CN117683833A - 一种由核苷一磷酸制备核苷酸糖的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种由核苷一磷酸制备核苷酸糖的方法。包括步骤：向底物糖、核苷一磷酸、聚磷酸盐和辅因子二价金属盐的混合反应溶液中加入核苷酸糖合成酶、无机焦磷酸酶和聚磷酸激酶，在35～40℃下联合催化反应2～50h，生成核苷酸糖粗产物，经纯化后，得到核苷酸糖。本发明提供的以核苷一磷酸为原料制备核苷酸糖的方法通过经济性较好、成本较低核苷一磷酸替代现有技术中使用的高成本核苷三磷酸，一步合成制备得到核苷酸糖。该方法极大地降低了制备核苷酸糖的成本，经济高效，并且步骤简单降低了核苷酸糖制备的难度，适合工业化生产，具有极高的经济价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种由核苷一磷酸制备核苷酸糖的方法，特别涉及了一种以核苷一磷酸、多聚磷酸盐、以及单糖或蔗糖等简单底物制备核苷酸糖的方法，属于生物技术及绿色化学技术领域。
背景技术
糖基转移酶催化的酶法糖基化反应是合成糖链、糖蛋白、糖脂、糖基化小分子等糖质聚合物或缀合物的新兴绿色方法，在医药、保健品、食品等人体健康等工业及技术领域的应用不断扩展。核苷酸糖(nucleotide sugars，也称糖核苷酸sugarnucleotides)是糖基转移酶的必需供体底物，糖基转移酶催化活化的糖基供体核苷酸糖与糖基受体生成糖苷键。其中，葡萄糖(glucose，简称Glc)、半乳糖(galactose，简称Gal)、氮-乙酰-葡萄糖胺(N-acetylglucosamine，简称GlcNAc)、氮-乙酰-半乳糖胺(N-acetylgalactosamine，GalNAc)、甘露糖(mannose，简称Man)、岩藻糖(L-fucose，简称Fuc)、木糖(xylose，Xyl)、葡萄糖醛酸(glucuronic acid，GlcA)及氮-乙酰-神经氨酸(N-acetylneuraminic acid，简称Neu5Ac)等唾液酸类(sialic acids，简称Sia)这九种单糖是组成哺乳动物糖质的主要单糖单元，其中除了Fuc为L-型单糖其它都为D-型单糖，它们对应的核苷酸糖是由单糖端基以磷酸酯键连接一个尿嘧啶核苷二磷酸(uridine 5'-diphosphate，UDP)或鸟嘌呤核苷二磷酸(guanosine 5'-diphosphate，GDP)或胞嘧啶核苷一磷酸(dytidine 5'-monophosphate，CMP)组成，具体为UDP-Glc、UDP-Gal、UDP-GlcNAc、UDP-GalNAc、UDP-Xyl、UDP-GlcA、GDP-Man、GDP-Fuc及CMP-Sia(包括CMP-Neu5Ac等)，其中单糖端基构型除了GDP-Fuc及CMP-Sia为beta型，其它都为alpha型。这九种核苷酸糖及其衍生物是人相关医药健康等应用的重要化合物，具有很高经济价值。
酶法合成是制备核苷酸糖的具有发展前途的高效、绿色方法，主要是利用重组的核苷酸糖补救合成途径相关酶类进行体外酶反应制备。文献Molecules,2011,16,pp.6396-6407报道了一种Bifidobacteriuminfantis来源的N-乙酰己糖胺激酶(BiNahK)以GlcNAc、GalNAc、Man等单糖及衍生物以及ATP(adenosine 5'-triphosphate，腺苷三磷酸)为底物合成相应的糖-1-磷酸；文献Org.lett.,2013,15(21),pp.5528-5530报道了一种Pyrococcusfuriosus来源的GDP-Man焦磷酸化酶(PfManC)以及BiNanK、PfManC、EcPPA(大肠杆菌来源的无机焦磷酸酶)催化以ATP、GTP(guanosine 5'-triphosphate，鸟苷三磷酸)和Man为底物一锅合成GDP-Man；文献Science，2005,307(5716),pp.1778-1781报道了一种Bacteroidesfragilis来源的GDP-Fuc合成酶(FKP)能够催化以ATP、GTP和Fuc为底物一锅合成GDP-Fuc；文献Chem.Commun.,2011,47,pp.10815-10817报道了一种Pasteurella multocida来源的N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酸转移酶(PmGlmU)和无机焦磷酸酶PmPPA以及BiNahK、PmGlmU、PmPPA催化以ATP、UTP(uridine 5'-triphosphate，尿苷三磷酸)和GlcNAc和衍生物为底物一锅合成UDP-GlcNAc及其衍生物；文献Bioorg.&Med.Chem.Lett.,2005,15,pp.5459-5462报道了利用人来源的UDP-N-乙酰半乳糖胺焦磷酸化酶(AGX1)、GalNAc激酶GK2、酵母无机焦磷酸酶催化以ATP、UTP和GalNAc及其衍生物为底物一锅合成UDP-GalNAc及其衍生物；文献Bioorg.&Med.Chem.,2004，12，pp.6427-6435报道了一种Neisseriameningitidis来源的CMP-唾液酸合成酶(NmCSS)可利用唾液酸单糖及衍生物以及CTP(cytidine 5'-triphosphate，胞苷三磷酸)为底物合成CMP-Sia及其衍生物；文献PlantPhysiol.Biochem.，2006，44(4)，pp.171-180和J.Biol.Chem.，2010，285(5)，pp.2902-2910报道了拟南芥来源的葡萄糖醛酸激酶(AtGlcAK)及UDP-糖焦磷酸化酶(AtUSP)可以分别催化以GlcA和ATP合成GlcA-1-P以及进一步由GlcA-1-P和UTP合成UDP-GlcA；文献GreenChem.，2022,24(9)，pp.3717-3722报道了一种Solitalea canadensis来源的木糖激酶(ScXylK)可以催化Xyl和ATP合成Xyl-1-P。
