CN113699131A

CN113699131A - 一种α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN113699131A
Application number: CN202111008555.7A
Authority: CN
Inventors: 楼志华; 徐俭; 刘翔
Original assignee: Jiangsu Ogo Biotech Co ltd
Current assignee: Jiangsu Ogo Biotech Co ltd
Priority date: 2021-08-31
Filing date: 2021-08-31
Publication date: 2021-11-26
Anticipated expiration: 2041-08-31
Also published as: CN113699131B

Abstract

本发明公开了一种α‑环糊精葡萄糖基转移酶突变体。本发明通过对野生型α‑环糊精葡萄糖基转移酶进行突变，得到所述α‑环糊精葡萄糖基转移酶突变体，与野生型α‑环糊精葡萄糖基转移酶相比，具有更高的热稳定性，可以在更宽的温度范围内保持较高的活性，且储存稳定性也得到明显提高。本发明所述α‑环糊精葡萄糖基转移酶突变体可以在70‑80℃温度下，保持高稳定性，用于转化淀粉底物制备α‑环糊精，反应过程中无需二次加酶，仍能实现高转化率。

Description

一种α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及酶工程和和微生物工程技术领域，具体涉及一种α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用。

背景技术

环糊精是淀粉在环糊精葡萄糖基转移酶作用下生成的一系列环状低聚糖的总称。常见的环糊精有α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精，它们分别是由6、7、8个葡萄糖单元组成的环状分子。环糊精具有亲水的外缘和疏水的内腔，能够包埋其它分子，起到促溶、稳定、缓释、乳化和分散等多种作用。其中，α-环糊精(阿尔法环糊精)为环状麦芽六糖，内腔尺寸小，且在水中溶解度高，更适合于包埋小分子，以及要求溶解度较高的应用场合。国际食品添加剂专家委员会(JECFA)安全性评价认为α-环糊精安全性高，没有使用量的限制。α-环糊精在医药、食品、化工等工业领域中都有着广泛的应用。

目前，α-环糊精的生产一般采用以下技术路线：

淀粉底物先用水悬浮得到淀粉悬液，并调节pH至7.0-8.0之间，加热升温至70-80℃糊化后，加入适量的软化类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)α-环糊精葡萄糖基转移酶(简称α-CGT酶)，在70-80℃温度下进行液化；液化后降温至40-50℃再补充适量的α-CGT酶进行环化反应，环化反应过程中可以加入癸醇等试剂选择性沉淀生成的α-环糊精；最后，过滤收集α-环糊精沉淀物，蒸馏除去癸醇等试剂，再经过活性炭脱色、浓缩结晶得到α-环糊精粗品，在经过精制得到α-环糊精。

然而，上述工艺主要存在以下问题：

首先，由于α-环糊精生产中所用α-环糊精葡萄糖基转移酶热稳定性较低，需要分两次添加酶液分别进行液化和环化。具体为淀粉糊化液中先添加一次α-环糊精葡萄糖基转移酶，在70-80℃温度下进行液化，然后降温至40-50℃再二次补充α-环糊精葡萄糖基转移酶进行环化反应。由于α-环糊精葡萄糖基转移酶热稳定性低，而液化过程中温度较高，导致液化反应后α-环糊精葡萄糖基转移酶几乎完全失活，液化后降温至40-50℃后，如果不添加酶液，后续环化反应难以进行。目前的生产工艺中，需要在降温后二次添加酶液，导致酶液用量大，成本高；此外，二次加酶的同时也会引入更多的杂质，导致转化体系的颜色加深，增加后续工序的脱色及纯化难度。

其次，α-环糊精葡萄糖基转移酶储存稳定性实验结果显示，酶液在室温(25-30℃)条件下放置3个月后，酶活完全丧失。因此，酶液在储存过程中需要加入较多的甘油、明胶等保护剂，并且将酶液置于冷库中保存，才能提高该酶的储存稳定性。但是，保护剂的加入和低温保存，会增加酶液的储存成本；同时，加入大量保护剂的酶液在使用过程中，加酶的同时会把保护剂(甘油、明胶等)带入酶反应体系，导致反应体系中杂质增加，后续纯化难度加大，生产成本增高。

上述缺陷均使得现有的α-环糊精葡萄糖基转移酶无法很好的用于α-环糊精的工业化生产。因此，亟需找到一种高热稳定性的α-环糊精葡萄糖基转移酶。

发明内容

为解决现有技术的问题，本发明提供一种高热稳定性的α-环糊精葡萄糖基转移酶。

为达此目的，本发明第一提供一种α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体，是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型α-环糊精葡萄糖基转移酶的第298位、第447位、第474位、第498位、第659位、第430位、第451位氨基酸中的一个或多个位点进行突变得到。

