JP2003093091A - Ｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法 - Google Patents
Ｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法Info
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- JP2003093091A JP2003093091A JP2002208987A JP2002208987A JP2003093091A JP 2003093091 A JP2003093091 A JP 2003093091A JP 2002208987 A JP2002208987 A JP 2002208987A JP 2002208987 A JP2002208987 A JP 2002208987A JP 2003093091 A JP2003093091 A JP 2003093091A
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Abstract
(57)【要約】
【課題】本発明は、糖鎖合成の重要な原料であるＣＭＰ
−ＮｅｕＡｃの改良された製造法を提供する。 【解決手段】本発明は、ＧｌｃＮＡｃ、ピルビン酸およ
びＣＭＰを含有する反応系に、酵母菌体、ＧｌｃＮＡｃ
−６Ｐ ２−エピメラーゼ活性を有する菌体またはその
処理物、ＮｅｕＡｃリアーゼ活性を有する菌体またはそ
の処理物およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を
有する菌体またはその処理物を添加し、反応させること
を特徴とする、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法に関する。
また、本発明は、ＧｌｃＮＡｃおよびＣＭＰを含有する
反応系に、酵母菌体、ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメ
ラーゼ活性を有する菌体またはその処理物、ＮｅｕＡｃ
シンセターゼ活性を有する菌体またはその処理物および
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を有する菌体また
はその処理物を添加し、反応させることを特徴とする、
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法に関する。
−ＮｅｕＡｃの改良された製造法を提供する。 【解決手段】本発明は、ＧｌｃＮＡｃ、ピルビン酸およ
びＣＭＰを含有する反応系に、酵母菌体、ＧｌｃＮＡｃ
−６Ｐ ２−エピメラーゼ活性を有する菌体またはその
処理物、ＮｅｕＡｃリアーゼ活性を有する菌体またはそ
の処理物およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を
有する菌体またはその処理物を添加し、反応させること
を特徴とする、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法に関する。
また、本発明は、ＧｌｃＮＡｃおよびＣＭＰを含有する
反応系に、酵母菌体、ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメ
ラーゼ活性を有する菌体またはその処理物、ＮｅｕＡｃ
シンセターゼ活性を有する菌体またはその処理物および
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を有する菌体また
はその処理物を添加し、反応させることを特徴とする、
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法に関する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、糖鎖合成の重要な
原料であるＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ
−ＮｅｕＡｃ）の改良された製造法に関するものであ
る。
原料であるＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ
−ＮｅｕＡｃ）の改良された製造法に関するものであ
る。
【０００２】
【従来の技術】近年、糖鎖に関する構造及び機能に関す
る研究が急速に進み、生理活性を有するオリゴ糖、糖脂
質、糖蛋白質などの医薬品または機能性素材としての用
途開発が注目を集めている。中でもその末端にＮ−アセ
チルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）を含むシアル酸含有糖
鎖は、細胞接着やウィルスの感染の際の受容体となる等
の重要な機能を有する糖鎖である。
る研究が急速に進み、生理活性を有するオリゴ糖、糖脂
質、糖蛋白質などの医薬品または機能性素材としての用
途開発が注目を集めている。中でもその末端にＮ−アセ
チルノイラミン酸（ＮｅｕＡｃ）を含むシアル酸含有糖
鎖は、細胞接着やウィルスの感染の際の受容体となる等
の重要な機能を有する糖鎖である。
【０００３】シアル酸含有糖鎖は、一般にシアル酸転移
酵素の触媒により合成される。シアル酸転移酵素はＣＭ
Ｐ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）
を糖供与体として、受容体となる糖鎖にシアル酸を転移
する酵素である。
酵素の触媒により合成される。シアル酸転移酵素はＣＭ
Ｐ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）
を糖供与体として、受容体となる糖鎖にシアル酸を転移
する酵素である。
【０００４】しかしながら、糖供与体として用いるＣＭ
Ｐ−ＮｅｕＡｃは非常に高価で、かつ量的にも試薬レベ
ルの僅かな供給量でしか供給され得ないのが現状であ
る。ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法としては、シチジン
５’−トリリン酸（ＣＴＰ）とＮｅｕＡｃを基質として
ＣＭＰ-ＮｅｕＡｃシンセターゼの触媒により合成する
方法（Appl. Microbiol. Biotechnol.,44,59-67(199
5)）が知られているが、その原料となるＣＴＰ及びＮｅ
ｕＡｃは高価であるため、それらを直接原料として合成
されたＣＭＰ−ＮｅｕＡｃも高価な試薬とならざるを得
ない。
Ｐ−ＮｅｕＡｃは非常に高価で、かつ量的にも試薬レベ
ルの僅かな供給量でしか供給され得ないのが現状であ
る。ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの製造法としては、シチジン
５’−トリリン酸（ＣＴＰ）とＮｅｕＡｃを基質として
ＣＭＰ-ＮｅｕＡｃシンセターゼの触媒により合成する
方法（Appl. Microbiol. Biotechnol.,44,59-67(199
5)）が知られているが、その原料となるＣＴＰ及びＮｅ
ｕＡｃは高価であるため、それらを直接原料として合成
されたＣＭＰ−ＮｅｕＡｃも高価な試薬とならざるを得
ない。
【０００５】最近、小泉らにより、オロチン酸からウリ
ジン ５’−トリリン酸（ＵＴＰ）への変換を行うBrevi
bacterium ammoniagenes菌体、ＵＴＰからＣＴＰへの変
換反応を触媒するＣＴＰ合成酵素を生産する組換え大腸
菌体およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素を生産する組換
え大腸菌体を組み合わせて、オロチン酸とＮｅｕＡｃを
原料としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを合成する方法が開発さ
れた（Appl.Microbiol.Biotechnol.,53,257-261,(200
0)）。該方法は、高価なＣＴＰを使用しない方法ではあ
るが、複数種の菌体を調製しなければならないなど工程
が煩雑であるとともに、それを実施するための大型の設
備を準備しなければならず、また依然として高価なＮｅ
ｕＡｃを原料としていることからも実用的な方法とは言
い難かった。
ジン ５’−トリリン酸（ＵＴＰ）への変換を行うBrevi
bacterium ammoniagenes菌体、ＵＴＰからＣＴＰへの変
換反応を触媒するＣＴＰ合成酵素を生産する組換え大腸
菌体およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成酵素を生産する組換
え大腸菌体を組み合わせて、オロチン酸とＮｅｕＡｃを
原料としてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを合成する方法が開発さ
れた（Appl.Microbiol.Biotechnol.,53,257-261,(200
0)）。該方法は、高価なＣＴＰを使用しない方法ではあ
るが、複数種の菌体を調製しなければならないなど工程
が煩雑であるとともに、それを実施するための大型の設
備を準備しなければならず、また依然として高価なＮｅ
ｕＡｃを原料としていることからも実用的な方法とは言
い難かった。
【０００６】ＮｅｕＡｃの製造法に関しては、従来、ウ
ミツバメの巣などからの抽出する方法（Carbohydrate R
esearch,56,423(1977)）や、シアル酸の多量体であるコ
ロミン酸を微生物から回収し、これを化学分解し回収す
る方法（Agric.Biol.Chem.,37,2105-2110(1973)）が知
られているが、最近になって酵素を利用した方法が開発
されている。
ミツバメの巣などからの抽出する方法（Carbohydrate R
esearch,56,423(1977)）や、シアル酸の多量体であるコ
ロミン酸を微生物から回収し、これを化学分解し回収す
る方法（Agric.Biol.Chem.,37,2105-2110(1973)）が知
られているが、最近になって酵素を利用した方法が開発
されている。
【０００７】酵素を利用した方法としては、（１）Ｎｅ
ｕＡｃリアーゼまたはＮｅｕＡｃシンセターゼを用い
て、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）から製
造する方法（J.Am.Chem.Soc.,110,6481(1988)、J.Am.Ch
em.Soc.,110,7159(1988)、特開平10-4961）、（２）ア
ルカリ条件下で、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮ
Ａｃ）をＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）に
変換させ、これにＮｅｕＡｃリアーゼまたはＮｅｕＡｃ
シンセターゼを作用させてＮｅｕＡｃを製造する方法
（特開平5-211884、Biotechnology And Bioengineerin
g,Vol.66,No.2(1999)、Enzyme Microb.Technol.,Vol.20
(1997)）、（３）ＧｌｃＮＡｃからＭａｎＮＡｃへの変
換を触媒するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡ
ｃ）２−エピメラーゼとＮｅｕＡｃリアーゼまたはＮｅ
ｕＡｃシンセターゼを用いて、ＧｌｃＮＡｃから製造す
る方法（WO95/26399、特開平3-180190、特開2001-13698
2）が報告されている。
ｕＡｃリアーゼまたはＮｅｕＡｃシンセターゼを用い
て、Ｎ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）から製
造する方法（J.Am.Chem.Soc.,110,6481(1988)、J.Am.Ch
em.Soc.,110,7159(1988)、特開平10-4961）、（２）ア
ルカリ条件下で、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮ
Ａｃ）をＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）に
変換させ、これにＮｅｕＡｃリアーゼまたはＮｅｕＡｃ
シンセターゼを作用させてＮｅｕＡｃを製造する方法
（特開平5-211884、Biotechnology And Bioengineerin
g,Vol.66,No.2(1999)、Enzyme Microb.Technol.,Vol.20
(1997)）、（３）ＧｌｃＮＡｃからＭａｎＮＡｃへの変
換を触媒するＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡ
ｃ）２−エピメラーゼとＮｅｕＡｃリアーゼまたはＮｅ
ｕＡｃシンセターゼを用いて、ＧｌｃＮＡｃから製造す
る方法（WO95/26399、特開平3-180190、特開2001-13698
2）が報告されている。
【０００８】しかしながら、（１）の方法は原料である
ＭａｎＮＡｃが高価であり、（２）の方法は、安価なＧ
ｌｃＮＡｃを原料とする方法ではあるが、ＧｌｃＮＡｃ
とＭａｎＮＡｃの混合物からＭａｎＮＡｃを精製する工
程が煩雑であるという問題があった。また、下記に示す
ように、（３）の方法で用いるＧｌｃＮＡｃ２−エピメ
ラーゼが高い触媒活性を示すためにはＡＴＰが必要であ
るため、高価なＡＴＰを添加するかあるいは微生物を用
いてＡＴＰの前駆体であるアデニンからＡＴＰを生成さ
せる必要があり、この方法も満足いく方法とはいい難か
った。
ＭａｎＮＡｃが高価であり、（２）の方法は、安価なＧ
ｌｃＮＡｃを原料とする方法ではあるが、ＧｌｃＮＡｃ
とＭａｎＮＡｃの混合物からＭａｎＮＡｃを精製する工
程が煩雑であるという問題があった。また、下記に示す
ように、（３）の方法で用いるＧｌｃＮＡｃ２−エピメ
ラーゼが高い触媒活性を示すためにはＡＴＰが必要であ
るため、高価なＡＴＰを添加するかあるいは微生物を用
いてＡＴＰの前駆体であるアデニンからＡＴＰを生成さ
せる必要があり、この方法も満足いく方法とはいい難か
った。
【０００９】（３）の方法
ア：ＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼ
イ：ＮｅｕＡｃリアーゼまたはＮｅｕＡｃシンセターゼ
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ＧｌｃＮ
Ａｃを基質とした大腸菌の生体内酵素によるＮｅｕＡｃ
合成を検討したところ、ＮｅｕＡｃはほとんど合成され
なかったが、ＧｌｃＮＡｃがＧｌｃＮＡｃ ６−リン酸
（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ）に変換されたことから、下に示
す経路によるＧｌｃＮＡｃからのＮｅｕＡｃ合成系の構
築を試みた。その結果、ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピ
メラーゼ（EC5.1.3.9）およびＮｅｕＡｃリアーゼまた
はＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を増強させるとＮｅｕＡ
ｃを高収率で生成できること、また該合成系には高価な
ＡＴＰを必要としないことを見出した。
Ａｃを基質とした大腸菌の生体内酵素によるＮｅｕＡｃ
合成を検討したところ、ＮｅｕＡｃはほとんど合成され
なかったが、ＧｌｃＮＡｃがＧｌｃＮＡｃ ６−リン酸
（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ）に変換されたことから、下に示
す経路によるＧｌｃＮＡｃからのＮｅｕＡｃ合成系の構
築を試みた。その結果、ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピ
メラーゼ（EC5.1.3.9）およびＮｅｕＡｃリアーゼまた
はＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を増強させるとＮｅｕＡ
ｃを高収率で生成できること、また該合成系には高価な
ＡＴＰを必要としないことを見出した。
【００１１】
：ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ
：ＮｅｕＡｃリアーゼ
：ＮｅｕＡｃシンセターゼ