现有技术可以实现以单糖及其衍生物或蔗糖，以及核苷三磷酸ATP、UTP、GTP、CTP为底物，联合核苷酸糖生物合成相关酶类，再加上焦磷酸酶，一锅合成常见核苷酸糖及其衍生物。但是上述现有技术存在以下缺点：1)使用核苷三磷酸为底物，经济成本较高；2)纯化方法主要依赖离子交换色谱、分子筛色谱等，操作繁琐成本高。
发明内容
针对现有技术不足，本发明提供了一种由核苷一磷酸制备核苷酸糖的方法。本发明通过在合成过程中以核苷一磷酸替代核苷三磷酸、添加多聚磷酸(polyphosphate，PolyPn)及聚磷酸激酶(polyphosphate kinase，PPK)实现。本发明同时提供了一种由酶催化反应液中分离核苷酸糖产物的简便方法，通过在反应液中加入硫酸铝形成沉淀后离心或过滤去除杂质、再通过活性炭吸附后的乙醇-水溶液分级洗脱实现产物纯化。
本发明的技术方案如下：
一种由核苷一磷酸制备核苷酸糖的方法，包括步骤如下：
向底物糖、核苷一磷酸、聚磷酸盐和辅因子二价金属盐的混合反应溶液中加入核苷酸糖合成酶、无机焦磷酸酶和聚磷酸激酶，在35～40℃下联合催化反应2～50h，生成核苷酸糖粗产物，经纯化后，得到核苷酸糖。
根据本发明优选的，所述底物糖选自D-甘露糖、L-岩藻糖、N-乙酰神经氨酸、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸、D-木糖、N-乙酰氨基-D-葡萄糖、N-乙酰氨基-D-半乳糖和蔗糖中的一种。
根据本发明优选的，所述底物糖在混合反应溶液中的终浓度为10～500mM。
进一步优选的，所述底物糖在混合反应溶液中的终浓度为40～150mM。
根据本发明优选的，所述核苷一磷酸选自腺嘌呤核苷一磷酸(AMP)、鸟嘌呤核苷一磷酸(GMP)、尿嘧啶核苷一磷酸(UMP)和胞嘧啶核苷一磷酸(CMP)中的一种或两种。
根据本发明优选的，所述核苷一磷酸在混合反应溶液中的终浓度为0.3～150mM。
进一步优选的，所述腺嘌呤核苷一磷酸(AMP)在混合反应溶液中的终浓度为0.3～50mM；所述鸟嘌呤核苷一磷酸(GMP)、尿嘧啶核苷一磷酸(UMP)、胞嘧啶核苷一磷酸(CMP)在混合反应溶液中的终浓度为40～150mM。
根据本发明优选的，所述聚磷酸盐为聚合度为2个磷酸及以上的聚磷酸化合物。
进一步优选的，所述聚磷酸盐为六偏磷酸钠；所述聚磷酸盐在混合反应溶液中的终浓度为40～150mM。
根据本发明优选的，所述辅因子二价金属盐为镁离子或锰离子盐。
进一步优选的，所述辅因子二价金属盐为氯化镁；所述氯化镁在混合反应溶液中的终浓度为10～200mM。
进一步优选的，所述氯化镁在混合反应溶液中的终浓度为40～150mM。
根据本发明优选的，所述混合反应溶液的pH值为7～10。
根据本发明优选的，所述核苷酸糖合成酶选自Bifidobacteriuminfantis来源的N-乙酰己糖胺激酶(BiNahK)、半乳糖激酶(BiGalK)、Pyrococcus furiosus来源的GDP-Man焦磷酸化酶(PfManC)、Bacteroides fragilis来源的GDP-Fuc合成酶(FKP)、Pasteurellamultocida来源的N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酸转移酶(PmGlmU)、人来源的UDP-N-乙酰半乳糖胺焦磷酸化酶(AGX1)、Neisseria meningitidis来源的CMP-唾液酸合成酶(NmCSS)、拟南芥来源的葡萄糖醛酸激酶(AtGlcAK)、UDP-糖焦磷酸化酶(AtUSP)、Solitaleacanadensis来源的木糖激酶(ScXylK)、Capillibacterium thermochitinicola来源的蔗糖磷酸化酶(CtSP)中一种或两种。
根据本发明优选的，所述核苷酸糖合成酶在混合反应溶液中的终浓度为0.5～4mg/mL。
以上核苷酸糖合成酶除了蔗糖磷酸化酶(CtSP)之外均为已公开核苷酸序列、氨基酸序列的现有核苷酸糖合成酶。所述蔗糖磷酸化酶(CtSP)的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。该酶的核苷酸序列经过密码子优化，适宜在大肠杆菌中重组表达。
根据本发明优选的，所述无机焦磷酸酶是大肠杆菌来源的无机焦磷酸酶EcPPA、Pasteurella multocida来源的无机焦磷酸酶PmPPA或酵母无机焦磷酸酶。以上无机焦磷酸酶EcPPA和无机焦磷酸酶PmPPA均为已公开核苷酸序列、氨基酸序列的现有无机焦磷酸酶；酵母无机焦磷酸酶为市售产品。
进一步优选的，所述无机焦磷酸酶是无机焦磷酸酶PmPPA；所述无机焦磷酸酶在混合反应溶液中的终浓度为0.5～2mg/mL。
根据本发明优选的，所述聚磷酸盐激酶为Erysipelotrichaceae bacterium来源的聚磷酸盐激酶EbPPK；所述聚磷酸盐激酶在混合反应溶液中的终浓度为0.5～4mg/mL。以上聚磷酸盐激酶EbPPK为已公开核苷酸序列、氨基酸序列的现有聚磷酸盐激酶。
根据本发明优选的，所述纯化为用硫酸铝沉淀操作去除杂质，再通过活性炭吸附后的乙醇-水溶液分级洗脱实现核苷酸糖粗产物的纯化；
具体步骤为：在反应完成后将反应液在离心力大于5000g以上离心1～60min，去除沉淀取上清，在上清液中加入硫酸铝溶液，静置到不再产生沉淀，在离心力大于5000g以上离心1～60min，去除沉淀取上清，采用活性炭对上清液进行吸附，接着进行梯度洗脱，收集含有核苷酸糖的溶液，最后经旋转蒸发和/或纳滤浓缩和/或冷冻干燥浓缩和/或阴离子交换色谱和/或分子筛色谱，得到核苷酸糖。
