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后20个循环(98℃10s，55℃5s，72℃8min)；72℃继续延伸10min。

(2)重组菌的制备

PCR产物经DpnⅠ消化(消化体系为：DpnI 0.5μL、上述反应PCR产物45μL、10×TBuffer5μL)，转化大肠杆菌JM109感受态，感受态细胞在LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)培养过夜后，挑单克隆于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中培养后提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

化学转化法具体步骤：

①将10μL同源重组产物导入100mL BL21感受态细胞；

②冰浴15-30min；

③42℃水浴热激90s，取出后迅速放入冰中静置冰浴3-5min；

④加入800μL无抗性LB培养基混匀，于37℃，200rpm培养1h；

⑤5000rpm离心2min收菌；

⑥移去上清，剩余100-200μL吹吸混匀涂布至含0.05mg/mL卡那霉素抗性平板上，37℃恒温培养12h左右。

⑦挑取单克隆于含0.05mg/mL卡那霉素抗性LB中，200rpm、37℃恒温培养12h后，送去公司测序，测序正确的即为阳性转化子。

将通过测序的重组菌分别命名为BL21(DE3)/pET20b(+)-Y195F和BL21(DE3)/pET20b(+)-Y260F。

实施例2：环糊精葡萄糖基转移酶双突变体重组菌的制备

在单突突变体Y195F的基础上，利用Y260F突变的定点突变引物，构建双突变体。具体实施方式参见实施例1，利用快速PCR技术，以重组质粒cgt/pET20b(+)为模板，重组质粒cgt/pET20b(+)的构建方法记载于李兆丰《软化类芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的表达及其产物特异性分析》(公开日2009年)的文献中。

引入Y260F突变的定点突变引物为：

正向引物：CGGGGAATGGTTCCTTGGCGCGGATCAAAC，SEQ ID NO.8，

反向引物：GTTTGATCCGCGCCAAGGAACCATTCCCCG，SEQ ID NO.9。

重组菌的制备方式参见实施例1，将通过测序的重组菌命名为BL21(DE3)/pET20b(+)-Y195F/Y260F。

实施例3：突变体重组菌发酵产酶

挑取实施例1和2得到的重组菌株于LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)生长8-10h，按5％接种量将种子发酵液接到TB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，在25℃摇床中培养60h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心10min除菌体，收集离心上清液得到粗酶液。

将含有野生型酶的大肠杆菌BL21(DE3)以相同的方法进行发酵产酶。

分别测定野生型、Y195F、Y260F、Y195F/Y260F的酶活，结果见表1，突变体Y195F的酶活较野生型略有降低，突变体Y260F、Y195F/Y260F的酶活较野生型分别提高了27.6％和20.7％。

表1环糊精葡萄糖转移酶突变体的酶活

实施例4：突变体的歧化比活力

将实施例3中发酵得到的粗酶液边搅拌边缓慢加入浓度为相对于酶液质量分数26％的硫酸铵，搅拌至硫酸铵溶解，在4℃条件下静置8-10h沉淀蛋白。混合物经离心(8000rpm，10min)收集沉淀，再用最小体积的20mM KH₂PO₄-Na₂HPO₄缓冲液(溶液A pH6.5)复溶，复溶后经过再次离心除去固形物，收集上清，4℃下将复溶液置于缓冲液A中透析24h，透析后在12000r·min^-1，4℃离心5min，收集上清酶液。将上清液经过0.22μm有机膜过滤制成上样样品。用DEAE阴离子交换柱对CGTase进行纯化。首先用缓冲液A对DEAE阴离子交换柱进行冲洗预平衡，将样品上样后，用缓冲液A洗脱两个柱体积，然后用含缓冲液A和缓冲液B(含1mol·L^-1氯化钠的缓冲液A)的混合液以1mL·min^-1的流速进行线性梯度洗脱。在波长为280nm紫外监测条件下，收集紫外吸收峰大于200m Au的洗脱液，测定酶活并进行蛋白电泳检测，并测定纯酶的歧化比活力，突变体的歧化比活与野生酶相比有所提高，Y195F、Y260F、Y195F/Y260F的歧化比活分别是野生酶的1.9倍、2.6倍和2.8倍。

