CN110229800A - 一种产麦芽六糖能力提高的直链麦芽低聚糖生成酶突变体 - Google Patents

一种产麦芽六糖能力提高的直链麦芽低聚糖生成酶突变体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种产麦芽六糖能力提高的直链麦芽低聚糖生成酶突变体，属于酶工程技术领域。本发明的直链麦芽低聚糖生成酶突变体，以5％(w/w)玉米淀粉溶液为底物，产物中麦芽六糖的百分含量分别为36.10％(G109N)、42.40％、(G109D)及38.99％(G109F)，是野生型(32.93％)的1.10、1.29、1.18倍，且底物转化率均提高到79％以上。即使在较高的底物浓度下(玉米淀粉20％，w/w)，突变体G109D依然可以有效水解淀粉生产高浓度麦芽六糖，产物中麦芽六糖的百分含量为44.69％，高产物纯度及底物转化率可以有效降低高纯度直链麦芽低聚糖浆的生产加工成本，更具有工业应用价值。

Description

一种产麦芽六糖能力提高的直链麦芽低聚糖生成酶突变体
技术领域
本发明涉及一种产麦芽六糖能力提高的直链麦芽低聚糖生成酶突变体，属于基因工程和 酶工程技术领域。
背景技术
直链麦芽低聚糖是一类由3～10个α-D-吡喃葡萄糖单元以α-1,4-糖苷键连接而成的链状寡 糖聚合体，是一类集营养和功能于一体的新糖源，它具有良好的食品加工特性和独特的生理 功效，在食品、医药和精细化工等领域具有广泛的应用前景。其中直链麦芽低聚六糖参与构 建的胆固醇和细菌响应性脂质复合物——智能纳米脂质体平台MLP18，可精确递送光敏剂红 紫素18，对细菌感染部位进行细菌特异性标记和可视化声动力治疗，能有效消除多药耐药细 菌对人体的威胁。此外直链麦芽六糖的衍生物可排除血清和尿液中的唾液α-淀粉酶和胰腺α- 淀粉酶等干扰因子，在新型医疗临床用诊断试剂盒的开发研究中意义重大。
目前工业上主要依靠直链麦芽低聚糖生成酶生产一种或几种麦芽低聚糖混合物，大多数 报道的直链麦芽低聚糖酶存在产物特异性不佳、产物中麦芽六糖的含量过低、底物转化率低 等问题。产物中麦芽六糖的含量过低会导致生产成本过高，且后续分离提纯困难，底物转化 率低则未能使底物得到充分利用，生产效率低下，进一步提高生产成本与能耗，这些问题的 存在使得直链麦芽低聚糖酶难以满足工业上的需求。寻找及筛选可适应工业化生产的直链麦 芽低聚糖生成酶的过程十分费时，因此采用定点突变提高其酶学性质与产物特异性成为了更 加便捷有效的手段。
发明内容
为了解决上述存在的技术问题，本发明通过对来源于Bacillusstearothermophilus STB04 的直链麦芽低聚糖生成酶进行突变得到产麦芽六糖能力提高的直链麦芽低聚糖生成酶突变体 G109N、G109D、G109F，其催化得到的产物中麦芽六糖的百分含量分别达到36.10％、42.40％ 及38.99％，且底物转化率均提高到79％以上，更能适应工业化生产。
本发明的第一个目的是提供一种产麦芽六糖能力提高的直链麦芽低聚糖生成酶突变体， 所述突变体的氨基酸序列包括：在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的基础上，将第109位的 氨基酸进行突变后得到的氨基酸序列。
在本发明的一种实施方式中，所述编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列是 SEQ ID NO:2所示的序列。
在本发明的一种实施方式中，所述直链麦芽低聚糖生成酶为来源于Bacillusstearothermophilus STB04的直链麦芽低聚糖生成酶。
在本发明的一种实施方式中，所述将第109位的氨基酸进行突变，是突变成天冬酰胺、 天冬氨酸或苯丙氨酸。
在本发明的一种实施方式中，所述直链麦芽低聚糖生成酶突变体的氨基酸序列分别为 SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5。
本发明的第二个目的是提供编码所述突变体的基因。
本发明的第三个目的是提供携带所述基因的载体或细胞。
本发明的第四个目的是提供表达所述突变体的基因工程菌。
在本发明的一种实施方式中，所述的基因工程菌以枯草芽孢杆菌为宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述的基因工程菌以Bacillus subtilis WB600为宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述的基因工程菌以pST为表达载体。
本发明的第五个目的是提供一种制备直链麦芽六糖的方法，所述方法是以所述突变体或 含有所述突变体的全细胞为催化剂，以淀粉为底物制备直链麦芽六糖。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是以pH 6.0的5～20％(w/w)玉米淀粉溶液为底物， 以5～10U/g干基淀粉的加酶量加入所述直链麦芽低聚糖生成酶突变体，在pH6.0、60℃条件 下反应24～72小时。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是以pH 6.0的5％(w/w)玉米淀粉溶液为底物，以 5U/g干基淀粉的加酶量加入所述直链麦芽低聚糖生成酶突变体，在pH 6.0、60℃条件下反应 48小时。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是以pH 6.0的20％(w/w)玉米淀粉溶液为底物， 以10U/g干基淀粉的加酶量加入所述直链麦芽低聚糖生成酶突变体，在pH 6.0、60℃条件下 反应24～72小时。