【００１２】次に、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成反応を行う
ためのＣＴＰ合成系について、安価なＣＭＰを原料とし
ての微生物によるＣＴＰへの変換系を上記ＮｅｕＡｃ合
成系と組み合わせるべく、種々の微生物を用いて検討を
行った。すると、大腸菌その他の微生物を用いたときに
はＣＭＰ−ＮｅｕＡｃがわずかしか合成されなかったの
に対して、酵母菌体を用いると高収率でＣＭＰ−Ｎｅｕ
Ａｃを合成できることを見出した。特に、ＮｅｕＡｃシ
ンセターゼ反応に必要なホスホエノールピルビン酸（Ｐ
ＥＰ）は、酵母菌体内のものを利用することができ、反
応系に新たに添加する必要がないことを確認し、本発明
を完成させた。
ためのＣＴＰ合成系について、安価なＣＭＰを原料とし
ての微生物によるＣＴＰへの変換系を上記ＮｅｕＡｃ合
成系と組み合わせるべく、種々の微生物を用いて検討を
行った。すると、大腸菌その他の微生物を用いたときに
はＣＭＰ−ＮｅｕＡｃがわずかしか合成されなかったの
に対して、酵母菌体を用いると高収率でＣＭＰ−Ｎｅｕ
Ａｃを合成できることを見出した。特に、ＮｅｕＡｃシ
ンセターゼ反応に必要なホスホエノールピルビン酸（Ｐ
ＥＰ）は、酵母菌体内のものを利用することができ、反
応系に新たに添加する必要がないことを確認し、本発明
を完成させた。
【００１３】すなわち、本発明は、Ｎ−アセチルグルコ
サミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ピルビン酸およびシチジン
５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を含有する反応系に、酵母
菌体、Ｎ−アセチルグルコサミン−６リン酸 ２−エピ
メラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ２−エピメラーゼ）活性
を有する菌体またはその処理物、Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸リアーゼ（ＮｅｕＡｃリアーゼ）活性を有する菌体
またはその処理物、およびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸シンセターゼ（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセター
ゼ）活性を有する菌体またはその処理物を添加し、反応
させることを特徴とする、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の製造法に関するもので
ある。
サミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ピルビン酸およびシチジン
５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を含有する反応系に、酵母
菌体、Ｎ−アセチルグルコサミン−６リン酸 ２−エピ
メラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ２−エピメラーゼ）活性
を有する菌体またはその処理物、Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸リアーゼ（ＮｅｕＡｃリアーゼ）活性を有する菌体
またはその処理物、およびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸シンセターゼ（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセター
ゼ）活性を有する菌体またはその処理物を添加し、反応
させることを特徴とする、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラ
ミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の製造法に関するもので
ある。
【００１４】また、本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミ
ン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシチジン５’−モノリン酸
（ＣＭＰ）を含有する反応系に、酵母菌体、Ｎ−アセチ
ルグルコサミン−６リン酸 ２−エピメラーゼ（Ｇｌｃ
ＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ）活性を有する菌体ま
たはその処理物、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセター
ゼ（ＮｅｕＡｃシンセターゼ）活性を有する菌体または
その処理物およびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シ
ンセターゼ（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）活性を
有する菌体またはその処理物を添加し、反応させること
を特徴とする、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｃ
ＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の製造法に関するものである。
ン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシチジン５’−モノリン酸
（ＣＭＰ）を含有する反応系に、酵母菌体、Ｎ−アセチ
ルグルコサミン−６リン酸 ２−エピメラーゼ（Ｇｌｃ
ＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ）活性を有する菌体ま
たはその処理物、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセター
ゼ（ＮｅｕＡｃシンセターゼ）活性を有する菌体または
その処理物およびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シ
ンセターゼ（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）活性を
有する菌体またはその処理物を添加し、反応させること
を特徴とする、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｃ
ＭＰ−ＮｅｕＡｃ）の製造法に関するものである。
【００１５】
【発明の実施の形態】本発明のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合
成反応経路を模式的に示すと、以下の（Ａ）ＮｅｕＡｃ
リアーゼを用いた方法と（Ｂ）ＮｅｕＡｃシンセターゼ
を用いた方法である。なお、（Ｂ）の反応系に必須のホ
スホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）は、グルコースから
酵母並びに大腸菌の生体（代謝）反応により合成、供給
されるので、反応系にホスホエノールピルビン酸（ＰＥ
Ｐ）を添加する必要はない。
成反応経路を模式的に示すと、以下の（Ａ）ＮｅｕＡｃ
リアーゼを用いた方法と（Ｂ）ＮｅｕＡｃシンセターゼ
を用いた方法である。なお、（Ｂ）の反応系に必須のホ
スホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）は、グルコースから
酵母並びに大腸菌の生体（代謝）反応により合成、供給
されるので、反応系にホスホエノールピルビン酸（ＰＥ
Ｐ）を添加する必要はない。
【００１６】（Ａ）ＮｅｕＡｃリアーゼを用いた方法
【００１７】（Ｂ）ＮｅｕＡｃシンセターゼを用いた方
法
法
【００１８】上記模式図（Ａ）及び（Ｂ）における記号
は以下のことを意味する。 ：ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ ：ＮｅｕＡｃリアーゼ ：ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ ：ＮｅｕＡｃシンセターゼ
は以下のことを意味する。 ：ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ ：ＮｅｕＡｃリアーゼ ：ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ ：ＮｅｕＡｃシンセターゼ
【００１９】（１）酵素等の調製
上記（Ａ）及び（Ｂ）の反応系に添加するＮ−アセチル
グルコサミン−６リン酸 ２−エピメラーゼ（ＧｌｃＮ
Ａｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ）活性を有する菌体また
はその処理物とは、上記のＧｌｃＮＡｃ ６−リン酸
からＭａｎＮＡｃ６−リン酸への変換反応を触媒する活
性を有するものを意味し、上記（Ａ）の反応系に添加す
るＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼ（ＮｅｕＡｃリア
ーゼ）活性を有する菌体またはその処理物とは、上記
のＭａｎＮＡｃとピルビン酸を基質としてＮｅｕＡｃを
合成する反応を触媒する活性を有するものを意味し、上
記（Ｂ）の反応系に添加するＮ−アセチルノイラミン酸
シンセターゼ（ＮｅｕＡｃシンセターゼ）活性を有する
菌体またはその処理物とは、上記のＭａＮＡｃとホス
ホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）を基質としてＮｅｕＡ
ｃを合成する反応を触媒する活性を有するものを意味
し、上記（Ａ）及び（Ｂ）の反応系に添加するＣＭＰ−
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＣＭＰ−Ｎｅ
ｕＡｃシンセターゼ）活性を有する菌体またはその処理
物とは、上記のＮｅｕＡｃとＣＴＰを基質としてＣＭ
Ｐ−ＮｅｕＡｃを合成する反応を触媒する活性を有する
ものを意味する。
グルコサミン−６リン酸 ２−エピメラーゼ（ＧｌｃＮ
Ａｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ）活性を有する菌体また
はその処理物とは、上記のＧｌｃＮＡｃ ６−リン酸
からＭａｎＮＡｃ６−リン酸への変換反応を触媒する活
性を有するものを意味し、上記（Ａ）の反応系に添加す
るＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼ（ＮｅｕＡｃリア
ーゼ）活性を有する菌体またはその処理物とは、上記
のＭａｎＮＡｃとピルビン酸を基質としてＮｅｕＡｃを
合成する反応を触媒する活性を有するものを意味し、上
記（Ｂ）の反応系に添加するＮ−アセチルノイラミン酸
シンセターゼ（ＮｅｕＡｃシンセターゼ）活性を有する
菌体またはその処理物とは、上記のＭａＮＡｃとホス
ホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）を基質としてＮｅｕＡ
ｃを合成する反応を触媒する活性を有するものを意味
し、上記（Ａ）及び（Ｂ）の反応系に添加するＣＭＰ−
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＣＭＰ−Ｎｅ
ｕＡｃシンセターゼ）活性を有する菌体またはその処理
物とは、上記のＮｅｕＡｃとＣＴＰを基質としてＣＭ
Ｐ−ＮｅｕＡｃを合成する反応を触媒する活性を有する
ものを意味する。
【００２０】これらの酵素活性を有する菌体またはその
処理物は、調製の簡便性などの点から、微生物由来のも
のを使用するのが好都合である。微生物由来のＧｌｃＮ
Ａｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸リアーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ
及びＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼは公知の酵素であ
り、常法により調製することができる。
処理物は、調製の簡便性などの点から、微生物由来のも
のを使用するのが好都合である。微生物由来のＧｌｃＮ
Ａｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミ
ン酸リアーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ
及びＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼは公知の酵素であ
り、常法により調製することができる。
【００２１】また、当該酵素活性を増強させるための手
段として、該酵素遺伝子群（J.Bacteriol.,181,47-54,1
999、J.Bacteriol.,181,4526-4532,1999、Nucleic Acid
s.Res.,13,8843-8852,1985、Agric.Biol.Chem.,50,2155
-2158,1986、FEMS Microbiol.Lett.,75,161-166,1992、
J.Biol.Chem.,271,15373-15380,1996、J.Biol.Chem.,26
4,14769-14774,1989、J.Bacteriol.,177,312-319,199
5、Mol.Microbiol.,35,1120-1134,2000）をクローン化
し、菌体内でこれを大量発現させた微生物種を用いる、
いわゆる組換えＤＮＡ手法を用いた方法を用いるのが好
適である。その際に、２つ以上の遺伝子を共発現させて
得られる菌体またはその処理物を用いることもできる。
段として、該酵素遺伝子群（J.Bacteriol.,181,47-54,1
999、J.Bacteriol.,181,4526-4532,1999、Nucleic Acid
s.Res.,13,8843-8852,1985、Agric.Biol.Chem.,50,2155
-2158,1986、FEMS Microbiol.Lett.,75,161-166,1992、
J.Biol.Chem.,271,15373-15380,1996、J.Biol.Chem.,26
4,14769-14774,1989、J.Bacteriol.,177,312-319,199
5、Mol.Microbiol.,35,1120-1134,2000）をクローン化
し、菌体内でこれを大量発現させた微生物種を用いる、
いわゆる組換えＤＮＡ手法を用いた方法を用いるのが好
適である。その際に、２つ以上の遺伝子を共発現させて
得られる菌体またはその処理物を用いることもできる。
【００２２】遺伝子のクローニング、クローン化したＤ
ＮＡ断片を用いた発現ベクターの調製、発現ベクターを
用いた目的とする酵素活性を有する酵素タンパク質の調
製などは、分子生物学の分野に属する技術者にとっては
周知の技術であり、具体的には、例えば「Molecular Cl
oning」（Maniatisら編、Cold Spring Harbor Laborato
ries, Cold Spring Harbor、New York(1982））に記載
の方法に従って行うことができる。
ＮＡ断片を用いた発現ベクターの調製、発現ベクターを
用いた目的とする酵素活性を有する酵素タンパク質の調
製などは、分子生物学の分野に属する技術者にとっては
周知の技術であり、具体的には、例えば「Molecular Cl
oning」（Maniatisら編、Cold Spring Harbor Laborato
ries, Cold Spring Harbor、New York(1982））に記載
の方法に従って行うことができる。
【００２３】たとえば、報告されている塩基配列をもと
にプローブを合成し、微生物の染色体ＤＮＡより目的と
する酵素活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝
子を含有するＤＮＡ断片をクローニングすればよい。ク
ローン化に用いる宿主は特に限定されないが、操作性及
び簡便性から大腸菌を宿主とするのが適当である。
にプローブを合成し、微生物の染色体ＤＮＡより目的と
する酵素活性を有する酵素タンパク質をコードする遺伝
子を含有するＤＮＡ断片をクローニングすればよい。ク
