KR20220012834A - 혼합 공급원료를 사용하는 미생물 세포에 의한 탄수화물의 발효적 생산 - Google Patents
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Abstract
목적 탄수화물을 생산하기 위해 유전자 조작된 미생물 세포로서, 상기 미생물 세포는 적어도 하나의 당 포스페이트의 증가된 세포내 이용가능성을 갖고, 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합된 단당류 공급원료를 함유하는 배양 배지에서 배양되면 목적 탄수화물을 생성하는, 유전자 조작된 미생물 세포가 개시되어 있다. 또한, 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합 단당류 공급원료의 존재하에 상기 유전자 조작된 미생물 세포를 배양함으로써 목적 탄수화물을 생산하는 발효적 방법이 개시되어 있다.
Description
본 발명은 목적 당류(saccharide of interest)의 발효적 생산(fermentative production)에 관한 것이다. 또한, 목적 당에 대응할 수 있는 미생물 세포가 개시되고, 여기서 상기 미생물 세포는 발효 중의 주요 탄소- 및 에너지원으로서 혼합된 단당류 공급원료를 사용한다. 또한, 상기 미생물 세포를 이용함으로써 목적 당을 생산하는 방법이 개시된다.
모유는 탄수화물, 지방, 단백질, 비타민, 미네랄 및 미량 원소의 복잡한 혼합물을 포함한다. 모유의 가장 우세한 분획은 탄수화물로 구성된다. 모유 중의 탄수화물 분획은 추가로 (i) 락토스 및 (ii) 올리고당(모유 올리고당, HMO)으로 분류될 수 있다. 이당류 락토스(갈락토스-β1,4-글루코스)는 유아에 의해 에너지원으로 사용되지만, 올리고당은 유아에 의해 대사되지 않는다.
올리고당의 분획은 총 탄수화물 분획의 최대 1/10을 점유하며, 아마도 150개 초과의 구조적으로 상이한 올리고당으로 구성되어 있다. 이러한 복잡한 올리고-당류의 발생 및 농도는 인간에 고유하고, 따라서 다량의 낙농장 동물을 포함하는 다른 포유동물의 우유 내에서 대량으로 발견할 수 없다.
가장 현저한 모유 올리고당은 2'-푸코실락토스(2'-FL) 및 3-푸코실락토스(3-FL)이고, 이들은 함께 총 HMO 분획의 최대 1/3을 구성할 수 있다. 추가로 현저한 HMO는 락토-N-테트라오스(LNT), 락토-n-네오테트라오스(LNnT) 및 락토-N-푸코펜타토스 I(LNFP-I)이다. 이들 중성 올리고당 이외에, 3'-시알릴락토스(3'-SL), 6'- 시알릴락토스(6'-SL), 3-푸코실-3'-시알릴락토스, 시알릴-락토-N-테트라오스 및 디시알릴-락토-N-테트라오스 등의 산성 HMO도 모유에서 발견할 수 있다.
특히, 대부분의 HMO는, 환원 말단에 갈락토스-β1,4-글루코스 모이어티(moiety)를 포함하고, 이는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 및/또는 푸코스 및/또는 갈락토스 및/또는 N-아세틸뉴라민산(NeuNAc) 등의 단당류 모이어티의 부가에 의해 확장된다. HMO의 구조는 상피 세포 표면 글리코접합체의 에피토프, 루이스 x(LeX) 등의 루이스 조직혈액 그룹 항원과 밀접하게 관련되어 있다. 상피 에피토프에 대한 HMO의 구조적 유사성은 세균 병원체에 대한 HMO의 보호 특성을 설명한다.
모유 중의 올리고당의 존재는 오랫동안 공지되어 있고, 이들 올리고당의 생리적 기능은 수십년에 걸쳐 의학 연구의 대상이었다. 보다 풍부한 모유 올리고당의 일부 경우, 특정 기능이 이미 확인되었다.
HMO는, 전술한 바와 같이 장관에 국소적 효과를 유발하는 것 이외에, 유아의 전신 순환에 진입함으로써 전신적 효과를 유발하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 단백질-탄수화물의 상호작용에 대한 HMO의 영향, 예를 들면, 셀렉틴-백혈구 결합은 면역 반응을 조절하고, 염증-매개 반응을 감소시킬 수 있다. 또한, HMO가 유아의 미생물총(microbiome)의 발달의 중요한 기질을 나타내는 것이 점차 인식되어 왔다.
일반적으로 다양한 탄수화물, 특히 프레바이오틱 올리고당의 유익한 특성이 충분히 연구되어 있지만, 천연 공급원으로부터 입수가 제한되어 있기 때문에, 단당류(예를 들면, L-푸코스, N-아세틸뉴라민산), 이당류(예를 들면, 락토-N-비오스) 및 올리고당류(예를 들면, 2'-FL, LNnT)의 효율적 및 비용-효과적 제조 프로세스가 매우 바람직하다.
기능성 탄수화물의 대규모 생산을 시도하여, 이들의 탄수화물 중 일부에 대한 화학적 경로가 개발되었다. 그러나, 이러한 방법은 최종 생성물을 오염시키는 위험을 부과하는 몇몇 유해한 화학물질의 사용을 수반한다. 적어도 대규모 양과, 식품 용도에서의 사용에 충분한 기능성 탄수화물의 품질은 화학 합성에 의해 오늘날 제공될 수 없다.
모유 올리고당의 화학 합성과 관련되는 결점을 회피하기 위해, 몇몇 효소적 방법과 이들의 생산을 위한 발효 접근법이 개발되었다. 발효 생산 프로세스는 L-푸코스, N-아세틸뉴라민산, 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 3'-시알릴-락토스 및 6'-시알릴락토스 등의 몇몇 탄수화물을 위해 개발되었다. 이들 생산 프로세스는 통상, 재조합 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 등의 유전자 조작된 세균 세포를 사용한다.
통상, HMO를 생성하기 위한 발효 생성 프로세스 및 생체촉매 반응은 생성되는 HMO의 최초의 수용자 기질로서 외인적으로 첨가된 락토스에 기초하고 있다. 이들 프로세스에서는 하나 이상의 단당류가 락토스에 추가된다(US 7,521,212 B1; Albermann et al, (2001) Carbohydr. Res. 334 (2) p. 97-103). 락토스에 대한 단당류의 첨가는 글리코실트랜스퍼라제에 의해, 또는 적절한 활성화 단당류 기질을 사용하는 글리코시다제에 의해 촉매될 수 있다. 추가로, 트랜스글리코시다제 반응에 의해, 락토스에 추가의 단당류를 첨가할 수 있다.
특히, HMO의 발효 생산은 효율적인 것으로 증명되었고, 이는 필요로 하지만 합성이 곤란한 뉴클레오티드-활성화 단당류가, 사용되는 미생물 세포의 대사에 의해 제공되기 때문이다. 뉴클레오티드 활성화 단당류의 생합성 경로는, 통상, 글루코스-6-포스페이트 또는 프럭토스-6-포스페이트의 수준에서 숙주 세포의 일차 대사로부터 유래한다. UDP-갈락토스(UDP-Gal)의 생합성 경로는 글루코스-6-포스페이트로부터 유래하지만, GDP-푸코스, UDP-N-아세틸글루코사민 및 CMP-N-아세틸뉴라민산의 생합성은 프럭토스-6-포스페이트로부터 유래한다.
