CN105039463B - 一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用 - Google Patents
一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种区域选择性专一的转糖基β‑N‑乙酰氨基已糖苷酶的应用，步骤如下：将转糖基β‑N‑乙酰氨基已糖苷酶与对硝基苯‑N‑乙酰‑β‑已糖胺和乳糖溶液混合，配制成反应体系，反应后，终止，纯化，制得N‑乙酰已糖胺寡糖。该方法所需要的底物价格便宜，易于获得，且反应条件温和，操作简便，大大降低了N‑乙酰已糖胺寡糖的生产成本，适合于GlcNAcβ1‑3Galβ1‑4Glc和GalNAcβ1‑3Galβ1‑4Glc的规模化合成，具有潜在的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用，特别涉及一种β-N-乙酰氨基已糖苷酶专一性合成N-乙酰已糖胺寡糖的应用，属于糖苷酶应用技术领域。
技术背景
β-N-乙酰氨基已糖苷酶(β-N-acetylhexosaminidases，EC.3.2.1.52)是一类重要的糖苷水解酶，催化β-N-乙酰氨基已糖苷键的水解，广泛分布于细菌、真菌，植物和动物中，根据氨基酸序列同源性归属于糖苷酶家族GH3、GH20和GH84(http://www.cazy.org/)。其中，细菌来源的β-N-乙酰氨基已糖苷酶在三个家族中均有分布，真核生物来源的主要属于GH20。该类酶既可以水解简单的β-N-乙酰氨基已糖苷，也可以作用于含β-N-乙酰氨基已糖苷键的大分子，如多糖、糖蛋白和糖脂。此外，某些β-N-乙酰氨基已糖苷酶不仅具有水解功能，在体外合适的反应条件下还具有转β-N-乙酰氨基已糖苷的活性，合成重要N-乙酰氨基已糖苷化合物，应用于基础研究、农业和医药等领域，但目前报道的酶转糖基区域选择性不严格，合成产物存在同分异构体，不利于产物纯化，并且产物产量很低。
N-乙酰已糖胺寡糖的合成具有重要意义，如寡糖GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(即lacto-N-trioseII)是存在于母乳低聚糖和很多血型抗原中的糖链结构，但目前糖苷酶法合成产率很低，不超过10％；寡糖GalNAcβ1-3Galβ1-4Glc是血型P抗原的类似物，但目前糖苷酶法合成还是空白。由于现有的合成方法均存在局限性，使得N-乙酰已糖胺寡糖的商品价格一直非常昂贵，需要寻找新的酶源和经济有效的合成方法。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种β-1,3区域选择性专一的高效转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用。
发明概述
本发明的技术要点是利用区域选择性专一的β-N-乙酰氨基已糖苷酶以对硝基苯-N-乙酰-β-D-已糖胺为糖基供体，以乳糖为受体，一步转糖基反应高效合成单一的N-乙酰已糖胺寡糖产物。
发明详述
一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用，所述转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
上述应用，步骤如下：
将转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶与对硝基苯-N-乙酰-β-D-已糖胺和乳糖溶液混合，配制成反应体系，在45～55℃条件下，反应1.5～4h，终止反应，纯化，制得N-乙酰已糖胺寡糖。
根据本发明优选的，所述转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的制备方法如下：
(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列插入质粒pET-21b中，转化大肠杆菌BL21(DE3)，制得重组大肠杆菌；
(2)将步骤(1)制得的重组大肠杆菌经扩大培养，再经过诱导培养后，收集细胞，细胞破碎、纯化，制得转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶。
经检测，转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶单亚基分子量为170kDa，专一性水解β-N-乙酰氨基已糖苷键，以对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺为底物时，最适pH为5.0～7.0，在pH4.0～11.0范围内稳定，适宜的反应温度为45℃～55℃，在低于55℃时稳定；Zn2+和Hg2+显著抑制酶活，NH4 +、Na+、Mg2+、Mn2+、Fe3+、Fe2+、K+、Cu2+、Co2+、Ca2+对酶有激活作用，EDTA对酶活性没有抑制作用。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(1)中，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列以两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)JCM1254的基因组DNA为模板，经PCR扩增获得，PCR引物核苷酸序列如下所示：
