CN105039463B - 一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用 - Google Patents
一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种区域选择性专一的转糖基β‑N‑乙酰氨基已糖苷酶的应用,步骤如下:将转糖基β‑N‑乙酰氨基已糖苷酶与对硝基苯‑N‑乙酰‑β‑已糖胺和乳糖溶液混合,配制成反应体系,反应后,终止,纯化,制得N‑乙酰已糖胺寡糖。该方法所需要的底物价格便宜,易于获得,且反应条件温和,操作简便,大大降低了N‑乙酰已糖胺寡糖的生产成本,适合于GlcNAcβ1‑3Galβ1‑4Glc和GalNAcβ1‑3Galβ1‑4Glc的规模化合成,具有潜在的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用,特别涉及一种β-N-乙酰氨基已糖苷酶专一性合成N-乙酰已糖胺寡糖的应用,属于糖苷酶应用技术领域。
技术背景
β-N-乙酰氨基已糖苷酶(β-N-acetylhexosaminidases,EC.3.2.1.52)是一类重要的糖苷水解酶,催化β-N-乙酰氨基已糖苷键的水解,广泛分布于细菌、真菌,植物和动物中,根据氨基酸序列同源性归属于糖苷酶家族GH3、GH20和GH84(http://www.cazy.org/)。其中,细菌来源的β-N-乙酰氨基已糖苷酶在三个家族中均有分布,真核生物来源的主要属于GH20。该类酶既可以水解简单的β-N-乙酰氨基已糖苷,也可以作用于含β-N-乙酰氨基已糖苷键的大分子,如多糖、糖蛋白和糖脂。此外,某些β-N-乙酰氨基已糖苷酶不仅具有水解功能,在体外合适的反应条件下还具有转β-N-乙酰氨基已糖苷的活性,合成重要N-乙酰氨基已糖苷化合物,应用于基础研究、农业和医药等领域,但目前报道的酶转糖基区域选择性不严格,合成产物存在同分异构体,不利于产物纯化,并且产物产量很低。
N-乙酰已糖胺寡糖的合成具有重要意义,如寡糖GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(即lacto-N-trioseII)是存在于母乳低聚糖和很多血型抗原中的糖链结构,但目前糖苷酶法合成产率很低,不超过10%;寡糖GalNAcβ1-3Galβ1-4Glc是血型P抗原的类似物,但目前糖苷酶法合成还是空白。由于现有的合成方法均存在局限性,使得N-乙酰已糖胺寡糖的商品价格一直非常昂贵,需要寻找新的酶源和经济有效的合成方法。
发明内容
本发明针对现有技术的不足,提供一种β-1,3区域选择性专一的高效转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用。
发明概述
本发明的技术要点是利用区域选择性专一的β-N-乙酰氨基已糖苷酶以对硝基苯-N-乙酰-β-D-已糖胺为糖基供体,以乳糖为受体,一步转糖基反应高效合成单一的N-乙酰已糖胺寡糖产物。
发明详述
一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用,所述转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述应用,步骤如下:
将转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶与对硝基苯-N-乙酰-β-D-已糖胺和乳糖溶液混合,配制成反应体系,在45~55℃条件下,反应1.5~4h,终止反应,纯化,制得N-乙酰已糖胺寡糖。
根据本发明优选的,所述转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的制备方法如下:
(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列插入质粒pET-21b中,转化大肠杆菌BL21(DE3),制得重组大肠杆菌;
(2)将步骤(1)制得的重组大肠杆菌经扩大培养,再经过诱导培养后,收集细胞,细胞破碎、纯化,制得转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶。
经检测,转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶单亚基分子量为170kDa,专一性水解β-N-乙酰氨基已糖苷键,以对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺为底物时,最适pH为5.0~7.0,在pH4.0~11.0范围内稳定,适宜的反应温度为45℃~55℃,在低于55℃时稳定;Zn2+和Hg2+显著抑制酶活,NH4 +、Na+、Mg2+、Mn2+、Fe3+、Fe2+、K+、Cu2+、Co2+、Ca2+对酶有激活作用,EDTA对酶活性没有抑制作用。
根据本发明进一步优选的,所述步骤(1)中,核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列以两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)JCM1254的基因组DNA为模板,经PCR扩增获得,PCR引物核苷酸序列如下所示:
引物F:5’-agtcaagcttagcgatgacaatcttgcact-3’
Hind III