미생물 숙주 세포에서 뉴클레오티드 활성화 단당류의 효율적 생합성, 및 이의 결과로서 발효 프로세스에 의한 목적 탄수화물의 생성은, 명백하게는, 글루코스-6-포스페이트 및/또는 프럭토스-6-포스페이트 등의 당 포스페이트의 계속적 공급에 의존한다.
통상, 미생물 숙주 세포에 의한 단순한 및 저렴한 탄소- 및 에너지 공급원(예를 들면, 글리세롤, 글루코스, 수크로스)의 소비에 기초하여, 상기 발현 프로세스에서 주요한 문제는 상기 숙주 세포에서 이러한 포스포릴화/활성화 당류의 이용가능성이 제한되어(예를 들면, 경쟁 반응에 기인하여), 생성물 생합성 경로의 탄소 유동을 대폭 손상시키고, 따라서 이들 프로세스의 생산성을 손상시키는 것이다.
전술한 결점을 극복하기 위해, HMO를 제조하기 위한 개선된 수단 및 방법이 개발되었다. 예를 들면, WO 2012/007481 A2호는 당, 활성화 당, 뉴클레오시드, 글리코시드, 당지질 및 당단백질을 생성할 수 있는 조작된 생물을 개시하고, 여기서 상기 조작된 생물은 i) 탄수화물 키나제를 코딩(encoding)하는 유전자와 조합하여 탄수화물 하이드롤라제를 코딩하는 유전자, ii) 탄수화물 신타제를 코딩하는 유전자 또는 iii) 탄수화물 포스포릴라제를 코딩하는 유전자를 발현하고, 그 결과, 상기 생물은 이당, 올리고당, 다당 또는 이들의 혼합물을 활성화된 당 및 당으로 분할할 수 있고, 상기 생물은, 상기 생물의 임의의 도입된 유전자가 기능성이 낮거나 기능성이 없도록 추가로 유전적으로 변형되고, 상기 다른 유전자는 상기 활성화된 당을 바이오매스 및/또는 생체촉매 효소로 전환하는 효소를 코딩한다. 상기 조작된 생물은, 수크로스, 올리고당, 다당 또는 이들의 혼합물 등의 이당을 이용하면서, 목적 탄수화물을 생성할 수 있다.
그러나, 유일한 탄소원 및 에너지 공급원으로서 수크로스를 사용하여, 상기 조작된 생물에 의해 목적 화합물을 생성하는 것은 수크로스를 멸균하는 것이 곤란하다는 주요 결점을 갖는다. 멸균의 가장 바람직한 방법은 열 멸균이다. 그러나, 수크로스의 열 멸균은 WO 2012/007481 A2에 기재되어 있는 방법의 적용성을 대응하는 상당한 정도의 가수분해를 초래한다.
열 멸균에 대한 대안으로서, 수크로스 용액의 멸균 여과를 사용할 수 있지만, 멸균 여과는, 특히 공업 규모의 발효에서, 바람직하지 않은 세균 세포의 증식을 유도하는 오염의 위험이 높아진다.
그럼에도 불구하고, 수크로스는, 이의 입수가능성 및 낮은 비용 때문에, 생물기술학적 용도를 위한 가장 매력적 탄소원이다.
따라서, 주요 탄소원 및 에너지원으로서 저렴한 원료의 존재하에 배양될 때에 목적 탄수화물을 생산할 수 있는 목적 탄수화물의 발효 생산을 위한 미생물 세포(여기서, 상기 원료는, 세포의 대사에 의해 이용가능해지기 위해 미생물 세포에 의해 가수분해될 필요는 없다), 및 주요 탄소원 및 에너지원으로서 상기 원료의 존재하에 상기 미생물 세포를 배양함으로써 발효에 의해 목적 탄수화물을 생성하는 방법을 제공하는 것이 바람직하다.
이 목적은, 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합 단당류 원료 상에서 배양될 때에 목적 탄수화물을 생성할 수 있는 유전자 조작된 미생물 세포(genetically engineered microbial cell)가 제공된다는 점에서 해결되고, 여기서, 상기 혼합 단당류 원료는, 글루코스와, 프럭토스 및 갈락토스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 추가 단당류로 이루어지고, 미생물 세포는, 적어도 하나의 당 포스페이트의 세포내 이용가능성의 증가를 갖고, 목적 탄수화물의 발효 생산을 위한 방법을 제공함으로써, 이 방법은 주요 탄소원 및 에너지원으로서 상기 혼합 단당류 공급원료의 존재하에서 상기 유전자 조작된 미생물 세포를 배양하는 것을 포함한다.
제1 측면에 따르면, 목적 탄수화물을 생산하기 위한 유전자 조작된 미생물 세포로서, 상기 미생물 세포는 야생형 세포와 비교하여 적어도 하나의 당 포스페이트의 세포내 이용가능성을 증가시키고, 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합된 단당류 공급원료를 포함하는 배양 배지에서 배양되면 목적 탄수화물을 생성하고, 상기 혼합 단당류 공급원료는 글루코스, 및 프럭토스 및 갈락토스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 단당류로 이루어지는, 유전자 조작된 미생물 세포가 제공된다.
제2 측면에 따르면, 목적 탄수화물 생산을 위해 본원에 기재된 바와 같은 유전자 조작된 미생물 세포의 용도가 제공되고, 여기서 상기 미생물 세포는 글루코스 및 프럭토스 및 갈락토스의 그룹으로부터 적어도 하나의 추가 단당류로 이루어진 단당류 혼합물의 존재하에 배양된다.
제3 측면에 따르면, 목적 탄수화물의 발효적 생산을 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은
a) 목적하는 탄수화물을 생산할 수 있는 유전자 조작된 미생물을 제공하는 단계로서, 상기 미생물은 적어도 하나의 당 포스페이트의 세포내 이용가능성의 증가를 나타내는, 단계;
b) 상기 유전자 조작된 미생물을, 상기 목적 탄수화물의 생산을 허용하는 배양 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 배양 배지는 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합 단당류 공급원료를 포함하고, 상기 주요 단당류 공급원료는 글루코스, 및 프럭토스 및 갈락토스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 단당류로 이루어지는, 단계; 및
c) 상기 목적 탄수화물을 회수하는 단계를 포함한다.
제4 측면에서, 유전자 조작된 미생물 세포에 의해 및/또는 의약 및/또는 영양 조성물을 제조하기 위한 본원에 기재된 방법에 의해 생성된 목적 탄수화물의 용도가 제공된다.
도 1은 당 포스페이트 프럭토스-1-포스페이트 및 글루코스-6-포스페이트를 유도하고 이들로부터 유래하는 천연에 존재하는 대사 경로를 나타내는, 예시적 야생형 미생물 세포(예를 들면, 이. 콜라이)의 개략도를 도시한다.