本发明还提供所述的突变体或所述的基因工程菌在医药生产、化工或食品领域的应用。
本发明的有益效果：
(1)以5％(w/w)玉米淀粉为底物，直链麦芽低聚糖生成酶突变体G109N、G109D和G109F 水解玉米淀粉的产物中麦芽六糖的百分含量分别可达到36.10％、42.40％、38.99％，分别是野 生型(32.93％)的1.10、1.29、1.18倍。其中G109D的麦芽六糖产量最高，达到16.94g·L-1， 相比野生型(麦芽六糖产量为12.41g·L-1)提高了36.5％，且底物转化率均提高到79％以上。
(2)与野生型直链麦芽低聚糖生成酶相比，本发明所得的直链麦芽低聚糖生成酶突变体 G109D在较高的底物浓度下(玉米淀粉20％，w/w)，依然可以有效水解淀粉生产高浓度麦芽 六糖，产物中麦芽六糖的百分含量高达44.69％。高产物纯度及底物转化率可以有效降低高纯 度直链麦芽低聚糖浆的生产加工成本，更具有工业应用价值。
(3)本发明所提供的生产直链麦芽六糖糖浆的方法，和其他生产淀粉糖的方法相比，不需 要在生产过程中调节温度和pH，不需要添加钙离子，不需要加入普鲁兰酶、异淀粉酶等其他 协同酶制剂，因此工艺更为简单、便捷，生产成本更低。
生物材料
本发明的菌株Bacillus stearothermophilus STB04和质粒pST、pST/mfa均在潘思惠的文献 《直链麦芽低聚糖生成酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达、酶学性质与产物研究》中公开(具 体参见第二章2.1.1小节)，公开日：2018-06-30。
附图说明
图1：野生型及突变体直链麦芽低聚糖生成酶作用于5％(w/w)玉米淀粉的产物分析； G1～G7分别代表葡萄糖、麦芽糖、直链麦芽三糖、直链麦芽四糖、直链麦芽五糖、直链麦芽 六糖、直链麦芽七糖。
具体实施方式
直链麦芽低聚糖生成酶活力的测定方法：酶活力的测定采用3,5-二硝基水杨酸(DNS)法。 以C6H8O7-Na2HPO4缓冲液(10mM，pH 5.5)配制1％(w/v)可溶性淀粉溶液作为底物，在0.9mL 底物中加入100μL适当稀释后的酶液，60℃下反应15min，加入1.0mL DNS溶液终止反应， 沸水浴中显色5min后立即冰浴冷却。加入2mL去离子水振荡均匀，于540nm下测定吸光 值，根据葡萄糖标准曲线计算出体系中还原糖含量。以每分钟生成1μmol还原糖(以葡萄糖 计)所需的酶量定义为1个酶活单位(U)。
利用高效阴离子交换色谱(HPAEC-PAD)分析产物中各组分含量。分析条件为：采用CarboPac PA 200色谱柱，以0.25M NaOH、1M NaAc和超纯水为流动相，设置流速为0.5 mL/min，柱温35℃，进样量10μL。底物总转化率与各单糖组分在G1～G7中所占百分比的计 算方法如下：
单糖百分含量＝(单糖组分质量/G1～G7总质量)×100％
总转化率＝(G1～G7总质量/底物干基质量)×100％
实施例1：直链麦芽低聚糖生成酶突变体基因序列的制备
(1)将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)的直链麦芽低聚 糖生成酶基因连接到载体pST上，得到重组载体pST/mfa，具体构建过程参见文献《直链麦 芽低聚糖生成酶在枯草芽孢杆菌中的分泌表达、酶学性质与产物研究》的第10页第2.2.2小 节。
(2)以含有目的基因序列的表达载体pST/mfa为模板，设计实验所需的互补引物链(见表1)，引物由金唯智生物科技有限公司合成，参照TaKaRa公司STAR Primer GXL试剂盒说明 书所示方法进行定点突变。PCR反应体系依照STAR Primer试剂盒说明书中所设定条件：超 纯水32μL，5×PrimeSTAR GXL Buffer10μL，dNTP Mixture(各2.5mM)4μL，正向和反向引 物(10μM)均为1μL，模板DNA 1μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase(2.5U/μL)1μL。PCR扩增条件为：98℃条件下预变性3min；随后以98℃10s，60℃15s，68℃8min为一个循 环，在以上条件下进行35个循环；最后68℃下保温10min。为了降低PCR错误的可能性， 设计的上下游引物仅在中间部分互补，两端错开。
表1直链麦芽低聚糖生成酶突变位点的引入
注：1下划线碱基对应于相应突变氨基酸。
实施例2：含有直链麦芽低聚糖生成酶突变体基因的基因工程菌的构建
含有直链麦芽低聚糖生成酶突变体基因的工程菌的构建按照如下方法进行：