表2野生酶以及突变体的歧化比活力

实施例5：突变前后热稳定性的比较

(1)半衰期t_1/2

保持蛋白浓度为10μg·mL^-1，于40℃孵育不同时间，并在冰上冷却5min后按照实例4中的酶活测定方法测剩余酶活，时间间隔设置为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10h。t_1/2的计算公式为

kd为失活常数，定义为ln[(残余酶活)/孵育时间(t)]。野生型环糊精葡萄糖基转移酶的半衰期为8h，而环糊精葡萄糖基转移酶突变体Y195F也为8h。

(2)最适温度

测定不同温度梯度(10℃，15℃，20℃，25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃，70℃)下的酶活，以酶活最高的为100％，其余酶活与之相比计算相对酶活，由此计算环糊精葡萄糖基转移酶的最适温度。

野生酶和突变体环糊精葡萄糖基转移酶的最适温度均为45℃。

实施例6：突变前后最适pH的比较

分别在45℃，pH为4.0、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0条件下测定野生型酶和突变酶的酶活，以酶活最高的为100％，其余酶活与之相比计算相对酶活，由此计算最适pH。

野生酶和突变体环糊精葡萄糖基转移酶的最适pH均为5.5。

实施例7：利用麦芽糊精制备AA-2G

在反应器中加入50g/L的L-抗坏血酸、50g/L的麦芽糊精(DE值5-7)作为底物，用20％的氢氧化钠水溶液将pH调节到5.0，加入一定量(2500U/g麦芽糊精)的实例4中获得的纯化的野生酶和突变体的酶液，在30℃，150rpm的水浴摇床中反应24小时，反应结束后加入60U葡萄糖淀粉酶，在60℃，150rpm的水浴摇床中反应24小时取样并加入同体积的三氯乙酸(10％，v/v)终止反应并沉淀蛋白，沉淀4小时后将样品12000rpm离心10min，取上清液适度稀释后用0.45μm超滤膜过滤，并进行HPLC分析。色谱条件如下：Agilent 1200HPLC色谱仪，Agilent自动进样器，LC-9A紫外检测器；流动相为20mM的稀磷酸，流速0.8mL min^-1；柱温35℃。

表3野生酶以及突变体生产AA-2G的产量

结果见表3，突变体表达获得的突变酶与野生酶相比，可以发现，突变体Y195F、Y260F、Y195F/Y260F的AA-2G产量与野生酶相比分别提高了33.3％、13.3％和46.7％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 歧化比活和AA-2G产量提高的环糊精葡萄糖基转移酶突变体

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 687

<212> PRT

<213> Paenibacillus macerans

<400> 1

Ser Pro Asp Thr Ser Val Asp Asn Lys Val Asn Phe Ser Thr Asp Val

1 5 10 15

Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Ala Asp Gly Asp Arg Thr Asn

20 25 30

Asn Pro Ala Gly Asp Ala Phe Ser Gly Asp Arg Ser Asn Leu Lys Leu

35 40 45

Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Asn Asp Gly

50 55 60

Tyr Leu Thr Gly Met Gly Val Thr Ala Leu Trp Ile Ser Gln Pro Val

65 70 75 80

Glu Asn Ile Thr Ser Val Ile Lys Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ser

85 90 95

Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Gln Thr Asn Asp Ala Phe

100 105 110

Gly Asp Phe Ala Asp Phe Gln Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His

115 120 125

Asn Ile Lys Val Val Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala

130 135 140

Asp Arg Asp Asn Pro Gly Phe Ala Glu Asn Gly Ala Leu Tyr Asp Asn

145 150 155 160

Gly Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Ser Asn Asp Thr Ala Gly Leu Phe His

165 170 175

His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asp Gly Ile Tyr Lys

180 185 190

Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Ile Asn His Asn Asn Asn Ala Met Asp

195 200 205

Ala Tyr Phe Lys Ser Ala Ile Asp Leu Trp Leu Gly Met Gly Val Asp

210 215 220

Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys

225 230 235 240

Ser Phe Val Ser Ser Ile Tyr Gly Gly Asp His Pro Val Phe Thr Phe

245 250 255

Gly Glu Trp Tyr Leu Gly Ala Asp Gln Thr Asp Gly Asp Asn Ile Lys

260 265 270

Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Asn Leu Leu Asp Phe Glu Tyr Ala Gln