도 2는 본 발명의 예시적 유전자 변형된 미생물 세포의 개략도를 나타내고, 여기서 세포내 글루코스-6-포스페이트 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 3은 본 발명의 유전자 조작된 미생물 세포의 또 다른 예시적 실시형태의 개략도를 도시하고, 여기서 세포내 글루코스-6-포스페이트 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 4는 본 발명의 유전자 조작된 미생물 세포의 또 다른 예시적 실시형태의 개략도를 도시하고, 여기서 세포내 글루코스-6-포스페이트 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 5는 본 발명의 유전자 조작된 미생물 세포의 또 다른 예시적 실시형태의 개략도를 도시하고, 여기서 세포내 글루코스-6-포스페이트 이용가능성의 증가 및 세포내 프럭토스-6-포스페이트 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 6은 본 발명의 유전자 조작된 미생물 세포의 또 다른 예시적 실시형태의 개략도를 도시하고, 여기서 세포내 글루코스-6-포스페이트 이용가능성의 증가 및 세포내 프럭토스-6-포스페이트 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 7은 본 발명의 유전자 조작된 미생물 세포의 또 다른 예시적 실시형태의 개략도를 도시하고, 여기서 세포내 글루코스-6-포스페이트 이용가능성의 증가 및 세포내 프럭토스-6-포스페이트 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 8은 본 발명의 유전자 조작된 미생물 세포의 또 다른 예시적 실시형태의 개략도를 도시하고, 여기서 세포내 글루코스-6-포스페이트 이용가능성의 증가 및 세포내 프럭토스-6-포스페이트 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 9는 본 발명의 유전자 조작된 미생물 세포의 또 다른 예시적 실시형태의 개략도를 도시하고, 여기서 세포내 글루코스-6-포스페이트 이용가능성의 증가 및 세포내 프럭토스-6-포스페이트 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 10은 본 발명의 유전자 조작된 미생물 세포의 또 다른 예시적 실시형태의 개략도를 도시하고, 여기서 글루코스, 글루코스-6-포스페이트 및 프럭토스-6-포스페이트의 세포내 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 11은 본 발명의 유전자 조작된 미생물 세포의 또 다른 예시적 실시형태의 개략도를 도시하고, 여기서 만노스 및/또는 만노스-6-포스페이트의 세포내 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 12는 본 발명의 유전자 조작된 미생물 세포의 또 다른 예시적 실시형태의 개략도를 도시하고, 여기서 갈락토스-1-포스페이트 및 프럭토스-6-포스페이트의 세포내 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 13은 유일한 탄소원 및 에너지원으로서 글루코스(A) 또는 글루코스 및 프럭토스로 이루어진 혼합-단당류 공급원료(B)에서 배양 중의 이. 콜라이 균주의 성장 특성을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 예시적 유전자 변형된 미생물 세포의 개략도를 나타내고, 여기서 세포내 글루코스-6-포스페이트 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 3은 본 발명의 유전자 조작된 미생물 세포의 또 다른 예시적 실시형태의 개략도를 도시하고, 여기서 세포내 글루코스-6-포스페이트 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 4는 본 발명의 유전자 조작된 미생물 세포의 또 다른 예시적 실시형태의 개략도를 도시하고, 여기서 세포내 글루코스-6-포스페이트 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 5는 본 발명의 유전자 조작된 미생물 세포의 또 다른 예시적 실시형태의 개략도를 도시하고, 여기서 세포내 글루코스-6-포스페이트 이용가능성의 증가 및 세포내 프럭토스-6-포스페이트 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 6은 본 발명의 유전자 조작된 미생물 세포의 또 다른 예시적 실시형태의 개략도를 도시하고, 여기서 세포내 글루코스-6-포스페이트 이용가능성의 증가 및 세포내 프럭토스-6-포스페이트 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 7은 본 발명의 유전자 조작된 미생물 세포의 또 다른 예시적 실시형태의 개략도를 도시하고, 여기서 세포내 글루코스-6-포스페이트 이용가능성의 증가 및 세포내 프럭토스-6-포스페이트 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 8은 본 발명의 유전자 조작된 미생물 세포의 또 다른 예시적 실시형태의 개략도를 도시하고, 여기서 세포내 글루코스-6-포스페이트 이용가능성의 증가 및 세포내 프럭토스-6-포스페이트 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 9는 본 발명의 유전자 조작된 미생물 세포의 또 다른 예시적 실시형태의 개략도를 도시하고, 여기서 세포내 글루코스-6-포스페이트 이용가능성의 증가 및 세포내 프럭토스-6-포스페이트 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 10은 본 발명의 유전자 조작된 미생물 세포의 또 다른 예시적 실시형태의 개략도를 도시하고, 여기서 글루코스, 글루코스-6-포스페이트 및 프럭토스-6-포스페이트의 세포내 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 11은 본 발명의 유전자 조작된 미생물 세포의 또 다른 예시적 실시형태의 개략도를 도시하고, 여기서 만노스 및/또는 만노스-6-포스페이트의 세포내 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 12는 본 발명의 유전자 조작된 미생물 세포의 또 다른 예시적 실시형태의 개략도를 도시하고, 여기서 갈락토스-1-포스페이트 및 프럭토스-6-포스페이트의 세포내 이용가능성의 증가를 유도하는 유전자 변형이 제시되어 있다.
도 13은 유일한 탄소원 및 에너지원으로서 글루코스(A) 또는 글루코스 및 프럭토스로 이루어진 혼합-단당류 공급원료(B)에서 배양 중의 이. 콜라이 균주의 성장 특성을 나타낸다.
제1 측면에 따르면, 목적 탄수화물을 생산할 수 있는 유전자 조작된 미생물 세포가 제공된다. 추가의 실시형태에서, 목적 탄수화물은 유전자 조작된 미생물 세포의 야생형 전구체(wild-type progenitor)에서 자연적으로 발생하지 않는 탄수화물이다.
미생물 세포는 상응하는 야생형 세포에서 상기 적어도 하나의 당 포스페이트의 세포내 이용가능성과 비교하여 적어도 하나의 당 포스페이트의 세포내 이용가능성의 증가를 갖는다. 유전자 조작된 미생물 세포는 상기 목적 탄수화물을 생성할 수 있고, 미생물 세포의 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합 단당류 공급원료를 포함하는 배지에서 배양되는 경우, 상기 목적 탄수화물을 생성하고, 여기서 혼합 단당류 공급원료는 글루코스와, 프럭토스 및 갈락토스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 단당류로 이루어진다.
유전자 조작된 미생물 세포는 유전적으로 조작되기 때문에 목적 탄수화물을 생성할 수 있다. 따라서, 유전자 조작된 미생물 세포는 하나 이상의 이종 유전자(들)를 발현하고, 여기서 상기 이종성 유전자(들)에 의해 코딩되는 폴리펩티드(들)의 활성은 미생물 세포가 목적 탄수화물을 합성하는 것을 가능하게 한다.
본원에서 사용되는 용어 "기능성 유전자(functional gene)"는, 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 또한 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 상기 기능성 유전자를 갖는 미생물 세포 내에서/에 의해 발현될 수 있도록 상기 단백질-코딩 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는 핵산 분자를 지칭한다. 따라서, 기능성 유전자의 발현을 허용하는 조건에서 배양되는 경우, 상기 기능성 유전자가 발현되고, 상기 기능성 유전자를 발현하는 미생물 세포는 전형적으로 기능성 유전자의 단백질 코딩 영역에 의해 코딩되는 단백질 또는 폴리펩티드를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "핵산" 및 "폴리뉴클레오티드"는 일본쇄 또는 이본쇄 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 폴리머를 지칭하고, 달리 제한되지 않는 한, 천연 존재 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 핵산과 하이브리드화하는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 특정 핵산 서열은 이의 상보적 서열을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 발현 조절 서열(예를 들면, 프로모터, 신호 서열, 또는 전사 인자 결합 부위의 어레이(array)) 및 제2 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 의미하고, 여기서 발현 조절 서열은 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사 및/또는 번역에 영향을 미친다. 따라서, 용어 "프로모터"는, 통상 DNA 폴리머 중의 유전자에 "선행"하고, mRNA로의 전사 개시를 위한 부위를 제공하는 DNA 서열을 지칭한다. "조절인자" DNA 서열은 또한 통상 소정 DNA 폴리머 중의 유전자의 "상류"(즉, 선행)에 존재하고, 전사 개시의 빈도(또는 속도)를 결정하는 단백질에 결합한다. 총칭하여 "프로모터/조절인자" 또는 "조절" DNA 서열로서, 기능성 DNA 폴리머 내의 선택된 유전자(또는 일련의 유전자)에 선행하는 이들 서열은 유전자의 전사(및 최종 발현)가 발생할 것인지를 결정하기 위해 협력한다. DNA 폴리머 내의 유전자를 "추적"하고 mRNA로의 전사를 종료하기 위한 신호를 제공하는 DNA 서열은 전사 "터미네이터" 서열로 지칭된다.
