CN112725313B

CN112725313B - 一种β-半乳糖苷酶的制备及其应用

Info

Publication number: CN112725313B
Application number: CN202110110439.XA
Authority: CN
Inventors: 律倩倩; 刘伟治; 刘晓华
Original assignee: Ocean University of China
Current assignee: Ocean University of China
Priority date: 2021-01-27
Filing date: 2021-01-27
Publication date: 2022-04-15
Anticipated expiration: 2041-01-27
Also published as: CN112725313A

Abstract

本发明提供一种β‑半乳糖苷酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明所提供的β‑半乳糖苷酶以葡萄糖，果糖，N‑乙酰氨基葡萄糖甘露糖、甘露醇、山梨醇、D‑阿拉伯糖等为受体的转糖基反应产物经HPLC和TLC检测为单一组分，具有优于其他同功能蛋白的立体异构选择性。本发明所述的β‑半乳糖苷酶还底物利用率高，对转糖基产物的分解能力较低，转糖基反应过程后期糖基供体耗尽时，不会出现产物的水解减少，故而提高了糖基供体的利用率。其产物均一性高。对于以葡萄糖，果糖，N‑乙酰氨基葡萄糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、D‑阿拉伯糖等糖基受体具有专一的立体异构选择性，有利于其后续在均一性寡糖制备中的应用。

Description

一种β-半乳糖苷酶的制备及其应用

技术领域

本发明属于蛋白酶技术领域，具体涉及一种β-半乳糖苷酶的制备及其应用。

背景技术

β-半乳糖苷(β-galactoside)化合物包括众多含有β-半乳糖基的二糖、寡糖、糖甙、糖蛋白、糖脂等，许多天然提取或人工合成的β-半乳糖苷被应用于药物开发，食品，科研等多个领域。如人乳寡糖(Human Milk Oligosaccharide，HMO)是人乳中除乳糖外一系列寡糖，多含有β-半乳糖苷结构。HMO对调节免疫力和肠道稳态有重要作用，HMO或其衍生物还表现出作为诊断工具和抗癌药物的应用潜质。另一类天然存在的β-半乳糖苷类寡糖为ABO，H等多种血型抗原(Blood Group Antigen)，其在组织识别、细胞黏附、免疫应答中发挥重要作用，血型寡糖作为重要的研究材料，在抗癌，器官移植，免疫应答等多方面具有重要应用前景。

现有糖苷类化合物的制备方法分为化学法和/或酶法。其中化学法存在构型选择性差，副反应较多，反应流程复杂，环境友好性差等问题。而随着对糖苷酶类结构功能的深入研究，基于酶法的糖苷类化合物的合成成为新型糖苷类化合物制备的重要手段，其具有反应条件温和，环境友好，底物选择性和立体异构选择性强，从而减少副产物，提高合成效率。酶法合成的工具酶依糖基供体(Donor)和反应机制分为两大类。其一为糖转移酶(Glycosyltransferases)，分为Leloir型和非-Leloir型两类，分别以核苷酸糖苷和磷酸糖苷为糖基供体；其二为糖苷酶类(Glycosidase)及基于此改造而成的糖苷合成酶(Glycosynthase)，分别以糖苷(glycans)，和氟基糖(glycoside fluorides)作为糖基供体。与糖苷转移酶相比，糖苷水解酶所采用的糖苷供体更加便宜易得，适合规模化制备。当前研究的糖苷水解酶在寡糖制备应用中，存在立体异构选择性不完全的特点，产物大多为多种糖苷键类型的混合物，或仅在优化后的有限反应条件下对少数受体具有专一的立体异构选择性。另外糖苷酶的水解副反应和反应后期对转糖基产物的分解限制了其原料的利用率。已有大量研究通过优化反应物比例，反应条件，对糖苷酶进行蛋白工程改造来改善反应转化效率及均一性等。

发明内容

本发明的目的是提供一种β-半乳糖苷酶的制备及其应用，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种β-半乳糖苷酶，其氨基酸序列如下：