进一步优选的，所述梯度洗脱为纯水洗脱、10％乙醇洗脱、30～50％乙醇洗脱。
根据本发明优选的，所述核苷酸糖包括鸟苷二磷酸甘露糖(I、GDP-Man)、鸟苷二磷酸岩藻糖(II、GDP-Fuc)、胞苷一磷酸唾液酸即胞苷一磷酸N-乙酰神经氨酸(III、CMP-Sia或CMP-Neu5Ac)、尿苷二磷酸半乳糖(IV、UDP-Gal)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(V、UDP-GlcA)、尿苷二磷酸木糖(VI、UDP-Xyl)、尿苷二磷酸N-乙酰氨基-D-葡萄糖(VII、UDP-GlcNAc)、尿苷二磷酸N-乙酰氨基-D-半乳糖(VIII、UDP-GalNAc)及尿苷二磷酸葡萄糖(IX、UDP-Glc)。不同的核苷酸糖产物是使用不同的底物糖，配合核苷一磷酸、聚磷酸盐和辅因子二价金属盐，以及相应的核苷酸糖合成酶、无机焦磷酸酶和聚磷酸激酶，催化反应后制备得到。
本发明提供的核苷酸糖的制备方法中的反应式及流程如图20所示。
在图20中，核苷酸糖CMP-Neu5Ac的结构已经给出，其它核苷酸糖的结构通式中灰色方框G/U代表核苷碱基，即鸟嘌呤(见于GDP-Man及GDP-Fuc)或尿嘧啶(见于除以上三种以外的其它6种核苷酸糖)，灰色六边形S代表单糖残基，即甘露糖/>(I、GDP-Man)、岩藻糖/>(II、GDP-Fuc)、半乳糖/>(IV、UDP-Gal)、葡萄糖醛酸/>(V、UDP-GlcA)、木糖/>(VI、UDP-Xyl)、N-乙酰氨基-D-葡萄糖/>(VII、UDP-GlcNAc)、N-乙酰氨基-D-半乳糖/>(VIII、UDP-GalNAc)及葡萄糖/>(IX、UDP-Glc)。
本发明中的核苷酸糖合成酶、无机焦磷酸酶和聚磷酸激酶均可通过在大肠杆菌异源表达获得。
本发明的技术特点和有益效果：
1、本发明提供的以核苷一磷酸为原料制备核苷酸糖的方法通过经济性较好、成本较低核苷一磷酸替代现有技术中使用的高成本核苷三磷酸，一步合成制备得到核苷酸糖。该方法极大地降低了制备核苷酸糖的成本，经济高效，并且步骤简单降低了核苷酸糖制备的难度，适合工业化生产，具有极高的经济价值。
2、本发明提供的以核苷一磷酸为原料制备核苷酸糖的方法通过在反应液中加入硫酸铝形成沉淀后离心或过滤去除杂质、再通过活性炭吸附后的乙醇-水溶液分级洗脱实现产物纯化，使用常见、无毒化学品硫酸铝对杂质进行沉淀分离。
附图说明
图1是制备鸟苷二磷酸甘露糖的薄层层析检测结果，其中，1为GMP标品，2为GTP标品，3为Man标品，4为Man-1-磷酸标品，5为GDP-Man标品，6为反应液。
图2是鸟苷二磷酸甘露糖的纯化薄层层析检测结果图。其中，1为GMP标品，2为GTP标品，3为Man标品，4为Man-1-磷酸标品，5为GDP-Man标品，6为加入铝离子处理后上清液，7为加入铝离子处理后沉淀，8为反应液，9为水洗脱活性炭洗脱液，10为10％乙醇洗脱活性炭洗脱液，11为20％乙醇洗脱活性炭洗脱液，12为30％乙醇洗脱活性炭洗脱液，13为100％乙醇洗脱活性炭洗脱液。
图3是制备的鸟苷二磷酸甘露糖的1H和13C核磁共振波谱图。
图4是制备鸟苷二磷酸岩藻糖的薄层层析检测结果，1为GMP标品，2为GTP标品，3为AMP标品，4为ATP标品，5为Fuc标品，6为Fuc-1-磷酸标品，7为GDP-Fuc标品，8为反应液。
图5是制备的鸟苷二磷酸岩藻糖的1H和13C核磁共振波谱图。
图6是制备胞苷一磷酸N-乙酰神经氨酸的薄层层析检测结果，其中，1为CMP标品，2为CTP标品，3为Neu5Ac标品，4为CMP-Neu5Ac标品，5为反应液。
图7是制备胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸的1H和13C核磁共振波谱图。
图8是制备尿苷二磷酸半乳糖的薄层层析检测结果，其中，1为UMP标品，2为UTP标品，3为Gal标品，4为Gal-1-磷酸标品，5为UDP-Gal标品，6为反应液。
图9是制备尿苷二磷酸半乳糖的1H和13C核磁共振波谱图。
图10是制备尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的薄层层析检测结果，其中，1为UMP标品，2为UTP标品，3为GlcA标品，4为UDP-GlcA标品，5为反应液。
图11是制备尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的1H和13C核磁共振波谱图。
图12是制备尿苷二磷酸木糖的薄层层析检测结果，其中，1为UMP标品，2为UDP标品，3为UTP标品，4为AMP标品，5为ADP标品，6为ATP标品，7为Xyl标品，8为Xyl-1-磷酸标品，9为UDP-Xyl标品，10为反应液。
图13是制备尿苷二磷酸木糖的1H和13C核磁共振波谱图。
图14是制备尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖的薄层层析检测结果，其中，1为UMP标品，2为UTP标品，3为GlcNAc标品，4为GlcNAc-1-磷酸标品，5为UDP-GlcNAc标品，6为反应液。
图15是制备尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖的1H和13C核磁共振波谱图。
图16是制备尿苷二磷酸N-乙酰氨基半乳糖的薄层层析检测结果，其中，1为UMP标品，2为UTP标品，3为GlcNAc标品，4为GalNAc标品，5为GalNAc-1-磷酸标品，6为UDP-GalNAc标品，7为反应液。
图17是制备尿苷二磷酸N-乙酰氨基半乳糖的1H和13C核磁共振波谱图。
图18是制备尿苷二磷酸葡萄糖的薄层层析检测结果，其中，1为UMP标品，2为UTP标品，3为蔗糖标品，4为果糖标品，5为Glc-1-磷酸标品，6为UDP-Glc标品，7为反应液。
