CN114908072A

CN114908072A - 一种β-淀粉酶突变体及其在麦芽糖制备中的应用

Info

Publication number: CN114908072A
Application number: CN202210692199.3A
Authority: CN
Inventors: 楼志华; 刘翔; 张劲楠
Original assignee: Jiangsu Ogo Biotech Co ltd
Current assignee: Jiangsu Ogo Biotech Co ltd
Priority date: 2022-03-10
Filing date: 2022-06-17
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2042-06-17
Also published as: CN114908072B

Abstract

本发明公开了一种β‑淀粉酶突变体。本发明通过对野生型β‑淀粉酶进行突变，得到所述β‑淀粉酶突变体，与野生型β‑淀粉酶相比，最适温度明显提高，且热稳定性更好，储存稳定性也更佳。本发明所述β‑淀粉酶突变体最适温度为65℃，比野生型β‑淀粉酶最适温度高10℃，热稳定性显著提高。在60‑65℃条件下与普鲁兰酶、麦芽三糖酶协同作用于转化淀粉底物制备麦芽糖，可以实现麦芽糖的高效制备。

Description

一种β-淀粉酶突变体及其在麦芽糖制备中的应用

技术领域

本发明涉及酶工程和和微生物工程技术领域，具体涉及一种β-淀粉酶突变体及其在麦芽糖制备中的应用。

背景技术

β-淀粉酶属于外切型糖化酶，能够从淀粉链的非还原端顺次切下麦芽糖单元，生成麦芽糖。麦芽糖被水解的同时发生沃尔登转位反应，由α-型麦芽糖变为β-型麦芽糖，因此称为β-淀粉酶。该酶存在于植物和微生物中，在淀粉糖、酿造、食品加工、医药等工业生产领域具有广泛的用途，是一种重要的淀粉加工用酶。在淀粉糖行业，β-淀粉酶是生产超高麦芽糖浆、结晶麦芽糖、麦芽糖醇等产品所必需的关键酶种。在啤酒酿造中，β-淀粉酶可以用来生产啤酒专用糖浆，不但能减少大麦芽的用量、降低成本，而且所产啤酒泡沫细腻、口味纯正。在食品加工领域，β-淀粉酶可用于面包、馒头、糕点和方便米饭等产品的保鲜，提高产品的货架期。在医药工业中，β-淀粉酶可用于生产高纯度的医用针剂级麦芽糖，用于糖尿病、高血压等特殊病人在临床上补充能量，而不会造成血糖升高。随着我国相关行业的快速发展，国内对β-淀粉酶的需求日益增加。

植物是β-淀粉酶的最主要来源之一，早在2000多年前，人们就开始用麦芽作为糖化剂来生产饴糖。此后，越来越多植物β-淀粉酶被发现。植物β-淀粉酶分子量一般为53-64kDa，最适温度为30-60℃，最适pH为4.8-6.0。其中，大麦β-淀粉酶最适温度和最适pH分别为55℃和5.2，是商品化β-淀粉酶的主要来源之一；其次是大豆β-淀粉酶和甘薯β-淀粉酶。但是，植物提取β-淀粉酶仍然存在以下缺点：原料来源有限，生产需要消耗大量粮食；产品中容易混杂有其它淀粉酶，影响应用效果；需低温储存，保存成本高等。微生物是β-淀粉酶的另一个主要来源。国内外科技工作者一直致力于筛选产β-淀粉酶的微生物，其中日本学者在这方面的研究最早。Higashihara于上世纪70年代首次发现了巨大芽孢杆菌β-淀粉酶。此后，多粘芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等多种微生物β-淀粉酶也相继被发现。研究发现，大部分微生物β-淀粉酶最适温度一般在40-50℃，最适pH为6.5-8.0。工业生产中，为减少污染杂菌，淀粉糖化过程尽可能在60℃以上进行。然而已有大部分微生物β-淀粉酶热稳定性难以满足淀粉糖化过程在高温条件下的应用需求。

上述缺陷均使得现有的β-淀粉酶无法很好的用于麦芽糖的工业化生产。因此，亟需得到一种热稳定性更高的β-淀粉酶。

发明内容

为解决现有技术的问题，本发明提供一种高稳定性的β-淀粉酶突变体。

为达此目的，本发明第一提供一种β-淀粉酶突变体，是通过将氨基酸序列如SEQID NO.1所示的野生型β-淀粉酶的第180位、第185位、第335位、第337位氨基酸中的一个或多个位点进行突变得到。