박테리아 숙주 세포와 관련하여 본원에 사용된 용어 "재조합"은 박테리아 세포가 이종성 핵산을 복제하거나, 또는 이종성 핵산에 의해 코딩된 펩티드 또는 단백질을 발현하는 것을 나타낸다(즉, "상기 세포"와는 상이한 서열). 재조합 세포는 세포의 천연(비-재조합) 형태에서는 발견되지 않은 유전자를 함유할 수 있다. 재조합 세포는 또한, 상기 유전자가 변형되어 인공적 수단에 의해 상기 세포 내로 재도입되는, 세포의 천연 형태에서 발견되는 유전자를 함유할 수 있다. 또한, 상기 용어는, 세포로부터 핵산을 제거하지 않고서 변형된 세포에 내인성의 핵산을 함유하는 세포를 포함하고; 이러한 변형은 유전자 치환, 부위-특이적 돌연변이 및 관련 기술에 의해 수득되는 것들을 포함한다. 따라서, "재조합 폴리펩티드"는 재조합 세포에 의해 생성된 것이다. 본원에서 사용되는 "이종성 서열" 또는 "이종성 핵산"은 특정 숙주 세포에 대해 외래인(예를 들면, 상이한 종으로부터) 공급원으로부터 유래하거나, 동일한 공급원으로부터 유래하는 경우 이의 본래 형태로부터 변형된 것이다. 따라서, 프로모터에 작동가능하게 연결된 이종성 핵산은 프로모터가 유래된 것과는 상이한 공급원으로부터 유래하거나, 동일한 공급원으로부터 유래한 경우 이의 본래 형태로부터 변형된 것이다. 이종성 서열은, 예를 들면, 형질감염, 형질전환, 접합 또는 형질도입에 의해, 숙주 미생물 세포의 게놈 내로 안정하게 도입될 수 있고, 서열이 도입되는 숙주 세포에 의존하는 기술을 적용할 수 있다. 다양한 기술이 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]에 개시되어 있다.
따라서, "유전자 조작된 숙주 세포" 또는 "유전자 조작된 미생물 세포"는 형질전환 또는 형질감염된, 또는 외인성(exogenous) 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 형질전환 또는 형질감염이 가능한 박테리아 세포 또는 효모 세포로서 이해된다.
따라서, 본 발명에서 사용되는 핵산 서열은, 예를 들면, 안정적으로 형질전환/형질감염되거나, 또는 달리 숙주 미생물 세포내로 도입될 수 있는 벡터에 포함될 수 있다.
다양한 발현 시스템을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드를 생산할 수 있다. 이러한 벡터는, 다른 것들 중에서, 염색체, 에피솜 및 바이러스-유래 벡터, 예를 들면, 박테리아 플라스미드, 박테리오-파지, 트랜스포손, 효모 에피솜, 바이러스 및 이의 조합으로부터 유래하는 벡터, 예컨대, 코스미드 및 파지미드 등의 플라스미드 및 박테리오파지 유전자 요소로부터 유래하는 것들을 포함한다. 발현 시스템 작제물은 발현을 조절 및 발생시키는 조절 영역을 포함할 수 있다. 일반적으로, 폴리뉴클레오티드를 유지, 증식 또는 발현하고, 숙주에서 폴리뉴클레오티드를 합성하기에 적합한 임의의 시스템 또는 벡터를 이와 관련하여 발현에 사용할 수 있다. 적절한 DNA 서열은, 예를 들면, 문헌[참조: Sambrook et al, supra]에 기재된 것과 같은 다양한 공지된 일상적 기술에 의해 발현 시스템에 삽입될 수 있다.
당해 기술은 선택된 숙주 생물의 형질전환에 사용하기 위한 유전 물질의 단리, 합성, 정제 및 증폭을 위한 "재조합 DNA" 방법론에 관한 특허 및 문헌 출판물이 풍부하다. 따라서, 선택된 외인성(즉, 외래 또는 "이종성") DNA 서열을 포함하는 "하이브리드" 바이러스 또는 환상 플라스미드 DNA로 숙주 생물을 형질전환하는 것은 일반적 지식이다. 당업계에 공지된 절차는 먼저 환상 바이러스 또는 플라스미드 DNA를 효소적으로 절단하여 선형 DNA 쇄를 형성함으로써 형질전환 벡터를 생성하는 것을 포함한다. 목적 단백질 산물을 코딩하는 서열을 포함하는 선택된 외래 DNA 쇄는, 일반적으로 동일한/유사한 효소를 사용하여 선형 형태로 제조된다. 선형 바이러스 또는 플라스미드 DNA는, 회복 프로세스를 실행할 수 있는 결찰 효소의 존재하에 외래 DNA와 인큐베이팅(incubating)되고, 바이러스 또는 환상 DNA 플라스미드에 "스플라이싱된" 선택된 외인성 DNA 세그먼트를 포함하는 "하이브리드" 벡터가 형성된다.
용어 "뉴클레오티드 서열을 코딩하는..."은 일반적으로 비변형 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있는 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 지칭하고, 일반적으로 특정 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 유전자의 부분를 나타낸다. 이 용어는, 제한 없이, 일본쇄 및 이본쇄 DNA, 일본쇄 및 이본쇄 영역 또는 일본쇄, 이본쇄 및 삼본쇄 영역의 혼합물인 DNA, 일본쇄 및 이본쇄 RNA, 및 일본쇄 및 이본쇄 영역의 혼합물인 RNA, 일본쇄 또는 보다 통상적으로 이본쇄 또는 삼본쇄 영역 또는 일본쇄 및 이본쇄 영역의 혼합물일 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 이 용어는 또한, 추가로 코딩 및/또는 비코딩 서열을 함유할 수 있는 추가의 영역과 함께, 폴리펩티드를 코딩하는 단일 연속 영역 또는 불연속 영역(예를 들면, 통합된 파지 또는 삽입 서열 또는 편집에 의해 차단됨)을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "변이체(variant)(들)"는 각각 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와는 상이하지만 참조 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 본질적(효소적) 특성을 보유하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 지칭한다. 폴리뉴클레오티드의 전형적인 변이체는 뉴클레오티드 서열이 다른 참조 폴리뉴클레오티드와는 상이하다. 변이체의 뉴클레오티드 서열의 변화는 참조 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열을 변경시킬 수 있거나, 또는 변경하지 않을 수 있다. 뉴클레오티드 변화는, 하기에서 논의되는 바와 같이, 참조 서열에 의해 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 치환, 부가, 결실, 융합 및 단축을 초래할 수 있다. 폴리펩티드의 전형적 변이체는 아미노산 서열이 다른 참조 폴리펩티드와는 상이하다. 일반적으로, 참조 폴리펩티드 및 변이체의 서열이 전체적으로 매우 유사하고, 많은 영역에서 동일하도록 차이는 제한된다. 변이체 및 참조 폴리펩티드는 임의 조합의 하나 이상의 치환, 부가, 결실에 의해 아미노산 서열이 상이할 수 있다. 치환 또는 삽입된 아미노산 잔기는 유전적 코드에 의해 코딩되거나 코딩되지 않을 수 있다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 변이체는 대립유전자 변이체 등의 천연에 존재하는 변이체일 수 있거나, 천연에 존재하는 것으로 공지되어 있지 않은 변이체일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 비-천연 존재 변이체는 돌연변이유발 기술, 직접 합성, 및 당업자에게 공지된 기타 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다.