275 280 285

Glu Val Arg Glu Val Phe Arg Asp Lys Thr Glu Thr Met Lys Asp Leu

290 295 300

Tyr Glu Val Leu Ala Ser Thr Glu Ser Gln Tyr Asp Tyr Ile Asn Asn

305 310 315 320

Met Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Gln Val Ala

325 330 335

Gly Ser Gly Thr Arg Ala Thr Glu Gln Ala Leu Ala Leu Thr Leu Thr

340 345 350

Ser Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr

355 360 365

Gly Asp Gly Asp Pro Asn Asn Arg Ala Met Met Thr Ser Phe Asn Thr

370 375 380

Gly Thr Thr Ala Tyr Lys Val Ile Gln Ala Leu Ala Pro Leu Arg Lys

385 390 395 400

Ser Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Thr Thr Thr Glu Arg Trp Val Asn

405 410 415

Asn Asp Val Leu Ile Ile Glu Arg Lys Phe Gly Ser Ser Ala Ala Leu

420 425 430

Val Ala Ile Asn Arg Asn Ser Ser Ala Ala Tyr Pro Ile Ser Gly Leu

435 440 445

Leu Ser Ser Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Ser Asp Val Leu Asn Gly Leu

450 455 460

Leu Asn Gly Asn Ser Ile Thr Val Gly Ser Gly Gly Ala Val Thr Asn

465 470 475 480

Phe Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala Pro

485 490 495

Glu Thr Ser Pro Ala Ile Gly Asn Val Gly Pro Thr Met Gly Gln Pro

500 505 510

Gly Asn Ile Val Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Gly Thr Ala Gly

515 520 525

Thr Val Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ser Gly Ile Val Ser

530 535 540

Trp Glu Asp Thr Gln Ile Lys Ala Val Ile Pro Lys Val Ala Ala Gly

545 550 555 560

Lys Thr Gly Val Ser Val Lys Thr Ser Ser Gly Thr Ala Ser Asn Thr

565 570 575

Phe Lys Ser Phe Asn Val Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe

580 585 590

Leu Val Asn Gln Ala Asn Thr Asn Tyr Gly Thr Asn Val Tyr Leu Val

595 600 605

Gly Asn Ala Ala Glu Leu Gly Ser Trp Asp Pro Asn Lys Ala Ile Gly

610 615 620

Pro Met Tyr Asn Gln Val Ile Ala Lys Tyr Pro Ser Trp Tyr Tyr Asp

625 630 635 640

Val Ser Val Pro Ala Gly Thr Lys Leu Asp Phe Lys Phe Ile Lys Lys

645 650 655

Gly Gly Gly Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Gly Asn His Thr Tyr Thr