进一步优选的，所述突变体为以下a-d中任一或多个组合：

a.将野生型β-淀粉酶的第180位的丙氨酸突变为天冬酰胺或谷氨酸或脯氨酸，将突变体命名为Ala180Asn，Ala180Glu，Ala180Pro，；

b.将野生型β-淀粉酶的第185位的甘氨酸突变为天冬酰胺或赖氨酸或丝氨酸，将突变体命名为Gly185Asn，Gly185Lys，Gly185Ser；

c.将野生型β-淀粉酶的第335位的缬氨酸突变成精氨酸或天冬氨酸或丝氨酸，将突变体命名为Val335Ser，Val335Arg，Val335Asp；

d.将野生型β-淀粉酶的第337丝氨酸突变为组氨酸或赖氨酸，将突变体命名为Ser337His，Ser337Lys。

作为本发明的优选方案，所述β-淀粉酶突变体是将野生型β-淀粉酶的第180位的丙氨酸突变成天冬氨酸、将第185位的甘氨酸突变成天冬氨酸、将第335位的缬氨酸突变成丝氨酸、同时将第337丝氨酸突变成组氨酸得到的。在本发明中，将上述方案得到的β-淀粉酶叠加突变体命名为Ala180Asn+Gly185Asn+Val335Ser+Ser337His。

进一步优选的，所述β-淀粉酶突变体具有如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列。

本发明第二提供所述β-淀粉酶突变体的基因序列，其具有如SEQ ID No:4所示的核苷酸序列。

本发明第三提供一种携带所述基因序列的重组质粒；

进一步优选的，所述重组质粒的载体为pET载体、pGEX载体、pPICZ载体、pAN载体或pUB载体。

所述重组质粒采用如下步骤的方法制备而成：以插入野生型β-淀粉酶基因序列的载体为模板，分别采用第180位氨基酸的引物SEQ ID No:5和引物SEQ ID No:6，以及引物SEQ ID No,7和引物SEQ ID No:8，以及引物SEQ ID No:9和引物SEQ ID No:10；第185位氨基酸的引物SEQ ID No:11和引物SEQ ID No:12，以及引物SEQ ID No:13和引物SEQ ID No:14，以及引物SEQ ID No:15和引物SEQ ID No:16；第335位氨基酸的引物SEQ ID No:17和引物SEQ ID No:18，以及引物SEQ ID No:19和引物SEQ ID No:20，以及引物SEQ ID No:21和引物SEQ ID No:22；第337位氨基酸的引物SEQ ID No:23和引物SEQ ID No:24，以及引物SEQ ID No:25和引物SEQ ID No:26；分别进行定点突变，获得含有单突变的重组质粒(即突变体质粒)。

作为本发明的优选方案，所述重组质粒采用包括如下步骤的方法制备而成：以含有野生型β-淀粉酶基因序列的载体为模板，采用第180位氨基酸的引物SEQ ID No:5和引物SEQ ID No:6，以及第185位氨基酸的引物SEQ ID No:11和引物SEQ ID No:12，以及第335位氨基酸的引物SEQ ID No:17和引物SEQ ID No:18，第337位氨基酸的引物SEQ ID No:23和引物SEQ ID No:24，进行多位点叠加突变，获得叠加突变体重组质粒。

本发明第四提供表达所述β-淀粉酶突变体的宿主细胞，所述宿主细胞中外源转入了所述重组质粒，所述宿主细胞为细菌或真菌。

作为本发明的优选方案，所述宿主为大肠杆菌，具体的，表达所述β-淀粉酶突变体的重组大肠杆菌，其以大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，转化所述重组质粒。所述重组质粒以pET20b为载体。

本发明第五提供一种β-淀粉酶突变体的制备方法，包括如下步骤：将所述重组质粒转化导入表达宿主E.coli BL21(DE3)细胞中，挑选转化子并验证，将验证后的阳性单克隆转化子进行诱导表达培养；离心收集培养液上清，纯化得到β-淀粉酶突变体。

本发明第六提供所述β-淀粉酶突变体、所述基因序列、所述重组质粒、所述宿主细胞、所述重组大肠杆菌或者所述β-淀粉酶突变体的制备方法制备得到β-淀粉酶突变体在生产麦芽糖中的应用。

本发明第七提供一种生产麦芽糖的方法，利用所述β-淀粉酶突变体，将淀粉转化为麦芽糖，反应过程在60-65℃条件下进行。

有益效果：

1)本发明提供的β-淀粉酶突变体最适温度为65℃，比野生型β-淀粉酶最适温度高10℃；热稳定性显著提高，突变体在在55℃、60℃和65℃条件下，半衰期分别为48h、26h和10h；

(2)储存稳定性明显增强，在室温储存1年，酶活保留率95％以上。

(3)采用本发明提供β-淀粉酶突变体，转化过程可以在60-65℃条件下进行，将淀粉底物转化为麦芽糖。

附图说明

图1为野生型β-淀粉酶蛋白的三维模拟结构；

图2为β-淀粉酶叠加突变体Ala180Asn+Gly185Asn+Val335Ser+Ser337His的三维模拟结构。

具体实施方式

下面所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1本实施例说明β-淀粉酶酶活力测定方法。

分别吸取500μL底物2％的可溶性淀粉溶液，400μL pH为6.0的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液加入到15mL的具塞试管中，混匀后置于55℃水浴中进行预热，10min后加入稀释后的酶液100μL并震荡混匀，55℃反应10min后加入800μL DNS并置于沸水浴中5min以显色，沸水浴结束后立刻放入冰水中冷却，然后用去离子水分别定容到15mL，震荡混匀，在波长540nm处测量吸光度，以使用沸水中灭活的酶液做为测量的对照组，标准曲线由不同浓度梯度的麦芽糖溶液作为标准浓度制成。