본 발명의 범위 내에서, 핵산/폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 다형성 변이체, 대립유전자, 돌연변이체 및 종간 상동체도 또한 이들 용어에 의해 포함되고, 이는, 바람직하게는 적어도 약 25, 50, 100, 200, 500, 1000 또는 그 이상의 아미노산의 영역에 걸쳐, 야생형 단백질에 의해 코딩된 폴리펩티드와 약 60% 초과의 아미노산 서열 동일성, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 바람직하게는 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 초과의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
따라서, 본원에 개시된 유전자들/단백질들 중 임의의 "기능적 변이체"는, 각각의 단편이 유래하는 유전자/단백질들의 동일하거나 다소 낮은 활성을 여전히 보유하는 유전자/단백질의 서열 변이체를 나타내는 것을 의미한다.
유전자 조작된 미생물 세포는 배양 배지로부터 적어도 하나의 단당류를 전좌(translocating)시키기 위한 적어도 하나의 단당류 수송체(transporter)를 보유하고, 상기 미생물 세포는 이의 세포질 내로 배양된다. 상기 적어도 하나의 단당류 수송체는 글루코스, 프럭토스 및 갈락토스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단당류를 전좌시킨다.
세포막을 횡단하여 전좌된(translocated across) 단당류는 세포 대사를 위해 접근가능하게 하기 위해 포스포릴화되어야 한다. 세포막을 횡단하여 단당류를 전좌시키는 단당류 수송체에 따라, 단당류(들)는 직접, 즉 세포로 전좌되는 동안 포스포릴화되거나, 또는 후속적으로 적절한 키나제에 의해 포스포릴화된다. 포스포에스테르피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 의존성 수송(PEP-PTS)에 의한 단당류의 전좌는 직접 포스포릴화를 유도하는 반면, 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 비의존성 수송(비-PEP-PTS)에 의한 단당류의 전좌는 세포내 키나제에 의한 단당류의 후속 포스포릴화를 필요로 한다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 미생물 세포는 글루코스-전좌 포스포트랜스퍼라제 시스템(PtsG)을 포함한다. 글루코스-전좌 포스포트랜스퍼라제 시스템은 세포막을 횡단하여 이의 전좌와 동시에 도입 글루코스의 포스포릴화를 촉매한다.
Pts 시스템의 일반적 메카니즘은 다음과 같다: 포스포에놀피루베이트(PEP)의 포스포릴 그룹은 신호 전달 경로를 통해 효소 I(EI)로 전달되고, 이 효소 I(EI)은 순차로 이를 포스포릴 담체(phosphoryl carrier), 히스티딘 단백질(HPr)로 전달한다. 이어서, 포스포-HPr은 포스포릴 그룹을 당-특이적 퍼미아제(permease), 효소 2(EII)로 공지된 막-결합 복합체로 전달하고, 당을 세포에 수송한다. EII은 적어도 3개의 구조적으로 상이한 도메인 IIA, IIB 및 IIC로 구성되어 있다. 이들은 단일 폴리펩티드 쇄에서 함께 융합될 수 있거나, 이전에 효소 II(Ell) 및 III(Elll)로 지칭된 2개 또는 3개의 상호작용 쇄로서 존재할 수 있다.
제1 도메인(IIA 또는 ENA)은 제1 퍼미아제-특이적 포스포릴화 부위, 포스포-HPr에 의해 포스포릴화된 히스티딘을 갖는다. 제2 도메인(IIB 또는 EIIB)은 수송되는 당에 따라 시스테인 또는 히스티딜 잔기에서 포스포노-IIA에 의해 포스포릴화된다. 마지막으로, 포스포릴 그룹은, IIC 도메인에 의해 처리된 당의 흡수와 동시에, IIB 도메인으로부터 당 기질로 전달된다. 이러한 제3 도메인(IIC 또는 EIIC)은 전좌 채널 및 특정 기질-결합 부위를 형성한다.
따라서, PtsG 시스템은 외인성 글루코스를 획득하고, 미생물 세포에 글루코스-6-포스페이트를 제공한다. 글루코스-6-포스페이트는, UDP-갈락토스 생합성 경로에서 사용될 수 있고/있거나 프럭토스-6-포스페이트로 전환될 수 있고, 이는 이어서, 중추 대사에서 및/또는, 예를 들면, GDP-푸코스 등의 뉴클레오티드 활성화 당류의 생합성에서 에너지-풍부 트리포스페이트를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 유전자 조작된 미생물 세포는 배양 배지로부터 미생물 세포의 세포질로 프럭토스(Frc)를 전좌시키기 위한 프럭토스 수송체를 포함한다. 유리 프럭토스의 흡수에 적합한 프럭토스 수송체는 문헌[참조: Kornberg et al. PNAS 97: 1808-1812 (2000)]에 의해 기재된 바와 같은 이소형(PtsG-F)이다.
이어서, 내재화된 프럭토스(internalized fructose)는 프럭토키나제(FrK)에 의해 포스포릴화되어 프럭토스-6-포스페이트(Fru-6-P)를 제공할 수 있다. 프럭토스-6-포스페이트는 UDP-갈락토스 생합성 경로 및/또는 중추 대사에서 에너지-풍부 트리포스페이트의 형성 등의 기타 대사 경로 및/또는, 예를 들면, GDP-푸코스 등의 뉴클레오티드 활성화 당류의 생합성에서 사용될 수 있다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 유전자 조작된 미생물 세포는 프럭토스-전좌 포스포트랜스퍼라제 시스템(PtsF)을 포함한다. 프럭토스-전좌 포스포트랜스퍼라제 시스템은, 세포 막을 횡단하는 전좌와 동시에, 도입 프럭토스의 포스포릴화를 촉매한다.
따라서, PtsF 시스템은 외인성 프럭토스를 획득하고, 미생물 세포에 프럭토스-1-포스페이트를 제공한다. PtsF 시스템은 막-관통 단백질 FruA, 1-포스포프럭토스 키나제(FruK) 및 디포스포릴 전달 단백질 FruB를 포함한다. 프럭토스는 FruA 및 FruB에 의해 전좌되어 세포질에 프럭토스-1-포스페이트를 제공한다. 프럭토스-1-포스페이트는, 포스포프럭토키나제(Fruk)에 의해 추가로 포스포릴화되어 프럭토스-1,6-비스포스페이트를 생산하고, 이는 미생물 세포에 의해 중추 대사에서 에너지-풍부 트리포스페이트를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
다른 적합한 PtsF 시스템은 LevD, LevE, LevF 및 LevG를 포함한다. LevD는 프럭토스-특이적 포스포트랜스퍼라제 효소 IIA 성분이다. LevE는 프럭토스-특이적 포스포트랜스퍼라제 효소 IIB 성분이다. LevF는 프럭토스 퍼미아제 IIC 성분이고, LevG는 프럭토스 퍼미아제 IID 성분이다. 대응하는 유전자 levD, levE, levF 및 levG는, 예를 들면, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)(균주 168)로 공지되어 있다. 상기 PtsF 시스템은 세포 내에 프럭토스-1-포스페이트를 제공한다.