图19是制备尿苷二磷酸葡萄糖的1H和13C核磁共振波谱图。
图20为本发明核苷酸糖的制备方法中的反应式及流程图。
具体实施方式
为便于应用本发明，下面以实施例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围不限于以下实施例。
实施例中，用到的生物试剂以及其它化学试剂为市售分析纯以上试剂。
实施例1：酶的表达及纯化
依据文献方法获得酶BiNahK、BiGalK、PfManC、FKP、PmGlmU、AGX1、NmCSS、AtGlcAK、AtUSP、ScXylK、PmPPA、EbPPK的重组表达载体，将重组表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，获得相应的重组表达菌株。所述BiNahK、BiGalK、PfManC、FKP、PmGlmU、AGX1、NmCSS、AtGlcAK、AtUSP、ScXylK、PmPPA、EbPPK均为已公开核苷酸序列、氨基酸序列的现有酶。
人工合成如SEQ ID NO.2所示的蔗糖磷酸化酶CtSP编码基因，通过酶切连接插入pET28a载体的NdeI及XhoI酶切位点之间，获得蔗糖磷酸化酶CtSP的重组载体，将此重组载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)，获得重组表达菌株。
将上述重组表达菌株的进行摇瓶或发酵罐培养，培养过程中加入40μg/mL相应的抗生素，当菌体浓度达到OD600约为0.6～0.8时加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷或1％的乳糖或1％半乳糖，在20℃诱导表达12小时。
使用立式离心机或连续流离心机收集菌体(8000g，10min，4℃)，将菌体重悬于缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 7.5，500mM NaCl)中，将菌体进行超声破碎或高压匀浆法处理，离心破碎后的菌液(4℃，10000g，30min)，收集上清。
重组表达的蛋白均带有六个连续组氨酸的标签，可以使用固定化金属离子亲和层析色谱纯化，因此将上述收集的上清采用镍离子亲和层析进行纯化，纯化步骤参照相关层析材料的说明书进行。主要步骤为将上清与层析介质混合或通过层析柱，用含有30mM咪唑的缓冲液洗去杂蛋白，用含有250～500mM咪唑的缓冲液洗脱得到重组酶，以超滤、纳滤、分子筛层析等方法脱盐，必要时进一步浓缩，用Bradford法测定蛋白浓度；向得到的蛋白中加入5～30％的甘油，分装保存于-80～-20℃。
本实施例获得了核苷酸糖合成酶、无机焦磷酸酶和聚磷酸激酶，具体包括BiNahK、BiGalK、PfManC、FKP、PmGlmU、AGX1、NmCSS、AtGlcAK、AtUSP、ScXylK、PmPPA、EbPPK和CtSP。
实施例2：鸟苷二磷酸甘露糖(GDP-Man)的制备
向水中加入AMP、GMP、D-甘露糖、六偏磷酸钠和氯化镁，得到混合反应溶液；所述混合反应溶液中AMP的终浓度为5mM，GMP、D-甘露糖、六偏磷酸钠以及氯化镁的终浓度为60mM，调节混合反应溶液pH为7.4～8.5，继续加入N-乙酰己糖胺激酶BiNahK、焦磷酸化酶PfManC、无机焦磷酸酶PmPPA和聚磷酸盐激酶EbPPK，这四种酶在混合反应溶液中的终浓度均为1.5mg/mL，然后在35℃下联合催化反应12h，使用薄层层析色谱检测到反应完成，生成鸟苷二磷酸甘露糖(GDP-Man)粗产物(见图1)，经纯化后，得到鸟苷二磷酸甘露糖。
所述纯化具体为：将反应完成后的反应液煮沸10分钟终止反应，在离心力10000g下离心10min，去除沉淀取上清，在上清液中加入硫酸铝溶液，调节pH至7.4～8.5，，静置到不再产生沉淀，在离心力10000g下离心10min去除沉淀取上清，然后采用活性炭对上清液进行吸附，接着以纯水、10％乙醇、30％乙醇、100％乙醇进行梯度洗脱，收集含有鸟苷二磷酸甘露糖的溶液，对此溶液进行薄层层析色谱检测(见图2)，最后含有核苷酸糖的溶液经旋转蒸发和冷冻干燥浓缩获得鸟苷二磷酸甘露糖，称重后计算鸟苷二磷酸甘露糖的收率约为77％。
取30mg本实施例制备的鸟苷二磷酸甘露糖(GDP-Man)溶于500μL氘代水中，使用600MHz的核磁共振进行分析，结果如图3所示，解析结果为：1H NMR(600MHz，D2O)δ8.06(s，1H)，5.89(d，J＝5.8Hz，1H)，5.48(dd，J＝8.1，1.8Hz，1H)，4.70(d，J＝11.0Hz，1H)，4.47(t，J＝4.4Hz，1H)，4.34-4.30(m，1H)，4.18(q，J＝4.4Hz，2H)，4.01(t，J＝2.7Hz，1H)，3.88(dd，J＝9.8，3.4Hz，1H)，3.83(ddt，J＝11.5，7.4，3.9Hz，2H)，3.72(dd，J＝12.3，5.6Hz，1H)，3.65(t，J＝10.0Hz，1H).13C NMR(151MHz，D2O)δ158.82，153.79，151.56，137.32，116.05，96.36，96.32，86.72，83.57，83.51，73.71，73.59，70.24，70.16，70.10，69.69，66.28，65.17，65.13，60.60。
以上数据说明通过本发明提供的方法成功制备得到鸟苷二磷酸甘露糖(GDP-Man)。
实施例3：鸟苷二磷酸岩藻糖(GDP-Fuc)的制备
向水中加入AMP、GMP、L-岩藻糖、六偏磷酸钠和氯化镁，得到混合反应溶液；所述混合反应溶液中AMP的终浓度为10mM，GMP、D-甘露糖、六偏磷酸钠以及氯化镁的终浓度为70mM，调节混合反应溶液pH为7.4～8.5，继续加入GDP-Fuc合成酶FKP、无机焦磷酸酶PmPPA和聚磷酸盐激酶EbPPK，这三种酶在混合反应溶液中的终浓度均为2mg/mL，然后在40℃下联合催化反应30h，使用薄层层析色谱检测到反应完成，生成鸟苷二磷酸岩藻糖(GDP-Fuc)粗产物(见图4)，经纯化后，得到鸟苷二磷酸岩藻糖。
