CN109468298B - 一种提高松二糖产量的淀粉蔗糖酶突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高松二糖产量的淀粉蔗糖酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。该淀粉蔗糖酶突变体D447V是通过将来源于Deinococcus Geothermalis的淀粉蔗糖酶第447位天冬氨酸突变为缬氨酸得到的。将淀粉蔗糖酶突变体D447V应用于松二糖的生产，在pH 7.0、35℃的反应条件下，松二糖的产量为57.01g/L，是野生酶产量的1.8倍。因此，本发明的淀粉蔗糖酶突变体能够应用于松二糖的制备中，提高松二糖的转化率。

Description

一种提高松二糖产量的淀粉蔗糖酶突变体
技术领域
本发明涉及一种提高松二糖产量的淀粉蔗糖酶突变体，属于基因工程和酶工程领域。
背景技术
松二糖是一种天然存在于蜂蜜中的还原性二糖，由一分子葡萄糖和一分子果糖以α-1,3糖苷键连接形成，是蔗糖的同分异构体，甜度为蔗糖的一半。松二糖具有容易结晶、高度可溶、水解速率慢，不会被致龋微生物发酵等特点，适合肥胖症、高血脂、高血压、糖尿病等人群食用。在食品工业中具有广阔的应用前景，具有代替蔗糖成为新型功能性甜味剂的潜力。此外，松二糖还可以广泛应用于医药、化妆品等领域，是一种高附加值的产品。
关于利用酶制备松二糖的方法，目前仅有两种报道。一种方法是以α-环糊精和果糖的混合物为底物，利用环糊精葡萄糖基转移酶合成松二糖。另一种方法是以蔗糖为底物，利用淀粉蔗糖酶直接将蔗糖异构化为松二糖。与环糊精葡萄糖基转移酶利用α-环糊精与果糖为底物且需糖化酶处理来制备松二糖相比，淀粉蔗糖酶仅需蔗糖底物，成本较低、工艺简洁，转化率更高。
淀粉蔗糖酶属于α-淀粉酶家族(GH13)，以蔗糖为天然底物，水解作用较弱，主要催化聚合和异构这两大转苷反应，而这两大转苷反应的发生依赖于蔗糖浓度。当蔗糖浓度较高时淀粉蔗糖酶以异构反应为主，主要产物为松二糖；当蔗糖浓度较低时淀粉蔗糖酶则以聚合反应为主，生成大量不溶性的α-1,4糖苷链及可溶性的麦芽低聚糖。因此，在松二糖的制备过程中，尽管淀粉蔗糖酶催化聚合反应在一定程度上会被高浓度的蔗糖所抑制，但反应至一定程度时蔗糖浓度会减少，聚合反应的发生还是会影响松二糖的最终产率。因此，获得一种聚合活性减弱的淀粉蔗糖酶突变体对于提高松二糖的转化率具有重要的工业应用潜力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种催化异构化反应能力提升的淀粉蔗糖酶的突变体。
本发明提供了一种淀粉蔗糖酶突变体，将来源于Deinococcus Geothermalis的淀粉蔗糖酶第447位氨基酸进行突变。
在本发明的一种实施方式中，所述来源于Deinococcus Geothermalis的淀粉蔗糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
在本发明的一种实施方式中，所述突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ IDNO.1的淀粉蔗糖酶第447位氨基酸由天冬氨酸(Asp)突变为缬氨酸(Val)得到的，命名为D447V。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种制备淀粉蔗糖酶突变体的方法，包括如下步骤：
(1)在淀粉蔗糖酶氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点突变的突变引物，以携带淀粉蔗糖酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；
(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；
(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，制备酶液。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉蔗糖酶的出发氨基酸序列如SEQ ID NO.1所述。
在本发明的一种实施方式中，所述淀粉蔗糖酶的来源为中度嗜热菌(DeinococcusGeothermalis)。
在本发明的一种实施方式中，所述质粒载体为pUC系列，pET系列，或pGEX中的任意一种。
在本发明的一种实施方式中，所述宿主细胞为细菌或真菌细胞。
在本发明的一种实施方式中，所述的细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种制备松二糖的方法，所述方法是以蔗糖为底物，以蔗糖淀粉酶突变体为催化剂进行转化；所述蔗糖酶突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQ ID NO.1的淀粉蔗糖酶第447位氨基酸由天冬氨酸突变为缬氨酸得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述转化是在30～40℃的条件下进行45～50h。
