CN116790649A - 一种酶法合成udp-葡萄糖醛酸和udp-n-乙酰氨基葡萄糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及UDP‑葡萄糖醛酸和UDP‑N‑乙酰氨基葡萄糖的体外酶法制备，属于生物工程及生物合成技术领域。本发明将不同来源的葡萄糖醛酸激酶GlcAK、UDP‑葡萄糖醛酸焦磷酸化酶USP、N‑乙酰己胺1‑激酶NahK、N‑乙酰葡糖胺激酶AmgK、UDP‑N‑乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶GlmU、聚磷酸激酶PPK的基因在大肠杆菌BL21(DE3)异源表达，得到的重组酶组合成功催化合成UDP‑葡萄糖醛酸和UDP‑N‑乙酰氨基葡萄糖。偶联ATP循环体系后，将反应体系扩大并提高底物浓度，50mL体系中UDP‑葡萄糖醛酸产量可达12.9g·L‑1，UDP‑N‑乙酰氨基葡萄糖产量可达18.2g·L‑1。本发明实现了UDP‑葡萄糖醛酸和UDP‑N‑乙酰氨基葡萄糖的高效催化合成，具有步骤简短，收率高，反应温和等优点，具有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶法合成UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖的方法，属于生物工程及生物合成技术领域。
背景技术
UDP-葡萄糖醛酸(uridine-5’-diphosphate glucuronic acid，UDP-GlcA)、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖(uridine-5’-diphosphate N-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc)属于糖核苷酸，是相应的单糖异头体羟基与尿苷二磷酸连接形成的。糖核苷酸广泛存在与多种生物细胞内，在各类体内外研究中起到了不可或缺的作用。在生物体内，糖核苷酸作为单糖的高能供体底物，参与生物细胞和机体内多种糖代谢途径与重要的糖基化过程。糖胺聚糖如透明质酸、硫酸软骨素、肝素等，其分子的基本二糖骨架单位中含有葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖。因此，UDP-GlcA和UDP-GlcNAc可作为糖基供体，在糖胺聚糖寡糖链的合成与相关糖基转移酶和分子生物学研究中具有重要应用。同时两者还可以在适当的酶催化下转化为其他尿苷二磷酸糖类，因此在糖核苷酸的相关研究中也具有重要的研究价值。
目前，UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的获取方法主要有直接提取法、化学法及酶法。直接提取法因二者在植物和哺乳动物细胞内的浓度大多处于pmol或nmol级别，因此难以大量获得，目前也尚无以直接提取的方式规模化制备UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的报道；UDP-GlcA和UDP-GlcNAc固有的性质使化学法合成具有一定难度。化学法合成UDP-GlcA和UDP-GlcNAc存在合成步骤繁琐、催化产率低等缺点，目前还没有通用的可以高效合成UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的化学法；酶法方便，收率较高，并且具有合成步骤相对较少、反应温和等优点。专利DE102018116200公开了利用糖核苷酸的Salvage Pathway路线及途径酶进行UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的合成，以及利用PPiase对反应中PPi进行降解的技术方案，但是，SalvagePathway路线进行合成中会发生副产物PPi的积累，并且反应需要ATP进行能量供应。对于如何解决利用糖核苷酸的Salvage Pathway路线合成UDP-GlcA和UDP-GlcNAc时的副产物PPi积累以及ATP再生的问题，现有技术均是利用一种酶先将副产物PPi降解，再用另一种酶催化添加的磷酸供体(PolyPn)实现ATP的循环再生。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是以酶法制备UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖时，酶转化率低、副产物积累及ATP供应不足导致的反应产率低的问题。
[技术方案]
为了解决现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供了酶法高效大量制备UDP-葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)的方法。本方法所使用的是糖核苷酸的Salvage Pathway路线。本方法通过较为廉价的葡萄糖醛酸(GlcA)和N-乙酰-葡萄糖胺(GlcNAc)为底物，分别经过两步反应，最终得到昂贵的UDP-GlcA和UDP-GlcNAc；通过偶联聚磷酸激酶，利用反应副产物腺苷二磷酸(ADP)、焦磷酸(PPi)实现腺苷三磷酸(ATP)的循环，提高反应转化率，降低生产成本；最后将体系扩大、提高底物浓度实现UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的高效大量制备。