660 665 670

Thr Pro Ala Ser Gly Val Gly Thr Val Thr Val Asp Trp Gln Asn

675 680 685

<210> 2

<211> 2064

<212> DNA

<213> Paenibacillus macerans

<400> 2

tcacccgata cgagcgtgga caacaaggtc aatttcagta cggacgtcat ctatcagatt 60

gtgaccgacc gcttcgcgga cggggacagg acgaacaatc cggcggggga tgcgttcagc 120

ggcgaccgat ccaatttgaa gctctatttc gggggagact ggcaggggat tatcgacaag 180

attaacgacg gttatttgac cggcatgggc gtcaccgccc tctggatatc ccagcctgtg 240

gaaaatatca cctccgtcat caagtattcc ggcgttaaca atacgtctta tcacggttac 300

tgggcgaggg attttaagca aaccaacgac gctttcgggg attttgccga ttttcaaaat 360

ctgattgata cggctcacgc tcataacatc aaggtcgtga tcgacttcgc ccccaaccac 420

acgtctccgg ccgacaggga caaccccggc ttcgccgaga acggtgcgct gtatgataac 480

ggttcgctgc tcggcgccta cagcaatgat acggccggcc ttttccatca taacgggggg 540

accgattttt ccacgattga agacggtatt tacaagaacc tctacgacct ggcggacatc 600

aaccataaca acaacgctat ggacgcttat tttaaaagcg ctatcgacct ttggctcggc 660

atgggtgtgg acgggattcg ttttgacgcg gtgaagcata tgcctttcgg ctggcaaaaa 720

agcttcgttt cctcgattta cggcggcgat catccggtat ttacgttcgg ggaatggtat 780

cttggcgcgg atcaaaccga cggagacaac attaaattcg ccaacgaaag cgggatgaac 840

ctgctggact ttgaatacgc gcaggaagtg cgcgaagtgt tccgggacaa aacggaaacg 900

atgaaggatc tctatgaggt gctggccagc acggagtcgc aatacgacta catcaacaat 960

atggtgacct tcatcgacaa ccatgatatg gaccggttcc aggttgccgg ttccggtacg 1020

cgggcgaccg agcaagcgtt ggcgctgacg ctgacttccc gcggcgtgcc agccatctac 1080

tacggcacgg agcagtacat gaccggcgat ggcgacccca acaaccgggc gatgatgacc 1140

tcgtttaata ccgggacgac ggcttataaa gtgattcagg cattggcgcc gctgcgtaaa 1200

tccaatccgg ccatcgctta tgggacgacg acagagcgct gggttaacaa cgatgtgttg 1260

attattgaac gcaaattcgg cagcagcgcc gctttggtgg cgattaatcg aaactcgtcc 1320

gccgcttatc cgatttcggg tctgttgagt tcgctgccgg cgggcactta ttcggatgta 1380

ttgaacggac tcttaaacgg caactccatt accgtgggca gcggcggcgc cgtcaccaac 1440

tttacgctgg cggccggcgg cacggcggta tggcagtaca cagcgccgga aacgtcgccg 1500

gcgatcggca atgtgggtcc caccatgggc cagccgggga atatagtgac gattgacggc 1560

cgcggctttg gcggcacggc gggcacggtt tatttcggga cgacggcggt gaccggctcc 1620

ggcatcgtaa gctgggagga cacgcagatt aaggcggtca taccgaaggt cgcggcgggc 1680

aaaacgggcg tatcggtcaa aacgtcgtcc ggcaccgcca gcaatacatt caaaagcttc 1740

aatgtactga cgggggatca ggtcacggtg cgtttcctgg tcaatcaagc caataccaat 1800

tacggaacaa atgtttatct tgtcggcaac gccgccgagc tcggctcctg ggacccgaac 1860

aaagcgattg ggccgatgta caatcaggtg atcgccaagt acccgtcctg gtattacgat 1920

gtcagcgtgc cggcggggac aaagctggat tttaaattta ttaaaaaggg cggcggtacg 1980

gtgacttggg aaggcggggg caaccatacg tacacgacgc cggccagcgg cgtagggacg 2040

gtgacggtgg actggcaaaa ttaa 2064

<210> 3

<211> 687

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

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Claims

1.一种环糊精葡萄糖基转移酶的突变体，其特征在于，所示突变体是将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶第195位和/或260位的酪氨酸突变为苯丙氨酸。

2.编码权利要求1所述突变体的基因。

3.携带权利要求2所述基因的重组表达载体。

4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述表达载体为pET系列、Duet系列、pGEX系列、pHY300、pHY300PLK、pPIC系列中的任意一种。

5.表达权利要求1所述突变体，或携带权利要求2所述基因的微生物细胞。

6.根据权利要求5所述的微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞为原核细胞或真核细胞。

7.一种提高环糊精葡萄糖基转移酶歧化比活力的方法，其特征在于，将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的环糊精葡萄糖基转移酶的第195位和260位由酪氨酸突变为苯丙氨酸。

8.一种提高2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸产量的方法，其特征在于，所述方法为以麦芽糊精和抗坏血酸为底物，以权利要求1所述环糊精葡萄糖基转移酶突变体为催化剂生产AA-2G。

9.权利要求1所述突变体，或权利要求2所述基因，或权利要求3~4所述重组表达载体，或权利要求5或6所述微生物细胞，或权利要求7或8所述方法在生物、化工领域制备2-O-α-D-吡喃葡萄糖基-L-抗坏血酸中的应用。