SHTNEKQPKANESVSLIAANWNDLATHYQVPEWFIDGKVGIWTHWGVPSSIDENRPHDGSHYGRRMYGVDGFITPSKNPARDRQTTATLTQWHTKRYGHPSEFGYEKLIPAFKAENWDPDALVKFFKDNGARFVMPVATHHDNFDMYDSSHPWNAVDMGPKRDTLQEWKNATIKHGLKFGVSTHLYWAPRFFNAARKYQKPGTLEWQLFAMDYHPTEFATQQSWNQHWYDRSWELIEKYDPDMFNNDSPYPADNFGKVSGVSLFTDFLNKDLVANNGEQTKVLSFKDSKANKSAFTYNLERGMFGEIQAEPWMWATDVSGNWFYRKNLITKMTVSVLLGNAVDAISKNGVVMMNVALRGDGSLPAEQAAYIRAFGDWITINGEGIYGTRPWKIYGEGPLKIVTKRAGENLKQFSAEDIRFTQKDNSLFAFVLASPTQDIHIKALKTDGLLAKNIQSISMLGSSEKIEWHRSEAGLTIRLPKILVPQPVIGFKLLLN(SEQ ID NO:1)；

编码上述β-半乳糖苷酶的基因，其编码基因的一种序列如下：

tctcatactaatgaaaaacaacctaaggcaaatgaaagtgtttcgcttattgcagcaaactggaatgatttggctacacattatcaagtgcccgaatggtttattgacggcaaggttggcatttggactcattggggagtgccttctagcattgatgagaatcgtcctcatgacggttcgcattatggtcgtagaatgtatggagtcgatggctttatcaccccgtctaaaaaccctgcacgggacaggcaaaccacagcgacgttaacgcagtggcatactaagcgatatggccatccttcagagtttggctatgaaaaattaattcccgcgtttaaagctgaaaattgggatccggatgcgttagtcaaattctttaaagataatggggcgcgttttgtcatgccggtcgcaacgcatcatgataattttgacatgtatgattcatctcatccatggaacgccgttgatatgggacctaagcgagatacgcttcaagaatggaaaaatgccaccattaaacatgggcttaaatttggtgtgtctactcatttatactgggcaccacgtttttttaacgcggcgcgaaaataccaaaagcctggaacgttagaatggcaactgtttgcgatggattatcaccctacagagtttgctactcagcagtcttggaaccagcattggtacgaccgcagctgggagttaattgaaaaatatgatccagacatgtttaacaatgattcaccttatccagctgataattttggcaaggtatcaggtgtcagtttatttacagattttcttaataaagatttagtggcgaacaatggtgaacaaactaaggtattgtcatttaaagatagcaaggctaataaatcagcttttacttacaatcttgaacggggtatgtttggtgaaatacaagcagagccgtggatgtgggcgactgatgtatctggtaactggttttatcgcaaaaacttaatcacgaaaatgactgtgtcagtacttctggggaacgccgtcgatgcgattagtaagaatggtgtggtgatgatgaacgttgcactgcgtggcgacggctcattaccagcagaacaagccgcttatattcgcgcttttggtgattggatcactattaatggcgagggtatctatggtactcgaccttggaaaatatacggtgaagggccattaaaaatagtcacgaaacgtgcaggcgaaaacctaaaacagttctcagctgaagatattcgctttacccaaaaagacaatagcttatttgcttttgtgctggcatcgcccacccaagatattcacattaaagcattaaaaaccgacggactgttagcaaaaaacattcaatcgatctctatgcttggttccagtgaaaagattgagtggcatcgaagtgaagctggactgactatcagattacctaaaatcttagtcccacaacctgtgattggatttaagcttttactaaattaa(SEQ ID NO:2)；

本发明还提供一种重组表达载体，所述的重组表达载体上插入有用于编码上述β-半乳糖苷酶基因的核酸片段；

本发明另一个方面还提供一种重组菌株，所述的重组菌株中包含有上述的重组表达载体。

本发明所提供的β-半乳糖苷酶能将半乳糖基转移到多种羟基化合物上。

所述的羟基化合物为半乳糖、果糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、D-阿拉伯糖、葡萄糖、氨基葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等。