ローン化に用いる宿主は特に限定されないが、操作性及
び簡便性から大腸菌を宿主とするのが適当である。
【００２４】クローン化した遺伝子の高発現系を構築す
るためには、たとえばマキザムーギルバートの方法（Me
thods in Enzymology，65，499(1980））もしくはダイ
デオキシチェインターミネーター法（Methods in Enzym
ology，101，20（1983））などを応用してクローン化し
たＤＮＡ断片の塩基配列を解析して該遺伝子のコーディ
ング領域を特定し、宿主微生物に応じて該遺伝子が菌体
中で自発現可能となるように発現制御シグナル（転写開
始及び翻訳開始シグナル）をその上流に連結した組換え
発現ベクターを作製する。
るためには、たとえばマキザムーギルバートの方法（Me
thods in Enzymology，65，499(1980））もしくはダイ
デオキシチェインターミネーター法（Methods in Enzym
ology，101，20（1983））などを応用してクローン化し
たＤＮＡ断片の塩基配列を解析して該遺伝子のコーディ
ング領域を特定し、宿主微生物に応じて該遺伝子が菌体
中で自発現可能となるように発現制御シグナル（転写開
始及び翻訳開始シグナル）をその上流に連結した組換え
発現ベクターを作製する。
【００２５】ベクターとしては、種々のプラスミドべク
ター、ファージベクターなどが使用可能であるが、大腸
菌菌体内で複製可能であり、適当な薬剤耐性マーカーと
特定の制限酵素切断部位を有し、菌体内のコピー数の高
いプラスミドベクターを使用するのが望ましい。具体的
には、ｐＢＲ３２２（Gene，2，95（1975））、ｐＵＣ
１８，ｐＵＣ１９（Gene、33，103(1985））などを例示
することができる。
ター、ファージベクターなどが使用可能であるが、大腸
菌菌体内で複製可能であり、適当な薬剤耐性マーカーと
特定の制限酵素切断部位を有し、菌体内のコピー数の高
いプラスミドベクターを使用するのが望ましい。具体的
には、ｐＢＲ３２２（Gene，2，95（1975））、ｐＵＣ
１８，ｐＵＣ１９（Gene、33，103(1985））などを例示
することができる。
【００２６】作製した組換えべクターを用いて大腸菌を
形質転換する。宿主となる大腸菌としては、例えば組換
えＤＮＡ実験に使用されるＫ１２株、Ｃ６００菌、ＪＭ
１０５菌、ＪＭ１０９菌(Gene, 33, 103-119(1985))な
どが使用可能である。ピルビン酸のＮｅｕＡｃ合成以外
での代謝を減らすため、ピルビン酸代謝に関するlip遺
伝子変異などが導入された大腸菌（例えばＷ１４８５ｌ
ｉｐ２（ＡＴＣＣ２５６４５））を宿主として使用する
こともできる。大腸菌を形質転換する方法はすでに多く
の方法が報告されており、低温下、塩化カルシウム処理
して菌体内にプラスミドを導入する方法（J．Mol．Bio
l．，53，159（1970））などにより大腸菌を形質転換す
ることができる。
形質転換する。宿主となる大腸菌としては、例えば組換
えＤＮＡ実験に使用されるＫ１２株、Ｃ６００菌、ＪＭ
１０５菌、ＪＭ１０９菌(Gene, 33, 103-119(1985))な
どが使用可能である。ピルビン酸のＮｅｕＡｃ合成以外
での代謝を減らすため、ピルビン酸代謝に関するlip遺
伝子変異などが導入された大腸菌（例えばＷ１４８５ｌ
ｉｐ２（ＡＴＣＣ２５６４５））を宿主として使用する
こともできる。大腸菌を形質転換する方法はすでに多く
の方法が報告されており、低温下、塩化カルシウム処理
して菌体内にプラスミドを導入する方法（J．Mol．Bio
l．，53，159（1970））などにより大腸菌を形質転換す
ることができる。
【００２７】得られた形質転換体は、当該微生物が増殖
可能な培地中で増殖させ、さらにクローン化した目的と
する酵素活性を有するタンパク質の発現を誘導して菌体
内に当該酵素タンパク質が大量に蓄積するまで培養を行
う。形質転換体の培養は、炭素源、窒素源などの当該微
生物の増殖に必要な栄養源を含有する培地を用いて常法
に従って行えばよい。例えば、培地としてブイヨン培
地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキ
ストラクト、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％
トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食
塩）などの大腸菌の培養に常用されている培地を用い、
３０〜５０℃の培養温度で１０〜５０時間程度必要によ
り通気攪拌しながら培養することができる。また、ベク
ターとしてプラスミドを用いた場合には、培養中におけ
るプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラ
スミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシリン、カナ
マイシンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養す
る。
可能な培地中で増殖させ、さらにクローン化した目的と
する酵素活性を有するタンパク質の発現を誘導して菌体
内に当該酵素タンパク質が大量に蓄積するまで培養を行
う。形質転換体の培養は、炭素源、窒素源などの当該微
生物の増殖に必要な栄養源を含有する培地を用いて常法
に従って行えばよい。例えば、培地としてブイヨン培
地、ＬＢ培地（１％トリプトン、０．５％イーストエキ
ストラクト、１％食塩）または２×ＹＴ培地（１．６％
トリプトン、１％イーストエキストラクト、０．５％食
塩）などの大腸菌の培養に常用されている培地を用い、
３０〜５０℃の培養温度で１０〜５０時間程度必要によ
り通気攪拌しながら培養することができる。また、ベク
ターとしてプラスミドを用いた場合には、培養中におけ
るプラスミドの脱落を防ぐために適当な抗生物質（プラ
スミドの薬剤耐性マーカーに応じ、アンピシリン、カナ
マイシンなど）の薬剤を適当量培養液に加えて培養す
る。
【００２８】目的の酵素活性を有する菌体としては、上
記の方法で得られる培養液から遠心分離、膜分離などの
固液分離手段で回収したものを例示することができる。
また、回収した菌体を、機械的破壊（ワーリングブレン
ダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによ
る）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾など
による）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波
処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの
一般的な処理法に従って処理して得られる処理物、もし
くは該菌体処理物から目的の酵素活性を有する画分を通
常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機
溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理
など）を施して得られる粗酵素または精製酵素も菌体処
理物として利用することができる。
記の方法で得られる培養液から遠心分離、膜分離などの
固液分離手段で回収したものを例示することができる。
また、回収した菌体を、機械的破壊（ワーリングブレン
ダー、フレンチプレス、ホモジナイザー、乳鉢などによ
る）、凍結融解、自己消化、乾燥（凍結乾燥、風乾など
による）、酵素処理（リゾチームなどによる）、超音波
処理、化学処理（酸、アルカリ処理などによる）などの
一般的な処理法に従って処理して得られる処理物、もし
くは該菌体処理物から目的の酵素活性を有する画分を通
常の酵素の精製手段（塩析処理、等電点沈澱処理、有機
溶媒沈澱処理、透析処理、各種クロマトグラフィー処理
など）を施して得られる粗酵素または精製酵素も菌体処
理物として利用することができる。
【００２９】次にＣＭＰからＣＴＰへの変換に使用する
酵母としては、市販のパン酵母、あるいはワイン酵母で
よく、菌体製造の過程が省略できる点で極めて有利であ
る。また、酵母生菌体、酵母乾燥菌体いずれの形態も利
用可能であるが、反応収率、取扱いの容易性などの点か
らは、乾燥酵母菌体を用いるのが好ましい。
酵母としては、市販のパン酵母、あるいはワイン酵母で
よく、菌体製造の過程が省略できる点で極めて有利であ
る。また、酵母生菌体、酵母乾燥菌体いずれの形態も利
用可能であるが、反応収率、取扱いの容易性などの点か
らは、乾燥酵母菌体を用いるのが好ましい。
【００３０】（２）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成反応に使用するＧｌｃＮＡｃ、
ピルビン酸およびＣＭＰは市販されており、この市販品
を使用することができる。使用濃度としては、例えばそ
れぞれ１〜５０００ｍＭ、好ましくは１０〜１０００ｍ
Ｍの範囲から適宜設定することができる。
ピルビン酸およびＣＭＰは市販されており、この市販品
を使用することができる。使用濃度としては、例えばそ
れぞれ１〜５０００ｍＭ、好ましくは１０〜１０００ｍ
Ｍの範囲から適宜設定することができる。
【００３１】（ＮｅｕＡｃリアーゼを用いた方法）ＣＭ
Ｐ−ＮｅｕＡｃの合成反応は、ＧｌｃＮＡｃ、ＣＭＰお
よびピルビン酸を含有する反応系に、ＧｌｃＮＡｃ−６
Ｐ ２−エピメラーゼ活性を有する菌体またはその処理
物、ＮｅｕＡｃリアーゼ活性を有する菌体またはその処
理物、およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を有
する菌体またはその処理物を反応液１ｍｌ当たりそれぞ
れ０．２ｍｇ以上、好ましくは２〜１００ｍｇ、乾燥酵
母を１〜２０％（ｗ／ｖ）添加し、５０℃以下、好まし
くは１５〜４０℃で１〜１５０時間程度、必要により撹
拌しながら反応させることにより実施できる。
Ｐ−ＮｅｕＡｃの合成反応は、ＧｌｃＮＡｃ、ＣＭＰお
よびピルビン酸を含有する反応系に、ＧｌｃＮＡｃ−６
Ｐ ２−エピメラーゼ活性を有する菌体またはその処理
物、ＮｅｕＡｃリアーゼ活性を有する菌体またはその処
理物、およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を有
する菌体またはその処理物を反応液１ｍｌ当たりそれぞ
れ０．２ｍｇ以上、好ましくは２〜１００ｍｇ、乾燥酵
母を１〜２０％（ｗ／ｖ）添加し、５０℃以下、好まし
くは１５〜４０℃で１〜１５０時間程度、必要により撹
拌しながら反応させることにより実施できる。
【００３２】また、上記反応においては、ＧｌｃＮＡｃ
およびピルビン酸を含有する反応系に、ＧｌｃＮＡｃ−
６Ｐ ２−エピメラーゼ活性を有する菌体またはその処
理物およびＮｅｕＡｃリアーゼ活性を有する菌体または
その処理物を添加して、５０℃以下、好ましくは１５〜
４０℃で１〜５０時間程度反応させてＮｅｕＡｃを合成
し、次いでＣＭＰ、酵母菌体およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ
シンセターゼ活性を有する菌体またはその処理物を添加
し、５〜５０時間程度反応させてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを
合成する２段階の反応を行うことでＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ
の合成収率を向上させることができる。なお、ＣＭＰは
あらかじめＮｅｕＡｃ合成時に反応系に添加しておいて
もかまわない。
およびピルビン酸を含有する反応系に、ＧｌｃＮＡｃ−
６Ｐ ２−エピメラーゼ活性を有する菌体またはその処
理物およびＮｅｕＡｃリアーゼ活性を有する菌体または
その処理物を添加して、５０℃以下、好ましくは１５〜
４０℃で１〜５０時間程度反応させてＮｅｕＡｃを合成
し、次いでＣＭＰ、酵母菌体およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ
シンセターゼ活性を有する菌体またはその処理物を添加
し、５〜５０時間程度反応させてＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを
合成する２段階の反応を行うことでＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ
の合成収率を向上させることができる。なお、ＣＭＰは
あらかじめＮｅｕＡｃ合成時に反応系に添加しておいて
もかまわない。
【００３３】（ＮｅｕＡｃシンセターゼを用いた方法）
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成反応は、ＧｌｃＮＡｃ及びＣ
ＭＰを含有する反応系に、ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エ
ピメラーゼ活性を有する菌体またはその処理物、Ｎｅｕ
Ａｃシンセターゼ活性を有する菌体またはその処理物、
およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を有する菌
体またはその処理物を反応液１ｍｌ当たりそれぞれ０．
２ｍｇ以上、好ましくは２〜１００ｍｇ、乾燥酵母を１
〜２０％（ｗ／ｖ）添加し、５０℃以下、好ましくは１
５〜４０℃で１〜１５０時間程度、必要により撹拌しな
がら反応させることにより実施できる。
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成反応は、ＧｌｃＮＡｃ及びＣ
ＭＰを含有する反応系に、ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エ
ピメラーゼ活性を有する菌体またはその処理物、Ｎｅｕ
Ａｃシンセターゼ活性を有する菌体またはその処理物、
およびＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を有する菌
体またはその処理物を反応液１ｍｌ当たりそれぞれ０．
２ｍｇ以上、好ましくは２〜１００ｍｇ、乾燥酵母を１
〜２０％（ｗ／ｖ）添加し、５０℃以下、好ましくは１
５〜４０℃で１〜１５０時間程度、必要により撹拌しな
がら反応させることにより実施できる。
【００３４】上記のいずれのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ合成系
においても、必要に応じて無機リン酸、マグネシウムお
よびエネルギー源を添加するのが好ましい。無機リン酸
としては、リン酸カリウムなどをそのまま使用すること
もできるが、好ましくはリン酸緩衝液の形態で使用する
のが好ましい。使用濃度は、たとえば１〜１０００ｍ
Ｍ、好ましくは１０〜４００ｍＭの範囲から適宜設定す
ることができる。また、リン酸緩衝液の形式で使用する
場合、緩衝液のｐＨは５〜１０の範囲から適宜設定すれ
ばよい。
においても、必要に応じて無機リン酸、マグネシウムお
よびエネルギー源を添加するのが好ましい。無機リン酸
としては、リン酸カリウムなどをそのまま使用すること
もできるが、好ましくはリン酸緩衝液の形態で使用する
のが好ましい。使用濃度は、たとえば１〜１０００ｍ
Ｍ、好ましくは１０〜４００ｍＭの範囲から適宜設定す
ることができる。また、リン酸緩衝液の形式で使用する
場合、緩衝液のｐＨは５〜１０の範囲から適宜設定すれ
ばよい。
【００３５】マグネシウムとしては、硫酸マグネシウ
ム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウム等の無機酸の
マグネシウム塩、クエン酸マグネシウム等の有機酸のマ
グネシウム塩を使用することができ、その使用濃度とし
ては１〜１０００ｍＭの範囲から適宜設定することがで
きる。エネルギー源としては、グルコース、フラクトー
ス、ショ糖などの糖類、酢酸、クエン酸などの有機酸を
使用することができ、その使用濃度としては、１〜５０
００ｍＭ、好ましくは１０〜１０００ｍＭの範囲から適
宜設定することができる。
ム、硝酸マグネシウム、塩化マグネシウム等の無機酸の
マグネシウム塩、クエン酸マグネシウム等の有機酸のマ
グネシウム塩を使用することができ、その使用濃度とし
ては１〜１０００ｍＭの範囲から適宜設定することがで
きる。エネルギー源としては、グルコース、フラクトー
ス、ショ糖などの糖類、酢酸、クエン酸などの有機酸を