所述纯化的方法参照实施例2，称重后计算鸟苷二磷酸岩藻糖(GDP-Fuc)的收率约为70％。
取30mg本实施例制备的鸟苷二磷酸岩藻糖(GDP-Fuc)溶于500μL氘代水中，使用600MHz的核磁共振进行分析，结果如图5所示，解析结果为：1H NMR(600MHz，D2O)δ8.08(d，J＝1.8Hz，1H)，5.90(dd，J＝6.4，1.8Hz，1H)，4.92-4.88(m，1H)，4.78-4.74(m，1H)，4.54-4.48(m，1H)，4.32(dq，J＝4.7，2.3Hz，1H)，4.21-4.15(m，2H)，3.77-3.72(m，1H)，3.72-3.67(m，1H)，3.63(ddd，J＝10.0，3.5，1.8Hz，1H)，3.53(ddd，J＝9.9，7.7，1.8Hz，1H)，1.20(dd，J＝6.5，1.8Hz，3H).13C NMR(151MHz，D2O)δ158.87，153.81，151.73，137.55，116.12，98.30，98.26，86.59，83.76，83.70，73.41，72.32，71.30，71.02，70.93，70.87，70.36，65.21，65.17，59.20，15.29。
以上数据说明通过本发明提供的方法成功制备鸟苷二磷酸岩藻糖(GDP-Fuc)。
实施例4：胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸(CMP-Neu5Ac)的制备
向水中加入CMP、N-乙酰神经氨酸、六偏磷酸钠和氯化镁，得到混合反应溶液；所述混合反应溶液中CMP、N-乙酰神经氨酸、六偏磷酸钠和氯化镁的终浓度均为100mM，调节混合反应溶液pH为8.5～9.6，继续加入CMP-唾液酸合成酶NmCSS、无机焦磷酸酶PmPPA和聚磷酸盐激酶EbPPK，这三种酶在混合反应溶液中的终浓度均为1mg/mL，然后在37℃下联合催化反应4h，使用薄层层析色谱检测到反应完成，生成胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸(CMP-Neu5Ac)粗产物(见图6)，经纯化后，得到胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸
所述纯化参照实施例2，称重后计算胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸(CMP-Neu5Ac)的收率约为80％。
取30mg本实施例制备的胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸(CMP-Neu5Ac)溶于500μL氘代水中，使用600MHz的核磁共振进行分析，结果如图7所示，解析结果为：1H NMR(600MHz，D2O)δ8.04-7.93(m，1H)，6.11(d，J＝7.7Hz，1H)，5.97(d，J＝4.4Hz，1H)，4.33(d，J＝4.8Hz，1H)，4.30(q，J＝4.5Hz，1H)，4.27-4.10(m，3H)，4.06(td，J＝10.7，4.6Hz，1H)，3.99-3.81(m，3H)，3.80-3.66(m，1H)，3.61(dd，J＝11.8，6.6Hz，1H)，3.44(d，J＝9.7Hz，1H)，2.48(dd，J＝13.4，4.7Hz，1H)，2.04(s，3H)，1.64(td，J＝12.4，5.7Hz，1H).13C NMR(151MHz，D2O)δ177.57，177.20，168.68，160.21，144.57，102.93，102.88，99.44，91.95，91.90，85.82，77.14，74.64，72.48，72.43，72.19，71.68，69.72，67.74，65.81，54.66，43.98，43.92，24.97。
以上数据说明通过本发明提供的方法成功制备胞苷一磷酸-N-乙酰神经氨酸(CMP-Neu5Ac)。
实施例5：尿苷二磷酸半乳糖(UDP-Gal)的制备
向水中加入AMP、UMP、D-半乳糖、六偏磷酸钠和氯化镁，得到混合反应溶液；所述混合反应溶液中AMP的终浓度为8mM，UMP、D-半乳糖、六偏磷酸钠以及氯化镁的终浓度均为120mM，调节混合反应溶液pH为7.4～8.5，继续加入N-乙酰己糖胺激酶BiNahK、UDP-糖焦磷酸化酶AtUSP、无机焦磷酸酶PmPPA和聚磷酸盐激酶EbPPK，这四种酶在混合反应溶液中的终浓度均为2mg/mL，然后在40℃下联合催化反应6h，使用薄层层析色谱检测到反应完成，生成尿苷二磷酸半乳糖(UDP-Gal)粗产物(见图8)，经纯化后，得到尿苷二磷酸半乳糖。
所述纯化参照实施例2，称重后计算尿苷二磷酸半乳糖(UDP-Gal)的收率约为64％。
取30mg本实施例制备的尿苷二磷酸半乳糖(UDP-Gal)溶于500μL氘代水中，使用600MHz的核磁共振进行分析，，结果如图9所示，解析结果为：1H NMR(600MHz，D2O)δ7.94(d，J＝8.1Hz，1H)，6.00-5.92(m，2H)，5.63(dd，J＝7.2，3.7Hz，1H)，4.36(d，J＝3.5Hz，2H)，4.28(p，J＝2.9Hz，1H)，4.23(dd，J＝4.6，2.5Hz，1H)，4.21-4.12(m，2H)，4.01(d，J＝3.3Hz，1H)，3.90(dd，J＝10.3，3.3Hz，1H)，3.79(dt，J＝10.4，3.3Hz，1H)，3.73(qd，J＝11.8，6.2Hz，2H).13C NMR(151MHz，D2O)δ166.13，151.71，141.52，102.53，95.76，95.73，88.31，83.14，83.12，73.67，71.84，69.53，69.21，69.01，68.33，68.27，64.89，64.86，60.90。