在37℃下，用Dpn I处理实施例1中得到的PCR产物2h以上，随后将处理好的PCR 产物转化到Escherichia coli JM109中，将转化的E.coli JM109涂布到含有100μg/mL卡那霉素的LB琼脂培养基中，在37℃恒温箱中过夜培养12h，从中挑选出单菌落接种到含有100 μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃下、200r/min培养过夜并按照质粒提取试剂盒 说明书所示方法提取质粒鉴定测序。将构建好的目的质粒通过化学转化法转入表达宿主Bacillu subtilis WB600感受态中。
实施例3：直链麦芽低聚糖生成酶突变体的表达
LB培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。
发酵培养基：酵母粉30g/L，玉米淀粉6g/L，KH2PO4 17mM，K2HPO4 72mM，pH 7.5。
(1)宿主菌活化培养：将实施例2中得到的含有表达载体质粒pST/mfa的B.subtilis WB600 在LB固体培养基上进行划线分离，置于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取阳性单菌落接种 于含有50mL LB液体培养基的250mL锥形瓶中。接种前添加终浓度为5μg/mL卡那霉素。 锥形瓶置于200r/min的回转式摇床中，在37℃下培养12h。
(2)发酵培养：将活化后的种子液以4％(v/v)的接种量转接至装有50mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，在摇床中振荡培养48h(转速为200r/min)，接种前添加终浓度为5μg/mL卡那 霉素。结束发酵后，将发酵液于4℃、10,000×g条件下离心15min，收集上清液即得到粗酶 液。
实施例4：直链麦芽低聚糖生成酶突变体的纯化
将发酵上清液通过0.45μm水系膜过滤，并使用5-mL HiTrap Phenyl HP柱进行一步疏水纯 化。用25mL超纯水以2mL/min的流速平衡柱子，并保持流速恒定。上样60mL后，用10mM NaOH以2mL/min的流速洗脱柱上的目的蛋白。收集到的洗脱液在超纯水中透析24h，然后通 过测定酶活力和SDS-PAGE进行鉴定，分别得到直链麦芽低聚糖生成酶突变体G109N(氨基酸 序列如SEQ ID NO:3所示)、G109D(氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)、G109F(氨基酸序列 如SEQ ID NO:5所示)纯酶，并在-80℃保存。
实施例5：直链麦芽低聚糖生成酶突变体的产物分析
配制pH 6.0的5％(w/w)玉米淀粉溶液，按5U/g加酶量加入野生型直链麦芽低聚糖生成 酶(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)和实施例4中得到的突变体直链麦芽低聚糖生成酶 G109N、G109D、G109F，在60℃下反应48h。反应结束后沸水浴灭酶，10,000×g条件下离心5min，稀释一定倍数后用0.22m针头式过滤器过滤。以一定浓度梯度的G1～G7混合标准品为对照进行定性与定量分析。
结果表明：产物分析如表2所示，野生型直链麦芽低聚糖生成酶主产麦芽五糖和麦芽六 糖，两者的百分含量分别为28.02％和32.93％，底物转化率为75.4％。突变体直链麦芽低聚糖 生成酶显著提高了产物中麦芽六糖的产量，直链麦芽六糖百分含量分别达到36.10％(G109N)、 42.40％(G109D)及38.99％(G109F)，其中G109D的直链麦芽六糖的产量提高效果最为显著， 比野生型提高了36.5％；且底物转化率均提高至79％以上。
表2直链麦芽低聚糖生成酶的产物分析
注：G1～G7分别代表葡萄糖、麦芽糖、直链麦芽三糖、直链麦芽四糖、直链麦芽五糖、 直链麦芽六糖、直链麦芽七糖。
表3直链麦芽低聚糖生成酶的产物中麦芽六糖的产量
实施例6：直链麦芽低聚糖生成酶突变体酶解玉米淀粉乳制备麦芽六糖
配制20％(w/w)的玉米淀粉乳200g，调节pH 6.0，在60℃水浴中保温15min，搅拌速率 300r/min。按照10U/g干基淀粉的加酶量加入野生型直链麦芽低聚糖生成酶及实施例5中制 备得到的突变体G109D(氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)，提高水浴温度至90℃，液化20 min，立即将温度降至60℃，开始反应计时。反应24～72h，取样称量，定容后离心取上清液， 稀释后过0.22μm水系滤膜，按照实施例5相同分析条件利用HPAEC-PAD进行产物测定。各糖组分的百分含量及底物总转化率如表4所示。反应24h时，野生型直链麦芽低聚糖生成酶的水解产物中直链麦芽六糖的百分含量为34.60％，突变体G109D则为42.71％，二者底物转化率相近，低于60％；48h后，G6的百分含量及底物转化率提高，野生型直链麦芽低聚糖生成酶的G6百分含量达到35.29％，突变体G109D的G6占比提高至44.69％。前者底物转化率66.30％，后者则为62.13％；进一步反应至72h，直链麦芽六糖的产量无明显变化。
表4野生型及突变体直链麦芽低聚糖生成酶水解玉米淀粉乳的产物情况