本发明所提供的β-半乳糖苷酶以葡萄糖，果糖，N-乙酰氨基葡萄糖甘露糖、甘露醇、山梨醇、D-阿拉伯糖等为受体的转糖基反应产物经HPLC和TLC检测为单一组分，具有优于其他同功能蛋白的立体异构选择性。本发明所述的β-半乳糖苷酶还底物利用率高，对转糖基产物的分解能力较低，转糖基反应过程后期糖基供体耗尽时，不会出现产物的水解减少，故而提高了糖基供体的利用率。

附图说明

图1：PsaGal对岩藻多糖组分糖苷人工底物水解反应图；

图2：PsaGal蛋白序列在NCBI数据库中序列比对结果图；

图3：重组蛋白表达电泳图，其中M：蛋白分子量Marker；line1：纯化的重组PsaGal蛋白；

图4：重组β半乳糖苷酶PsaGal对oNPG的水解活性曲线图；

图5：重组β半乳糖苷酶PsaGal对oNPG的不同pH值下的水解反应相对酶活：

图6：重组β半乳糖苷酶PsaGal对oNPG的水解活性于不同温度下处理1h后的酶活保留图：

图7：PsaGal以半乳糖为受体的转糖基反应产物的TLC检测图，其中PsaGal催化以半乳糖为受体的转糖基反应、Line1:空白对照(示糖基供体oNPG，糖基受体Gal)、Line2：转糖基反应产物(示未反应完全的oNPG，糖基受体Gal，转糖基产物半乳寡糖GOS)；

图8：糖基受体为半乳糖Gal的转糖基HPLC检测图；

图9：糖基受体为葡萄糖Glc的转糖基HPLC检测图；

图10：糖基受体为氨基葡萄糖GlcN的转糖基HPLC检测图；

图11：糖基受体为N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc的转糖基HPLC检测图；

图12：糖基受体为果糖Fru的转糖基HPLC检测图；

图13：糖基受体为甘露糖Man的转糖基HPLC检测图；

图14：糖基受体为甘露醇Mat的转糖基HPLC检测图；

图15：糖基受体为山梨醇Sot的转糖基HPLC检测图；

图16：转糖基产物的质谱分析图。

具体实施方式

本发明的β-半乳糖苷酶PsaGal来源于岩藻多糖降解菌株Pseudoaleromonasp.OU03的岩藻多糖降解基因簇。研究表明该β-半乳糖苷酶PsaGal属于糖苷水解酶家族29(GH29)，具有2-硝基苯酚-β-D-吡喃半乳糖苷(oNPG)水解活性，但不能降解pNP-α-L-岩藻糖苷，乳糖，乳果糖等GH29家族和β-半乳糖苷酶常见底物。该酶以oNPG为糖基供体，多种单糖及衍生物作为单糖受体时，进行高效的转糖基反应。研究发现，当糖基受体为葡萄糖及其衍生物时，基于PsaGal的糖基化反应中具有两个优点：其一，产物的成分单一，产物二糖几乎不作为受体产生三糖以上副产物，只产生单一键型的空间异构产物；其二，反应产物易于积累，对于一般糖苷酶进行转糖基反应的同时，产生的转糖基产物也会被糖苷酶水解，从而限制反应效率，而该酶无法分解，这十分有利于转糖基产物在反应后期的积累。因此该酶具有高效合成单一构型的β-半乳糖苷的功能。

研究表明该酶以oNPG为糖基供体时能将半乳糖基转移到多种羟基化合物上，如半乳糖、果糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、D-阿拉伯糖、葡萄糖、氨基葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等，具有广泛的糖基受体特异性。上述受体转糖基产物，除半乳糖和氨基葡萄糖以外，经TLC检测为单一斑点，经HPLC检测均为单一信号峰，证明其转糖基产物具有较高的均一性，有利于后续的产业化应用研究。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：β-半乳糖苷酶PsaGal的筛选及序列分析