추가 및/또는 대안적 실시예에서, 유전자 조작된 미생물 세포는 UDP-갈락토스(UDP-Gal)의 세포내 형성을 위한 UDP-갈락토스 생합성 경로를 갖는다. UDP-갈락토스는 갈락토실트랜스퍼라제의 기질로서 요구되고, 여기서 상기 갈락토실트랜스퍼라제의 활성은 갈락토실화된 이당류 또는 갈락토실화된 올리고당의 형성을 유도할 수 있다.
UDP-갈락토스는, 미생물 세포의 천연 존재 대사에 의해, 즉 글루코스 1-포스페이트 및 글루코스 6-포스페이트의 상호전환을 촉매하는 포스포글루코뮤타제, 글루코스-1-포스페이트 및 UTP로부터 UTP-글루코스의 형성을 촉매하는 UTP-글루코스-1-포스페이트-우리딜트랜스퍼라제, 및 UDP-글루코스로부터 UDP-갈락토스로의 가역적 전환을 촉매하는 UDP-글루코스-4-에피머라제의 활성에 의해 제공될 수 있다.
UDP-갈락토스의 세포내 공급은, 포스포글루코뮤타제, UDP-글루코스-1-포스페이트-우리딜트랜스퍼라제, UDP-글루코스-4-에피머라제 및 이의 기능적 변이체를 코딩하는 하나 이상의 유전자가 과발현된다는 점, 및/또는 포스포글루코뮤타제, UDP-글루코스-1-포스페이트-우리딜트랜스퍼라제, UDP-글루코스-4-에피머라제 및 이의 기능적 변이체를 코딩하는 하나 이상의 유전자를 코딩하는 하나 이상의 유전자의 하나 이상의 카피(copy)가 미생물 세포에서 발현된다는 점에서 유전자 조작에 의해 개선될 수 있다. 포스포글루코뮤타제를 코딩하는 유전자의 예는 이. 콜라이 K-12에서 발견되는 pgm 유전자(수탁 번호 NP_415214)이고, UDP-글루코스-1-포스페이트-우리딜트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자의 예는 이. 콜라이 K-12에서 발견되는 이. 콜라이 galU 유전자(수탁 번호 NP_415752)이고, UDP-글루코스-4-에피머라제를 코딩하는 유전자의 예는 이. 콜라이 K-12에서 발견되는 이. 콜라이 galE 유전자(NP_415280)이다.
본원에 사용된 용어 "과발현" 또는 "과발현된"은, 야생형 전구 세포, 즉 유전자 조작된 미생물 세포와 동일한 종의 세포 및 유전자 조작되지 않은 세포에서 측정된 것보다 높은 효소 또는 폴리펩티드 발현의 수준을 지칭한다.
추가 및/또는 대안적으로, 세포내 UDP-갈락토스 공급은 상기 미생물 세포가 배양되는 배양 배지를 통해 미생물 세포에 갈락토스를 공급함으로써 달성될 수 있거나, 개선될 수 있다. 외인적으로 공급된 갈락토스는 미생물 세포에 의해 취입되고, 이어서 갈락토스-1-포스페이트로 포스포릴화되고, 이어서 UDP-갈락토스로 전환된다. 이러한 GDP-갈락토스 생합성 경로에서, 요구되는 효소 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자는 문헌[참조: Groissoird et al, "Characterization, Expression, and Mutation of the Lactococcus lactis galPMKTE Genes, Involved in Galactose Utilization via the Leloir Pathway (2003) J. Bacteriol. 185(3) 870-878]에 공지되어 있다. galP 유전자(수탁 번호 NP_417418)은 갈락토스-프로톤 공수송체를 코딩한다. galM 유전자(수탁 번호 NP_415277)는 알돌라제 1-에피머라제를 코딩하고, galK 유전자(수탁 번호 NP_415278)는 갈락토키나제를 코딩하고, galT 유전자(수탁 번호 NP_415279)는 갈락토스-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제를 코딩하고, galE 유전자는 UDP-갈락토스-4-에피머라제를 코딩한다.
따라서, UDP-갈락토스 생합성은 미생물 세포에서 갈락토스-프로톤 공수송체, 갈락토스 키나제 및 갈락토스-1-포스페이트 우리일트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자의 발현에 의해 또한 공급될 수 있거나, 미생물 세포에서 갈락토스-프로톤 공수송체, 갈락토스 키나제 및 갈락토스-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자의 과발현에 의해 개선될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 유전자 조작된 미생물 세포는 GDP-L-푸코스(GDP-Fuc)의 세포내 형성을 위한 GDP-푸코스 생합성 경로를 갖는다. GDP-Fuc는 푸코실트랜스퍼라제의 기질이고, 푸코실트랜스퍼라제의 효소적 활성은 푸코실화된 이당류 또는 푸코실화된 올리고당의 형성을 유도할 수 있다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 유전자 조작된 미생물 세포는 만노스-6-포스페이트 이소머라제, 포스포만노뮤타제, 만노스-1-포스페이트-구아닐릴트랜스퍼라제, GDP-만노스-4,6-데하이드라타제 및 GDP-L-푸코스 신타제를 포함하는 GDP-L-푸코스 생합성 경로를 갖는다.
GDP-L-푸코스의 세포내 공급은, 만노스-6-포스페이트 이소머라제, 포스포만노뮤타제, 만노스-1-포스페이트-구아닐릴트랜스퍼라제, GDP-만노스-4,6-데하이드라타제 또는 GDP-L-푸코스 신타제를 코딩하는 하나 이상의 유전자가 과발현된다는 점, 및/또는 만노스-6-포스페이트 이소머라제, 포스피로만노뮤타제, 만노스-1-포스페이트-구아닐릴트랜스퍼라제, GDP-만노스-4,6-데하이드라타제 및 GDP-L-푸코스 신타제 또는 이의 기능적 변이체를 코딩하는 하나 이상의 유전자의 추가 카피가 미생물 세포에서 발현된다는 점에서 유전자 조작에 의해 개선될 수 있다. 만노스-6-포스페이트 이소머라제를 코딩하는 유전자의 예는 이. 콜라이 K-12에서 발견되는 이. 콜라이 manA 유전자(수탁 번호 NP_416130)이고, 포스포만노뮤타제를 코딩하는 유전자의 예는 이. 콜라이 K-12에서 발견되는 이. 콜라이 manB 유전자(수탁 번호 NP_416552)이고, 만노스-1-포스페이트-구아닐릴트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자의 예는 이. 콜라이 K-12에서 발견되는 이. 콜라이 manC 유전자(수탁 번호 NP_416553)이고, GDP-만노스-4,6-데하이드라타제를 코딩하는 유전자의 예는 이. 콜라이 K-12에서 발견되는 이. 콜라이 gmd 유전자(수탁 번호 NP_416557)이고, GDP-L-푸코스 신타제를 코딩하는 유전자의 예는 이. 콜라이 K-12에서 발견되는 이. 콜라이 wcaG 유전자(NP_416556)이다.