本发明披露了一种酶法制备UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的方法，所述方法分别以GlcA为底物以葡萄糖醛酸激酶(GlcAK)、UDP-葡萄糖醛酸焦磷酸化酶(USP)催化制备UDP-GlcA；以GlcNAc为底物，以N-乙酰己胺1-激酶(NahK)或N-乙酰葡糖胺激酶(AmgK)，偶联UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(GlmU)催化制备UDP-GlcNAc，所述方法还使用聚磷酸激酶(PPK)同时降解PPi并利用ADP合成ATP，实现减少副产物PPi和ATP的循环再生的目的。
在本发明的一种实施方式中，所述GlcAK来源于Arabidopsis thaliana或Daniorerio，编码GlcAK的基因的核苷酸序列分别为SEQ ID No.1、SEQ ID No.2，GlcAK的氨基酸序列分别为SEQ ID No.3、SEQ ID No.4。
在本发明的一种实施方式中，所述USP来源于Bifidobacterium longumsubsp.infantis ATCC 15697，编码USP的基因的核苷酸序列为SEQ ID No.5，USP的氨基酸序列为SEQ IDNo.6。
在本发明的一种实施方式中，所述NahK来源于Bifidobacterium longumsubsp.longum JCM 1217，编码NahK的基因的核苷酸序列为SEQ ID No.7，NahK的氨基酸序列为SEQ IDNo.8。
在本发明的一种实施方式中，所述AmgK来源于Pseudomonas putida KT2440或Pseudomonas aeruginosa，编码AmgK的基因的核苷酸序列分别为SEQ ID No.9、SEQIDNo.10，AmgK的氨基酸序列分别为SEQ ID No.11、SEQ ID No.12。
在本发明的一种实施方式中，所述GlmU来源于Bacillus subtilis、Corynebacterium glutamicum、Escherichia coli、Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus或Pseudomonas putida，编码GlmU的基因的核苷酸序列分别为SEQID No.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ IDNo.16或SEQ ID No.17，GlmU的氨基酸序列分别为SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ IDNo.20、SEQ ID No.21或SEQ ID No.22。
在本发明的一种实施方式中，所述PPK来源于Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus，编码PPK的基因的核苷酸序列为SEQ ID No.23，PPK的氨基酸序列为SEQ ID No.24。
在本发明的一种实施方式中，所述GlcAK、USP、NahK或AmgK、GlmU、PPK分别是将SEQID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.5、SEQ ID No.7、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ IDNo.13、SEQ ID No.14、SEQ ID No.15、SEQ ID No.16、SEQ ID No.17、SEQ ID No.23基因构建至pET系列载体，在大肠杆菌中表达后纯化得到的。
在本发明的一种实施方式中，所述pET系列载体包括pET28a(+)。
在本发明的一种实施方式中，所述大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
在本发明的一种实施方式中，所述UDP-GlcA的酶法制备，是在终浓度为80-120mM的Tris缓冲液(pH＝7.4)中，加入终浓度为8-12mM的氯化镁，加入GlcA、ATP、UTP为底物，加入GlcAK、USP和PPK。
在本发明的一种实施方式中，所述UDP-GlcNAc的酶法制备，是在终浓度为80-120mM的Tris缓冲液(pH＝7.4)中，加入终浓度为8-12mM的氯化镁，加入GlcNAc、ATP、UTP为底物，加入NahK/AmgK以及GlmU和PPK。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中GlcA、ATP、UTP底物浓度摩尔比为(1-3)：1：1；所述反应体系中GlcAK：USP：PPK摩尔比为(0.5-1.5)：1：1。