所述淀粉蔗糖酶突变体在制备含松二糖的产品方面的应用。
本发明的有益效果：
本发明构建了一种提高松二糖产量的淀粉蔗糖酶突变体，该淀粉蔗糖酶突变体D447V是通过将来源于Deinococcus Geothermalis的淀粉蔗糖酶第447位天冬氨酸突变为缬氨酸得到的。将淀粉蔗糖酶突变体D447V应用于松二糖的生产，在pH 7.0、35℃的反应条件下，松二糖的产量为57.01g/L，是野生酶产量的1.8倍。因此，本发明的淀粉蔗糖酶突变体能够应用于松二糖的制备中，提高松二糖的转化率。
附图说明
图1：蔗糖淀粉酶突变体D447V和野生酶的纯化蛋白电泳检测图。
图2(A)：不同温度下的野生酶和淀粉蔗糖酶突变体的酶活。
图2(B)：45℃的条件下野生酶和淀粉蔗糖酶突变体酶活的温度稳定性。
图2(C)：不同pH下的野生酶和淀粉蔗糖酶突变体的酶活。
图2(D)：45℃的条件下野生酶和淀粉蔗糖酶突变体酶活的pH稳定性。
具体实施方式
LB培养基(g·L-1)：胰蛋白胨10g·L-1，酵母粉5g·L-1，氯化钠10g·L-1。
LB固体培养基：胰蛋白胨10g·L-1，酵母粉5g·L-1，氯化钠10g·L-1，琼脂粉20g·L-1。
LB液体培养基：胰蛋白胨10g·L-1，酵母粉5g·L-1，氯化钠10g·L-1。
TB培养基：胰蛋白胨12g·L-1，酵母粉24g·L-1，甘油5g·L-1，KH2PO4 2.31g·L-1，K2HPO4·3H2O 16.43g·L-1。
PBS缓冲液：氯化钠8.18g·L-1，氯化钾0.2g·L-1，磷酸氢二钠1.42g·L-1，磷酸二氢钾0.25g·L-1，用2mol/L盐酸将pH调节至7.4。
淀粉蔗糖酶的酶活定义：一个酶活单位(U)定义为每分钟催化产生相当于1μmol果糖所需的酶量。
淀粉蔗糖酶的酶活测定方法：采用3,5-二硝基水杨酸法(DNS)与还原糖显色的方法测定酶活。
(1)预热：取1.9mL预先配置好的0.3M蔗糖溶液(50mM，pH 7.0的Tris-HCl缓冲液配制)，35℃保温10min；
(2)反应：加入0.1mL酶液，反应30min，加入3mL DNS终止反应，沸水浴7min后迅速冰浴冷却，最后向上述反应体系中加入10mL蒸馏水，震荡混匀；
(3)测量：在540nm处测定吸光值并计算酶活力。
实施例1：重组菌的构建
根据NCBI上淀粉蔗糖酶dgas的氨基酸序列(PDB ID：3UER)，采用化学合成法合成编码淀粉蔗糖酶的dgas基因。用于构建重组大肠杆菌的质粒是pET24a(+)，带有T7启动子。将pET24a(+)质粒和dgas基因分别用Nde I和Hind III双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶连接，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，得到重组细胞。将重组细胞经37℃培养8h，挑转化子在LB液体培养基(含30mg/L卡纳霉素)中震荡培养，提取质粒，酶切验证后得到表达质粒dgas/pET24a(+)。
将质粒dgas/pET24a(+)转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，涂布LB平板(含30mg/L卡纳霉素)，37℃培养8h，得到的重组菌命名为E.coli J BL21(DE3)/dgas/pET24a(+)。挑单菌落到LB液体培养基(含30mg/L卡纳霉素)中，37℃培养过夜，保存于甘油管中。
实施例2：淀粉蔗糖酶突变体的制备
根据实施例1中化学合成法合成的淀粉蔗糖酶的dgas基因序列，设计并合成引入D447V突变的引物，对淀粉蔗糖酶dgas基因进行定点突变，测定突变后的DNA序列，鉴别出原先编码第447位的Asp的密码子变成编码Val的密码子。将携带突变后的编码淀粉蔗糖酶的基因的表达载体导入枯草芽孢杆菌、大肠杆菌或短小芽孢杆菌中进行表达，得到单突变淀粉蔗糖酶。
单突变D447V的定点突变；利用快速PCR技术，以携带野生型淀粉蔗糖酶的基因的表达载体dgas/pET24a(+)为模板。引入D447V突变的引物为：
核苷酸序列为SEQ ID NO.2的正向引物：
5’-CCGGTTAATGGTGTTCGCCGTATTAGCG-3’(下划线为突变碱基)
核苷酸序列为SEQ ID NO.3的反向引物：
5’-CGCTAATACGGCGAACACCATTAACCGG-3’(下划线为突变碱基)
PCR反应体系均为：5×PS buffer 10μL，dNTPs Mix(2.5mM)4μL，正向引物(10μM)1μL，反向引物(10μM)1μL，模板DNA1μL，PrimerStar HS(5U/μL)0.5μL，加入双蒸水至50μL。
PCR扩增条件为：94℃预变性4min；随后20个循环(98℃10s，55℃30s，72℃8min)；72℃继续延伸10min。