进一步优选的，所述突变体为以下a-e中任一或多个组合：

a.将野生型α-环糊精葡萄糖基转移酶的第298位的苏氨酸突变为半胱氨酸，将突变体命名为T298C；

b.将野生型α-环糊精葡萄糖基转移酶的第447位的甘氨酸突变成谷氨酸或丙氨酸，将突变体分别命名为G447E、G447A；

c.将野生型α-环糊精葡萄糖基转移酶的第474位的丝氨酸突变成天冬氨酸，将突变体命名为S474D；

d.将野生型α-环糊精葡萄糖基转移酶的第498苏氨酸突变为丝氨酸，将突变体命名为T498S；

e.将野生型α-环糊精葡萄糖基转移酶的第659位的甘氨酸突变成精氨酸或谷氨酸，将突变体命名为G659R、G659E；

f.将野生型α-环糊精葡萄糖基转移酶的第430位的丙氨酸和第451位的丝氨酸突变成半胱氨酸，将突变体命名为A430C/S451C。

作为本发明的优选方案，所述α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体是将野生型α-环糊精葡萄糖基转移酶的第447位的甘氨酸突变成谷氨酸、将第474位的丝氨酸突变成天冬氨酸、将第659位的甘氨酸突变成精氨酸、同时将第430位的丙氨酸突变成半胱氨酸与第451位的丝氨酸突变成半胱氨酸得到的。在本发明中，将上述方案得到的α-环糊精葡萄糖基转移酶叠加突变体命名为G447E/S474D/G659R/A430C/S451C。

进一步优选的，所述α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体具有如SEQ ID No:2所示的氨基酸序列。

本发明第二提供所述α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因序列，其具有如SEQID No:3所示的核苷酸序列。

本发明第三提供一种携带所述基因序列的重组质粒；

进一步优选的，所述重组质粒的载体为pET载体、pPICZ载体或pUB载体。

所述重组质粒采用如下步骤的方法制备而成：以插入野生型α-环糊精葡萄糖基转移酶基因序列的载体为模板，分别采用第298位氨基酸的正向引物SEQ ID No:4和反向引物SEQ ID No:5，第447位氨基酸的正向引物SEQ ID No:6和反向引物SEQ ID No:7，以及正向引物SEQ ID No:8和反向引物SEQ ID No:9，第474位氨基酸的正向引物SEQ ID No:10和反向引物SEQ ID No:11，第498位氨基酸的正向引物SEQ ID No:12和反向引物SEQ ID No:13，第695位氨基酸的正向引物SEQ ID No:14和反向引物SEQ ID No:15，以及正向引物SEQ IDNo:16和反向引物SEQ ID No:17，进行定点突变，获得含有单突变的重组质粒(即突变体质粒)，以及分别采用第430位氨基酸的正向引物SEQ ID No:18和反向引物SEQ ID No:19，与第451位氨基酸的正向引物SEQ ID No:20和反向引物SEQ ID No:21，进行定点突变，获得含有新二硫键的双突变重组质粒。

作为本发明的优选方案，所述重组质粒采用包括如下步骤的方法制备而成：以插入野生型α-环糊精葡萄糖基转移酶基因序列的载体为模板，采用第447位氨基酸的正向引物SEQ ID No:6和反向引物SEQ ID No:7，以及第474位氨基酸的正向引物SEQ ID No:10和反向引物SEQ ID No:11，以及第659位氨基酸的正向引物SEQ ID No:14和反向引物SEQ IDNo:15，第430位氨基酸的正向引物SEQ ID No:18和反向引物SEQ ID No:19，第451位氨基酸的正向引物SEQ ID No:20和反向引物SEQ ID No:21，进行多位点叠加定点突变，获得叠加突变体重组质粒。

本发明第四提供表达所述α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体的宿主细胞，所述宿主细胞中外源转入了所述重组质粒，所述宿主细胞为细菌或真菌。

作为本发明的优选方案，所述宿主位大肠杆菌，具体的，表达所述α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体的重组大肠杆菌，其以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，转化所述重组质粒。所述重组质粒以pET20b为载体。

本发明第五提供一种α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体酶的制备方法，包括如下步骤：将所述重组质粒导入表达宿主E.coli BL21(DE3)，挑选验证后的阳性单克隆进行诱导表达培养；离心收集上清，层析纯化得到α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体酶。

本发明第六提供所述α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体、所述基因序列、所述重组质粒、所述宿主细胞、所述重组大肠杆菌或者所述方法制备得到α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体酶在生产α-环糊精中的应用。

本发明第七提供一种生产α-环糊精的方法，利用所述α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体或者所述α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体酶，将淀粉转化为α-环糊精，反应过程中不进行二次加酶。

有益效果：1)本发明提供的α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体最适温度为65℃，在70℃和80℃分别保留93％和75％的活性；热稳定性显著提高，突变体在70℃和80℃，半衰期分别为7h和4h；

(2)储存稳定性明显增强，不添加保护剂的情况下，在室温储存6个月，酶活保留率90％。

(3)采用本发明提供α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体，转化过程中可以在不二次加酶的情况下，将淀粉底物转化为α-环糊精。