岩藻多糖降解菌株Pseudoaleromona sp.OU03能够以纯化的海带岩藻多糖作为唯一碳源生长，将生长于普通培养基和以岩藻多糖为单一碳源的该菌株进行表达谱差异分析，发现显著上调表达的基因位于一个多糖降解基因簇上，经基因功能预测其上包含PsaGal等5个糖苷酶家族基因，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2；氨基酸序列为SEQID NO:1。

将重组表达的蛋白采用oNPG等人工合成底物进行糖苷酶活性的筛选，测得PsaGal具有β-半乳糖苷酶活性，由于其所属的GH29家族具有保持型催化机制，具有催化糖苷转移反应的潜在能力(图1)。

经NCBI nr数据库Blastp序列比对PsaGal与多种近缘物种来源的蛋白序列高度相似(>60％),这些序列相关蛋白均注释为α-L-岩藻糖苷酶(图2)，没有关于β-半乳糖苷酶活性的描述或研究。

实施例2：β-半乳糖苷酶PsaGal的重组表达

1、β-半乳糖苷酶PsaGal的重组表达载体的构建：

根据PsaGal的基因序列设计引物：

PsaGal-F：ggaattcGCTTCTCATACTAATGAAAA；

PsaGal-R:cctcgagTTAATTTAGTAAAAGCTT。

以Pseudoaleromona sp.OU03基因组为模板，使用PrimeSTAR HS DNA Polymerase(TaKaRa)通过PCR扩增获得PsaGal的DNA片段，PCR体系如下：

PCR反应条件为(98℃-10sec.55℃-5sec.72℃1.5min.)×30循环

将纯化后的PCR产物使用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切37℃双酶切20h，使用T4 DNA连接酶(TaKaRa)与同样处理的pET32a载体于16℃连接5小时。将连接产物使用CaCl₂转化法转化BL21(DE3)表达菌株，涂布于LB平板，过夜培养后，挑取阳性菌落，经PCR检测后送测序验证(上海生工生物有限公司)与基因核苷酸序列对比，选取正确的重组克隆。

2、重组蛋白的制备：将过夜培养的pET32a-PsaGal重组表达菌株接种于LB(含氨苄100ppm)培养液，接种比例为1/100，于37℃，180rpm培养至OD600为0.8，加入0.2mM的IPTG于16℃180rpm培养20h。离心收取菌体。将菌体以Tris-HCl缓冲液(20mM Tris-HCl，500mMNaCl 10mM咪唑pH7.5)重悬，超声破碎，12000g离心30min去除沉淀，上清液经镍柱亲和层析纯化，经含200mM咪唑的Tris-HCl缓冲液洗脱后。经蛋白酶酶切后流经镍柱3次去除Trx标签，蛋白经SDS-PAGE检测样品分子量为58kDa，纯度大于90％(图3)。

实施例3：重组蛋白的β-半乳糖苷酶PsaGal水解活性

待测样品，加入含1mM oNPG的PBS溶液反应体系中，于25℃反应，监测OD405nm光吸收的变化。以反应初始阶段产物邻硝基苯酚(oNP)的生成量斜率计算反应速率。以相同缓冲液中oNP的OD405nm吸光度制作标准曲线。将1min水解oNPG释放1μmol oNP的酶量作为一个活力单位1U。

结果表明β-半乳糖苷酶PsaGal水解oNPG，比活力0.3U/mg，Km为0.2mM，kcat为0.96S^-1(图4)。酶对oNPG的最适pH值为7.0-7.5(图5)，在50℃以下至少保持1h活力稳定(图6)。

实施例4：β-半乳糖苷酶PsaGal转糖基活性研究：

利用重组β-半乳糖苷酶PsaGal进行转糖基反应，以oNPG为糖基供体，多种单糖为糖基受体。PsaGal重组酶终浓度0.4U/mL分三次添加，糖基供体浓度为40mM，糖基受体浓度为100mM，pH7.0-7.5，反应温度25-30℃，反应时间3h。至反应底物消耗完全。将产物99℃加热10min灭活蛋白，于12000rpm离心5min去除沉淀后冷冻干燥。采用薄层层析和高效液相色谱检测产物。