引物F：5’-agtcaagcttagcgatgacaatcttgcact-3’
Hind III
引物R：5’-atatctcgagggcgacctcgtcaggcgtgt-3’
Xho I
PCR体系如下(总体积100μL)：
10×PCR buffer 10μL，2.5mmol/L dNTP 8μL、20μmol/L引物各2μL、100ng/μL模板1μL、5U/μL TaKaRa LA Taq酶1μL，超纯水76μL。
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸5分钟，反应30个循环；72℃延伸10分钟。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(2)中，扩大培养条件为：37℃、150～180r/min培养至OD600为0.4～0.6。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(2)中，扩大培养基为LB培养液，配制方法如下：
蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 7g/L、pH 7.0，121℃灭菌20分钟。
更优的，所述扩大培养基还包括浓度为40～60μg/mL的氨苄霉素。
根据本发明进一步优选的，所述步骤(2)中，诱导培养为在扩大培养后，向培养液中加入IPTG，使培养液中IPTG的浓度为0.5mM～1mM，在25～28℃、100r/min继续过夜培养。
根据本发明优选的，所述反应体系中，对硝基苯-N-乙酰-β-D-已糖胺的反应浓度为10～20mM，乳糖反应浓度为300～400mM，pH为5.0～6.0。
根据本发明优选的，所述反应体系由浓度为50mM的磷酸钠缓冲液配制，pH为5.8。
根据本发明优选的，所述纯化采用柱层析进行纯化。
有益效果
本发明提供了一种区域选择性专一的β-N-乙酰氨基已糖苷酶高效合成N-乙酰已糖胺寡糖的方法，所采用的β-N-乙酰氨基已糖苷酶在以乳糖为受体底物的反应体系中专一性合成GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc或GalNAcβ1-3Galβ1-4Glc，获得单一寡糖产物，不存在其他异构产物的干扰，避免了异构体纯化的复杂步骤，真正适合于N-乙酰已糖胺寡糖的规模化合成及分离制备纯品，具有潜在的应用前景。
附图说明
图1为本发明制备的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶电泳图；
其中，M、分子量标准；1、含β-N-乙酰氨基已糖苷酶的重组菌的粗细胞酶液；2、对照重组菌的粗细胞酶液；3、纯化转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶；
图2为β-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖为受体、以对硝基苯-N-乙酰-β-D-半乳糖胺为供体合成产物的质谱；
图3为β-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖为受体、以对硝基苯-N-乙酰-β-D-半乳糖胺为供体合成产物的核磁氢谱图；
图4为β-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖为受体、以对硝基苯-N-乙酰-β-D-半乳糖胺为供体合成产物的核磁碳谱图；
图5为β-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖为受体、以对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺为供体合成产物的质谱；
图6为β-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖为受体、以对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺为供体合成产物的核磁氢谱图；
图7为β-N-乙酰氨基已糖苷酶以乳糖为受体、以对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺为供体合成产物的核磁碳谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
生物材料来源
两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)JCM1254来源于日本微生物菌种保藏中心(JapanCollection of Microorganisms)；
质粒pET-21b购自Novagen公司。
实施例1
一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用，步骤如下：
1.β-N-乙酰氨基已糖苷酶的制备
根据两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)JCM1254预测的β-N-乙酰氨基已糖苷酶基因序列(GenBank Accession No.AB504521.1)设计引物F和引物R：