附图说明

图1为野生型α-环糊精葡萄糖基转移酶蛋白的三维模拟结构；

图2为α-环糊精葡萄糖基转移酶叠加突变体酶G447E/S474D/G659R/A430C/S451C的三维模拟结构。

具体实施方式

下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1本实施例说明α-环糊精葡萄糖基转移酶酶活力测定方法。

取适当稀释的酶液0.1mL，加入装有2.0mL预先用50mM磷酸缓冲液(pH 5.5)配制的1％(w/v)可溶性淀粉溶液中，在45℃下反应10min后，加入0.2mL 3.0M的盐酸终止反应，再加入0.2mL用0.44mM甲基橙，在16℃下保温15min，在505nm下测定吸光度。

酶活单位定义为：在上述条件下每分钟生成1μmolα-环糊精所需的酶量。

实施例2α-环糊精葡萄糖基转移酶野生型酶及突变体酶的制备

(1)重组质粒的构建定及定点突变

重组质粒pET20b-α-CGT的构建：根据野生型α-环糊精葡萄糖基转移酶蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，合成其α-环糊精葡萄糖基转移酶编码基因片段α-CGT(SEQ IDNO.22所示)，并连接至pET20b质粒的酶切位点BamH I和Xho I之间，获得重组质粒pET20b-α-CGT。

pET20b-G447E/S474D/G659R/A430C/S451C/突变质粒的构建：

以带有野生型α-环糊精葡萄糖基转移酶基因序列的载体pET20b-α-CGT为模板，采用第447位氨基酸的正向引物SEQ ID No:6和反向引物SEQ ID No:7，第474位氨基酸的正向引物SEQ ID No:10和反向引物SEQ ID No:11，第659位氨基酸的正向引物SEQ ID No:14和反向引物SEQ ID No:15，以及第430位氨基酸的正向引物SEQ ID No:18和反向引物SEQ IDNo:19，第451位氨基酸的正向引物SEQ ID No:20和反向引物SEQ ID No:21，进行多位点叠加定点突变，获得突变体重组质粒。经PCR引入G447E/S474D/G659R/A430C/S451C定点突变，测序验证结果表明序列与预期一致，由此可以判断突变质粒pET20b-G447E/S474D/G659R/A430C/S451C构建成功。

具体构建步骤如下：

分别以引物SEQ ID No:6/引物SEQ ID No:7、引物SEQ ID No:10/引物SEQ ID No:11和引物SEQ ID No:14/引物SEQ ID No:15、引物SEQ ID No:18/引物SEQ ID No:19和引物SEQ ID No:20/引物SEQ ID No:21为突变引物，以重组质粒pET20b-α-CGT为模板进行定点突变，获得突变质粒pET20b-G447E/S474D/G659R/A430C/S451C。

PCR反应体系为：5×PS buffer 10μL，dNTPs Mix(2.5mM)4μL，正向引物1μL，反向引物1μL，模板DNA 1μL，Prime STAR DNA聚合酶0.5μL，加入ddH2O至50μL。PCR反应程序：95℃预变性2min；94℃解链30s，55℃退火30s，72℃延伸6min，共30个循环；72℃延伸20min；4℃保温。

PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳检测、确认成功后，向10μL扩增产物中加入0.5μLDpn I消化酶消化模板DNA。消化产物转化至E.coli JM109感受态细胞，涂布LB固体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃培养过夜。挑取单克隆进行培养，然后抽提质粒并测序。将测序成功的突变体质粒导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上于37℃培养过夜，挑选转化子，此转化子即为含有突变质粒pET20b-G447E/S474D/G659R/A430C/S451C的重组菌。该重组菌可用于突变体酶的诱导表达。

(2)野生酶及突变体酶的表达及纯化

分别将含有野生型基因α-CGT和突变基因G447E/S474D/G659R/A430C/S451C的重组菌株分别接种到LB液体培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素)于37℃振荡培养10～12h作为发酵用种子发酵液。然后按5％接种量将种子发酵液接入TB发酵培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，并置于37℃振荡培养4h，加入再用0.1mM异丙基硫代-D半乳糖苷(IPTG)于30℃诱导培养48h，得到发酵液。将发酵液于4℃、l0000 rpm离心10min，收集上清备用。

向上清液中缓慢加入50％的(NH4)₂SO₄，放置4℃条件下，盐析过夜，离心后收集沉淀。将沉淀复溶于pH 6.5、20mmol·L^-1的磷酸缓冲液，然后用pH 6.5、20mmol·L^-1的磷酸缓冲液透析24h，中间更换3次缓冲液，再用0.45μm微孔滤膜过滤后得到透析样品。在装有DEAE阴离子交换色谱柱的AKTA蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化，通过在线监测并分部收集含α-环糊精葡萄糖基转移酶酶活的洗脱液，每管收集1mL液体。将收集的有活性的洗脱样品置于透析袋中，在20mM pH5.5磷酸缓冲液中4℃透析过夜后，分别得到纯化后的α-环糊精葡萄糖基转移酶野生酶和突变体酶G447E/S474D/G659R/A430C/S451C。