酶活力(U)定义为：在上述分析测定条件下，每分钟催化产生相当于1μmol麦芽糖还原力的酶量定义为一个活力单位(1U)。

实施例2β-淀粉酶野生型酶及突变体酶的制备

(1)野生型β-淀粉酶重组菌株的构建

设计并化学合成一段核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的β-淀粉酶编码基因(与此β-淀粉酶基因相对应的β-淀粉酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示)，将此β-淀粉酶基因与pET20b(+)载体经双酶切(酶切位点Nco I、HindⅢ)连接，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶于16℃下连接12h，连接产物转化大肠杆菌JM109感受态细胞，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基，于37℃培养12h，挑选转化子接入含100mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，于37℃、200rpm的条件下摇床培养10h后提取质粒，得到重组质粒PET20b(+)-β-Amy；

将重组质粒PET20b(+)-amy-1热击转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，转化产物涂布于含100mg/L氨苄青霉素的LB固体培养基，于37℃培养12h，挑选转化子，得到重组菌E.coli BL21(DE3)/PET20b(+)-β-Amy。

(2)β-淀粉酶单突变酶重组菌株的构建

以含有野生型β-淀粉酶基因序列的载体pET20b-β-Amy为模板，分别采用第180位氨基酸的引物SEQ ID No:5和引物SEQ ID No:6，以及引物SEQ ID No,7和引物SEQ ID No:8，以及引物SEQ ID No:9和引物SEQ ID No:10；第185位氨基酸的引物SEQ ID No:11和引物SEQ ID No:12，以及引物SEQ ID No:13和引物SEQ ID No:14，以及引物SEQ ID No:15和引物SEQ ID No:16；第335位氨基酸的引物SEQ ID No:17和引物SEQ ID No:18，以及引物SEQID No:19和引物SEQ ID No:20，以及引物SEQ ID No:21和引物SEQ ID No:22；第337位氨基酸的引物SEQ ID No:23和引物SEQ ID No:24，以及引物SEQ ID No:25和引物SEQ ID No:26；分别进行定点突变，获得含有单突变的重组质粒(即突变体质粒)。经PCR引入目的突变，测序验证结果表明序列与预期一致，由此可以判断突变质粒pET20b-Ala180Asn、pET20b-Ala180Glu、pET20b-Ala180Pro、pET20b-Gly185Asn、pET20b-Gly185Lys、pET20b-Gly185Ser、pET20b-Val335Ser、pET20b-Val335Arg、pET20b-Val335Asp、pET20b-Ser337His和pET20b-Ser337Lys构建成功。

PCR反应体系为：10×buffer 5μL，dNTPs Mix(2.5mM)4μL，正向引物1μL，反向引物1μL，模板DNA 1μL，pfu DNA聚合酶1μL，加入ddH2O至50μL。PCR反应程序：94℃预变性4min；94℃解链30s，55℃退火30s，72℃延伸12min，共30个循环；72℃延伸10min；4℃保温。

PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳验证后，加入0.5μL Dpn I消化酶，37℃反应30min。消化产物转化至E.coli JM109感受态细胞，并涂布含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基，37℃培养12h。挑取单克隆进行培养，收集菌体抽提质粒酶切验证，酶切验证正确的突变体质粒再次进行测序验证。将测序正确的突变体质粒转化导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上于37℃培养12h，挑选转化子，此转化子即为含有突变质粒pET20b-Ala180Asn+Gly185Asn+Val335Ser+Ser337His的重组菌。该重组菌可用于突变体酶的诱导表达。

(3)β-淀粉酶叠加突变酶重组菌株的构建

以含有野生型β-淀粉酶基因序列的载体pET20b-β-Amy为模板，采用第180位氨基酸的引物SEQ ID No:5和引物SEQ ID No:6，以及第185位氨基酸的引物SEQ ID No:11和引物SEQ ID No:12，以及第335位氨基酸的引物SEQ ID No:17和引物SEQ ID No:18，第337位氨基酸的引物SEQ ID No:23和引物SEQ ID No:24，进行多位点叠加突变，获得叠加突变体重组质粒。经PCR引入目的突变，测序验证结果表明序列与预期一致，由此可以判断突变质粒pET20b-Ala180Asn+Gly185Asn+Val335Ser+Ser337His构建成功。