使用することができ、その使用濃度としては、１〜５０
００ｍＭ、好ましくは１０〜１０００ｍＭの範囲から適
宜設定することができる。
【００３６】このようにして得られたＣＭＰ−ＮｅｕＡ
ｃは、糖ヌクレオチドの通常の単離精製手段（イオン交
換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩
析、アフィニティクロマトグラフィーなど）を用いて単
離精製することができる。
ｃは、糖ヌクレオチドの通常の単離精製手段（イオン交
換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、塩
析、アフィニティクロマトグラフィーなど）を用いて単
離精製することができる。
【００３７】
【発明の効果】本発明のＮｅｕＡｃリアーゼを用いる方
法は、高価なＡＴＰを必要とせず、安価なＧｌｃＮＡ
ｃ、ＣＭＰ及びピルビン酸から効率的にＣＭＰ−Ｎｅｕ
Ａｃを製造することが初めて可能となり、ＣＭＰ−Ｎｅ
ｕＡｃの大量合成法として極めて有意義な方法である。
法は、高価なＡＴＰを必要とせず、安価なＧｌｃＮＡ
ｃ、ＣＭＰ及びピルビン酸から効率的にＣＭＰ−Ｎｅｕ
Ａｃを製造することが初めて可能となり、ＣＭＰ−Ｎｅ
ｕＡｃの大量合成法として極めて有意義な方法である。
【００３８】また、本発明のＮｅｕＡｃシンセターゼを
用いる方法は、高価なＡＴＰを必要とせず、反応系に必
須のホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）はグルコース
から酵母並びに大腸菌の生体（代謝）反応により合成・
供給されるので、反応系にホスホエノールピルビン酸
（ＰＥＰ）を添加する必要がなく、安価なＧｌｃＮＡｃ
及びＣＭＰから効率的にＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを製造する
ことが初めて可能となり、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの大量合
成法として極めて有意義な方法である。特に、本発明の
ＮｅｕＡｃシンセターゼを用いる方法は、本発明のＮｅ
ｕＡｃリアーゼを用いる方法で用いられる２段階の反応
を必要としない点で、より簡便で優れた方法である。
用いる方法は、高価なＡＴＰを必要とせず、反応系に必
須のホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）はグルコース
から酵母並びに大腸菌の生体（代謝）反応により合成・
供給されるので、反応系にホスホエノールピルビン酸
（ＰＥＰ）を添加する必要がなく、安価なＧｌｃＮＡｃ
及びＣＭＰから効率的にＣＭＰ−ＮｅｕＡｃを製造する
ことが初めて可能となり、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの大量合
成法として極めて有意義な方法である。特に、本発明の
ＮｅｕＡｃシンセターゼを用いる方法は、本発明のＮｅ
ｕＡｃリアーゼを用いる方法で用いられる２段階の反応
を必要としない点で、より簡便で優れた方法である。
【００３９】
【実施例】以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明
するが、本発明がこれに限定されないことは明らかであ
る。なお、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素によ
る切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに
大腸菌の形質転換法は全て「Molecular Cloning, A Lab
oratory Manual, Second Edition」（Sambrookら編、Co
ld spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N
ew York (1989)）に従って行った。また、制限酵素、Ａ
ｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼは宝酒造（株）より入手した。
するが、本発明がこれに限定されないことは明らかであ
る。なお、実施例におけるＤＮＡの調製、制限酵素によ
る切断、Ｔ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡ連結、並びに
大腸菌の形質転換法は全て「Molecular Cloning, A Lab
oratory Manual, Second Edition」（Sambrookら編、Co
ld spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N
ew York (1989)）に従って行った。また、制限酵素、Ａ
ｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガー
ゼは宝酒造（株）より入手した。
【００４０】さらに、反応液中のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの
定量はＨＰＬＣ法により行った。具体的には、分離には
ＹＭＣ社製のＯＤＳ−ＨＳ３０２カラムを用い、溶出液
として１ｍＭ テトラブチルアンモニウム硫酸塩、５０
ｍＭ 酢酸マグネシウム溶液を用いた。また、ＮｅｕＡ
ｃ等の糖の定量にはＨＰＡＥ−ＰＡＤ法によるＨＰＬＣ
により行った。具体的には、分離、検出にはダイオネク
ス社製のＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム、ＥＤ４０を
用い、溶出液としてＡ液；０．１Ｎ ＮａＯＨＢ液；
０．１Ｎ ＮａＯＨ、０．５Ｍ 酢酸ナトリウムを用
い、Ａ液―Ｂ液のグラジエントにより行った。
定量はＨＰＬＣ法により行った。具体的には、分離には
ＹＭＣ社製のＯＤＳ−ＨＳ３０２カラムを用い、溶出液
として１ｍＭ テトラブチルアンモニウム硫酸塩、５０
ｍＭ 酢酸マグネシウム溶液を用いた。また、ＮｅｕＡ
ｃ等の糖の定量にはＨＰＡＥ−ＰＡＤ法によるＨＰＬＣ
により行った。具体的には、分離、検出にはダイオネク
ス社製のＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ１カラム、ＥＤ４０を
用い、溶出液としてＡ液；０．１Ｎ ＮａＯＨＢ液；
０．１Ｎ ＮａＯＨ、０．５Ｍ 酢酸ナトリウムを用
い、Ａ液―Ｂ液のグラジエントにより行った。
【００４１】実施例１
（１）Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼをコードする
ｎａｎＡ遺伝子のクローニング Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ株の染色体ＤＮＡ（Ａ
ＴＣＣ５１９０７Ｄ）をテンペレートとして、以下に示
す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、Ｐ
ＣＲ法によりＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＮ−アセチル
ノイラミン酸リアーゼ（ｎａｎＡ）遺伝子を増幅した。 プライマー（Ａ）：5’- CACCATGGCGAAGATATTGCCGCTCAA
ACTA -3’ プライマー（Ｂ）：5’- CCGAATTCATTTATGACAAAAATTTCG
CTTTCAAG -3’
ｎａｎＡ遺伝子のクローニング Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ株の染色体ＤＮＡ（Ａ
ＴＣＣ５１９０７Ｄ）をテンペレートとして、以下に示
す２種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、Ｐ
ＣＲ法によりＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのＮ−アセチル
ノイラミン酸リアーゼ（ｎａｎＡ）遺伝子を増幅した。 プライマー（Ａ）：5’- CACCATGGCGAAGATATTGCCGCTCAA
ACTA -3’ プライマー（Ｂ）：5’- CCGAATTCATTTATGACAAAAATTTCG
CTTTCAAG -3’
【００４２】ＰＣＲによるｎａｎＡ遺伝子の増幅は、反
応液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネ
シウム、０．００１％ ゼラチン、テンペレートＤＮＡ
０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２
μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５
ユニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA
Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９４℃、１分）、ア
ニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーショ
ン（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことに
より行った。
応液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネ
シウム、０．００１％ ゼラチン、テンペレートＤＮＡ
０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２
μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５
ユニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA
Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９４℃、１分）、ア
ニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーショ
ン（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことに
より行った。
【００４３】遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．２
ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素
ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、同じく制限酵素Ｎｃ
ｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９
Ａ（Pharmacia Biotech.社より入手）とＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ
１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）を形質転換し、得られ
たアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ
ｎａｎＡを単離した。ｐＴｒｃｎａｎＡは、ｐＴｒｃ９
９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ
切断部位にＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｎａｎＡ遺伝子
の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたもので
ある。
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、１．２
ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素
ＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、同じく制限酵素Ｎｃ
ｏＩ及びＥｃｏＲＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９
Ａ（Pharmacia Biotech.社より入手）とＴ４ＤＮＡリガ
ーゼを用いて連結した。連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ
１０９株（ＡＴＣＣ５３３２３）を形質転換し、得られ
たアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ
ｎａｎＡを単離した。ｐＴｒｃｎａｎＡは、ｐＴｒｃ９
９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ
切断部位にＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｎａｎＡ遺伝子
の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたもので
ある。
【００４４】（２）ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラ
ーゼをコードするｎａｎＥ遺伝子のクローニング Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ株の染色体ＤＮＡをテ
ンペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮ
Ａを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりＨ．ｉｎｆｌ
ｕｅｎｚａｅのＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ
（ｎａｎＥ）遺伝子を増幅した。 プライマー（Ｃ）：5’- GGTCTAGATTTAAATGAGGGGTGTTAT
ATGT -3’ プライマー（Ｄ）：5’- TCGTCGACTTATCTTGCAGATTTCACT
GAATTAGCAAACCA -3’
ーゼをコードするｎａｎＥ遺伝子のクローニング Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ Ｒｄ株の染色体ＤＮＡをテ
ンペレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮ
Ａを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりＨ．ｉｎｆｌ
ｕｅｎｚａｅのＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ
（ｎａｎＥ）遺伝子を増幅した。 プライマー（Ｃ）：5’- GGTCTAGATTTAAATGAGGGGTGTTAT
ATGT -3’ プライマー（Ｄ）：5’- TCGTCGACTTATCTTGCAGATTTCACT
GAATTAGCAAACCA -3’
【００４５】ＰＣＲによるｎａｎＥ遺伝子の増幅は、反
応液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネ
シウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ
０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｃ）（Ｄ）各々０．２
μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５
ユニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA
Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９４℃、１分）、ア
ニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーショ
ン（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことに
より行った。
応液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネ
シウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ
０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｃ）（Ｄ）各々０．２
μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５
ユニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA
Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９４℃、１分）、ア
ニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーショ
ン（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことに
より行った。
【００４６】遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献の方法（Molecular Cloning、前述）
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、７２０
ｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素Ｘ
ｂａＩ及びＳａｌＩで切断し、同じく制限酵素ＸｂａＩ
及びＳａｌＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９ＡとＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用い
て大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたアンピシ
リン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ｎａｎＥ
を単離した。ｐＴｒｃ−ｎａｎＥは、ｐＴｒｃ９９Ａの
ｔｒｃプロモーター下流のＸｂａＩ−ＳａｌＩ切断部位
にＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｎａｎＥ遺伝子の構造遺
伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献の方法（Molecular Cloning、前述）
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、７２０
ｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素Ｘ
ｂａＩ及びＳａｌＩで切断し、同じく制限酵素ＸｂａＩ
及びＳａｌＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９ＡとＴ
４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用い
て大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたアンピシ
リン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃ−ｎａｎＥ
を単離した。ｐＴｒｃ−ｎａｎＥは、ｐＴｒｃ９９Ａの
ｔｒｃプロモーター下流のＸｂａＩ−ＳａｌＩ切断部位
にＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｎａｎＥ遺伝子の構造遺
伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００４７】（３）ｎａｎＡ、ｎａｎＥ遺伝子共発現プ
ラスミドの構築 上記（１）で得られたｐＴｒｃｎａｎＡプラスミドを制
限酵素ＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩで切断し、ｎａｎＡ遺伝子
を含むＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片をアガロースゲル電気
泳動を用いて回収した。これを同じくＮｃｏＩ、Ｅｃｏ
ＲＩで消化した上記（２）で得られたｐＴｒｃ−ｎａｎ
ＥプラスミドとＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し
た。この連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質
転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラ
スミドｐＴｒｃＡＥを単離した。ｐＴｒｃＡＥは、ｐＴ
ｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−Ｓａ
ｌＩ切断部位にＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｎａｎＡ、
ｎａｎＥ遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿
入されたものである。
ラスミドの構築 上記（１）で得られたｐＴｒｃｎａｎＡプラスミドを制
限酵素ＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩで切断し、ｎａｎＡ遺伝子
を含むＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片をアガロースゲル電気
泳動を用いて回収した。これを同じくＮｃｏＩ、Ｅｃｏ
ＲＩで消化した上記（２）で得られたｐＴｒｃ−ｎａｎ
ＥプラスミドとＴ４ＤＮＡライゲースを用いて連結し
た。この連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質
転換し、得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラ
スミドｐＴｒｃＡＥを単離した。ｐＴｒｃＡＥは、ｐＴ
ｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−Ｓａ
ｌＩ切断部位にＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｎａｎＡ、
ｎａｎＥ遺伝子の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿
入されたものである。
【００４８】（４）ＮｅｕＡｃの合成
（３）で構築したプラスミドｐＴｒｃＡＥを保持する大
腸菌Ｗ１４８５ｌｉｐ２（ＡＴＣＣ２５６４５）を、１
００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地
５００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。菌体数
が１×１０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終濃
度０．２ｍＭになるようにイソプロピルβ−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３７℃
で２６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離
（９，０００×ｇ、１０分）により２５ｍｌ培養液分の
菌体５０ｍｇを回収し、これに１００ｍＭ ＧｌｃＮＡ
ｃ、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ｍＭ グルコー
ス、３００ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．５％（ｖ
／ｖ）キシレンを含有する２００ｍＭ リン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍｌを添加し、２８℃で攪拌し
ながら反応を行った。１４、２４時間後に１１０ｍｇの
ピルビン酸ナトリウムを添加し、４８時間で反応液を１
００℃、５分間の熱処理をすることで反応を停止させ
た。得られた反応液を糖分析用ＨＰＬＣ（ＨＰＡＥ−Ｐ
ＡＤ、ダイオネクス社）で分析したところ、４３．７ｍ
ＭのＮｅｕＡｃの生成が確認された。なお、対照菌（ｐ
Ｔｒｃ９９Ａプラスミドを保持する大腸菌Ｗ１４８５ｌ
ｉｐ２）を用いて同様の反応を行ったが、ＮｅｕＡｃの
生成を検出することは出来なかった（０．５ｍＭ以下の
生成）。
腸菌Ｗ１４８５ｌｉｐ２（ＡＴＣＣ２５６４５）を、１
００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する２×ＹＴ培地
５００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培養した。菌体数
が１×１０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に最終濃
度０．２ｍＭになるようにイソプロピルβ−Ｄ−チオガ
ラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加し、さらに３７℃
で２６時間振とう培養を続けた。培養終了後、遠心分離
（９，０００×ｇ、１０分）により２５ｍｌ培養液分の
菌体５０ｍｇを回収し、これに１００ｍＭ ＧｌｃＮＡ
ｃ、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ｍＭ グルコー
ス、３００ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．５％（ｖ
／ｖ）キシレンを含有する２００ｍＭ リン酸カリウム
緩衝液（ｐＨ８．０）５ｍｌを添加し、２８℃で攪拌し
ながら反応を行った。１４、２４時間後に１１０ｍｇの
ピルビン酸ナトリウムを添加し、４８時間で反応液を１
００℃、５分間の熱処理をすることで反応を停止させ
た。得られた反応液を糖分析用ＨＰＬＣ（ＨＰＡＥ−Ｐ
ＡＤ、ダイオネクス社）で分析したところ、４３．７ｍ
ＭのＮｅｕＡｃの生成が確認された。なお、対照菌（ｐ
Ｔｒｃ９９Ａプラスミドを保持する大腸菌Ｗ１４８５ｌ
ｉｐ２）を用いて同様の反応を行ったが、ＮｅｕＡｃの
生成を検出することは出来なかった（０．５ｍＭ以下の
生成）。
【００４９】（４）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼを
コードするｎｅｕＡ遺伝子のクローニング Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＩ９１４菌の染色体ＤＮ
Ａをテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマ
ーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりＨ．ｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａｅのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ
（ｎｅｕＡ）遺伝子を増幅した。 プライマー（Ｅ）：5’- TGCCATGGTGAAAATAATAATGACAAG
AA -3’ プライマー（Ｆ）：5’- AACTGCAGTGCAGATCAAAAGTGCGGC
C -3’
コードするｎｅｕＡ遺伝子のクローニング Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ ＨＩ９１４菌の染色体ＤＮ
Ａをテンペレートとして、以下に示す２種類のプライマ
ーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ法によりＨ．ｉ
ｎｆｌｕｅｎｚａｅのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ
（ｎｅｕＡ）遺伝子を増幅した。 プライマー（Ｅ）：5’- TGCCATGGTGAAAATAATAATGACAAG
AA -3’ プライマー（Ｆ）：5’- AACTGCAGTGCAGATCAAAAGTGCGGC
C -3’
【００５０】ＰＣＲによるｎｅｕＡ遺伝子の増幅は、反
応液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネ
シウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ
０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｅ）（Ｆ）各々０．２
μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５
ユニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA
Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９４℃、１分）、ア
ニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーショ
ン（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことに
より行った。
応液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネ
シウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ
０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｅ）（Ｆ）各々０．２
μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５
ユニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA
Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９４℃、１分）、ア
ニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーショ
ン（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことに
より行った。
【００５１】遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献の方法（Molecular Cloning、前述）
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、７２０
ｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素Ｎ
ｃｏＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵素ＮｃｏＩ
Ｉ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａと
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用
いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたアンピ
シリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃｓｉａＢ
ＮＰを単離した。ｐＴｒｃｓｉａＢＮＰは、ｐＴｒｃ９
９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ切
断部位にＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｎｅｕＡ遺伝子の
構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものであ
る。
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献の方法（Molecular Cloning、前述）
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、７２０
ｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素Ｎ
ｃｏＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵素ＮｃｏＩ
Ｉ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａと
Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を用
いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたアンピ
シリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃｓｉａＢ
ＮＰを単離した。ｐＴｒｃｓｉａＢＮＰは、ｐＴｒｃ９
９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−ＰｓｔＩ切
断部位にＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｎｅｕＡ遺伝子の
構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたものであ
る。
【００５２】（５）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼの
調製 プラスミドｐＴｒｃｓｉａＢＮＰを保持する大腸菌ＪＭ
１０９菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有す
る２×ＹＴ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培
養した。４×１０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に
最終濃度０．２５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、
さらに３７℃で６時間振とう培養を続けた。培養終了
後、遠心分離（９，０００×ｇ，１０分）により菌体を
回収し、５ｍｌの緩衝液（１００ｍＭ トリス塩酸（ｐ
Ｈ７．８）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に懸濁した。超音
波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，
０００×ｇ、１０分）により菌体残さを除去した。
調製 プラスミドｐＴｒｃｓｉａＢＮＰを保持する大腸菌ＪＭ
１０９菌を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有す
る２×ＹＴ培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう培
養した。４×１０８個／ｍｌに達した時点で、培養液に
最終濃度０．２５ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、
さらに３７℃で６時間振とう培養を続けた。培養終了
後、遠心分離（９，０００×ｇ，１０分）により菌体を
回収し、５ｍｌの緩衝液（１００ｍＭ トリス塩酸（ｐ
Ｈ７．８）、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２）に懸濁した。超音
波処理を行って菌体を破砕し、さらに遠心分離（２０，
０００×ｇ、１０分）により菌体残さを除去した。
【００５３】このように得られた上清画分を酵素液と
し、酵素液におけるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活
性を測定した結果を対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する
大腸菌Ｋ−１２株 ＪＭ１０９）と共に下記表１に示
す。なお、本発明におけるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセタ
ーゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法で５’
−ＣＭＰとＮ−アセチルノイラミン酸からのＣＭＰ−Ｎ
ｅｕＡｃの合成活性を測定、算出したものである。
し、酵素液におけるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活
性を測定した結果を対照菌（ｐＴｒｃ９９Ａを保持する
大腸菌Ｋ−１２株 ＪＭ１０９）と共に下記表１に示
す。なお、本発明におけるＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセタ
ーゼ活性の単位（ユニット）は、以下に示す方法で５’
−ＣＭＰとＮ−アセチルノイラミン酸からのＣＭＰ−Ｎ
ｅｕＡｃの合成活性を測定、算出したものである。
【００５４】（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性の
測定と単位の算出法）５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ Ｃ
ＴＰおよび１０ｍＭ Ｎ−アセチルノイラミン酸に、Ｃ
ＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼを添加して３７℃で５分
反応させる。また、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼの
代わりにｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌ＪＭ１０９株
の菌体破砕液を用い同様の反応を行い、これをコントロ
ールとした。反応液に２倍量の７０％エタノールを添加
して反応を停止し、これを希釈した後ＨＰＬＣによる分
析を行った。分離にはＹＭＣ社製ＨＳ−３０２カラムを
用い、溶出液として５０ｍＭ酢酸マグネシウムと１ｍＭ
テトラブチルアンモニウム水溶液の混合液を用いた。Ｈ
ＰＬＣ分析結果から反応液中のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの量
を算出し，３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＣＭＰ−Ｎ
ｅｕＡｃを合成する活性を１単位（ユニット）としてＣ
ＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を算出した。
測定と単位の算出法）５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ８．０）、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、５ｍＭ Ｃ
ＴＰおよび１０ｍＭ Ｎ−アセチルノイラミン酸に、Ｃ
ＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼを添加して３７℃で５分
反応させる。また、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼの
代わりにｐＴｒｃ９９Ａを保持する大腸菌ＪＭ１０９株
の菌体破砕液を用い同様の反応を行い、これをコントロ
ールとした。反応液に２倍量の７０％エタノールを添加
して反応を停止し、これを希釈した後ＨＰＬＣによる分
析を行った。分離にはＹＭＣ社製ＨＳ−３０２カラムを
用い、溶出液として５０ｍＭ酢酸マグネシウムと１ｍＭ
テトラブチルアンモニウム水溶液の混合液を用いた。Ｈ
ＰＬＣ分析結果から反応液中のＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの量
を算出し，３７℃で１分間に１μｍｏｌｅのＣＭＰ−Ｎ
ｅｕＡｃを合成する活性を１単位（ユニット）としてＣ
ＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性を算出した。
【００５５】
【表１】
【００５６】（６）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成
上記（３）で構築したプラスミドｐＴｒｃＡＥを保持す
る大腸菌 Ｋ−１２株ＭＥ８４１７（ＦＥＲＭ ＢＰ−
６８４７：平成１１年８月１８日 特許生物寄託センタ
ーに寄託）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有
する２×ＹＴ培地５００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう
培養した。菌体数が４×１０８個／ｍｌに達した時点
で、培養液に最終濃度０．２ｍＭになるようにＩＰＴＧ
を添加し、さらに３７℃で８．５時間振とう培養を続け
た。培養終了後、遠心分離（９、０００×ｇ、１０分）
により２５ｍｌ培養液分の菌体５０ｍｇを回収し、これ
に５０ｍＭ ＣＭＰ、１００ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、２０
ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ｍＭ グルコース、２５
０ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．５％（ｖ／ｖ）キ
シレンを含有する２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ８．０）５ｍｌを添加し、２８℃で攪拌しながら
反応を行った。
る大腸菌 Ｋ−１２株ＭＥ８４１７（ＦＥＲＭ ＢＰ−
６８４７：平成１１年８月１８日 特許生物寄託センタ
ーに寄託）を、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有
する２×ＹＴ培地５００ｍｌに植菌し、３７℃で振とう
培養した。菌体数が４×１０８個／ｍｌに達した時点
で、培養液に最終濃度０．２ｍＭになるようにＩＰＴＧ
を添加し、さらに３７℃で８．５時間振とう培養を続け
た。培養終了後、遠心分離（９、０００×ｇ、１０分）
により２５ｍｌ培養液分の菌体５０ｍｇを回収し、これ
に５０ｍＭ ＣＭＰ、１００ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、２０
ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ｍＭ グルコース、２５
０ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．５％（ｖ／ｖ）キ
シレンを含有する２００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ８．０）５ｍｌを添加し、２８℃で攪拌しながら
反応を行った。
【００５７】反応開始２４時間後に乾燥パン酵母（オリ
エンタル酵母社製）２５０ｍｇ、上記（５）で調製した
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性（３．４ｕｎｉｔ
ｓ／ｍｌ反応液）を有する酵素調製物及び１Ｍ 塩化マ
グネシウム溶液 １００μｌを添加し、合計６２時間反
応させた。なお、反応開始１４時間後に１１０ｍｇのピ
ルビン酸ナトリウムを、２４、３８時間後に１１０ｍｇ
ピルビン酸ナトリウム、１８０ｍｇグルコースを、４８
時間後に５５ｍｇピルビン酸ナトリウム、１８０ｍｇグ
ルコースをそれぞれ添加した。反応液上清をＨＰＬＣに
より分析したところ、２１．４ｍＭのＣＭＰ−ＮｅｕＡ
ｃが生成することが認められた。
エンタル酵母社製）２５０ｍｇ、上記（５）で調製した
ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ活性（３．４ｕｎｉｔ
ｓ／ｍｌ反応液）を有する酵素調製物及び１Ｍ 塩化マ
グネシウム溶液 １００μｌを添加し、合計６２時間反
応させた。なお、反応開始１４時間後に１１０ｍｇのピ
ルビン酸ナトリウムを、２４、３８時間後に１１０ｍｇ
ピルビン酸ナトリウム、１８０ｍｇグルコースを、４８
時間後に５５ｍｇピルビン酸ナトリウム、１８０ｍｇグ
ルコースをそれぞれ添加した。反応液上清をＨＰＬＣに
より分析したところ、２１．４ｍＭのＣＭＰ−ＮｅｕＡ
ｃが生成することが認められた。
【００５８】比較例１
（１）ＣＭＰカイネースをコードするｃｍｋ遺伝子のク
ローニング 大腸菌ＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法
（Biochim. Biopys. Acta., 72, 619 (1963)）で調製
した染色体ＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２
種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ
法により大腸菌のＣＭＰカイネース（ｃｍｋ）遺伝子を
増幅した。 プライマー（Ｇ）：5’- TTGAATTCTAAGGAGATAAAGATGACG
GCAATT -3’ プライマー（Ｈ）：5’- TTGAGCTCTGCAAATTCGGTCGCTTAT
GCG -3’
ローニング 大腸菌ＪＭ１０９株の染色体ＤＮＡを斉藤と三浦の方法
（Biochim. Biopys. Acta., 72, 619 (1963)）で調製
した染色体ＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２
種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ
法により大腸菌のＣＭＰカイネース（ｃｍｋ）遺伝子を
増幅した。 プライマー（Ｇ）：5’- TTGAATTCTAAGGAGATAAAGATGACG
GCAATT -3’ プライマー（Ｈ）：5’- TTGAGCTCTGCAAATTCGGTCGCTTAT
GCG -3’
【００５９】ＰＣＲによるｃｍｋ遺伝子の増幅は、反応
液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシ
ウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ０．
１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｇ）（Ｈ）各々０．２μ
Ｍ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユ
ニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA Th
ermal Cyclerを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニ
ーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション
（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことによ
り行った。
液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグネシ
ウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ０．
１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ｇ）（Ｈ）各々０．２μ
Ｍ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５ユ
ニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA Th
ermal Cyclerを用いて、熱変性（９４℃、１分）、アニ
ーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーション
（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことによ
り行った。
【００６０】遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献の方法（Molecular Cloning、前述）
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、７２０
ｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ及びＳａｃＩで切断し、同じく制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ及びＳａｃＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ
とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を
用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたアン
ピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃＣＭＫ
ＡＢを単離した。ｐＴｒｃＣＭＫＡＢは、ｐＴｒｃ９９
Ａのｔｒｃプロモーター下流のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ切
断部位に大腸菌のｃｍｋ遺伝子の構造遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片が挿入されたものである。
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献の方法（Molecular Cloning、前述）
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、７２０
ｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ及びＳａｃＩで切断し、同じく制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ及びＳａｃＩで消化したプラスミドｐＴｒｃ９９Ａ
とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結反応液を
用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたアン
ピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃＣＭＫ
ＡＢを単離した。ｐＴｒｃＣＭＫＡＢは、ｐＴｒｃ９９
Ａのｔｒｃプロモーター下流のＥｃｏＲＩ−ＳａｃＩ切
断部位に大腸菌のｃｍｋ遺伝子の構造遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００６１】（２）ｃｍｋ、ｎｅｕＡ遺伝子共発現プラ
スミドの構築 実施例２で得られたｐＴｒｃｓｉａＢＮＰプラスミドを
制限酵素ＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩで切断し、ｎｅｕＡ遺伝
子を含むＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片をアガロースゲル電
気泳動を用いて回収した。これを同じくＮｃｏＩ、Ｅｃ
ｏＲＩで消化した上記比較例（１）のｐＴｒｃＣＭＫＡ
ＢプラスミドとＴ４ライゲースを用いて連結した。この
連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、
得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐ
ＴｒｃＳＢＣＫを単離した。ｐＴｒｃＳＢＣＫは、ｐＴ
ｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−Ｓａ
ｃＩ切断部位にＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｎｅｕＡ遺
伝子及び大腸菌のｃｍｋ遺伝子の構造遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片が挿入されたものである。
スミドの構築 実施例２で得られたｐＴｒｃｓｉａＢＮＰプラスミドを
制限酵素ＮｃｏＩ、ＥｃｏＲＩで切断し、ｎｅｕＡ遺伝
子を含むＮｃｏＩ−ＥｃｏＲＩ断片をアガロースゲル電
気泳動を用いて回収した。これを同じくＮｃｏＩ、Ｅｃ
ｏＲＩで消化した上記比較例（１）のｐＴｒｃＣＭＫＡ
ＢプラスミドとＴ４ライゲースを用いて連結した。この
連結反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、
得られたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐ
ＴｒｃＳＢＣＫを単離した。ｐＴｒｃＳＢＣＫは、ｐＴ
ｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＮｃｏＩ−Ｓａ
ｃＩ切断部位にＨ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｎｅｕＡ遺
伝子及び大腸菌のｃｍｋ遺伝子の構造遺伝子を含有する
ＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００６２】（３）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成
実施例１で調製した大腸菌ＭＥ８４１７／ｐＴｒｃＡＥ
の２５ｍｌ培養分の集菌体５０ｍｇに、１００ｍＭ Ｇ
ｌｃＮＡｃ、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ｍＭ
グルコース、２５０ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．
５％（ｖ／ｖ）キシレンを含有する２００ｍＭ リン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）２．５ｍｌを添加し、２
８℃で攪拌しながら２４時間反応を行った。上記（２）
で構築したプラスミドｐＴｒｃＳＢＣＫを保持する大腸
菌ＭＥ８４１７株の２５ｍｌ培養分の集菌体５０ｍｇと
１００ｍＭ ＣＭＰ、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、２
５０ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを含有する２００ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）２．５ｍｌを添
加後、超音波処理を行った。
の２５ｍｌ培養分の集菌体５０ｍｇに、１００ｍＭ Ｇ
ｌｃＮＡｃ、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、５０ｍＭ
グルコース、２５０ｍＭ ピルビン酸ナトリウム、０．
５％（ｖ／ｖ）キシレンを含有する２００ｍＭ リン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）２．５ｍｌを添加し、２
８℃で攪拌しながら２４時間反応を行った。上記（２）
で構築したプラスミドｐＴｒｃＳＢＣＫを保持する大腸
菌ＭＥ８４１７株の２５ｍｌ培養分の集菌体５０ｍｇと
１００ｍＭ ＣＭＰ、２０ｍＭ 塩化マグネシウム、２
５０ｍＭ ピルビン酸ナトリウムを含有する２００ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）２．５ｍｌを添
加後、超音波処理を行った。
【００６３】反応開始２４時間後、上記の超音波処理液
２．５ｍｌを添加し、更に２８℃で攪拌しながら反応を
行った。なお、反応開始１４、２４時間後に５５ｍｇ、
３８時間後に１１０ｍｇのピルビン酸ナトリウムを添加
した。合計４８時間反応後、反応液上清をＨＰＬＣによ
り分析したところ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの生成量は６．
２８ｍＭであった。
２．５ｍｌを添加し、更に２８℃で攪拌しながら反応を
行った。なお、反応開始１４、２４時間後に５５ｍｇ、
３８時間後に１１０ｍｇのピルビン酸ナトリウムを添加
した。合計４８時間反応後、反応液上清をＨＰＬＣによ
り分析したところ、ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの生成量は６．
２８ｍＭであった。
【００６４】実施例２
（１）Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼをコード
するｎｅｕＢ１遺伝子のクローニング Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ １６５２
株の染色体ＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２
種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ
法によりＮ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ｎｅ
ｕＢ１）遺伝子を増幅した。 プライマー（Ｉ）：5’- TACGATTATTTTCCTGATGCTC -3’ プライマー（Ｊ）：5’- TCTCCAAGCTGCATTAAACGCC -3’
するｎｅｕＢ１遺伝子のクローニング Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ １６５２
株の染色体ＤＮＡをテンペレートとして、以下に示す２
種類のプライマーＤＮＡを常法に従って合成し、ＰＣＲ
法によりＮ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ｎｅ
ｕＢ１）遺伝子を増幅した。 プライマー（Ｉ）：5’- TACGATTATTTTCCTGATGCTC -3’ プライマー（Ｊ）：5’- TCTCCAAGCTGCATTAAACGCC -3’
【００６５】ＰＣＲによるｎｅｕＢ１遺伝子の増幅は、
反応液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍ
Ｍ トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグ
ネシウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ
０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２
μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５
ユニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA
Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９４℃、１分）、ア
ニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーショ
ン（７２℃、３分）のステップを３０回繰り返すことに
より行った。
反応液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍ
Ｍ トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグ
ネシウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ
０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２
μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５
ユニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA
Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９４℃、１分）、ア
ニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーショ
ン（７２℃、３分）のステップを３０回繰り返すことに
より行った。
【００６６】遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、２．２
ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡ断片をテン
プレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡ
を常法に従って合成し、再度ＰＣＲ法によりＣ．ｊｅｊ
ｕｎｉのｎｅｕＢ１遺伝子を増幅した。 プライマー（Ｋ）：5’-AAGGATCCTCTAGTGAGGCTTATGGAA-
3’ プライマー（Ｌ）：5’-GTCTGCAGATTTAATCTTAGAATAATCA
GCCC-3’
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡを文献（Molecular Cloning、前述）の方法
に従ってアガロースゲル電気泳動により分離し、２．２
ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡ断片をテン
プレートとして、以下に示す２種類のプライマーＤＮＡ
を常法に従って合成し、再度ＰＣＲ法によりＣ．ｊｅｊ
ｕｎｉのｎｅｕＢ１遺伝子を増幅した。 プライマー（Ｋ）：5’-AAGGATCCTCTAGTGAGGCTTATGGAA-
3’ プライマー（Ｌ）：5’-GTCTGCAGATTTAATCTTAGAATAATCA
GCCC-3’
【００６７】ＰＣＲによるｎｅｕＢ１遺伝子の増幅は、
反応液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍ
Ｍ トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグ
ネシウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ
０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２
μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５
ユニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA
Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９４℃、１分）、ア
ニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーショ
ン（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことに
より行った。
反応液１００μｌ中（５０ｍＭ 塩化カリウム、１０ｍ
Ｍ トリス塩酸（ｐＨ８．３）、１．５ｍＭ 塩化マグ
ネシウム、０．００１％ゼラチン、テンペレートＤＮＡ
０．１μｇ、プライマーＤＮＡ（Ａ）（Ｂ）各々０．２
μＭ、ＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ２．５
ユニット）をPerkin-Elmer Cetus Instrument社製 DNA
Thermal Cyclerを用いて、熱変性（９４℃、１分）、ア
ニーリング（５５℃、１．５分）、ポリメライゼーショ
ン（７２℃、３分）のステップを２５回繰り返すことに
より行った。
【００６８】遺伝子増幅後、反応液をフェノール／クロ
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、
１．２ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制
限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵
素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒ
ｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．社よ
り入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結