本实施例所得α-环糊精葡萄糖基转移酶野生型酶和叠加突变体酶G447E/S474D/G659R/A430C/S451C的三维模拟结构分别如图1和图2所示。

实施例3：突变前后酶的最适温度比较

将实施例2中获得的野生型α-环糊精葡萄糖基转移酶酶液和突变体α-环糊精葡萄糖基转移酶G447E/S474D/G659R/A430C/S451C纯化酶液分别在40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、80℃条件下，测定酶活力，确定最适野生型酶及突变体酶在不同温度下酶活，温度以及并以最高酶活作为100％，计算不同温度条件下的相对酶活，从而确定最适温度。相对酶活(％)＝不同温度下酶活占最高酶活的比例。

结果显示，野生型α-环糊精葡萄糖基转移酶在40℃、50℃、60℃、65℃、70℃和80℃条件下相对酶活力分别为89％、100％、64％、46％、29％和9％的活性。突变体α-环糊精葡萄糖基转移酶G447E/S474D/G659R/A430C/S451C在40℃、50℃、60℃、65℃、70℃和80℃条件下相对酶活力分别为67％、87％、94％、100％、93％和75％的活性。野生型酶和突变体最适温度分别为50℃和65℃。突变体最适温度比野生型α-环糊精葡萄糖基转移酶最适温度提高了15℃。

实施例4：突变前后酶的热稳定性比较

本发明中野生型α-环糊精葡萄糖基转移酶在50℃、60℃条件下半衰期分别为5h和2h；在70℃和80℃保温半小时，酶活力完全消失。α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体G447E/S474D/G659R/A430C/S451C在50℃、60℃、70℃和80℃条件下，半衰期分别为20h、16h、7h和4h；

实施例5：突变前后酶的储存稳定性比较

将实施例2中获得的野生型α-环糊精葡萄糖基转移酶酶液和突变体α-环糊精葡萄糖基转移酶G447E/S474D/G659R/A430C/S451C纯化酶液分别在室温条件下进行储存，每隔1个月取样测定残留酶活力。并以初始酶活作为100％，计算不同储存时间后的相对酶活。相对酶活(％)＝不同储存时间下酶活占初始酶活的比例。

结果显示，野生酶储存2个月酶活力下降到初始酶活力的30％，3个月后完全失活。突变体α-环糊精葡萄糖基转移酶G447E/S474D/G659R/A430C/S451C在储存3个月和6个月后，酶活保留率分别为98％和90％。

实施例6野生酶及突变体酶二次加酶工艺转化产物分析

淀粉底物先用水悬浮得到浓度为10％的淀粉悬液，用稀盐酸调节pH至7.0，加热升温至70℃糊化后，加入α-环糊精葡萄糖基转移酶(野生酶或突变体G447E/S474D/G659R/A430C/S451C)使反应体系中酶的终浓度为1U/mL，维持温度在在70-80℃之间进行液化30min；液化后降温至50℃，再补充终浓度为1U/mLα-CGT酶进行环化反应，同时加入5％的癸醇；反应24h后蒸馏除去癸醇，用于HPLC检测α-环糊精含量。

样品处理，取1mL蒸馏脱除癸醇的环糊精溶液，取500μL与无水乙醇1:1混合，室温放置2h沉淀大分子量的糊精或极限糊精，12000rpm，离心10min，取上清经过0.45μm滤膜过滤，进行HPLC分析。HPLC分析的色谱条件是为，色谱柱：250×4.6mm 5μm Hypersil APS-2氨基色谱柱；流动相：70％乙腈。柱温：40℃，流速0.8mL·min-1。根据HPLC检测结果计算α-环糊精转化率

结果显示，野生酶转化体系α-环糊精转化率为62％；突变体G447E/S474D/G659R/A430C/S451C转化体系α-环糊精转化率为65％。对比发现，二次加酶工艺中，野生酶和突变体酶都经过了二次补充酶液，所以二者转化率相差不大。但是由于突变体酶在液化过程中可以维持很好的稳定性，降温并进行环化反应后，第一次和第二次添加的酶液同时进行转化反应，转化率略高于野生型酶转化体系。

实施例7野生酶及突变体酶单次加酶工艺转化产物分析

淀粉底物先用水悬浮得到浓度为10％的淀粉悬液，用稀盐酸调节pH至7.0，加热升温至70℃糊化后，加入α-环糊精葡萄糖基转移酶(野生酶或突变体G447E/S474D/G659R/A430C/S451C)使反应体系中酶的终浓度为1U/mL，维持温度在在70-80℃之间进行液化30min；液化后降温至50℃加入5％的癸醇(本工艺无需二次加酶)；继续反应24h后，通过蒸馏除去癸醇，样品经过过滤适当稀释后，用于HPLC分析(检测方法参考实施例6)，测定α-环糊精含量，并计算转化率。