1.转糖基产物的TLC

将转糖基产物进行薄层层析分析，TLC薄板(Silica gel60 F553，Merck)点样后干燥，在展开剂(正丁醇：甲酸：水＝4：6：1)，层析40min，经充分干燥后，采用苯胺-二苯胺法染色，于110℃烘烤显色10min，除半乳糖以外的新增斑点即转糖基产物，确定有转糖基活性(图7)。

2.转糖基产物的高效液相色谱分析

HPLC设备为赛默飞Ultimate 3000高效液相色谱系统，检测器为SEDERE LT-ELSDSEDEX 80，层析柱为Shodex Asahipak NH2P-50 4E。检测流动相为乙腈：水(70：30)，流速1mL/min，柱温30℃。图8是糖基受体为半乳糖Gal的转糖基HPLC检测图，添加受体Gal后，比只添加oNPG的样品增加了额外的信号峰GOS(箭头所示)。图9是糖基受体为葡萄糖Glc的转糖基HPLC检测图，箭头示产物峰；图10是糖基受体为氨基葡萄糖GlcN的转糖基HPLC检测图，箭头示产物峰。图11是糖基受体为N-乙酰氨基葡萄糖GlcNAc的转糖基HPLC检测图，箭头示产物峰；图12是糖基受体为果糖Fru的转糖基HPLC检测图，箭头示产物峰。图13是糖基受体为甘露糖Man的转糖基HPLC检测图，箭头示产物峰。图14是糖基受体为甘露醇Mat的转糖基HPLC检测图，箭头示产物峰。图15是糖基受体为山梨醇Sot的转糖基HPLC检测图，箭头示产物峰。

3.转糖基产物的质谱分析

以葡萄糖为受体的转糖基反应产物，经HPLC检测显示为单一的产物峰，为了确认该产物的分子量，按照前述转糖基产物制备方法，以葡萄糖为糖基受体，制备转糖基产物，按照前述HPLC检测得到的产物保留时间(11min)收集HPLC的相应流出组分，分离产物组分经真空冷冻干燥后，扫描模式正离子+ESI，扫描范围100-800(m/z)。

质谱检测到荷质比为365的组分，根据样品成分推定为[Gal-Glc][Na⁺]。确定受体为葡萄糖的转糖基产物为半乳-葡萄二糖。说明本蛋白可以将oNPG的β-半乳糖基转移至葡萄糖上生成单一的半乳-葡萄二糖组分(图16)。

综上，本发明所提供的β-半乳糖苷酶具有如下的优点：

1、底物的高效转化

在转糖基反应后期，因糖基供体的含量下降对酶的竞争性降低，反应平衡逐渐倾向于将转糖基产物水解，因此一般的转糖基研究中将糖基供体的消耗量限制在80％以内，以避免水解反应速率增加导致的产物减少。如S.L.Arreola利用来自Bifidobacteriumbreve DSM20213的半乳糖苷酶进行异乳糖和半乳寡糖的合成，供体消耗超过70％-80％时产物含量因分解而减少。而本发明所提供的蛋白在反应后期糖基供体几乎耗尽转糖基产物含量依然持续积累。

2、具有良好的立体异构专一性

大多转糖基反应的产物同时具有多种糖苷键类型。大肠杆菌的β半乳糖糖苷酶LacZ合成异乳糖的过程中产生的异乳糖占总产物含量的40％左右,半乳β(1-3)葡萄二糖以及少量三糖。来自Bacillus circulans的半乳糖苷酶在以N-乙酰氨基葡萄糖为受体的反应中，在不同的供/受体比条件下，产物多为1-3，1-4，1-6糖苷键的混合物，其中丰度最高的产物含量优化后可达到87％-90％之间。当受体为葡萄糖、N-乙酰葡萄糖、果糖、甘露糖，山梨糖，甘露醇、D-阿拉伯糖，蔗糖，麦芽糖，基于HPLC显示该新酶所产生的转糖基产物均为单一组分，具有专一的立体异构选择性。