引物R:5’-atatctcgagggcgacctcgtcaggcgtgt-3’
Xho I
PCR体系如下(总体积100μL):
10×PCR buffer 10μL,2.5mmol/L dNTP 8μL、20μmol/L引物各2μL、100ng/μL模板1μL、5U/μL TaKaRa LA Taq酶1μL,超纯水76μL。
PCR扩增程序如下:
95℃预变性5分钟;95℃变性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸5分钟,反应30个循环;72℃延伸10分钟。
根据本发明进一步优选的,所述步骤(2)中,扩大培养条件为:37℃、150~180r/min培养至OD600为0.4~0.6。
根据本发明进一步优选的,所述步骤(2)中,扩大培养基为LB培养液,配制方法如下:
蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 7g/L、pH 7.0,121℃灭菌20分钟。
更优的,所述扩大培养基还包括浓度为40~60μg/mL的氨苄霉素。
根据本发明进一步优选的,所述步骤(2)中,诱导培养为在扩大培养后,向培养液中加入IPTG,使培养液中IPTG的浓度为0.5mM~1mM,在25~28℃、100r/min继续过夜培养。
根据本发明优选的,所述反应体系中,对硝基苯-N-乙酰-β-D-已糖胺的反应浓度为10~20mM,乳糖反应浓度为300~400mM,pH为5.0~6.0。
根据本发明优选的,所述反应体系由浓度为50mM的磷酸钠缓冲液配制,pH为5.8。
根据本发明优选的,所述纯化采用柱层析进行纯化。
有益效果
本发明提供了一种区域选择性专一的β-N-乙酰氨基已糖苷酶高效合成N-乙酰已糖胺寡糖的方法,所采用的β-N-乙酰氨基已糖苷酶在以乳糖为受体底物的反应体系中专一性合成GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc或GalNAcβ1-3Galβ1-4Glc,获得单一寡糖产物,不存在其他异构产物的干扰,避免了异构体纯化的复杂步骤,真正适合于N-乙酰已糖胺寡糖的规模化合成及分离制备纯品,具有潜在的应用前景。
附图说明
图1为本发明制备的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶电泳图;
其中,M、分子量标准;1、含β-N-乙酰氨基已糖苷酶的重组菌的粗细胞酶液;2、对照重组菌的粗细胞酶液;3、纯化转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶;
图2为β-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖为受体、以对硝基苯-N-乙酰-β-D-半乳糖胺为供体合成产物的质谱;
图3为β-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖为受体、以对硝基苯-N-乙酰-β-D-半乳糖胺为供体合成产物的核磁氢谱图;
图4为β-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖为受体、以对硝基苯-N-乙酰-β-D-半乳糖胺为供体合成产物的核磁碳谱图;
图5为β-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖为受体、以对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺为供体合成产物的质谱;
图6为β-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖为受体、以对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺为供体合成产物的核磁氢谱图;
图7为β-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖为受体、以对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺为供体合成产物的核磁碳谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明,但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源
两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)JCM1254来源于日本微生物菌种保藏中心(JapanCollection of Microorganisms);
质粒pET-21b购自Novagen公司。
实施例1
一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用,步骤如下:
1.β-N-乙酰氨基已糖苷酶的制备
根据两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)JCM1254预测的β-N-乙酰氨基已糖苷酶基因序列(GenBank Accession No.AB504521.1)设计引物F和引物R:
引物F:5’-agtcaagcttagcgatgacaatcttgcact-3’
Hind III