PCR产物经DpnⅠ消化，转化大肠杆菌JM109感受态，感受态细胞在LB固体培养基(含30μg/mL卡纳霉素)培养过夜后，挑克隆于LB液体培养基(含30μg/mL卡纳霉素)中培养后提取质粒，所有突变质粒均测序正确，得到的重组菌命名为E.coli JM109/dgas/pET24a(+)(D447V)。
测序正确的突变体，从甘油管接种至LB培养基，过夜培养，提取质粒，将突变质粒转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，突变质粒均测序正确，得到的重组菌命名为E.coli J BL21(DE3)/dgas/pET24a(+)-D447V。
实施例3：淀粉蔗糖酶突变体的发酵
挑取重组菌E.coli J BL21(DE3)/dgas/pET24a(+)-D447V于LB液体培养基(含30μg/mL卡纳霉素)生长8-10h，按5％接种量将种子发酵液接到TB培养基(含30μg/mL卡纳霉素)中，在37℃摇床中培养OD600至0.2后，加入0.4mM异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行诱导，在于25℃下发酵24h后，将发酵液于4℃、8000rpm离心10min弃去上清，收集菌体至30OD，并用pH7.4PBS缓冲液复溶后进行高压匀浆破壁，8000rpm离心10min后收集上清液得到突变体粗酶液。
采用同样方法，以实施例1中的重组菌E.coli J BL21(DE3)/dgas/pET24a(+)发酵得到的破壁酶液为野生酶粗酶液。
实施例4：蔗糖淀粉酶突变体的纯化
将实施例3中获得的突变体粗酶液或野生酶粗酶液边搅拌边缓慢加入浓度为相对于酶液质量分数35％的硫酸铵，搅拌至硫酸铵溶解，在4℃条件下静置8-10h沉淀蛋白，然后经离心(8000rpm，10min)收集沉淀，再用最小体积的20mM、pH7.5Tris-HCl缓冲液(A液)复溶，复溶后经过再次离心除去固形物，收集上清，4℃下将复溶液置于A液中透析24h，透析后在12000rpm，4℃离心5min，收集上清液。将上清液经过0.22μm有机膜过滤制成上样样品。采用AKTA avant系统及阴离子交换色谱进行纯化：用5倍柱体积的A液平衡阴离子交换色谱柱Mono Q 10/100GL，以1mL/min的流速上样，用B液(含有1mol/L NaCl的A液)以1mL/min的流速进行线性洗脱，以280nm紫外在线监测，分管收集含有不同纯度的酶液。使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定酶蛋白的表达水平，检测结果如图1所示。
实施例5：酶学性质测定
(1)最适温度及温度稳定性
以0.3M蔗糖为底物(pH 7.0)，在30-55℃范围内每间隔5℃测定野生酶或淀粉蔗糖酶突变体的酶活，定义最高酶活力为100％，计算各个温度下的相对酶活，以确定酶的最适温度，如图2(A)所示。
测定酶的温度稳定性，于45℃下每间隔5h取样测定酶的残留酶活(定义初始酶活力为100％)，结果如图2(B)所示。
(2)最适pH及pH稳定性
用50mM磷酸二氢钾-磷酸氢二钠(pH5.0-8.0)及50mM Tris-HCl(pH7.0-10.0)的缓冲液配制0.3M蔗糖溶液，在45℃条件下，pH5.0-10.0范围内每间隔0.5或1个pH测定野生酶或淀粉蔗糖酶突变体的酶活，定义最高酶活力为100％，计算其它各pH条件下野生酶或淀粉蔗糖酶突变体的酶活的相对酶活，以确定最适pH，结果如2(C)所示。将野生酶或淀粉蔗糖酶突变体的酶活在上述pH缓冲液中于45℃放置30min后测定残留酶活(初始酶活为100％)，考察酶的pH稳定性，结果如2(D)。
与野生酶相比，突变体的酶学性质并无变化，两者的最适温度均为45℃，45℃下的半衰期为均为20h；最适pH均为7.0，在6.0-8.0范围内相对酶活均在90％以上。
实施例6：HPLC检测松二糖的产量
在10mL的反应器中，加入2g蔗糖和2mL从实施例3中获得的突变体粗酶液或野生酶粗酶液，反应温度35℃，初始pH7.0，150rpm的水浴摇床中反应48小时，待反应结束后，煮沸10min使酶失活，12000rpm离心10min，收集上清，用50％(v/v)乙腈溶液稀释至4倍，并用0.22μm的滤头过滤，所得滤液作为样品通过HPLC色谱来测定松二糖的含量。
HPLC色谱分析检测的条件：Agilent 1200HPLC色谱仪，Agilent示差检测器，色谱柱4.6mm×250mm 5μm Syncronis Amino Column，流动相为80％(v/v)的乙腈溶液，流速0.8mL/min，柱温35℃。
结果见表1，蔗糖淀粉酶突变体的松二糖产量为57.03g/L，与野生酶相比，单突变体D447V的松二糖产量提高了80.5％。
表1野生酶以及突变体生产松二糖的产量
酶 松二糖产量(g/L)
野生酶 31.59
D447V 57.03