结果显示，野生酶转化体系α-环糊精转化率为14％；突变体G447E/S474D/G659R/A430C/S451C转化体系中α-环糊精转化率为63％。对比发现，单次加酶反应工艺中，由于野生型酶热稳定性差，液化后可能绝大部分酶已经失活，但是由于底物的保护作用，仍然保留了部分活力，但是由于残留酶活力较少，转化率显著降低。由于突变体酶热稳定性好，在液化后仍然可以保留较高的酶活力，即使没有二次添加酶液，后续转化仍然能够顺利进行，并能达到接近二次加酶反应过程的转化效果。说明本发明获得的突变体具有更好的操作稳定性，更适合工业化操作过程，在α-环糊精工业生产中具有更好的应用潜能。

以上所揭露的仅为本发明几种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明申请专利范围所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 江苏省奥谷生物科技有限公司

<120> 一种α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体及其应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 687

<212> PRT

<213> 麦氏类芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)

<400> 1

Ser Pro Asp Thr Ser Val Asp Asn Lys Val Asn Phe Ser Thr Asp Val

1 5 10 15

Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Ala Asp Gly Asp Arg Thr Asn

20 25 30

Asn Pro Ala Gly Asp Ala Phe Ser Gly Asp Arg Ser Asn Leu Lys Leu

35 40 45

Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Asn Asp Gly

50 55 60

Tyr Leu Thr Gly Met Gly Val Thr Ala Leu Trp Ile Ser Gln Pro Val

65 70 75 80

Glu Asn Ile Thr Ser Val Ile Lys Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ser

85 90 95

Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Gln Thr Asn Asp Ala Phe

100 105 110

Gly Asp Phe Ala Asp Phe Gln Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His

115 120 125

Asn Ile Lys Val Val Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala

130 135 140

Asp Arg Asp Asn Pro Gly Phe Ala Glu Asn Gly Gly Met Tyr Asp Asn

145 150 155 160

Gly Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Ser Asn Asp Thr Ala Gly Leu Phe His

165 170 175

His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asp Gly Ile Tyr Lys

180 185 190

Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Ile Asn His Asn Asn Asn Ala Met Asp

195 200 205

Ala Tyr Phe Lys Ser Ala Ile Asp Leu Trp Leu Gly Met Gly Val Asp

210 215 220

Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys

225 230 235 240

Ser Phe Val Ser Ser Ile Tyr Gly Gly Asp His Pro Val Phe Thr Phe

245 250 255

Gly Glu Trp Tyr Leu Gly Ala Asp Gln Thr Asp Gly Asp Asn Ile Lys

260 265 270

Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Asn Leu Leu Asp Phe Glu Tyr Ala Gln

275 280 285

Glu Val Arg Glu Val Phe Arg Asp Lys Thr Glu Thr Met Lys Asp Leu

290 295 300

Tyr Glu Val Leu Ala Ser Thr Glu Ser Gln Tyr Asp Tyr Ile Asn Asn

305 310 315 320

Met Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Gln Val Ala

325 330 335

Gly Ser Gly Thr Arg Ala Thr Glu Gln Ala Leu Ala Leu Thr Leu Thr

340 345 350

Ser Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr

355 360 365

Gly Asp Gly Asp Pro Asn Asn Arg Ala Met Met Thr Ser Phe Asn Thr

370 375 380

Gly Thr Thr Ala Tyr Lys Val Ile Gln Ala Leu Ala Pro Leu Arg Lys

385 390 395 400

Ser Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Thr Thr Thr Glu Arg Trp Val Asn

405 410 415

Asn Asp Val Leu Ile Ile Glu Arg Lys Phe Gly Ser Ser Ala Ala Leu

420 425 430

Val Ala Ile Asn Arg Asn Ser Ser Ala Ala Tyr Pro Ile Ser Gly Leu

435 440 445

Leu Ser Ser Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Ser Asp Val Leu Asn Gly Leu

450 455 460

Leu Asn Gly Asn Ser Ile Thr Val Gly Ser Gly Gly Ala Val Thr Asn

465 470 475 480

Phe Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala Pro

485 490 495

Glu Thr Ser Pro Ala Ile Gly Asn Val Gly Pro Thr Met Gly Gln Pro

500 505 510

Gly Asn Ile Val Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Gly Thr Ala Gly

515 520 525

Thr Val Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ser Gly Ile Val Ser

530 535 540

Trp Glu Asp Thr Gln Ile Lys Ala Val Ile Pro Lys Val Ala Ala Gly

545 550 555 560

Lys Thr Gly Val Ser Val Lys Thr Ser Ser Gly Thr Ala Ser Asn Thr

565 570 575

Phe Lys Ser Phe Asn Val Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe

580 585 590

Leu Val Asn Gln Ala Asn Thr Asn Tyr Gly Thr Asn Val Tyr Leu Val

595 600 605

Gly Asn Ala Ala Glu Leu Gly Ser Trp Asp Pro Asn Lys Ala Ile Gly

610 615 620

Pro Met Tyr Asn Gln Val Ile Ala Lys Tyr Pro Ser Trp Tyr Tyr Asp

625 630 635 640

Val Ser Val Pro Ala Gly Thr Lys Leu Asp Phe Lys Phe Ile Lys Lys

645 650 655

Gly Gly Gly Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Gly Asn His Thr Tyr Thr