引物R::5’-atatctcgagggcgacctcgtcaggcgtgt-3’
Xho I
以两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)JCM1254的基因组为模板,PCR扩增β-N-乙酰氨基已糖苷酶基因片段,PCR体系如下(总体积100μL):
10×PCR buffer 10μL,2.5mmol/L dNTP 8μL、20μmol/L引物各2μL、100ng/μL模板1μL、5U/μL TaKaRa LA Taq酶1μL,超纯水76μL。
PCR扩增条件为:
95℃预变性5分钟;95℃变性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸5分钟,反应30个循环;72℃延伸10分钟。
将纯化的PCR产物加入与Hind III和Xho I 37℃双酶切3小时,16℃过夜连接到同样双酶切处理的质粒pET-21b载体上,构建重组质粒。采用CaCl2转化法转化宿主菌大肠杆菌DH5α,转化菌液涂布氨苄霉素LB平板,37℃过夜培养,挑取阳性生长菌菌落,提取质粒验证,测得核苷酸序列见SEQ ID No.1。
将获得的含有重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)接种于LB培养液,37℃,180r/min培养至OD600约0.8,加入终浓度0.5mM IPTG,25℃、100r/min过夜诱导,离心收集细胞,用pH7.0、50mmol/L磷酸钠缓冲溶液重新悬浮菌体,并置于冰水浴中,超声波破碎细胞壁20分钟,12000r/min离心30分钟,上清液通过镍亲和层析纯化获得电泳纯重组酶,SDS-PAGE显示重组酶单亚基分子量约为170kDa(如图1所示)。
2.β-N-乙酰氨基已糖苷酶的性质研究
研究了重组β-N-乙酰氨基已糖苷酶的酶学性质,该酶专一性水解β-D-N-乙酰氨基已糖苷键,对对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺的水解活性高于对硝基苯-N-乙酰-β-D-半乳糖胺。
在适当的温度范围(30℃~70℃)内,每5℃为一个梯度测定酶在该温度下的相对酶活。结果表明:酶适宜反应的温度为45℃~55℃,最适反应温度为55℃。将酶在上述温度梯度下保温30min后测定相对酶活。结果表明:酶在55℃以下比较稳定,55℃以上失活较快,70℃失去所有的酶活。
用不同pH的缓冲液配制酶反应体系,测定相对酶活,结果表明:酶适宜反应的pH范围比较广,为pH4.5~8.0,最适反应pH为5.0~7.0;酶在不同pH的缓冲液中4℃保存24小时,测定相对酶活,结果表明酶在pH 4.0~11.0范围内稳定。
以对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺为底物,在酶活测定反应体系中分别加入终浓度为1mmol/L的各种金属离子,10mmol/L的EDTA,测定相对酶活。结果显示,Zn2+和Hg2+显著抑制酶活,NH4 +、Na+、Mg2+、Mn2+、Fe3+、Fe2+、K+、Cu2+、Co2+、Ca2+对酶有激活作用,EDTA对酶活性没有抑制作用。
上述酶活测定方法为:50μL稀释一倍的纯酶与450μL、2mmol/L的糖苷底物溶液混合,于37℃反应10分钟,加1mL、0.5mol/L的Na2CO3溶液终止反应,测定OD400。
上述不同pH缓冲液分别为:醋酸-醋酸钠缓冲液pH3.6~5.0;磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液pH5.5~8.5;甘氨酸-氢氧化钠缓冲液pH8.7~10.6;碳酸氢钠-氢氧化钠缓冲液pH10.0~11.0。
3.β-N-乙酰氨基已糖苷酶催化合成寡糖GalNAcβ1-3Galβ1-4Glc
将重组β-N-乙酰氨基已糖苷酶在以对硝基苯-N-乙酰-β-D-半乳糖胺为糖基供体,乳糖为糖基受体进行转糖基反应。研究了转糖基反应条件如糖基供体底物浓度(5-30mM)、糖基受体底物浓度(100-400mM)、pH(3.6-12.0)、反应温度(35℃-60℃)和时间(1-14h)对转糖基产物产率的影响,对硝基苯-N-乙酰-β-D-半乳糖胺10mM、乳糖400mM时45℃反应4h产物产率达到最高。将反应产物煮沸10min终止反应,于12000r/min离心10min,取上清液进行薄层层析分析,结果显示反应产物为单一寡糖,高效液相色谱定量分析产物产量为55.4%。进一步对产物采用Bio-gel P2柱层析进行纯化,质谱和核磁共振分析鉴定其结构为GalNAcβ1-3Galβ1-4Glc(图2、图3、图4)。
上述薄层层析条件如下:
薄层层析板点样,在展层剂(正丁醇:无水乙醇:水=5:3:2)中展开,雾喷显色剂(苯胺、二苯胺、磷酸),于86℃烘烤10分钟,糖斑点显色后,产物单一。
上述高效液相色谱分析所用设备及条件如下:
安捷伦(Agilent)1200型高压液相色谱仪;安捷伦G1314B紫外检测器;WatersSpherisorbNH2分析柱(4.6×250mm);流动相为乙腈/水(72:28,v/v);流速为1.0mL/min,柱温30℃;结果分析软件为Agilent Chemstation B.04.01版。反应液按1:1.5(v/v)的比例加水稀释,煮沸离心后上清用0.22μm的滤膜过滤后,进样分析。