优选的，所述反应体系中GlcA、ATP、UTP底物浓度摩尔比为2：1：1；所述反应体系中GlcAK：USP：PPK摩尔比为1：1：1。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中GlcA、ATP、UTP底物浓度摩尔比为(1-3)：1：1；所述反应体系中GlcAK：USP：PPK摩尔比为(0.5-1.5)：1：1；所述反应体系中GlcA底物浓度优选为10-50mM；所述反应体系中GlcAK优选为0.005-0.01mM。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中GlcNAc、ATP、UTP底物浓度摩尔比为(1-2)：1：1；所述反应体系中NahK或AmgK：GlmU：PPK摩尔比为(0.5-1.5)：1：1。
优选的，所述反应体系中NahK或AmgK：GlmU：PPK摩尔比为1：1：1。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中GlcNAc、ATP、UTP底物浓度摩尔比为(1-2)：1：1；所述反应体系中NahK或AmgK：GlmU：PPK摩尔比为(0.5-1.5)：1：1；所述反应体系中GlcNAc底物浓度优选为10-40mM；所述反应体系中NahK或AmgK浓度优选为0.005-0.01mM。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系的反应温度为25-35℃。
优选的，所述反应体系的反应温度为30℃。
在本发明的一种实施方式中，所述反应体系的反应时间为1.5-5h。
在本发明的一种实施方式中，所述UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的检测方法为：反应结束后，将反应液煮沸5min，离心5min后，过滤膜，使用HPLC进行检测，HPLC检测条件为：使用YMC-Pack Polyamine II色谱柱(250mm×4.6mm，5μm)，柱温：30℃；紫外检测波长：210nm；流动相：80mM的NaH2PO4溶液(含3％乙腈作为氨基柱保护试剂)；洗脱方式：等度洗脱；流速：0.5mL·min-1；上样量为5μL。
本发明的有益效果：本发明首次将PPK酶用于降解PPi的同时利用ADP合成ATP，实现了以Salvage Pathway路线合成UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖时副产物的降解及ATP循环供应的提升。此外，本发明将不同来源的葡萄糖醛酸激酶GlcAK、UDP-葡萄糖醛酸焦磷酸化酶USP、N-乙酰己胺1-激酶NahK、N-乙酰葡糖胺激酶AmgK、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶GlmU、聚磷酸激酶PPK的基因在大肠杆菌中成功实现高效异源表达。得到的重组酶组合成功催化合成UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖。最终在50mL反应体系中UDP-葡萄糖醛酸产量可达12.9g/L，UDP-N-乙酰氨基葡萄糖产量可达18.2g/L，具有重要的应用前景。
附图说明
图1：UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的酶法合成途径。
图2：UDP-GlcA和UDP-GlcNAc的酶法合成途径偶联聚磷酸激酶。
图3：SDS-PAGE分析12种重组蛋白的表达情况。
图4：A：反应体系为1.5mL，底物GlcA为10mM，ATP和UTP均为5mM，且每种酶的添加量均为0.005mM时，两种葡萄糖醛酸激酶GlcAK分别与一种UDP-葡萄糖醛酸焦磷酸化酶USP组合催化90min后合成UDP-GlcA的量；B：反应体系为1.5mL，底物GlcNAc为10mM，ATP和UTP均为5mM，且每种酶的添加量均为0.005mM时，一种N-乙酰己胺1-激酶NahK和两种N-乙酰葡糖胺激酶AmgK分别与五种UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶GlmU组合催化90min后合成UDP-GlcNAc的量。
图5：A：反应体系为1.5mL，底物GlcA为10mM，ATP和UTP均为5mM，且每种酶的添加量均为0.005mM时，偶联聚磷酸激酶SePPK，两种葡萄糖醛酸激酶GlcAK分别与一种UDP-葡萄糖醛酸焦磷酸化酶USP组合催化90min后合成UDP-GlcA的量；B：反应体系为1.5mL，底物GlcNAc为10mM，ATP和UTP均为5mM，且每种酶的添加量均为0.005mM，偶联聚磷酸激酶SePPK，一种N-乙酰己胺1-激酶NahK和两种N-乙酰葡糖胺激酶AmgK分别与五种UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶GlmU组合催化90min后合成UDP-GlcNAc的量。