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学(如皋)食品生物技术研究所
江南大学
<120> 一种提高松二糖产量的淀粉蔗糖酶突变体
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 650
<212> PRT
<213> Deinococcus Geothermalis
<400> 1
Met Leu Lys Asp Val Leu Thr Ser Glu Leu Ala Ala Gln Val Arg Asp
1 5 10 15
Ala Phe Asp Asp Asp Arg Asp Ala Glu Thr Phe Leu Leu Arg Leu Glu
20 25 30
Arg Tyr Gly Glu Asp Leu Trp Glu Ser Leu Arg Ala Val Tyr Gly Asp
35 40 45
Gln Val Arg Ala Leu Pro Gly Arg Leu Leu Glu Val Met Leu His Ala
50 55 60
Tyr His Ala Arg Pro Ala Glu Leu Arg Arg Leu Asp Glu Ala Arg Leu
65 70 75 80
Leu Arg Pro Asp Trp Leu Gln Arg Pro Glu Met Val Gly Tyr Val Ala
85 90 95
Tyr Thr Asp Arg Phe Ala Gly Thr Leu Lys Gly Val Glu Glu Arg Leu
100 105 110
Asp Tyr Leu Glu Gly Leu Gly Val Lys Tyr Leu His Leu Met Pro Leu
115 120 125
Leu Arg Pro Arg Glu Gly Glu Asn Asp Gly Gly Tyr Ala Val Gln Asp
130 135 140
Tyr Arg Ala Val Arg Pro Asp Leu Gly Thr Met Asp Asp Leu Ser Ala
145 150 155 160
Leu Ala Arg Ala Leu Arg Gly Arg Gly Ile Ser Leu Val Leu Asp Leu
165 170 175
Val Leu Asn His Val Ala Arg Glu His Ala Trp Ala Gln Lys Ala Arg
180 185 190
Ala Gly Asp Pro Lys Tyr Arg Ala Tyr Phe His Leu Phe Pro Asp Arg
195 200 205
Arg Gly Pro Asp Ala Phe Glu Ala Thr Leu Pro Glu Ile Phe Pro Asp
210 215 220
Phe Ala Pro Gly Asn Phe Ser Trp Asp Glu Glu Ile Gly Glu Gly Glu
225 230 235 240
Gly Gly Trp Val Trp Thr Thr Phe Asn Ser Tyr Gln Trp Asp Leu Asn
245 250 255
Trp Ala Asn Pro Asp Val Phe Leu Glu Phe Val Asp Ile Ile Leu Tyr
260 265 270
Leu Ala Asn Arg Gly Val Glu Val Phe Arg Leu Asp Ala Ile Ala Phe
275 280 285
Ile Trp Lys Arg Leu Gly Thr Asp Cys Gln Asn Gln Pro Glu Val His
290 295 300
His Leu Thr Arg Ala Leu Arg Ala Ala Ala Arg Ile Val Ala Pro Ala
305 310 315 320
Val Ala Phe Lys Ala Glu Ala Ile Val Ala Pro Ala Asp Leu Ile His
325 330 335
Tyr Leu Gly Thr Arg Ala His His Gly Lys Val Ser Asp Met Ala Tyr
340 345 350
His Asn Ser Leu Met Val Gln Leu Trp Ser Ser Leu Ala Ser Arg Asn
355 360 365
Thr Arg Leu Phe Glu Glu Ala Leu Arg Ala Phe Pro Pro Lys Pro Thr
370 375 380
Ser Thr Thr Trp Gly Leu Tyr Val Arg Cys His Asp Asp Ile Gly Trp
385 390 395 400
Ala Ile Ser Asp Glu Asp Ala Ala Arg Ala Gly Leu Asn Gly Ala Ala
405 410 415