引物F：5’-agtcaagcttagcgatgacaatcttgcact-3’
Hind III
引物R:：5’-atatctcgagggcgacctcgtcaggcgtgt-3’
Xho I
以两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)JCM1254的基因组为模板，PCR扩增β-N-乙酰氨基已糖苷酶基因片段，PCR体系如下(总体积100μL)：
10×PCR buffer 10μL，2.5mmol/L dNTP 8μL、20μmol/L引物各2μL、100ng/μL模板1μL、5U/μL TaKaRa LA Taq酶1μL，超纯水76μL。
PCR扩增条件为：
95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸5分钟，反应30个循环；72℃延伸10分钟。
将纯化的PCR产物加入与Hind III和Xho I 37℃双酶切3小时，16℃过夜连接到同样双酶切处理的质粒pET-21b载体上，构建重组质粒。采用CaCl2转化法转化宿主菌大肠杆菌DH5α，转化菌液涂布氨苄霉素LB平板，37℃过夜培养，挑取阳性生长菌菌落，提取质粒验证，测得核苷酸序列见SEQ ID No.1。
将获得的含有重组质粒的重组大肠杆菌BL21(DE3)接种于LB培养液，37℃，180r/min培养至OD600约0.8，加入终浓度0.5mM IPTG，25℃、100r/min过夜诱导，离心收集细胞，用pH7.0、50mmol/L磷酸钠缓冲溶液重新悬浮菌体，并置于冰水浴中，超声波破碎细胞壁20分钟，12000r/min离心30分钟，上清液通过镍亲和层析纯化获得电泳纯重组酶，SDS-PAGE显示重组酶单亚基分子量约为170kDa(如图1所示)。
2.β-N-乙酰氨基已糖苷酶的性质研究
研究了重组β-N-乙酰氨基已糖苷酶的酶学性质，该酶专一性水解β-D-N-乙酰氨基已糖苷键，对对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺的水解活性高于对硝基苯-N-乙酰-β-D-半乳糖胺。
在适当的温度范围(30℃～70℃)内，每5℃为一个梯度测定酶在该温度下的相对酶活。结果表明：酶适宜反应的温度为45℃～55℃，最适反应温度为55℃。将酶在上述温度梯度下保温30min后测定相对酶活。结果表明：酶在55℃以下比较稳定，55℃以上失活较快，70℃失去所有的酶活。
用不同pH的缓冲液配制酶反应体系，测定相对酶活，结果表明：酶适宜反应的pH范围比较广，为pH4.5～8.0，最适反应pH为5.0～7.0；酶在不同pH的缓冲液中4℃保存24小时，测定相对酶活，结果表明酶在pH 4.0～11.0范围内稳定。
以对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺为底物，在酶活测定反应体系中分别加入终浓度为1mmol/L的各种金属离子，10mmol/L的EDTA，测定相对酶活。结果显示，Zn2+和Hg2+显著抑制酶活，NH4 +、Na+、Mg2+、Mn2+、Fe3+、Fe2+、K+、Cu2+、Co2+、Ca2+对酶有激活作用，EDTA对酶活性没有抑制作用。
上述酶活测定方法为：50μL稀释一倍的纯酶与450μL、2mmol/L的糖苷底物溶液混合，于37℃反应10分钟，加1mL、0.5mol/L的Na2CO3溶液终止反应，测定OD400。
上述不同pH缓冲液分别为：醋酸－醋酸钠缓冲液pH3.6～5.0；磷酸氢二钾－磷酸二氢钾缓冲液pH5.5～8.5；甘氨酸－氢氧化钠缓冲液pH8.7～10.6；碳酸氢钠－氢氧化钠缓冲液pH10.0～11.0。
3.β-N-乙酰氨基已糖苷酶催化合成寡糖GalNAcβ1-3Galβ1-4Glc
将重组β-N-乙酰氨基已糖苷酶在以对硝基苯-N-乙酰-β-D-半乳糖胺为糖基供体，乳糖为糖基受体进行转糖基反应。研究了转糖基反应条件如糖基供体底物浓度(5-30mM)、糖基受体底物浓度(100-400mM)、pH(3.6-12.0)、反应温度(35℃-60℃)和时间(1-14h)对转糖基产物产率的影响，对硝基苯-N-乙酰-β-D-半乳糖胺10mM、乳糖400mM时45℃反应4h产物产率达到最高。将反应产物煮沸10min终止反应，于12000r/min离心10min，取上清液进行薄层层析分析，结果显示反应产物为单一寡糖，高效液相色谱定量分析产物产量为55.4％。进一步对产物采用Bio-gel P2柱层析进行纯化，质谱和核磁共振分析鉴定其结构为GalNAcβ1-3Galβ1-4Glc(图2、图3、图4)。
上述薄层层析条件如下：
薄层层析板点样，在展层剂(正丁醇:无水乙醇:水＝5:3:2)中展开，雾喷显色剂(苯胺、二苯胺、磷酸)，于86℃烘烤10分钟，糖斑点显色后，产物单一。
上述高效液相色谱分析所用设备及条件如下：
安捷伦(Agilent)1200型高压液相色谱仪；安捷伦G1314B紫外检测器；WatersSpherisorbNH2分析柱(4.6×250mm)；流动相为乙腈/水(72：28，v/v)；流速为1.0mL/min，柱温30℃；结果分析软件为Agilent Chemstation B.04.01版。反应液按1：1.5(v/v)的比例加水稀释，煮沸离心后上清用0.22μm的滤膜过滤后，进样分析。
4.β-N-乙酰氨基已糖苷酶催化合成寡糖GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc
将重组β-N-乙酰氨基已糖苷酶在以对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺为糖基供体，乳糖为糖基受体进行转糖基反应。研究了转糖基反应条件如糖基供体底物浓度(5-40mM)、糖基受体底物浓度(100-400mM)、pH(3.6-12.0)、反应温度(35℃-60℃)和时间(10-300min)对转糖基产物产率的影响，结果表明酶在对硝基苯-N-乙酰-β-D-葡萄糖胺20mM、乳糖400mM时，55℃反应90min产物产率达到最高。将反应产物煮沸10min终止反应，于12000r/min离心10min，取上清液进行薄层层析分析，结果显示反应产物为单一寡糖，高效液相色谱定量分析产物产量为44.9％，进一步对产物采用Bio-gel P2柱层析进行纯化，质谱和核磁共振分析鉴定其结构分别为GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc(图5、图6、图7)。
薄层层析条件及高效液相色谱分析所用设备及条件同3。
Claims (10)
1.一种区域选择性专一的转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的应用，所述转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的表达基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，步骤如下：
将转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶与对硝基苯-N-乙酰-β-D-已糖胺和乳糖溶液混合，配制成反应体系，在45～55℃条件下，反应1.5～4h，终止反应，纯化，制得N-乙酰已糖胺寡糖。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶的制备方法如下：
（1）将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列插入质粒pET-21b中，转化大肠杆菌大肠杆菌BL21（DE3），制得重组大肠杆菌；
（2）将步骤（1）制得的重组大肠杆菌经扩大培养，再经过诱导培养后，收集细胞，细胞破碎、纯化，制得转糖基β-N-乙酰氨基已糖苷酶。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤（1）中，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因序列以两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）JCM1254的基因组DNA为模板，经PCR扩增获得，PCR引物核苷酸序列如下所示：
引物F：5’-agtcaagcttagcgatgacaatcttgcact-3’
Hind III
引物R：5’-atatctcgagggcgacctcgtcaggcgtgt-3’
XhoI
PCR体系如下，总体积100µL：
10×PCR buffer 10μL，2.5mmol/L dNTP 8μL、20µmol/L引物各2μL、100ng/μL模板1μL、5U/μL TaKaRa LA Taq酶1μL，超纯水76μL；
PCR扩增程序如下：
95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸5分钟，反应30个循环；72℃延伸10分钟。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，扩大培养条件为：37℃、150～180r/min培养至OD600为0.4～0.6。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，扩大培养基为LB培养液，配制方法如下：
蛋白胨10g/L、酵母膏5g/L、NaCl 7g/L、pH 7.0，121℃灭菌20分钟。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述扩大培养基还包括浓度为40～60µg/mL的氨苄霉素。
7.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述步骤（2）中，诱导培养为在扩大培养后，向培养液中加入IPTG，使培养液中IPTG的浓度为0.5mM～1mM，在25～28℃、100r/min继续过夜培养。
8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述反应体系中，对硝基苯-N-乙酰-β-D-已糖胺的反应浓度为10～20mM，乳糖反应浓度为300～400mM，pH为5.0～6.0。
9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述反应体系由浓度为50mM的磷酸钠缓冲液配制，pH为5.8。
10.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述纯化采用柱层析进行纯化。
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