추가 및/또는 대안적으로, GDP-L-푸코스 공급은 미생물 세포가 배양되는 배양 배지를 통해 L-푸코스를 미생물 세포에 공급함으로써 달성될 수 있거나 개선될 수 있다. 외인적으로 공급된 L-푸코스는 미생물 세포에 의해 취입되고, 먼저 효소 푸코스 키나제에 의해 푸코스-1-포스페이트로 포스포릴화된다. 이어서, 푸코스-1-포스페이트는 효소 푸코스-1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라제의 효소적 활성에 의해 GDP-L-푸코스로 전환된다. 필요한 효소 활성을 갖는 효소를 코딩하는 유전자는 당업자에게 공지되어 있다. 예시적으로, 박테리오이데스 프라질리스(Bacteroides fragilis)의 이작용성 L-푸코키나제/L-푸코스 1-포스페이트 구아닐릴트랜스퍼라제를 코딩하는 fkp 유전자(수탁 번호 WP_010993080)은 유전자 조작된 숙주 세포에서 과발현될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 유전자 조작된 미생물 세포는, 예를 들면, N-아세틸글루코사미닐화된 디- 또는 올리고당의 형성을 유도하는 N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 반응에 필요한 UDP-N-아세틸글루코사민(UDP-GIcNAc)의 세포내 형성을 위한 UDP-N-아세틸글루코사민 생합성 경로를 갖는다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 유전자 조작된 미생물 세포는 UDP-N-아세틸글루코사민 생합성 경로를 갖고, 예를 들면, L-글루타민:D-펜토스-6-포스페이트 아미노트랜스퍼라제, 포스포글루코사민 뮤타제 및 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제/글루코사민-1-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제를 포함한다.
UDP-N-아세틸글루코사민의 세포내 공급은, L-글루타민:D-펜토스-6-포스페이트 아미노트랜스퍼라제 활성(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 glmS 유전자(수탁 번호 NP_418185)), 포스포글루코사민 뮤타제 활성(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 glmM 유전자(수탁 번호 NP_417643)) 및 N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제/글루코사민-1-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 활성(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 glmU 유전자(수탁 번호 NP_418186))을 나타내는 폴리펩티드를 코딩하는 하나 이상의 유전자 또는 이의 변이체의 발현 또는 과발현 등의 유전자 변형에 의해 개선될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 유전자 조작된 미생물 세포는, 예를 들면, 시알릴화된 디- 또는 올리고당의 형성을 유도하는 시알릴트랜스퍼라제 반응에 요구되는, CMP-N-아세틸뉴라민산(CMP-Neu5Ac)의 세포내 형성을 위한 CMP-N-아세틸뉴라민산/CMP-시알산 생합성 경로를 갖는다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 유전자 조작된 미생물 세포는, L-글루타민:D-프럭토스-6-포스페이트 아미노트랜스퍼라제, 포스포글루코사민 뮤타제, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제/글루코사민-1-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제, UDP-N-아세틸글루코사민-2-에피머라제, 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 포스파타제(바람직하게는 HAD-유사 당 포스파타제), N-아세틸-글루코사민-2-에피머라제, 시알산 신타제 및 CMP-시알산 신세타제(synthetase)를 포함하는, CMP-N-아세틸뉴라민산 생합성 경로를 갖는다.
CMP-N-아세틸뉴라민산의 세포내 공급은, L-글루타민:D-펜토스-6-포스페이트 아미노트랜스퍼라제 활성(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 glmS 유전자), 포스포글루코사민 뮤타제 활성(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 glmM 유전자), N-아세틸글루코사민-1-포스페이트 우리딜트랜스퍼라제/글루코사민-1-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 활성(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 glmU 유전자), UDP-N-아세틸글루코사민-2-에피머라제 활성(예를 들면, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) neuC 유전자(수탁 번호 AF305571)), 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 활성(예를 들면, 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) gna1 유전자(수탁 번호 NP_116637)), N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 포스파타아제 활성(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 yihX 유전자(수탁 번호 NP_418321)), N-아세틸글루코사민 2-에피머라제 활성(예를 들면, 시네코시스티스 종(Synechocystis sp.) PCC6803 slr1975 유전자(수탁 번호 BAL 35720)). 시알산 신타제 활성(예를 들면, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) neuB 유전자(수탁 번호 AF305571)) 및 CMP-시알산 신세타제 활성(예를 들면, 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni) neuA 유전자(수탁 번호 AF305571)을 나타내는 하나 이상의 유전자 또는 이의 변이체의 발현 또는 과발현 등의 유전자 변형에 의해 개선될 수 있다.
유전자 조작된 미생물 세포는 글리코실트랜스퍼라제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 적어도 하나의 글리코실트랜스퍼라제는 푸코실-트랜스퍼라제, 시알릴트랜스퍼라제, 글루코사미닐트랜스퍼라제 또는 갈락토실트랜스퍼라제이고, 보다 바람직하게는, 적어도 하나의 글리코실트랜스퍼라제는 β-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 활성, β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 활성, β-1,6-갈락토실트랜스퍼라제 활성, β-1,3-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제 활성, α-2,3-시알릴트랜스퍼라제 활성, α-2,6-시알릴트랜스퍼라제 활성, α-1,2-푸코실트랜스퍼라제 활성, α-1,3-푸코실트랜스퍼라제 활성, α-1,4-푸코실트랜스퍼라제 활성을 나타낸다. 적합한 글리코실트랜스퍼라제는 당업자에게 공지되어 있거나, 문헌에서 발견될 수 있다.
일반적으로 및 본 개시 전반에 걸쳐, 용어 "글리코실트랜스퍼라제 활성" 또는 "글리코실트랜스퍼라제"는 이당류, 올리고당 및 다당류의 생합성에 관여하는 효소를 지칭하고 포함하며, 이들은 활성화된 뉴클레오티드 단당류/당(예를 들면, UDP-GIc, UDP-Gal, GDP-Fuc, UDP-GlcNAc, CMP-Neu5Ac)로부터 글리코실 수용체 분자(예를 들면, 모노-, 디- 또는 올리고당)로의 단당류 모이어티의 이동을 촉매한다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 유전자 조작된 미생물 세포는 야생형 세포보다 더 많은 포스포에놀피루베이트(PEP)를 합성한다. 추가 및/또는 대안적 실시예에서, 유전자 조작된 미생물 세포는 증진된 PEP 생합성 경로를 갖도록 유전자 조작되었다. 예를 들면, 유전자 조작된 미생물 세포는, 예를 들면, 이. 콜라이 K-12 pckA 유전자(수탁 번호 NP_417862) 또는 이의 기능적 변이체를 과발현시킴으로써 증가된 포스포에놀피루베이트 카복시키나제 활성을 갖도록 유전적으로 조작되었다. 바람직하게는, 유전자 조작된 숙주 세포는, 예를 들면, 포스포에놀피루베이트 신타제를 코딩하는 이. 콜라이 K-12 ppsA 유전자(수탁 번호 NP_416217)가 과발현된다는 점 및/또는 비천연-존재 미생물이 포스포에놀피루베이트 신타제 또는 이의 기능적 변이체의 발현을 가능하게 하는 뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 추가 카피를 함유한다는 점에서 증가된 포스포에놀피루베이트 신타제 활성을 갖도록 유전자 조작되었다. pckA 또는 ppsA의 과발현은 세포내 PEP 합성을 증진시키고, 이에 의해 보다 많은 PEP가, 예를 들면, 시알산의 생성에 이용가능하다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 유전자 조작된 숙주 세포의 세포내 PEP-이용가능성은, 배양 배지로부터 세포 내로, 탄소원 및 에너지원으로서 사용되는 특정 당(예를 들면, 글루코스)의 이동에 필요한 포스포트랜스퍼라제 의존성 수송인자(transporter)의 활성을 저하 및/또는 감소시킴으로써 개선될 수 있다. 결과적으로, 탄소원 및 에너지원으로서 상기 특정 당을 사용하는 유전자 조작된 숙주 세포의 능력을 유지하기 위해, 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 비의존성 수송인자를 발현 또는 과발현시키는 것이 필요하다. 추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 상기 특정 당을 포스포릴화할 수 있는 키나제의 발현 또는 과발현은, 세포 내에서 각각 상기 당의 대사 또는 비포스포릴화 형태에서 이의 축적을 실현하기 위해 필요하거나, 저하 및/또는 감소한다.