4.β-N-乙酰氨基已糖苷酶催化合成寡糖GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc
将重组β-N-乙酰氨基已糖苷酶在以对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺为糖基供体,乳糖为糖基受体进行转糖基反应。研究了转糖基反应条件如糖基供体底物浓度(5-40mM)、糖基受体底物浓度(100-400mM)、pH(3.6-12.0)、反应温度(35℃-60℃)和时间(10-300min)对转糖基产物产率的影响,结果表明酶在对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺20mM、乳糖400mM时,55℃反应90min产物产率达到最高。将反应产物煮沸10min终止反应,于12000r/min离心10min,取上清液进行薄层层析分析,结果显示反应产物为单一寡糖,高效液相色谱定量分析产物产量为44.9%,进一步对产物采用Bio-gel P2柱层析进行纯化,质谱和核磁共振分析鉴定其结构分别为GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(图5、图6、图7)。
薄层层析条件及高效液相色谱分析所用设备及条件同3。
Claims (10)
1.一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用,所述转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示,步骤如下:
将转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶与对硝基苯-N-乙酰-β-D-已糖胺和乳糖溶液混合,配制成反应体系,在45~55℃条件下,反应1.5~4h,终止反应,纯化,制得N-乙酰已糖胺寡糖。
2.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的制备方法如下:
(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列插入质粒pET-21b中,转化大肠杆菌大肠杆菌BL21(DE3),制得重组大肠杆菌;
(2)将步骤(1)制得的重组大肠杆菌经扩大培养,再经过诱导培养后,收集细胞,细胞破碎、纯化,制得转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶。
3.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(1)中,核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列以两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)JCM1254的基因组DNA为模板,经PCR扩增获得,PCR引物核苷酸序列如下所示:
引物F:5’-agtcaagcttagcgatgacaatcttgcact-3’
Hind III
引物R:5’-atatctcgagggcgacctcgtcaggcgtgt-3’
XhoI
PCR体系如下,总体积100µL:
10×PCR buffer 10μL,2.5mmol/L dNTP 8μL、20µmol/L引物各2μL、100ng/μL模板1μL、5U/μL TaKaRa LA Taq酶1μL,超纯水76μL;
PCR扩增程序如下:
95℃预变性5分钟;95℃变性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸5分钟,反应30个循环;72℃延伸10分钟。
4.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(2)中,扩大培养条件为:37℃、150~180r/min培养至OD600为0.4~0.6。
5.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(2)中,扩大培养基为LB培养液,配制方法如下:
蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 7g/L、pH 7.0,121℃灭菌20分钟。
6.如权利要求5所述的应用,其特征在于,所述扩大培养基还包括浓度为40~60µg/mL的氨苄霉素。
7.如权利要求2所述的应用,其特征在于,所述步骤(2)中,诱导培养为在扩大培养后,向培养液中加入IPTG,使培养液中IPTG的浓度为0.5mM~1mM,在25~28℃、100r/min继续过夜培养。
8.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述反应体系中,对硝基苯-N-乙酰-β-D-已糖胺的反应浓度为10~20mM,乳糖反应浓度为300~400mM,pH为5.0~6.0。
9.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述反应体系由浓度为50mM的磷酸钠缓冲液配制,pH为5.8。
10.如权利要求1所述的应用,其特征在于,所述纯化采用柱层析进行纯化。
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