660 665 670

Thr Pro Ala Ser Gly Val Gly Thr Val Thr Val Asp Trp Gln Asn

675 680 685

<210> 2

<211> 687

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ser Pro Asp Thr Ser Val Asp Asn Lys Val Asn Phe Ser Thr Asp Val

1 5 10 15

Ile Tyr Gln Ile Val Thr Asp Arg Phe Ala Asp Gly Asp Arg Thr Asn

20 25 30

Asn Pro Ala Gly Asp Ala Phe Ser Gly Asp Arg Ser Asn Leu Lys Leu

35 40 45

Tyr Phe Gly Gly Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asp Lys Ile Asn Asp Gly

50 55 60

Tyr Leu Thr Gly Met Gly Val Thr Ala Leu Trp Ile Ser Gln Pro Val

65 70 75 80

Glu Asn Ile Thr Ser Val Ile Lys Tyr Ser Gly Val Asn Asn Thr Ser

85 90 95

Tyr His Gly Tyr Trp Ala Arg Asp Phe Lys Gln Thr Asn Asp Ala Phe

100 105 110

Gly Asp Phe Ala Asp Phe Gln Asn Leu Ile Asp Thr Ala His Ala His

115 120 125

Asn Ile Lys Val Val Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala

130 135 140

Asp Arg Asp Asn Pro Gly Phe Ala Glu Asn Gly Gly Met Tyr Asp Asn

145 150 155 160

Gly Ser Leu Leu Gly Ala Tyr Ser Asn Asp Thr Ala Gly Leu Phe His

165 170 175

His Asn Gly Gly Thr Asp Phe Ser Thr Ile Glu Asp Gly Ile Tyr Lys

180 185 190

Asn Leu Tyr Asp Leu Ala Asp Ile Asn His Asn Asn Asn Ala Met Asp

195 200 205

Ala Tyr Phe Lys Ser Ala Ile Asp Leu Trp Leu Gly Met Gly Val Asp

210 215 220

Gly Ile Arg Phe Asp Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys

225 230 235 240

Ser Phe Val Ser Ser Ile Tyr Gly Gly Asp His Pro Val Phe Thr Phe

245 250 255

Gly Glu Trp Tyr Leu Gly Ala Asp Gln Thr Asp Gly Asp Asn Ile Lys

260 265 270

Phe Ala Asn Glu Ser Gly Met Asn Leu Leu Asp Phe Glu Tyr Ala Gln

275 280 285

Glu Val Arg Glu Val Phe Arg Asp Lys Thr Glu Thr Met Lys Asp Leu

290 295 300

Tyr Glu Val Leu Ala Ser Thr Glu Ser Gln Tyr Asp Tyr Ile Asn Asn

305 310 315 320

Met Val Thr Phe Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Gln Val Ala

325 330 335

Gly Ser Gly Thr Arg Ala Thr Glu Gln Ala Leu Ala Leu Thr Leu Thr

340 345 350

Ser Arg Gly Val Pro Ala Ile Tyr Tyr Gly Thr Glu Gln Tyr Met Thr

355 360 365

Gly Asp Gly Asp Pro Asn Asn Arg Ala Met Met Thr Ser Phe Asn Thr

370 375 380

Gly Thr Thr Ala Tyr Lys Val Ile Gln Ala Leu Ala Pro Leu Arg Lys

385 390 395 400

Ser Asn Pro Ala Ile Ala Tyr Gly Thr Thr Thr Glu Arg Trp Val Asn

405 410 415

Asn Asp Val Leu Ile Ile Glu Arg Lys Phe Gly Ser Ser Cys Ala Leu

420 425 430

Val Ala Ile Asn Arg Asn Ser Ser Ala Ala Tyr Pro Ile Ser Glu Leu

435 440 445

Leu Ser Cys Leu Pro Ala Gly Thr Tyr Ser Asp Val Leu Asn Gly Leu

450 455 460

Leu Asn Gly Asn Ser Ile Thr Val Gly Asp Gly Gly Ala Val Thr Asn

465 470 475 480

Phe Thr Leu Ala Ala Gly Gly Thr Ala Val Trp Gln Tyr Thr Ala Pro

485 490 495

Glu Thr Ser Pro Ala Ile Gly Asn Val Gly Pro Thr Met Gly Gln Pro

500 505 510

Gly Asn Ile Val Thr Ile Asp Gly Arg Gly Phe Gly Gly Thr Ala Gly

515 520 525

Thr Val Tyr Phe Gly Thr Thr Ala Val Thr Gly Ser Gly Ile Val Ser

530 535 540

Trp Glu Asp Thr Gln Ile Lys Ala Val Ile Pro Lys Val Ala Ala Gly

545 550 555 560

Lys Thr Gly Val Ser Val Lys Thr Ser Ser Gly Thr Ala Ser Asn Thr

565 570 575

Phe Lys Ser Phe Asn Val Leu Thr Gly Asp Gln Val Thr Val Arg Phe

580 585 590

Leu Val Asn Gln Ala Asn Thr Asn Tyr Gly Thr Asn Val Tyr Leu Val

595 600 605

Gly Asn Ala Ala Glu Leu Gly Ser Trp Asp Pro Asn Lys Ala Ile Gly

610 615 620