序列表

<110> 中国海洋大学

<120> 一种β-半乳糖苷酶的制备及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 496

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Ser His Thr Asn Glu Lys Gln Pro Lys Ala Asn Glu Ser Val Ser Leu

1 5 10 15

Ile Ala Ala Asn Trp Asn Asp Leu Ala Thr His Tyr Gln Val Pro Glu

20 25 30

Trp Phe Ile Asp Gly Lys Val Gly Ile Trp Thr His Trp Gly Val Pro

35 40 45

Ser Ser Ile Asp Glu Asn Arg Pro His Asp Gly Ser His Tyr Gly Arg

50 55 60

Arg Met Tyr Gly Val Asp Gly Phe Ile Thr Pro Ser Lys Asn Pro Ala

65 70 75 80

Arg Asp Arg Gln Thr Thr Ala Thr Leu Thr Gln Trp His Thr Lys Arg

85 90 95

Tyr Gly His Pro Ser Glu Phe Gly Tyr Glu Lys Leu Ile Pro Ala Phe

100 105 110

Lys Ala Glu Asn Trp Asp Pro Asp Ala Leu Val Lys Phe Phe Lys Asp

115 120 125

Asn Gly Ala Arg Phe Val Met Pro Val Ala Thr His His Asp Asn Phe

130 135 140

Asp Met Tyr Asp Ser Ser His Pro Trp Asn Ala Val Asp Met Gly Pro

145 150 155 160

Lys Arg Asp Thr Leu Gln Glu Trp Lys Asn Ala Thr Ile Lys His Gly

165 170 175

Leu Lys Phe Gly Val Ser Thr His Leu Tyr Trp Ala Pro Arg Phe Phe

180 185 190

Asn Ala Ala Arg Lys Tyr Gln Lys Pro Gly Thr Leu Glu Trp Gln Leu

195 200 205

Phe Ala Met Asp Tyr His Pro Thr Glu Phe Ala Thr Gln Gln Ser Trp

210 215 220

Asn Gln His Trp Tyr Asp Arg Ser Trp Glu Leu Ile Glu Lys Tyr Asp

225 230 235 240

Pro Asp Met Phe Asn Asn Asp Ser Pro Tyr Pro Ala Asp Asn Phe Gly

245 250 255

Lys Val Ser Gly Val Ser Leu Phe Thr Asp Phe Leu Asn Lys Asp Leu

260 265 270

Val Ala Asn Asn Gly Glu Gln Thr Lys Val Leu Ser Phe Lys Asp Ser

275 280 285

Lys Ala Asn Lys Ser Ala Phe Thr Tyr Asn Leu Glu Arg Gly Met Phe

290 295 300

Gly Glu Ile Gln Ala Glu Pro Trp Met Trp Ala Thr Asp Val Ser Gly

305 310 315 320

Asn Trp Phe Tyr Arg Lys Asn Leu Ile Thr Lys Met Thr Val Ser Val

325 330 335

Leu Leu Gly Asn Ala Val Asp Ala Ile Ser Lys Asn Gly Val Val Met

340 345 350

Met Asn Val Ala Leu Arg Gly Asp Gly Ser Leu Pro Ala Glu Gln Ala

355 360 365

Ala Tyr Ile Arg Ala Phe Gly Asp Trp Ile Thr Ile Asn Gly Glu Gly

370 375 380

Ile Tyr Gly Thr Arg Pro Trp Lys Ile Tyr Gly Glu Gly Pro Leu Lys

385 390 395 400

Ile Val Thr Lys Arg Ala Gly Glu Asn Leu Lys Gln Phe Ser Ala Glu

405 410 415

Asp Ile Arg Phe Thr Gln Lys Asp Asn Ser Leu Phe Ala Phe Val Leu

420 425 430

Ala Ser Pro Thr Gln Asp Ile His Ile Lys Ala Leu Lys Thr Asp Gly

435 440 445

Leu Leu Ala Lys Asn Ile Gln Ser Ile Ser Met Leu Gly Ser Ser Glu

450 455 460

Lys Ile Glu Trp His Arg Ser Glu Ala Gly Leu Thr Ile Arg Leu Pro

465 470 475 480

Lys Ile Leu Val Pro Gln Pro Val Ile Gly Phe Lys Leu Leu Leu Asn

485 490 495

<210> 2

<211> 1491

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tctcatacta atgaaaaaca acctaaggca aatgaaagtg tttcgcttat tgcagcaaac 60