以上数据说明通过本发明提供的方法成功制备得到尿苷二磷酸半乳糖(UDP-Gal)。
实施例6：尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)的制备
向水中加入AMP、UMP、D-葡萄糖醛酸、六偏磷酸钠和氯化镁，得到混合反应溶液；所述混合反应溶液中AMP的终浓度为8mM，UMP、D-葡萄糖醛酸、六偏磷酸钠以及氯化镁的终浓度均为150mM，调节混合反应溶液pH为7.4～8.5，继续加入葡萄糖醛酸激酶AtGlcAK、UDP-糖焦磷酸化酶AtUSP、无机焦磷酸酶PmPPA和聚磷酸盐激酶EbPPK，这四种酶在混合反应溶液中的终浓度均为4mg/mL，然后在40℃下联合催化反应4h，使用薄层层析色谱检测到反应完成，生成尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)粗产物(见图10)，经纯化后，得到尿苷二磷酸葡萄糖醛酸。
所述纯化的方法参照实施例2，称重后计算尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)的收率约为78％。
取30mg制备的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)溶于500μL氘代水中，使用600MHz的核磁共振进行分析，结果如附图11所示，解析结果为：1H NMR(600MHz，D2O)δ7.94(d，J＝8.1Hz，1H)，6.06-5.89(m，2H)，5.61(dd，J＝7.6，3.5Hz，1H)，4.36(d，J＝3.7Hz，2H)，4.23(dt，J＝11.6，3.2Hz，1H)，4.17(ddd，J＝11.8，5.3，2.7Hz，1H)，4.13(d，J＝10.2Hz，1H)，3.78(t，J＝9.5Hz，1H)，3.57(dt，J＝9.8，3.0Hz，1H)，3.50(t，J＝9.7Hz，1H).13C NMR(151MHz，D2O)δ176.31，166.15，151.76，141.45，102.64，95.25，95.21，88.21，88.16，83.19，73.67，72.87，72.45，71.73，71.28，71.25，69.55，64.88，64.85。
以上数据说明通过本发明提供的方法成功制备得到尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)。
实施例7：尿苷二磷酸木糖(UDP-Xyl)的制备
向水中加入AMP、UMP、D-木糖、六偏磷酸钠和氯化镁，得到混合反应溶液；所述混合反应溶液中AMP的终浓度为5mM，UMP、D-木糖、六偏磷酸钠以及氯化镁的终浓度均为150mM，调节混合反应溶液pH为7.4～8.5，继续加入木糖激酶ScXylK、UDP-糖焦磷酸化酶AtUSP、无机焦磷酸酶PmPPA和聚磷酸盐激酶EbPPK，这四种酶在混合反应溶液中的终浓度均为4mg/mL，然后在40℃下联合催化反应25h，使用薄层层析色谱检测到反应完成，生成尿苷二磷酸木糖(UDP-Xyl)粗产物(见图12)，经纯化后，得到尿苷二磷酸木糖。
所述纯化的方法参照实施例2，称重后计算尿苷二磷酸木糖(UDP-Xyl)的收率约为81％。
取30mg的产物溶于500μL氘代水中，使用600MHz的核磁共振进行分析，，结果如图13所示，解析结果为：1H NMR(600MHz，D2O)δ7.94(d，J＝8.1Hz，1H)，5.99-5.94(m，2H)，5.54(dd，J＝7.1，3.4Hz，1H)，4.36(d，J＝3.4Hz，2H)，4.29-4.16(m，3H)，3.78-3.54(m，4H)，3.51(dt，J＝9.6，3.2Hz，1H).13C NMR(151MHz，D2O)δ166.14，151.71，141.51，102.55，95.58，95.54，88.33，83.13，73.68，72.92，71.46，69.52，69.06，64.84，64.81，62.16。
以上数据说明通过本发明提供的方法成功制备得到尿苷二磷酸木糖(UDP-Xyl)。
实施例8：尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)的制备
向水中加入AMP、UMP、N-乙酰氨基葡萄糖、六偏磷酸钠和氯化镁，得到混合反应溶液；所述混合反应溶液中AMP的终浓度为8mM，UMP、N-乙酰氨基葡萄糖、六偏磷酸钠以及氯化镁的终浓度均为100mM，调节混合反应溶液pH为7.4～8.5，继续加入N-乙酰己糖胺激酶BiNahK、N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酸转移酶PmGlmU、无机焦磷酸酶PmPPA和聚磷酸盐激酶EbPPK，这四种酶在混合反应溶液中的终浓度均为2mg/mL，然后在35℃下联合催化反应25h，使用薄层层析色谱检测到反应完成，生成尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)粗产物(见图14)，经纯化后，得到尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖。
所述纯化的方法参照实施例2，称重后计算尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)的收率约为76％。