Pro Met Tyr Asn Gln Val Ile Ala Lys Tyr Pro Ser Trp Tyr Tyr Asp

625 630 635 640

Val Ser Val Pro Ala Gly Thr Lys Leu Asp Phe Lys Phe Ile Lys Lys

645 650 655

Gly Gly Arg Thr Val Thr Trp Glu Gly Gly Gly Asn His Thr Tyr Thr

660 665 670

Thr Pro Ala Ser Gly Val Gly Thr Val Thr Val Asp Trp Gln Asn

675 680 685

<210> 3

<211> 2064

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcacccgata cgagcgtgga caacaaggtc aatttcagta cggacgtcat ctatcagatt 60

gtgaccgacc gcttcgcgga cggggacagg acgaacaatc cggcggggga tgcgttcagc 120

ggcgaccgat ccaatttgaa gctctatttc gggggagact ggcaggggat tatcgacaag 180

attaacgacg gttatttgac cggcatgggc gtcaccgccc tctggatatc ccagcctgtg 240

gaaaatatca cctccgtcat caagtattcc ggcgttaaca atacgtctta tcacggttac 300

tgggcgaggg attttaagca aaccaacgac gctttcgggg attttgccga ttttcaaaat 360

ctgattgata cggctcacgc tcataacatc aaggtcgtga tcgacttcgc ccccaaccac 420

acgtctccgg ccgacaggga caaccccgga ttcgccgaga acggtggcat gtatgataac 480

ggttcgctgc tcggcgccta cagcaatgat acggccggcc ttttccatca taacgggggg 540

accgattttt ccacgattga agacggtatt tacaagaacc tctacgacct ggcggacatc 600

aaccataaca acaacgctat ggacgcttat tttaaaagcg ctatcgacct ttggctcggc 660

atgggtgtgg acgggattcg ttttgacgcg gtgaagcata tgcctttcgg ctggcaaaaa 720

agcttcgttt cctcgattta cggcggcgat catccggtat ttacgttcgg ggaatggtat 780

cttggcgcgg atcaaaccga cggagacaac attaaattcg ccaacgaaag cgggatgaac 840

ctgctggact ttgaatacgc gcaggaagtg cgcgaagtgt tccgggacaa aacggaaacg 900

atgaaggatc tctatgaggt gctggccagc acggagtcgc aatacgacta catcaacaat 960

atggtgacct tcatcgacaa ccatgatatg gaccggttcc aggttgccgg ttccggtacg 1020

cgggcgaccg agcaagcgtt ggcgctgacg ctgacttccc gcggcgtgcc agccatctac 1080

tacggcacgg agcagtacat gaccggcgat ggcgacccca acaaccgggc gatgatgacc 1140

tcgtttaata ccgggacgac ggcttataaa gtgattcagg cattggcgcc gctgcgtaaa 1200

tccaatccgg ccatcgctta tgggacgacg acagagcgct gggttaacaa cgatgtgttg 1260

attattgaac gcaaattcgg cagcagctgc gctttggtgg cgattaatcg aaactcgtcc 1320

gccgcttatc cgatttcgga actgttgagt tgcctgccgg cgggcactta ttcggatgta 1380

ttgaacggac tcttaaacgg caactccatt accgtgggcg acggcggcgc cgtcaccaac 1440

tttacgctgg cggccggcgg cacggcggta tggcagtaca cagcgccgga aacgtcgccg 1500

gcgatcggca atgtgggtcc caccatgggc cagccgggga atatagtgac gattgacggg 1560

cgcggctttg gcggcacggc gggcacggtt tatttcggga cgacggcggt gaccggctcc 1620

ggcatcgtaa gctgggagga cacgcagatt aaggcggtca taccgaaggt cgcggcgggc 1680

aaaacgggcg tatcggtcaa aacgtcgtcc ggcaccgcca gcaatacatt caaaagcttc 1740

aatgtactga cgggggatca ggtcacggtg cgtttcctgg tcaatcaagc caataccaat 1800

tacggaacaa atgtttatct tgtcggcaac gccgccgagc tcggctcctg ggacccgaac 1860

aaagcgattg ggccgatgta caatcaggtg atcgccaagt acccgtcctg gtattacgat 1920

gtcagcgtgc cggcggggac aaagctggat tttaaattta ttaaaaaggg cggccgtacg 1980

gtgacttggg aaggcggggg caaccatacg tacacgacgc cggccagcgg cgtagggacg 2040

gtgacggtgg actggcaaaa ttaa 2064

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttccgggaca aatgcgaaac gatgaagga 29

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tccttcatcg tttcgcattt gtcccggaa 29

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ttatccgatt tcggaactgt tgagt 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

actcaacagt tccgaaatcg gataa 25

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ttatccgatt tcggcactgt tgagttcgc 29