注：G1～G7分别代表葡萄糖、麦芽糖、直链麦芽三糖、直链麦芽四糖、直链麦芽五糖、 直链麦芽六糖、直链麦芽七糖。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种产麦芽六糖能力提高的直链麦芽低聚糖生成酶突变体
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 515
<212> PRT
<213> Bacillus stearothermophilus STB04
<400> 1
Ala Ala Pro Phe Asn Gly Thr Met Met Gln Tyr Phe Glu Trp Tyr Leu
1 5 10 15
Pro Asp Asp Gly Thr Leu Trp Thr Lys Val Ala Asn Glu Ala Asn Asn
20 25 30
Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys
35 40 45
Gly Thr Ser Arg Ser Asp Val Gly Tyr Gly Val Tyr Asp Leu Tyr Asp
50 55 60
Leu Gly Glu Phe Asn Gln Lys Gly Thr Val Arg Thr Lys Tyr Gly Thr
65 70 75 80
Lys Ala Gln Tyr Leu Gln Ala Ile Gln Ala Ala His Ala Ala Gly Met
85 90 95
Gln Val Tyr Ala Asp Val Val Phe Asp His Lys Gly Gly Ala Asp Gly
100 105 110
Thr Glu Trp Val Asp Ala Val Glu Val Asn Pro Ser Asp Arg Asn Gln
115 120 125
Glu Ile Ser Gly Thr Tyr Gln Ile Gln Ala Trp Thr Lys Phe Asp Phe
130 135 140
Pro Gly Arg Gly Asn Thr Tyr Ser Ser Phe Lys Trp Arg Trp Tyr His
145 150 155 160
Phe Asp Gly Val Asp Trp Asp Glu Ser Arg Lys Leu Ser Arg Ile Tyr
165 170 175
Lys Phe Arg Gly Ile Gly Lys Ala Trp Asp Trp Glu Val Asp Thr Glu
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195 200 205
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210 215 220
Thr Thr Asn Ile Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Lys His Ile Lys
225 230 235 240
Phe Ser Phe Phe Pro Asp Trp Leu Ser Tyr Val Arg Ser Gln Thr Gly
245 250 255
Lys Pro Leu Phe Thr Val Gly Glu Tyr Trp Ser Tyr Asp Ile Asn Lys
260 265 270
Leu His Asn Tyr Ile Thr Lys Thr Asn Gly Thr Met Ser Leu Phe Asp
275 280 285
Ala Pro Leu His Asn Lys Phe Tyr Thr Ala Ser Lys Ser Gly Gly Ala
290 295 300
Phe Asp Met Arg Thr Leu Met Thr Asn Thr Leu Met Lys Asp Gln Pro
305 310 315 320
Thr Leu Ala Val Thr Phe Val Asp Asn His Asp Thr Glu Pro Gly Gln
325 330 335
Ala Leu Gln Ser Trp Val Asp Pro Trp Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala
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Phe Ile Leu Thr Arg Gln Glu Gly Tyr Pro Gly Val Phe Tyr Gly Asp
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Tyr Tyr Gly Ile Pro Gln Tyr Asn Ile Pro Ser Leu Lys Ser Lys Ile
370 375 380
Asp Pro Leu Leu Ile Ala Arg Arg Asp Tyr Ala Tyr Gly Thr Gln His
385 390 395 400
Asp Tyr Leu Asp His Ser Asp Ile Ile Gly Trp Thr Arg Glu Gly Val