His Arg His Phe Leu Ser Asp Phe Tyr Ser Gly Gln Phe Pro Gly Ser
420 425 430
Phe Ala Arg Gly Leu Val Phe Gln Tyr Asn Pro Val Asn Gly Asp Arg
435 440 445
Arg Ile Ser Gly Ser Ala Ala Ser Leu Ala Gly Leu Glu Ala Ala Leu
450 455 460
Glu Thr Gly Asp Pro Gly Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Arg Leu Leu
465 470 475 480
Leu Leu His Thr Val Ile Leu Gly Phe Gly Gly Val Pro Leu Leu Tyr
485 490 495
Met Gly Asp Glu Leu Ala Leu Leu Asn Asp Tyr Ala Phe Glu Asp Val
500 505 510
Pro Glu His Ala Pro Asp Asn Arg Trp Val His Arg Pro Gln Met Asp
515 520 525
Trp Ala Leu Ala Glu Arg Val Arg Gln Glu Pro Ser Ser Pro Ala Gly
530 535 540
Arg Val Asn Thr Gly Leu Arg His Leu Leu Arg Val Arg Arg Asp Thr
545 550 555 560
Pro Gln Leu His Ala Ser Ile Glu Ser Gln Val Leu Pro Ser Pro Asp
565 570 575
Ser Arg Ala Leu Leu Leu Arg Arg Asp His Pro Leu Gly Gly Met Val
580 585 590
Gln Val Tyr Asn Phe Ser Glu Glu Thr Val Met Leu Pro Ser His Val
595 600 605
Leu Arg Asp Val Leu Gly Asp His Val Gln Asp Arg Leu Ser Gly Ser
610 615 620
Ala Phe Arg Leu Asp Arg Pro Thr Val Arg Leu Glu Gly Tyr Arg Ala
625 630 635 640
Leu Trp Leu Thr Ala Gly Glu Ala Pro Ala
645 650
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
ccggttaatg gtgttcgccg tattagcg 28
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
cgctaatacg gcgaacacca ttaaccgg 28

Claims (8)

1.一种淀粉蔗糖酶突变体，其特征在于，所述突变体是通过将出发氨基酸序列为SEQID NO.1的淀粉蔗糖酶第447位氨基酸由天冬氨酸突变为缬氨酸得到的，命名为D447V。
2.一种制备权利要求1所述淀粉蔗糖酶突变体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)根据确定的突变位点，设计定点突变的突变引物，以携带淀粉蔗糖酶基因的载体为模板进行定点突变；构建含编码突变体的基因的质粒载体；
(2)将突变体质粒转化进宿主细胞；
(3)挑选阳性克隆进行发酵培养，收集菌体破壁后的上清液即为淀粉蔗糖酶突变体的粗酶液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述质粒载体为pUC系列，pET系列，或pGEX中的任意一种.
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为细菌或真菌细胞；所述的细菌为革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。
5.一种生产松二糖的方法，其特征在于，所述方法是以蔗糖为底物，以权利要求1所述的一种淀粉蔗糖酶突变体为催化剂，将蔗糖转化为松二糖。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述蔗糖的浓度为180～220g/L，所述淀粉蔗糖酶突变体的浓度为0.2～0.5U/mL。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述转化是在30～40℃条件下进行45～50h。
8.权利要求1所述的一种淀粉蔗糖酶突变体在制备含松二糖的产品方面的应用。
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