具体构建步骤如下：

以重组质粒pET20b-β-Amy为模板进行定点突变，首先采用引物SEQ ID No:5和引物SEQ ID No:6进行定点突变，PCR反应体系及电泳、转化、验证等方法参考实施例2(2)中具体方法。将测序正确的突变体质粒命名为pET20b-Ala180Asn。然后，以pET20b-Ala180Asn为模板，采用引物SEQ ID No:11和引物SEQ ID No:12进型定点突变，获得突变质粒pET20b-Ala180Asn+Gly185Asn。接着依次采用引物SEQ ID No:17和引物SEQ ID No:18，以及引物SEQ ID No:23和引物SEQ ID No:24进行叠加突变，最终获得突变质粒pET20b-Ala180Asn+Gly185Asn+Val335Ser+Ser337His。

将测序正确的突变体质粒转化导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上于37℃培养12h，挑选转化子，此转化子即为含有突变质粒pET20b-Ala180Asn+Gly185Asn+Val335Ser+Ser337His的重组菌。该重组菌可用于叠加突变体酶的诱导表达。

(4)野生酶及突变体酶的制备

分别将含有野生型基因质粒pET20b-β-Amy、单突变基因质粒pET20b-Ala180Asn、pET20b-Ala180Glu、pET20b-Ala180Pro、pET20b-Gly185Asn、pET20b-Gly185Lys、pET20b-Gly185Ser、pET20b-Val335Ser、pET20b-Val335Arg、pET20b-Val335Asp、pET20b-Ser337His和pET20b-Ser337Lys，以及叠加突变质粒pET20b-ALA180ASN+GLY185ASN+VAL335SER+SER337HIS的重组菌株接种到LB液体培养基中(含100μg/mL氨苄青霉素)于37℃振荡培养10～12h作为发酵用种子发酵液。

然后按5％接种量将种子发酵液接入TB发酵培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，并置于37℃振荡培养4h，加入再用0.1mM异丙基硫代-D半乳糖苷(IPTG)于30℃诱导培养48h，得到发酵液。将发酵液于4℃、l0000rpm离心10min，收集上清即为粗酶液。

(5)野生酶及突变体酶的纯化

向上清液中缓慢加入70％的(NH4)₂SO₄，放置4℃条件下，盐析过夜，离心后收集沉淀。将沉淀复溶于pH 8.5、20mmol·L^-1的Tris-HCl缓冲液，然后用pH8.5、20mmol·L^-1的Tris-HCl缓冲液透析24h，中间更换3次缓冲液，再用0.45μm微孔滤膜过滤后得到透析样品。在装有DEAE阴离子交换色谱柱的AKTA蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化，通过在线监测并分部收集含β-淀粉酶酶活的洗脱液，每管收集1mL液体。将收集的有活性的洗脱样品置于透析袋中，在20mM pH8.5 Tris-HCl缓冲液中4℃透析过夜后，分别得到纯化后的β-淀粉酶野生酶、单突变酶Ala180Asn、Ala180Glu、Ala180Pro、Gly185Asn、Gly185Lys、Gly185Ser、Val335Ser、Val335Arg、Val335Asp、Ser337His、Ser337Lys，和叠加突变体酶ALA180ASN+GLY185ASN+VAL335SER+SER337HIS。

其中，本实施例所得β-淀粉酶野生型酶和叠加突变体酶ALA180ASN+GLY185ASN+VAL335SER+SER337HIS的三维模拟结构分别如图1和图2所示。

实施例3：突变前后酶的最适温度比较

将实施例2中获得的野生型β-淀粉酶酶液、单突变酶Ala180Asn、Ala180Glu、Ala180Pro、Gly185Asn、Gly185Lys、Gly185Ser、Val335Ser、Val335Arg、Val335Asp、Ser337His、Ser337Lys，和叠加突变体β-淀粉酶ALA180ASN+GLY185ASN+VAL335SER+SER337HIS纯化酶液分别在50℃、55℃、57.5℃、60℃、62.5℃、65℃、70℃条件下，测定酶活力，确定最适野生型酶及突变体酶在不同温度下酶活，温度以及并以最高酶活作为100％，计算不同温度条件下的相对酶活，从而确定最适温度。相对酶活(％)＝不同温度下酶活占最高酶活的比例。

结果显示，野生型β-淀粉酶的最适温度为55℃；单突变体Ala180Asn、Ala180Glu和Ala180Pro的最适温度分别为60℃、55℃、57.5℃；单突变体Gly185Asn、Gly185Lys和Gly185Ser的最适温度分别为62.5℃、57.5℃、60℃；单突变体Val335Ser、Val335Arg和Val335Asp的最适温度分别为57.5℃、50℃、55℃；单突变体Ser337His和Ser337Lys的最适温度分别为57.5℃、50℃。