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Thr Glu Lys Pro Gly Ser Gly Leu Ala Ala Leu Ile Thr Asp Gly Pro
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Gly Gly Ser Lys Trp Met Tyr Val Gly Lys Gln His Ala Gly Lys Val
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Phe Tyr Asp Leu Thr Gly Asn Arg Ser Asp Thr Val Thr Ile Thr Ser
450 455 460
Asp Gly Trp Gly Glu Phe Lys Val Asn Gly Gly Ser Val Ser Val Trp
465 470 475 480
Val Pro Arg Lys Thr Thr Val Ser Thr Ile Thr Arg Pro Ile Thr Thr
485 490 495
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Ala Trp Pro
515
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<213> Bacillus stearothermophilus STB04
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tgggtcgacc cgtggttcaa accgttggct tacgccttta ttctaactcg gcaggaagga 1080
tacccgggcg tcttttatgg tgactattat ggcattccac aatataacat tccttcgctg 1140
aaaagcaaaa tcgatccgct cctcatcgcg cgcagggatt atgcttacgg aacgcaacat 1200
gattatcttg atcactccga catcatcggg tggacaaggg aaggggtcac tgaaaaacca 1260
ggatccggac tggccgcact gatcaccgat gggccgggag gaagcaaatg gatgtacgtt 1320
ggcaaacaac acgccggaaa agtgttctat gaccttaccg gcaaccggag tgacaccgtc 1380
accatcacca gtgatggatg gggggaattc aaagtcaatg gcggttcggt ttcggtttgg 1440
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ggtgaattcg tccgttggac cgaaccacgg ttggtggcat ggccttaa 1548
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20 25 30
Leu Ser Ser Leu Gly Ile Thr Ala Leu Trp Leu Pro Pro Ala Tyr Lys
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Claims (10)

1.一种产麦芽六糖能力提高的直链麦芽低聚糖生成酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列包括：在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的基础上，将第109位的氨基酸进行突变后得到的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的直链麦芽低聚糖生成酶突变体，其特征在于，所述编码SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列是SEQ ID NO:2所示的序列。
3.根据权利要求1所述的直链麦芽低聚糖生成酶突变体，其特征在于，所述将第109位的氨基酸进行突变，是突变成天冬酰胺、天冬氨酸或苯丙氨酸。
4.编码权利要求1～3任一所述突变体的基因。
5.携带权利要求4所述基因的载体或细胞。
6.表达权利要求1～3任一所述突变体的基因工程菌。
7.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，以枯草芽孢杆菌为宿主。
8.根据权利要求6所述的基因工程菌，其特征在于，以Bacillus subtilis WB600为宿主。
9.一种制备直链麦芽六糖的方法，其特征在于，所述方法是以权利要求1～3任一所述突变体或含有所述突变体的全细胞为催化剂，以淀粉为底物制备直链麦芽六糖。
10.权利要求1～3任一所述的突变体或权利要求6所述的基因工程菌在医药生产、化工或食品领域的应用。
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