取30mg本实施例制备的尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)溶于500μL氘代水中，使用600MHz的核磁共振进行分析，结果如图15所示，解析结果为：1H NMR(600MHz，D2O)δ7.93(d，J＝8.1Hz，1H)，5.94(dd，J＝9.4，6.3Hz，2H)，5.48(dd，J＝7.4，3.3Hz，1H)，4.33(t，J＝3.7Hz，2H)，4.25(t，J＝3.1Hz，1H)，4.24-4.12(m，2H)，3.96(dt，J＝10.6，3.1Hz，1H)，3.89(ddd，J＝10.2，4.5，2.3Hz，1H)，3.84(dd，J＝12.5，2.3Hz，1H)，3.78(ddd，J＝10.5，8.1，3.4Hz，2H)，3.52(t，J＝9.7Hz，1H)，2.04(s，3H).13C NMR(151MHz，D2O)δ174.63，166.12，151.67，141.49，102.51，94.35，94.31，88.34，83.07，83.01，73.66，72.86，70.77，69.48，69.33，64.84，64.80，60.16，53.51，53.49，21.94。
以上数据说明通过本发明提供的方法成功制备得到尿苷二磷酸N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-GlcNAc)。
实施例9：尿苷二磷酸N-乙酰氨基半乳糖(UDP-GalNAc)的制备
向水中加入AMP、UMP、N-乙酰氨基半乳糖、六偏磷酸钠和氯化镁，得到混合反应溶液；所述混合反应溶液中AMP的终浓度为8mM，UMP、N-乙酰氨基半乳糖、六偏磷酸钠以及氯化镁的终浓度均为100mM，调节混合反应溶液pH为7.4～8.5，继续加入N-乙酰己糖胺激酶BiNahK、UDP-N-乙酰半乳糖胺焦磷酸化酶AGX1、无机焦磷酸酶PmPPA和聚磷酸盐激酶EbPPK，这四种酶在混合反应溶液中的终浓度均为2mg/mL，然后在35℃下联合催化反应25h，使用薄层层析色谱检测到反应完成，生成尿苷二磷酸N-乙酰氨基半乳糖(UDP-GalNAc)粗产物(见图16)，经纯化后，得到尿苷二磷酸N-乙酰氨基半乳糖。
所述纯化的方法参照实施例2，称重后计算尿苷二磷酸N-乙酰氨基半乳糖(UDP-GalNAc)的收率约为80％。
取30mg本实施例制备的尿苷二磷酸N-乙酰氨基半乳糖(UDP-GalNAc)溶于500μL氘代水中，使用600MHz的核磁共振进行分析，结果如图17所示，解析结果为：1H NMR(600MHz，D2O)δ7.92(d，J＝8.1Hz，1H)，5.94(dd，J＝10.3，6.2Hz，2H)，5.51(dd，J＝7.3，3.4Hz，1H)，4.40-4.30(m，2H)，4.25(p，J＝3.0Hz，1H)，4.22(dt，J＝11.2，3.4Hz，2H)，4.19-4.13(m，2H)，4.01(d，J＝3.1Hz，1H)，3.93(dd，J＝11.0，3.2Hz，1H)，3.73(qd，J＝11.7，6.1Hz，2H)，2.05(s，3H).13C NMR(151MHz，D2O)δ174.82，166.12，151.67，141.51，102.49，94.54，94.50，88.35，83.08，83.02，73.65，71.95，69.49，68.23，67.47，64.86，64.83，60.91，49.63，49.60，22.02。
以上数据说明本发明成功制备得到尿苷二磷酸N-乙酰氨基半乳糖(UDP-GalNAc)。
实施例10：尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)的制备
向水中加入UMP、蔗糖、六偏磷酸钠和氯化镁，得到混合反应溶液；所述混合反应溶液中UMP、蔗糖、六偏磷酸钠以及氯化镁的终浓度均为90mM，调节混合反应溶液pH为7.4～8.5，继续加入蔗糖磷酸化酶CtSP、UDP-N-乙酰半乳糖胺焦磷酸化酶AGX1、无机焦磷酸酶PmPPA和聚磷酸盐激酶EbPPK，这四种酶在混合反应溶液中的终浓度均为2mg/mL，然后在35℃下联合催化反应25h，使用薄层层析色谱检测到反应完成，生成尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)粗产物(见图18)，经纯化后，得到尿苷二磷酸葡萄糖。
所述纯化的方法参照实施例2，称重后计算尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)的收率约为70％。
取30mg本实施例制备的尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)溶于500μL氘代水中，使用600MHz的核磁共振进行分析，结果如图19所示，解析结果为：1H NMR(600MHz，D2O)δ7.94(d，J＝8.1Hz，1H)，5.98-5.94(m，2H)，5.59(dd，J＝7.2，3.5Hz，1H)，4.36(d，J＝3.6Hz，2H)，4.24(ddd，J＝11.8，4.6，2.6Hz，1H)，4.19(ddd，J＝11.8，5.6，2.9Hz，1H)，3.90-3.86(m，1H)，3.84(dd，J＝12.5，2.3Hz，1H)，3.78(d，J＝4.0Hz，1H)，3.75(d，J＝9.5Hz，1H)，3.72(s，1H)，3.52(dt，J＝9.8，3.2Hz，1H)，3.45(t，J＝9.7Hz，1H).13C NMR(151MHz，D2O)δ166.13，151.71，141.50，102.55，95.50，95.45，88.28，83.13，83.07，73.67，72.74，72.69，71.50，71.45，69.52，69.04，64.84，64.80，60.18，59.22。