叠加突变体LA180ASN+GLY185ASN+VAL335SER+SER337HIS的最适温度为65℃，比野生型β-淀粉酶最适温度提高了10℃。

表1野生型β-淀粉酶及突变体最适温度

实施例4：突变前后酶的热稳定性比较

配制pH值为6.0的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液代替β-淀粉酶活力测定方法中的缓冲液，将纯化得到的野生酶和叠加突变体酶分别在55℃、60℃和65℃的条件下保温，每隔一段时间h将部分酶液取出，迅速冷却，在55℃、pH 6.0条件下测定其β-淀粉酶活力，以初始酶活为100％，保温后酶活与之相比计算残留酶活，以考察其温度稳定性。结果显示

野生型β-淀粉酶及突变体ALA180ASN+GLY185ASN+VAL335SER+SER337HIS在55℃条件下半衰期分别为7h和48h；在60℃条件下，半衰期分别为3h和26h；在65℃条件下，半衰期分别为0.5h和10h。

表2野生型β-淀粉酶及突变体热稳定性

实施例5：野生酶和突变酶的储存稳定性

将实施例2中获得的野生型β-淀粉酶酶液和突变体β-淀粉酶ALA180ASN+GLY185ASN+VAL335SER+SER337HIS纯化酶液分别在室温条件下进行储存，每隔1个月取样测定残留酶活力。并以初始酶活作为100％，计算不同储存时间后的相对酶活。相对酶活(％)＝不同储存时间下酶活占初始酶活的比例。

结果显示，野生酶室温条件下储存12个月酶活力下降到初始酶活力的15％；突变体β-淀粉酶ALA180ASN+GLY185ASN+VAL335SER+SER337HIS在室温条件下储存12个月后，酶活保留率为95％。

实施例6突变酶转化淀粉制备麦芽糖

本实施例提供突变体酶ALA180ASN+GLY185ASN+VAL335SER+SER337HIS用于多酶协同糖化在55℃温度下生产麦芽糖的方法，包括以下步骤：

(1)调浆罐中加入去离子水，开启搅拌器，加入淀粉，混合均匀后调节pH值在6.0，淀粉乳浓度控制在20％；(2)将淀粉乳和α-高温淀粉酶搅拌均匀，进行喷射液化，液化温度控制在95℃，加酶量为12U/g；(3)采用板框式压滤机将液化液过滤，过滤压力为0.5mpa，水流量为60L/min，去除掉多余杂质，加入0.1％活性炭吸附脱色30min，得到适合糖化的底物A；(4)底物A中依次加入8U/g淀粉底物普鲁兰酶、50U/g淀粉底物β-淀粉酶突变体和10U/g淀粉底物麦芽三糖酶协同糖化，糖化温度控制在55℃，糖化时间为48h，糖化结束后升温灭酶，取样按1：1的比例加入乙腈，静置1～2h使长链糖沉淀，然后离心取上清，用HPLC检测产物的产量。

HPLC分析条件：安捷伦HPLC系统；检测器：示差检测器；氨基柱：Thermo HypersilAPS-2NH2，流动相采用70％(v/v)乙腈和去离子水的混合溶液，混匀后抽滤；设置检测器温度35℃，柱温35℃，流速1mL/min。

转化率的计算方法/公式为：麦芽糖转化率(％)＝(麦芽糖的质量/淀粉的质量)×100％。

转化结果显示所得麦芽糖浆中麦芽糖含量为85.1％。

对比例1野生β-淀粉酶转化淀粉制备麦芽糖

本对比例提供野生β-淀粉酶在55℃温度下用于多酶协同糖化生产麦芽糖的方法，与实施例6提供的多酶协同糖化生产高纯度麦芽糖的方法不同之处在于，在糖化时所用β-淀粉酶为野生酶。

转化结果显示所得麦芽糖浆中麦芽糖含量为85.3％。

实施例7突变酶转化淀粉制备麦芽糖

本实施例提供突变体酶ALA180ASN+GLY185ASN+VAL335SER+SER337HIS用于多酶协同糖化在60℃温度下生产麦芽糖的方法，包括以下步骤：

(1)调浆罐中加入去离子水，开启搅拌器，加入淀粉，混合均匀后调节pH值在6.0，淀粉乳浓度控制在20％；(2)将淀粉乳和α-高温淀粉酶搅拌均匀，进行喷射液化，液化温度控制在95℃，加酶量为12U/g；(3)采用板框式压滤机将液化液过滤，过滤压力为0.5mpa，水流量为60L/min，去除掉多余杂质，加入0.1％活性炭吸附脱色30min，得到适合糖化的底物A；(4)底物A中依次加入8U/g淀粉底物普鲁兰酶、50U/g淀粉底物β-淀粉酶突变体和10U/g淀粉底物麦芽三糖酶协同糖化，糖化温度控制在60℃，糖化时间为48h，糖化结束后升温灭酶，取样按1：1的比例加入乙腈，静置1～2h使长链糖沉淀，然后离心取上清，用HPLC检测产物的产量。