图6：反应体系为50mL，底物GlcA为50mM，ATP和UTP均为25mM，且每种酶的添加量均为0.01mM时，酶AtGlcAK、酶BlUSP和酶SePPK组合催化5h后合成UDP-GlcA的量；以及反应体系为50mL，底物GlcNAc、ATP和UTP均为40mM，且每种酶的添加量均为0.01mM时，酶PpAmgK、酶SeGlmU和酶SePPK组合催化5h后合成UDP-GlcNAc的量。
图7：聚磷酸激酶SePPK催化ADP和PPi合成ATP。
具体实施方式
为了理解本发明，下面以实施例进一步说明本发明，但不意于限制本发明的保护范围。
对比例1：UDP-GlcNAc的酶法制备
(1)重组菌株的构建
将NCBI报道的Arabidopsis thaliana和Danio rerio来源的葡萄糖醛酸激酶GlcAK的序列，Bifidobacterium longum subsp.infantis ATCC 15697来源的UDP-葡萄糖醛酸焦磷酸化酶USP，Bifidobacterium longum subsp.longum JCM 1217来源的N-乙酰己胺1-激酶NahK，Pseudomonas putida和Pseudomonas aeruginosa来源的N-乙酰葡糖胺激酶AmgK，Bacillus subtilis、Corynebacterium glutamicum、Escherichia coli、Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus和Pseudomonas putida来源的UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶GlmU，Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus来源的聚磷酸激酶PPK的氨基酸序列(Accession Number分别为OAP06484.1，XP_005157584.1，WP_007054277.1，WP_276342752.1，WHA83530.1，WP_274146999.1，WP_003226732.1，WP_011013993.1，WP_000933736.1，WP_012677301.1，WP_010955885.1)提供给天霖生物科技无锡有限公司，由公司按照大肠杆菌BL21(DE3)密码子偏好性进行优化，优化后的基因序列继续交由天霖生物科技无锡有限公司合成并连接至表达载体pET-28a(+)的BamH I和HindIII酶切位点之间，并在酶的N端添加6xHis标签，得到12种重组菌株21-AtGlcAK，21-DrGlcAK，21-BlUSP，21-BlNahK，21-PpAmgK，21-PaAmgK，21-BsGlmU，21-CgGlmU，21-EcGlmU，21-SeGlmU，21-PpGlmU，21-SePPK。
(2)重组菌株的摇瓶发酵
将对比例1构建的12种重组菌株分别在LB固体培养基上划线，置于37℃恒温培养箱培养至长出单菌落。将单菌落分别接种于含5mL LB培养基的50mL摇菌管中，于37℃、220rpm培养8h，获得种子培养物。将种子培养物按2％(v/v)接种量转接到含50mL TB培养基的250mL摇瓶中，于37℃、220rpm培养至OD600达到1.0，加入终浓度为0.2mM的IPTG进行诱导，之后将摇瓶转至30℃、220rpm培养12h。
收集12h的摇瓶发酵液，使用高压均质机对发酵液进行破壁，将破壁后的液体10000rpm离心15min。使用镍离子亲和树脂对离心后上清进行纯化，纯化时先使用平衡缓冲液平衡镍柱，然后使用清洗缓冲液A洗脱杂蛋白，之后使用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，再使用清洗缓冲液B洗脱剩余杂蛋白，最后使用平衡缓冲液平衡镍柱。
通过SDS-PAGE对纯化收集的纯化液进行分析，SDS-PAGE分析结果如图3所示，重组酶AtGlcAK(43.6kDa)，DrGlcAK(43.8kDa)，BlUSP(60.9kDa)，BlNahK(43.4kDa)，PpAmgK(41.8kDa)，PaAmgK(41.8kDa)，BsGlmU(53.0kDa)，CgGlmU(54.0kDa)，EcGlmU(52.7kDa)，SeGlmU(52.8kDa)，PpGlmU(52.0kDa)，SePPK(60.6kDa)可成功表达，目的条带大小与蛋白理论分子量相符。
使用超滤管将12种蛋白纯化液分别浓缩，得到的浓缩液使用碧云天生物技术有限公司的Bradford蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，蛋白浓度测定数据如表1所示。
表1重组菌株摇瓶发酵后所得蛋白含量
LB培养基：蛋白胨10g·L-1，氯化钠10g·L-1，酵母粉5g·L-1。
TB培养基：蛋白胨12g·L-1，酵母粉24g·L-1，甘油4g·L-1，磷酸氢二钾12.54g·L-1，磷酸二氢钾2.31g·L-1。