tggaatgatt tggctacaca ttatcaagtg cccgaatggt ttattgacgg caaggttggc 120

atttggactc attggggagt gccttctagc attgatgaga atcgtcctca tgacggttcg 180

cattatggtc gtagaatgta tggagtcgat ggctttatca ccccgtctaa aaaccctgca 240

cgggacaggc aaaccacagc gacgttaacg cagtggcata ctaagcgata tggccatcct 300

tcagagtttg gctatgaaaa attaattccc gcgtttaaag ctgaaaattg ggatccggat 360

gcgttagtca aattctttaa agataatggg gcgcgttttg tcatgccggt cgcaacgcat 420

catgataatt ttgacatgta tgattcatct catccatgga acgccgttga tatgggacct 480

aagcgagata cgcttcaaga atggaaaaat gccaccatta aacatgggct taaatttggt 540

gtgtctactc atttatactg ggcaccacgt ttttttaacg cggcgcgaaa ataccaaaag 600

cctggaacgt tagaatggca actgtttgcg atggattatc accctacaga gtttgctact 660

cagcagtctt ggaaccagca ttggtacgac cgcagctggg agttaattga aaaatatgat 720

ccagacatgt ttaacaatga ttcaccttat ccagctgata attttggcaa ggtatcaggt 780

gtcagtttat ttacagattt tcttaataaa gatttagtgg cgaacaatgg tgaacaaact 840

aaggtattgt catttaaaga tagcaaggct aataaatcag cttttactta caatcttgaa 900

cggggtatgt ttggtgaaat acaagcagag ccgtggatgt gggcgactga tgtatctggt 960

aactggtttt atcgcaaaaa cttaatcacg aaaatgactg tgtcagtact tctggggaac 1020

gccgtcgatg cgattagtaa gaatggtgtg gtgatgatga acgttgcact gcgtggcgac 1080

ggctcattac cagcagaaca agccgcttat attcgcgctt ttggtgattg gatcactatt 1140

aatggcgagg gtatctatgg tactcgacct tggaaaatat acggtgaagg gccattaaaa 1200

atagtcacga aacgtgcagg cgaaaaccta aaacagttct cagctgaaga tattcgcttt 1260

acccaaaaag acaatagctt atttgctttt gtgctggcat cgcccaccca agatattcac 1320

attaaagcat taaaaaccga cggactgtta gcaaaaaaca ttcaatcgat ctctatgctt 1380

ggttccagtg aaaagattga gtggcatcga agtgaagctg gactgactat cagattacct 1440

aaaatcttag tcccacaacc tgtgattgga tttaagcttt tactaaatta a 1491

Claims

1.一种β-半乳糖苷酶，其特征在于，所述的β-半乳糖苷酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的β-半乳糖苷酶。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

4.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体上插入权利要求2所述的基因的核酸片段。

5.一种重组菌株，其特征在于，所述的重组菌株中包含有权利要求4所述的重组表达载体。

6.权利要求1所述的β-半乳糖苷酶在将半乳糖基转移到羟基化合物上的应用；所述的羟基化合物为半乳糖、果糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、D-阿拉伯糖、葡萄糖、氨基葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、蔗糖或麦芽糖。

7.一种将半乳糖基转移到羟基化合物上的方法，其特征在于，所述的方法是使用权利要求1所述的β-半乳糖苷酶将半乳糖基转移到羟基化合物上；所述的羟基化合物为半乳糖、果糖、甘露糖、甘露醇、山梨醇、D-阿拉伯糖、葡萄糖、氨基葡萄糖、N-乙酰氨基葡萄糖、蔗糖或麦芽糖。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的β-半乳糖苷酶是由权利要求5所述的重组菌株表达制备的。