转化结果显示所得麦芽糖浆中麦芽糖含量为87.3％。

对比例2野生β-淀粉酶转化淀粉制备麦芽糖

本对比例提供野生β-淀粉酶在60℃温度下用于多酶协同糖化生产麦芽糖的方法，与实施例7提供的多酶协同糖化生产高纯度麦芽糖的方法不同之处在于，在糖化时所用β-淀粉酶为野生酶。

转化结果显示所得麦芽糖浆中麦芽糖含量为65.2％。

实施例8突变酶转化淀粉制备麦芽糖

本实施例提供突变体酶ALA180ASN+GLY185ASN+VAL335SER+SER337HIS用于多酶协同糖化在65℃温度下生产麦芽糖的方法，包括以下步骤：

(1)调浆罐中加入去离子水，开启搅拌器，加入淀粉，混合均匀后调节pH值在6.0，淀粉乳浓度控制在20％；(2)将淀粉乳和α-高温淀粉酶搅拌均匀，进行喷射液化，液化温度控制在95℃，加酶量为12U/g；(3)采用板框式压滤机将液化液过滤，过滤压力为0.5mpa，水流量为60L/min，去除掉多余杂质，加入0.1％活性炭吸附脱色30min，得到适合糖化的底物A；(4)底物A中依次加入8U/g淀粉底物普鲁兰酶、50U/g淀粉底物β-淀粉酶突变体和10U/g淀粉底物麦芽三糖酶协同糖化，糖化温度控制在65℃，糖化时间为48h，糖化结束后升温灭酶，取样按1：1的比例加入乙腈，静置1～2h使长链糖沉淀，然后离心取上清，用HPLC检测产物的产量。

转化结果显示所得麦芽糖浆中麦芽糖含量为89.7％。

对比例3野生β-淀粉酶转化淀粉制备麦芽糖

本对比例提供野生β-淀粉酶在65℃温度下用于多酶协同糖化生产麦芽糖的方法，与实施例8提供的多酶协同糖化生产高纯度麦芽糖的方法不同之处在于，在糖化时所用β-淀粉酶为野生酶。

转化结果显示所得麦芽糖浆中麦芽糖含量为32.6％。

比较实施例6、实施例7、实施例8与对比例1、对比例2、对比例3的结果发现，本发明获得的突变体具有更好的热稳定性，更适合在高温反应条件下应用，更适合工业化操作过程，在麦芽糖工业生产中具有更好的应用潜能。

以上所揭露的仅为本发明几种较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明申请专利范围所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。

序列表

<110> 江苏省奥谷生物科技有限公司

<120> 一种β-淀粉酶突变体及在麦芽糖制备中的应用

<130> 江苏省奥谷生物科技有限公司

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 515

<212> PRT

<213> 人工合成()