平衡缓冲液：20mM Tris-HCl(pH＝7)，500mM氯化钠。
清洗缓冲液A：20mM Tris-HCl(pH＝7)，500mM氯化钠，50mM咪唑。
清洗缓冲液B：20mM Tris-HCl(pH＝7)，500mM氯化钠，500mM咪唑。
洗脱缓冲液：20mM Tris-HCl(pH＝7)，500mM氯化钠，300mM咪唑。
(3)UDP-GlcA的合成
反应体系(1.5mL)
按上述体系在2mL的EP管中制备反应体系，最后在反应体系中加入0.005mM的酶AtGlcAK/DrGlcAK和0.005mM的酶BlUSP，将EP管置于30℃金属浴，在300rpm下进行；待反应90min后，将反应液煮沸5min终止反应；煮沸后的反应液10000rpm高速离心5min，过膜处理后，使用HPLC对UDP-GlcA浓度进行检测，检测结果如图4A所示。
对比例2：UDP-GlcNAc的酶法制备
(1)重组菌株构建
具体方案同对比例1。
(2)重组菌株摇瓶发酵
具体方案同对比例1。
(3)UDP-GlcNAc的合成
反应体系(1.5mL)
按上述体系在2mL的EP管中制备反应体系，最后在反应体系中加入0.005mM的酶BINahK/PaAmgK/PpAmgK和0.005mM的酶BsGlmU/CgGlmU/EcGlmu/PtGlmU/SeGlmU，将EP管置于30℃金属浴，在300rpm下进行；待反应90min后，将反应液煮沸5min终止反应；煮沸后的反应液10000rpm高速离心5min，过膜处理后，使用HPLC对UDP-GlcNAc浓度进行检测，检测结果如图4B所示。
实施例1：偶联ATP循环体系合成UDP-GlcA
(1)重组菌株构建
具体方案同对比例1。
(2)重组菌株摇瓶发酵
具体方案同对比例1。
(3)UDP-GlcNAc的合成
反应体系(1.5mL)
按上述体系在2mL的EP管中制备反应体系，最后在反应体系中加入0.005mM的酶AtGlcAK/DrGlcAK、0.005mM的酶BlUSP和0.005mM的酶SePPK，将EP管置于30℃金属浴，在300rpm下进行；待反应90min后，将反应液煮沸5min终止反应；煮沸后的反应液10000rpm高速离心5min，过膜处理后，使用HPLC对UDP-GlcA浓度进行检测，检测结果如图5A所示，反应90min，AtGlcAK+BlUSP、DrGlcAK+BlUSP偶联了酶SePPK的反应液中UDP-GlcA的含量分别达到1.6082g/L、0.8343g/L；相比于对比例1，分别提升了18.80％和6.67％。
实施例2：偶联ATP循环体系合成UDP-GlcNAc
(1)重组菌株构建
具体方案同对比例1。
(2)重组菌株摇瓶发酵
具体方案同对比例1。
(3)UDP-GlcNAc的合成
反应体系(1.5mL)
按上述体系在2mL的EP管中制备反应体系，最后在反应体系中加入0.005mM的酶BINahK/PaAmgK/PpAmgK、0.005mM的酶BsGlmU/CgGlmU/EcGlmu/PtGlmU/SeGlmU和0.005mM的酶SePPK，将EP管置于30℃金属浴，在300rpm下进行；待反应90min后，将反应液煮沸5min终止反应；煮沸后的反应液10000rpm高速离心5min，过膜处理后，使用HPLC对UDP-GlcNAc浓度进行检测，检测结果如图5B所示，反应90min，BINahK+BsGlmU、BINahK+CgGlmU、BINahK+EcGlmU、BINahK+PtGlmU、BINahK+SeGlmU、PaAmgK+BsGlmU、PaAmgK+CgGlmU、PaAmgK+EcGlmU、PaAmgK+PtGlmU、PaAmgK+SeGlmU、PpAmgK+BsGlmU、PpAmgK+CgGlmU、PpAmgK+EcGlmU、PpAmgK+PtGlmU、PpAmgK+SeGlmU偶联了酶SePPK的反应液中UDP-GlcNAc的含量分别达到1.7538g/L，1.6956g/L，1.5626g/L，1.8832g/L，1.6691g/L，1.4827g/L，1.3145g/L，1.4821g/L，1.4019g/L，1.5484g/L，1.6960g/L，1.1157g/L，1.2424g/L，1.0134g/L，2.0313g/L；相比于对比例2，分别提升了105.82％、68.99％、71.41％、73.06％、76.87％、79.44％、61.51％、82.84％、107.54％、85.99％、58.85％、64.82％、139.02％、229.67％、60.11％。
实施例3：偶联ATP循环的UDP-GlcA酶法制备体系的扩大
(1)重组菌株构建
具体方案同对比例1。
(2)重组菌株摇瓶发酵
具体方案同对比例1。
(3)UDP-GlcNAc的合成
反应体系(50mL)