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gcgaactcaa cagtgccgaa atcggataa 29

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ctccattacc gtgggcgacg gcggcgccgt 30

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

acggcgccgc cgtcgcccac ggtaatggag 30

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

tacacagcgc cggaaagctc gccggcgat 29

<210> 13

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atcgccggcg agctttccgg cgctgtgta 29

<210> 14

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

taaaaagggc ggccgtacgg tgacttggg 29

<210> 15

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

cccaagtcac cgtacggccg cccttttta 29

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

taaaaagggc ggcgaaacgg tgacttggg 29

<210> 17

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

cccaagtcac cgtttcgccg cccttttta 29

<210> 18

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

aattcggcag cagctgcgct ttggtggcga 30

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

tcgccaccaa agcgcagctg ctgccgaatt 30

<210> 20

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ctgttgagtt gcctgccggc gggcacttat 30

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcccgccggc aggcaactca acagttccga 30

<210> 22

<211> 2064

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tcacccgata cgagcgtgga caacaaggtc aatttcagta cggacgtcat ctatcagatt 60

gtgaccgacc gcttcgcgga cggggacagg acgaacaatc cggcggggga tgcgttcagc 120

ggcgaccgat ccaatttgaa gctctatttc gggggagact ggcaggggat tatcgacaag 180

attaacgacg gttatttgac cggcatgggc gtcaccgccc tctggatatc ccagcctgtg 240

gaaaatatca cctccgtcat caagtattcc ggcgttaaca atacgtctta tcacggttac 300

tgggcgaggg attttaagca aaccaacgac gctttcgggg attttgccga ttttcaaaat 360

ctgattgata cggctcacgc tcataacatc aaggtcgtga tcgacttcgc ccccaaccac 420

acgtctccgg ccgacaggga caaccccgga ttcgccgaga acggtggcat gtatgataac 480

ggttcgctgc tcggcgccta cagcaatgat acggccggcc ttttccatca taacgggggg 540

accgattttt ccacgattga agacggtatt tacaagaacc tctacgacct ggcggacatc 600

aaccataaca acaacgctat ggacgcttat tttaaaagcg ctatcgacct ttggctcggc 660

atgggtgtgg acgggattcg ttttgacgcg gtgaagcata tgcctttcgg ctggcaaaaa 720

agcttcgttt cctcgattta cggcggcgat catccggtat ttacgttcgg ggaatggtat 780

cttggcgcgg atcaaaccga cggagacaac attaaattcg ccaacgaaag cgggatgaac 840

ctgctggact ttgaatacgc gcaggaagtg cgcgaagtgt tccgggacaa aacggaaacg 900

atgaaggatc tctatgaggt gctggccagc acggagtcgc aatacgacta catcaacaat 960

atggtgacct tcatcgacaa ccatgatatg gaccggttcc aggttgccgg ttccggtacg 1020

cgggcgaccg agcaagcgtt ggcgctgacg ctgacttccc gcggcgtgcc agccatctac 1080

tacggcacgg agcagtacat gaccggcgat ggcgacccca acaaccgggc gatgatgacc 1140

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gtgacttggg aaggcggggg caaccatacg tacacgacgc cggccagcgg cgtagggacg 2040

gtgacggtgg actggcaaaa ttaa 2064

Claims

1.一种α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，是通过将氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示的野生型α-环糊精葡萄糖基转移酶的第298位、第447位、第474位、第498位、第659位、第430位、第451位氨基酸中的一个或多个位点进行突变得到。

2.如权利要求1所述的α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体为将野生型α-环糊精葡萄糖基转移酶的第447位的甘氨酸突变成谷氨酸、第474位的丝氨酸突变成天冬氨酸、将第659位的甘氨酸突变成精氨酸、同时将第430位的丙氨酸突变成半胱氨酸与第451位的丝氨酸突变成半胱氨酸得到的。

3.如权利要求2所述的一种α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体，其特征在于，具有如SEQID No:2所示的氨基酸序列。

4.编码权利要求1-3任一项所述α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体的基因，具有如SEQID No:3所示的核苷酸序列。

5.携带权利要求4所述基因的重组质粒。

6.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的载体为pET载体、pPICZ载体或pUB载体。

7.表达权利要求1-3任一项所述α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为细菌或真菌，其外源转入了权利要求5所述的重组质粒。

8.一种α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求5或6所述重组质粒导入表达宿主E.coliBL21(DE3)，挑选验证后的阳性单克隆进行诱导表达培养；离心收集上清，层析纯化得到α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体酶。

9.权利要求1-3任一项所述α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体、权利要求4所述基因、权利要求5或6所述重组质粒、权利要求7所述宿主细胞或者权利要求8所述方法制备得到α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体酶在生产α-环糊精中的应用。

10.一种生产α-环糊精的方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体或者权利要求8所述方法制备得到的α-环糊精葡萄糖基转移酶突变体酶，将淀粉转化为α-环糊精，反应过程中不进行二次加酶。