<400> 1

Ala Val Asn Gly Gln Ser Phe Asn Ser Asn Tyr Lys Thr Tyr Leu Met

1 5 10 15

Ala Pro Leu Lys Lys Val Thr Glu Phe Thr Thr Trp Glu Ala Phe Glu

20 25 30

Asn Asp Leu Arg Lys Ala Lys Gln Asn Gly Phe Tyr Ala Val Thr Val

35 40 45

Asp Phe Trp Trp Gly Asp Met Glu Lys Asn Gly Asp Gln Gln Phe Asp

50 55 60

Phe Ser Tyr Ala Gln Arg Phe Ala Gln Ala Ala Arg Asn Ala Gly Ile

65 70 75 80

Lys Met Val Pro Ile Ile Ser Thr His Gln Cys Gly Gly Asn Val Gly

85 90 95

Asp Asp Cys Asn Thr Pro Leu Pro Ser Trp Ile Trp Asn Thr Lys Thr

100 105 110

Asp Asp Ser Leu Tyr Phe Lys Ser Glu Thr Gly Thr Val Asn Lys Glu

115 120 125

Thr Val Asn Pro Leu Ala Thr Asp Val Ile Thr Lys Gln Tyr Gly Glu

130 135 140

Leu Tyr Thr Ala Phe Ala Gln Ala Leu Ala Pro Tyr Lys Asp Val Ile

145 150 155 160

Pro Lys Val Tyr Leu Ser Gly Gly Pro Ala Gly Glu Leu Arg Tyr Pro

165 170 175

Ser Tyr Thr Ala Ala Asp Gly Thr Gly Tyr Pro Ser Arg Gly Lys Phe

180 185 190

Gln Ala Tyr Thr Asp Phe Ala Lys Ser Lys Phe Gln Met Trp Ala Val

195 200 205

Asn Lys Tyr Gly Ser Leu Ala Gly Val Asn Gln Ala Trp Gly Leu Ser

210 215 220

Leu Thr Ser Thr Ser Gln Ile Leu Pro Pro Ser Asp Gly Asn Gln Phe

225 230 235 240

Leu Lys Asp Gly Tyr Asn Thr Asn Tyr Gly Lys Asp Phe Leu Glu Trp

245 250 255

Tyr Gln Gly Val Leu Gln Asp His Ala Lys Arg Ile Gly Ala Leu Ala

260 265 270

His Gln Ala Phe Asp Pro Val Phe Asn Val Pro Val Gly Ala Lys Ile

275 280 285

Ala Gly Ile His Trp Gln Tyr Asn Asn Pro Thr Met Pro His Ala Ala

290 295 300

Glu Lys Pro Ala Gly Tyr Asn Asn Tyr Ser Thr Leu Leu Asp Ser Phe

305 310 315 320

Lys Thr Ala Lys Leu Asp Leu Thr Phe Thr Cys Leu Glu Met Val Asp

325 330 335

Ser Gly Thr Tyr Pro Glu Tyr Ser Met Pro Lys Thr Leu Val Lys Glu

340 345 350

Val Ala Ser Leu Ala Asn Ala Lys Gly Ile Val Leu Asn Gly Glu Asn

355 360 365

Ala Leu Ser Ile Gly Ser Glu Glu Gln Tyr Lys Arg Ala Ala Glu Met

370 375 380

Thr Phe Asn Tyr Asn Phe Ala Gly Phe Thr Leu Leu Arg Phe Tyr Asp

385 390 395 400

Val Ile Asn Asn Ser Thr Arg Met Ser Gln Phe Asn Gln His Leu Asn

405 410 415

Ile Lys Pro Val Ala Gln Thr Met Val Val Lys Asn Ala Pro Thr Ser

420 425 430

Ser Gly Glu Ser Val Tyr Ile Val Gly Asp Arg Pro Glu Leu Gly Gln

435 440 445

Trp Asp Thr Ile Ala Tyr Pro Ile Lys Leu Ser Tyr Asn Ser Thr Tyr

450 455 460

Gly Asp Trp Arg Gly Thr Val Asn Phe Pro Ala Asp Arg Ser Val Gln

465 470 475 480

Phe Lys Ala Ile Ile Lys Arg Ser Asp Gly Ser Leu Lys Ser Trp Gln

485 490 495

Pro Thr Gln Gln Tyr Trp Asn Val Pro Gly Thr Pro Thr Thr Tyr Thr

500 505 510

Asn Asn Trp

515

<210> 2

<211> 1545

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

gcggtgaacg gccagagctt taacagcaac tataaaacct atctgatggc gccgctgaaa 60

aaagtgaccg aatttaccac ctgggaagcg tttgaaaacg atctgcgcaa agcgaaacag 120

aacggctttt atgcggtgac cgtggatttt tggtggggcg atatggaaaa aaacggcgat 180

cagcagtttg attttagcta tgcgcagcgc tttgcgcagg cggcgcgcaa cgcgggcatt 240

aaaatggtgc cgattattag cacccatcag tgcggcggca acgtgggcga tgattgcaac 300

accccgctgc cgagctggat ttggaacacc aaaaccgatg atagcctgta ttttaaaagc 360

gaaaccggca ccgtgaacaa agaaaccgtg aacccgctgg cgaccgatgt gattaccaaa 420

cagtatggcg aactgtatac cgcgtttgcg caggcgctgg cgccgtataa agatgtgatt 480

ccgaaagtgt atctgagcgg cggcccggcg ggcgaactgc gctatccgag ctataccgcc 540

gcggatggca ccggctatcc gagccgcggc aaatttcagg cgtataccga ttttgcgaaa 600

agcaaatttc agatgtgggc ggtgaacaaa tatggcagcc tggcgggcgt gaaccaggcg 660

tggggcctga gcctgaccag caccagccag attctgccgc cgagcgatgg caaccagttt 720

ctgaaagatg gctataacac caactatggc aaagattttc tggaatggta tcagggcgtg 780

ctgcaggatc atgcgaaacg cattggcgcg ctggcgcatc aggcgtttga tccggtgttt 840

aacgtgccgg tgggcgcgaa aattgcgggc attcattggc agtataacaa cccgaccatg 900

ccgcatgcgg cggaaaaacc ggcgggctat aacaactata gcaccctgct ggatagcttt 960

aaaaccgcga aactggatct gacctttacc tgcctggaaa tggtcgattc tggcacctat 1020

ccggaatata gcatgccgaa aaccctggtg aaagaagtgg cgagcctggc gaacgcgaaa 1080

ggcattgtgc tgaacggcga aaacgcgctg agcattggca gcgaagaaca gtataaacgc 1140

gcggcggaaa tgacctttaa ctataacttt gcgggcttta ccctgctgcg cttttatgat 1200

gtgattaaca acagcacccg catgagccag tttaaccagc atctgaacat taaaccggtg 1260

gcgcagacca tggtggtgaa aaacgcgccg accagcagcg gcgaaagcgt gtatattgtg 1320

ggcgatcgcc cggaactggg ccagtgggat accattgcgt atccgattaa actgagctat 1380

aacagcacct atggcgattg gcgcggcacc gtgaactttc cggcggatcg cagcgtgcag 1440

tttaaagcga ttattaaacg cagcgatggc agcctgaaaa gctggcagcc gacccagcag 1500

tattggaacg tgccgggcac cccgaccacc tataccaaca actgg 1545

<210> 3

<211> 515

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Ala Val Asn Gly Gln Ser Phe Asn Ser Asn Tyr Lys Thr Tyr Leu Met