按上述体系在250mL的摇瓶中制备反应体系，最后在反应体系中加入0.01mM的酶AtGlcAK、0.01mM的酶BlUSP和0.01mM的酶SePPK，将摇瓶置于30℃摇床上，在220rpm下进行；待反应5h后，将反应液煮沸5min终止反应；煮沸后的反应液10000rpm高速离心5min，过膜处理后，使用HPLC对UDP-GlcA浓度进行检测，检测结果如图6所示，AtGlcAK+BlUSP偶联酶SePPK的反应液中UDP-GlcA浓度达到12.9g/L，相比于实施例1，提升了702.14％。
实施例4：偶联ATP循环的UDP-GlcNAc酶法制备体系的扩大
(1)重组菌株构建
具体方案同对比例1。
(2)重组菌株摇瓶发酵
具体方案同对比例1。
(3)UDP-GlcNAc的合成
反应体系(50mL)
按上述表格在250mL的摇瓶中制备反应体系，最后在反应体系中加入0.01mM的酶PpAmgK、0.01mM的酶SeGlmU和0.01mM的酶SePPK，将摇瓶置于30℃摇床，在220rpm下进行；待反应5h后，将反应液煮沸5min终止反应；煮沸后的反应液10000rpm高速离心5min，过膜处理后，使用HPLC对UDP-GlcNAc浓度进行检测，检测结果如图6所示，PpAmgK+SeGlmU偶联酶SePPK的反应液中UDP-GlcNAc浓度达到18.2g/L，相比于实施例2，提升了795.98％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (10)
1.一种酶法合成UDP-葡萄糖醛酸和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖的方法，其特征在于，
制备UDP-GlcA时，以GlcA为底物以葡萄糖醛酸激酶(GlcAK)、UDP-葡萄糖醛酸焦磷酸化酶(USP)催化制备UDP-GlcA，以聚磷酸激酶(PPK)降解PPi的同时利用ADP合成ATP；
制备UDP-GlcNAc时，以GlcNAc为底物，以N-乙酰己胺1-激酶(NahK)或N-乙酰葡糖胺激酶(AmgK)，偶联UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(GlmU)催化制备UDP-GlcNAc，以聚磷酸激酶(PPK)降解PPi的同时利用ADP合成ATP。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述GlcAK来源于Arabidopsis thaliana或Danio rerio；所述USP来源于Bifidobacterium longum subsp.infantis ATCC 15697；所述NahK来源于Bifidobacterium longum subsp.longum JCM 1217；所述AmgK来源于Pseudomonas putida KT2440或Pseudomonas aeruginosa；所述GlmU来源于Bacillussubtilis、Corynebacterium glutamicum、Escherichia coli、Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus或Pseudomonas putida；所述PPK来源于Streptococcus equisubsp.Zooepidemicus。
3.根据权利要求2所述方法，其特征在于，所述GlcAK、USP、NahK、AmgK、GlmU、PPK是以pET-28a(+)为表达载体、以大肠杆菌E.coli BL21(DE3)为表达宿主制备得到的。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述催化在缓冲体系中进行，所述缓冲体系是80-120mM的缓冲液，含有8-12mM的Mg2+。
5.根据权利要求1或4所述方法，其特征在于，制备UDP-GlcA时，底物浓度摩尔比为(1-3)：1：1的GlcA、ATP、UTP；制备UDP-GlcNAc时，底物浓度摩尔比为(1-2)：1：1的GlcNAc、ATP、UTP。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，制备UDP-GlcA时，所述GlcA浓度为10-50mM，制备UDP-GlcNAc时，所述GlcNAc浓度为10-40mM。
7.根据权利要求5所述方法，其特征在于，制备UDP-GlcA时，所述GlcAK：USP：PPK摩尔比为(0.5-1.5)：1：1；制备UDP-GlcNAc时，所述NahK或AmgK：GlmU：PPK摩尔比为(0.5-1.5)：1：1。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，制备UDP-GlcA时，所述GlcAK浓度为0.005-0.01mM；制备UDP-GlcNAc时，所述NahK或AmgK浓度为0.005-0.01mM。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，催化的温度为25-35℃。
10.权利要求1所述方法在制备含UDP-GlcA或UDP-GlcNAc的产品中的应用。
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