以上数据说明本发明成功制备得到尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)。
Claims (10)
1.一种由核苷一磷酸制备核苷酸糖的方法，其特征在于，包括步骤如下：
向底物糖、核苷一磷酸、聚磷酸盐和辅因子二价金属盐的混合反应溶液中加入核苷酸糖合成酶、无机焦磷酸酶和聚磷酸激酶，在35～40℃下联合催化反应2～50h，生成核苷酸糖粗产物，经纯化后，得到核苷酸糖。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述底物糖选自D-甘露糖、L-岩藻糖、N-乙酰神经氨酸、D-半乳糖、D-葡萄糖醛酸、D-木糖、N-乙酰氨基-D-葡萄糖、N-乙酰氨基-D-半乳糖和蔗糖中的一种；
所述底物糖在混合反应溶液中的终浓度为10～500mM；
进一步优选的，所述底物糖在混合反应溶液中的终浓度为40～150mM。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷一磷酸选自腺嘌呤核苷一磷酸(AMP)、鸟嘌呤核苷一磷酸(GMP)、尿嘧啶核苷一磷酸(UMP)和胞嘧啶核苷一磷酸(CMP)中的一种或两种；
所述核苷一磷酸在混合反应溶液中的终浓度为0.3～150mM；
进一步优选的，所述腺嘌呤核苷一磷酸(AMP)在混合反应溶液中的终浓度为0.3～50mM；所述鸟嘌呤核苷一磷酸(GMP)、尿嘧啶核苷一磷酸(UMP)、胞嘧啶核苷一磷酸(CMP)在混合反应溶液中的终浓度为40～150mM。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚磷酸盐为聚合度为2个磷酸及以上的聚磷酸化合物；
进一步优选的，所述聚磷酸盐为六偏磷酸钠；所述聚磷酸盐在混合反应溶液中的终浓度为40～150mM。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述辅因子二价金属盐为镁离子或锰离子盐；
所述辅因子二价金属盐为氯化镁；所述氯化镁在混合反应溶液中的终浓度为10～200mM；
进一步优选的，所述氯化镁在混合反应溶液中的终浓度为40～150mM；
所述混合反应溶液的pH值为7～10。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸糖合成酶选自Bifidobacteriuminfantis来源的N-乙酰己糖胺激酶(BiNahK)、半乳糖激酶(BiGalK)、Pyrococcus furiosus来源的GDP-Man焦磷酸化酶(PfManC)、Bacteroides fragilis来源的GDP-Fuc合成酶(FKP)、Pasteurella multocida来源的N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸尿苷酸转移酶(PmGlmU)、人来源的UDP-N-乙酰半乳糖胺焦磷酸化酶(AGX1)、Neisseria meningitidis来源的CMP-唾液酸合成酶(NmCSS)、拟南芥来源的葡萄糖醛酸激酶(AtGlcAK)、UDP-糖焦磷酸化酶(AtUSP)、Solitalea canadensis来源的木糖激酶(ScXylK)、Capillibacterium thermochitinicola来源的蔗糖磷酸化酶(CtSP)中一种或两种；
进一步优选的，所述核苷酸糖合成酶在混合反应溶液中的终浓度为0.5～4mg/mL。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述无机焦磷酸酶是大肠杆菌来源的无机焦磷酸酶EcPPA、Pasteurella multocida来源的无机焦磷酸酶PmPPA或酵母无机焦磷酸酶；
进一步优选的，所述无机焦磷酸酶是无机焦磷酸酶PmPPA；所述无机焦磷酸酶在混合反应溶液中的终浓度为0.5～2mg/mL。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚磷酸盐激酶为Erysipelotrichaceaebacterium来源的聚磷酸盐激酶EbPPK；所述聚磷酸盐激酶在混合反应溶液中的终浓度为0.5～4mg/mL。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化为用硫酸铝沉淀操作去除杂质，再通过活性炭吸附后的乙醇-水溶液分级洗脱实现核苷酸糖粗产物的纯化；
具体步骤为：在反应完成后将反应液在离心力大于5000g以上离心1～60min，去除沉淀取上清，在上清液中加入硫酸铝溶液，静置到不再产生沉淀，在离心力大于5000g以上离心1～60min，去除沉淀取上清，采用活性炭对上清液进行吸附，接着进行梯度洗脱，收集含有核苷酸糖的溶液，最后经旋转蒸发和/或纳滤浓缩和/或冷冻干燥浓缩和/或阴离子交换色谱和/或分子筛色谱，得到核苷酸糖；
进一步优选的，所述梯度洗脱为纯水洗脱、10％乙醇洗脱、30～50％乙醇洗脱。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核苷酸糖包括鸟苷二磷酸甘露糖(GDP-Man)、鸟苷二磷酸岩藻糖(GDP-Fuc)、胞苷一磷酸N-乙酰神经氨酸(CMP-Sia)、尿苷二磷酸半乳糖(UDP-Gal)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸(UDP-GlcA)、尿苷二磷酸木糖(UDP-Xyl)、尿苷二磷酸N-乙酰氨基-D-葡萄糖(UDP-GlcNAc)、尿苷二磷酸N-乙酰氨基-D-半乳糖(UDP-GalNAc)及尿苷二磷酸葡萄糖(UDP-Glc)。
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