反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得ら
れたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒ
ｃｎｅｕＢ１を単離した。ｐＴｒｃｎｅｕＢ１は、ｐＴ
ｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＢａｍＨＩ−Ｐ
ｓｔＩ切断部位にＣ．ｊｅｊｕｎｉのｎｅｕＢ１遺伝子
の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたもので
ある（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９０５：平成１４年６月２５
日特許生物寄託センターに寄託）。
ロホルム（１：１）混合液で処理し、水溶性画分に２倍
容のエタノールを添加しＤＮＡを沈殿させた。沈殿回収
したＤＮＡをアガロースゲル電気泳動により分離し、
１．２ｋｂ相当のＤＮＡ断片を精製した。該ＤＮＡを制
限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで切断し、同じく制限酵
素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで消化したプラスミドｐＴｒ
ｃ９９Ａ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ．社よ
り入手）とＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。連結
反応液を用いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得ら
れたアンピシリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒ
ｃｎｅｕＢ１を単離した。ｐＴｒｃｎｅｕＢ１は、ｐＴ
ｒｃ９９Ａのｔｒｃプロモーター下流のＢａｍＨＩ−Ｐ
ｓｔＩ切断部位にＣ．ｊｅｊｕｎｉのｎｅｕＢ１遺伝子
の構造遺伝子を含有するＤＮＡ断片が挿入されたもので
ある（ＦＥＲＭ Ｐ−１８９０５：平成１４年６月２５
日特許生物寄託センターに寄託）。
【００６９】（２）ｎａｎＥ、ｎｅｕＢ１遺伝子共発現
プラスミドの構築 上記（１）で得られたｐＴｒｃｎｅｕＢ１プラスミドを
制限酵素ＢａｍＨＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
を用いて切断面を平滑化した。これを制限酵素ＰｓｔＩ
で切断し、ｎｅｕＢ１遺伝子を含む（ＢａｍＨＩ）−Ｐ
ｓｔＩ断片をアガロースゲル電気泳動を用いて回収し
た。続いて実施例１の（２）で得られたｐＴｒｃｎａｎ
Ｅプラスミドを制限酵素ＳａｌＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて切断面を平滑化し、更に制限酵素
ＰｓｔＩで切断した。これと上記で得られたｎｅｕＢ１
遺伝子を含む（ＢａｍＨＩ）−ＰｓｔＩ断片とをＴ４Ｄ
ＮＡライゲースを用いて連結した。この連結反応液を用
いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたアンピ
シリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃＮＥＮＢ
を単離した。ｐＴｒｃＮＥＮＢは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔ
ｒｃプロモーター下流のＸｂａＩ−ＰｓｔＩ切断部位に
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｎａｎＥ遺伝子、並びに
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉのｎｅｕＢ１遺伝子の構造遺伝子を含
有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
プラスミドの構築 上記（１）で得られたｐＴｒｃｎｅｕＢ１プラスミドを
制限酵素ＢａｍＨＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ
を用いて切断面を平滑化した。これを制限酵素ＰｓｔＩ
で切断し、ｎｅｕＢ１遺伝子を含む（ＢａｍＨＩ）−Ｐ
ｓｔＩ断片をアガロースゲル電気泳動を用いて回収し
た。続いて実施例１の（２）で得られたｐＴｒｃｎａｎ
Ｅプラスミドを制限酵素ＳａｌＩで切断後、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼを用いて切断面を平滑化し、更に制限酵素
ＰｓｔＩで切断した。これと上記で得られたｎｅｕＢ１
遺伝子を含む（ＢａｍＨＩ）−ＰｓｔＩ断片とをＴ４Ｄ
ＮＡライゲースを用いて連結した。この連結反応液を用
いて大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、得られたアンピ
シリン耐性形質転換体よりプラスミドｐＴｒｃＮＥＮＢ
を単離した。ｐＴｒｃＮＥＮＢは、ｐＴｒｃ９９Ａのｔ
ｒｃプロモーター下流のＸｂａＩ−ＰｓｔＩ切断部位に
Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅのｎａｎＥ遺伝子、並びに
Ｃ．ｊｅｊｕｎｉのｎｅｕＢ１遺伝子の構造遺伝子を含
有するＤＮＡ断片が挿入されたものである。
【００７０】（３）ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃの合成
上記（２）で調製したプラスミドｐＴｒｃＮＥＮＢを保
持する大腸菌ＭＣ１０６１株（ＡＴＣＣ５３３３８）の
２５ｍｌ培養液分の菌体５０ｍｇに５０ｍＭＣＭＰ、１
００ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、３０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、２００ｍＭグルコース、１００ｍＭ ピルビン酸ナ
トリウム、０．５％（ｖ／ｖ）キシレン、４％（ｗ／
ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母社製）、並びに実
施例１の（５）で調製したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセタ
ーゼ活性（１．７ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）を有する酵
素調製物を含有する１７５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ８．０）５ｍｌを添加し、２８℃で攪拌しながら
７２時間反応を行った。なお、反応開始１４、２４、３
８、４８、６２時間後に１８０ｍｇグルコースをそれぞ
れ添加した。反応液上清をＨＰＬＣにより分析したとこ
ろ、２５．６ｍＭのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ生成が認められ
た。
持する大腸菌ＭＣ１０６１株（ＡＴＣＣ５３３３８）の
２５ｍｌ培養液分の菌体５０ｍｇに５０ｍＭＣＭＰ、１
００ｍＭ ＧｌｃＮＡｃ、３０ｍＭ 塩化マグネシウ
ム、２００ｍＭグルコース、１００ｍＭ ピルビン酸ナ
トリウム、０．５％（ｖ／ｖ）キシレン、４％（ｗ／
ｖ）乾燥パン酵母（オリエンタル酵母社製）、並びに実
施例１の（５）で調製したＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセタ
ーゼ活性（１．７ｕｎｉｔｓ／ｍｌ反応液）を有する酵
素調製物を含有する１７５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液
（ｐＨ８．０）５ｍｌを添加し、２８℃で攪拌しながら
７２時間反応を行った。なお、反応開始１４、２４、３
８、４８、６２時間後に１８０ｍｇグルコースをそれぞ
れ添加した。反応液上清をＨＰＬＣにより分析したとこ
ろ、２５．６ｍＭのＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ生成が認められ
た。
【００７１】
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> Yamasa Corporation
<120> Process for producing cytidine 5'-monophospho-N-acetylneuraminic
acid
<130> YP2002-011
<140>
<141>
<160> 12
<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplification of nanA gene
<400> 1
caccatggcg aagatattgc cgctcaaact a 31
<210> 2
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplification of nanA gene
<400> 2
ccgaattcat ttatgacaaa aatttcgctt tcaag 35
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplification of nanE gene
<400> 3
ggtctagatt taaatgaggg gtgttatatg t 31
<210> 4
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplification of nanE gene
<400> 4
tcgtcgactt atcttgcaga tttcactgaa ttagcaaacc a 41
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplification of neuA gene
<400> 5
tgccatggtg aaaataataa tgacaagaa 29
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplification of neuA gene
<400> 6
aactgcagtg cagatcaaaa gtgcggcc 28
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplification of cmk gene
<400> 7
ttgaattcta aggagataaa gatgacggca att 33
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplification of cmk gene
<400> 8
ttgagctctg caaattcggt cgcttatgcg 30
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplification of neuB1 gene
<400> 9
tacgattatt ttcctgatgc tc 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplification of neuB1 gene
<400> 10
tctccaagct gcattaaacg cc 22
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplification of neuB1 gene
<400> 11
aaggatcctc tagtgaggct tatggaa 27
<210> 12
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer for amplification of neuB1 gene
<400> 12
gtctgcagat ttaatcttag aataatcagc cc 32
【００７２】
Claims (3)
- 【請求項１】 Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡ
ｃ）、ピルビン酸およびシチジン５'−モノリン酸（Ｃ
ＭＰ）を含有する反応系に、酵母菌体、Ｎ−アセチルグ
ルコサミン−６リン酸 ２−エピメラーゼ（ＧｌｃＮＡ
ｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ）活性を有する菌体または
その処理物、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ（Ｎｅ
ｕＡｃリアーゼ）活性を有する菌体またはその処理物お
よびＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ
（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）活性を有する菌体
またはその処理物を添加し、反応させることを特徴とす
る、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−Ｎｅ
ｕＡｃ）の製造法。 - 【請求項２】 Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡ
ｃ）およびピルビン酸を含有する反応系に、Ｎ−アセチ
ルグルコサミン−６リン酸 ２−エピメラーゼ（Ｇｌｃ
ＮＡｃ−６Ｐ ２−エピメラーゼ）活性を有する菌体ま
たはその処理物およびＮ−アセチルノイラミン酸リアー
ゼ（ＮｅｕＡｃリアーゼ）活性を有する菌体またはその
処理物を添加してＮ−アセチルノイラミン酸（ＮｅｕＡ
ｃ）を合成し、続けて、この反応系にシチジン５'−モ
ノリン酸（ＣＭＰ）、酵母菌体およびシチジン５'−モ
ノリン酸Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＣＭ
Ｐ−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）活性を有する菌体または
その処理物を添加してＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン
酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）を合成する、請求項１記載の
製造法。 - 【請求項３】 Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡ
ｃ）およびシチジン５’−モノリン酸（ＣＭＰ）を含有
する反応系に、酵母菌体、Ｎ−アセチルグルコサミン−
６リン酸 ２−エピメラーゼ（ＧｌｃＮＡｃ−６Ｐ ２−
エピメラーゼ）活性を有する菌体またはその処理物、Ｎ
−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＮｅｕＡｃシン
セターゼ）活性を有する菌体またはその処理物およびＣ
ＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸シンセターゼ（ＣＭＰ
−ＮｅｕＡｃシンセターゼ）活性を有する菌体またはそ
の処理物を添加し、反応させることを特徴とする、ＣＭ
Ｐ−Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＣＭＰ−ＮｅｕＡｃ）
の製造法。
Priority Applications (11)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2002208987A JP3833584B2 (ja) | 2001-07-19 | 2002-07-18 | Ｃｍｐ−ｎ−アセチルノイラミン酸の製造法 |
| CNB038170701A CN1301330C (zh) | 2002-07-18 | 2003-01-15 | Cmp－n－乙酰神经氨酸的制造方法 |
| KR1020057000945A KR100922085B1 (ko) | 2002-07-18 | 2003-01-15 | Ｃｍｐ-ｎ-아세틸뉴라민산의 제조 방법 |
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