1 5 10 15

Ala Pro Leu Lys Lys Val Thr Glu Phe Thr Thr Trp Glu Ala Phe Glu

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Asn Asp Leu Arg Lys Ala Lys Gln Asn Gly Phe Tyr Ala Val Thr Val

35 40 45

Asp Phe Trp Trp Gly Asp Met Glu Lys Asn Gly Asp Gln Gln Phe Asp

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Phe Ser Tyr Ala Gln Arg Phe Ala Gln Ala Ala Arg Asn Ala Gly Ile

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Lys Met Val Pro Ile Ile Ser Thr His Gln Cys Gly Gly Asn Val Gly

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Asp Asp Cys Asn Thr Pro Leu Pro Ser Trp Ile Trp Asn Thr Lys Thr

100 105 110

Asp Asp Ser Leu Tyr Phe Lys Ser Glu Thr Gly Thr Val Asn Lys Glu

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Leu Tyr Thr Ala Phe Ala Gln Ala Leu Ala Pro Tyr Lys Asp Val Ile

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Pro Lys Val Tyr Leu Ser Gly Gly Pro Ala Gly Glu Leu Arg Tyr Pro

165 170 175

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Asn Lys Tyr Gly Ser Leu Ala Gly Val Asn Gln Ala Trp Gly Leu Ser

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Leu Thr Ser Thr Ser Gln Ile Leu Pro Pro Ser Asp Gly Asn Gln Phe

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275 280 285

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Glu Lys Pro Ala Gly Tyr Asn Asn Tyr Ser Thr Leu Leu Asp Ser Phe

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Lys Thr Ala Lys Leu Asp Leu Thr Phe Thr Cys Leu Glu Met Ser Asp

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340 345 350

Val Ala Ser Leu Ala Asn Ala Lys Gly Ile Val Leu Asn Gly Glu Asn

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<213> 人工序列()

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<210> 5

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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agctatacca acgcggatgg caccaa 26

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<212> DNA

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gtgccatccg cttcggtata gctc 24

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

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<400> 17

ctggaaatga gcgattctgg caccta 26

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

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<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

ctggaaatgc gcgattctgg cacctatc 28

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

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<400> 20

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<210> 21

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

ctggaaatgg acgattctgg cacctatcc 29

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

ggataggtgc cagaatcgtc catttccag 29

<210> 23

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

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<210> 24

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<212> DNA

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<400> 24

cggataggtg ccatgatcga ccattt 26

<210> 25

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<212> DNA

<213> 人工序列()

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<210> 26

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

ataggtgcct ttatcgacca tttcc 25

Claims

1.一种β-淀粉酶突变体，其特征在于，是通过将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的野生型β-淀粉酶的第180位、第185位、第335位、第337位氨基酸中的一个或多个位点进行突变得到。

2.如权利要求1所述的β-淀粉酶突变体，其特征在于，所述突变体为将野生型β-淀粉酶的第180位的丙氨酸突变成天冬氨酸、将第185位的甘氨酸突变成天冬氨酸、将第335位的缬氨酸突变成丝氨酸、同时将第337丝氨酸突变成组氨酸得到的。

3.如权利要求2所述的一种β-淀粉酶突变体，其特征在于，具有如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列。

4.编码权利要求1-3任一项所述β-淀粉酶突变体的基因，具有如SEQ ID No:4所示的核苷酸序列。

5.携带权利要求4所述基因的重组质粒。

6.如权利要求5所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的载体为pET载体、pGEX载体、pPICZ载体、pAN载体或pUB载体。

7.表达权利要求1-3任一项所述β-淀粉酶突变体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为细菌或真菌，其外源转入了权利要求5所述的重组质粒。

8.一种β-淀粉酶突变体酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求5或6所述重组质粒导入表达宿主E.coli BL21(DE3)，挑选验证后的阳性单克隆进行诱导表达培养；离心收集上清，纯化得到β-淀粉酶突变体。

9.权利要求1-3任一项所述β-淀粉酶突变体、权利要求4所述基因、权利要求5或6所述重组质粒、权利要求7所述宿主细胞或者权利要求8所述方法制备得到β-淀粉酶突变体在制备麦芽糖中的应用。

10.一种生产麦芽糖的方法，其特征在于，利用权利要求1或2所述β-淀粉酶突变体或者权利要求8所述方法制备得到的β-淀粉酶突变体，可以在60-65℃条件下保持稳定，将淀粉高效转化为麦芽糖。