발현 및/또는 활성이 유전자 조작된 미생물 세포(예를 들면, 이. 콜라이 K-12)에서 저하 및/또는 감소될 수 있는 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 의존성 수송인자 또는 이의 성분은 글루코스 PEP-PTS 유전자 ptsG(수탁 번호 NP_415619), malX(수탁 번호 NP_416138), crr(수탁 번호 NP_416912), bgIF(수탁 번호 NP_418178) 및/또는 프럭토스 PEP-PTS 유전자 fruA(수탁 번호 NP_416672), fruB(수탁 번호 NP_416674) 및/또는 만노스 PEP-PTS 유전자 manX(수탁 번호 NP_416331), many(수탁 번호 NP_416332), manZ(수탁 번호 NP_416333) 및/또는 N-아세틸글루코사민 PEP-PTS 유전자 nagE(수탁 번호 NP_415205)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다.
단당류(글루코스 및/또는 프럭토스 및/또는 갈락토스 및/또는 N-아세틸글루코사민 및/또는 N-아세틸뉴라민산 및/또는 푸코스)를 미생물 세포로 전달할 수 있는 적절한 PEP-PTS 수송인자 또는 이의 변이체는 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있다. 상기 비-PEP-PTS 수송인자를 코딩하는 유전자의 비-제한적 예는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) K-12의 galP(서열번호 1), 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)의 gif(서열번호 2), 에스케리키아 콜라이 W의 cscB(서열번호 3), 류코노스톡 슈도메센테로이데스(Leuconostoc pseudomesenteroides)의 fupL(서열번호 4), 에스케리키아 콜라이 K-12의 lacY(서열번호 5), 에스케리키아 콜라이 K-12의 fucP(서열번호 6), 에스케리키아 콜라이 K-12의 nanT(서열번호 7), 크산토모나스 캄페스트리스(Xanthomonas campestris)의 nagP(서열번호 6), 비피도박테리움 롱굼 NCC2750의 glcP(서열번호 9), 바실루스 서브틸리스의 glcP(서열번호 10), 비브리오 파라하에몰리티쿠스의 sglS(서열번호 11), 에스케리키아 콜라이 K-12의 xylE(서열번호 12), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 168의 araE(서열번호 13)이다. 따라서, 추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 유전자 조작된 숙주 세포는 전술한 유전자 또는 이의 기능적 변이체의 단백질 코딩 영역을 포함하는 적어도 하나의 유전자를 포함하고 발현한다.
바람직한 실시형태에서, 적합한 비-PEP-PTS-글루코스 수송체는 당 촉진 확산 단백질 및/또는 글루코스 전좌 퍼미아제이다. 적합한 글루코스 촉진된 융합 단백질은 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)의 gif 유전자에 의해 코딩된다. 적절한 글루코스 전좌 퍼미아제는 이. 콜라이 K-12 galP 유전자에 의해 코딩된다. 글루코스 전좌 퍼미아제는 갈락토스-프로톤 공수송체 또는 갈락토스 프레미아제로서 또한 공지되어 있지만, 또한 세포 막에 걸쳐 글루코스를 수입한다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 적절한 비-PEP-PTS-글루코스 수송체는 당 촉진된 확산 단백질 및/또는 프럭토스 담체 단백질이다. 적절한 프럭토스 촉진된 융합 단백질은 자이모모나스 모빌리스의 gif 유전자에 의해 코딩된다. 적합한 프럭토스 담체 단백질은 류코노스톡 슈도도메센-테로이데스 fupL 유전자에 의해 코딩된다.
일반적으로 및 본 개시의 전반에 걸쳐, 용어 "당 포스페이트의 세포내 이용가능성의 증가" 또는 "당 포스페이트의 공급의 증가/개선"은, 비변형된 미생물 세포와 비교하여, 목적 탄수화물의 생합성 경로를 통해 탄소 플럭스(carbon flux)를 상승시킬 수 있는, 유전자 변형된 미생물 세포가 상술한 당 포스페이트의 세포내 양의 증가를 생성하는 능력의 증가를 지칭한다. 결과로서, 상기 유전자 변형된 미생물 세포에 의한 상기 목적 탄수화물의 상승된 생산은 상기 당 포스페이트의 상승된 세포내 양의 직접적 척도이다. 더욱이, 세포내 대사산물 정량화 및/또는 세포의 탄소 플럭스를 표적화하는 방법은 당업자에게 공지된 문헌에서 발견할 수 있다[참조: 예를 들면, Lammerhofer and Weckwerth, "Metabolomics in Practice: Successful Strategies to Generate and Analyze Metabolic Data", Wiley-VCH, Weinheim, Germany (2013)].
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 목적 탄수화물의 생합성과 경쟁하는 유전자 및/또는 단백질의 각각의 발현 및/또는 활성은 유전자 조작된 숙주 세포 내에서 저하 및/또는 감소될 수 있다. 이러한 중화 단백질/단백질 활성의 비제한적 예는 β-갈락토시다제(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 LacZ(수탁 번호 NP_414878)), UDP-글루코스:운데카프레닐포스페이트 글루코스-1-포스페이트 트랜스퍼라제(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 WcaJ(수탁 번호 NP_416551)), L-푸코스 이소머라제(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 Fuel), 푸쿨로키나제(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 FucK(수탁 번호 NP_417282)), N-아세틸글루코사민-6-포스페이트 데아세틸라제(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 NagA(수탁 번호 NP_415203)), 글루코사민-6-포스페이트 데아미나제(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 NagB(수탁 번호 NP_415204)), NV-아세틸만노사민 키나제(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 NanK(수탁 번호 NP_417689)), N-아세틸만노사민-6-포스페이트 에피머라제(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 NanE(수탁 번호 NP_417690)), N-아세틸뉴라민산 알돌라제(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 NanA(수탁 번호 NP_417692)), 시알산 퍼미아제(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 NanT(수탁 번호 NP_417691))로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나를 포함한다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 유전자 조작된 미생물 세포는 수크로스를 대사할 수 있고, 따라서 (i) 이종성 PTS 의존성 수크로스 이용 수송 시스템(예를 들면, 클레브시엘라 뉴모니아에 scrYAB(서열번호 14) 또는 수크로스 포린(scrY), PTS 수크로스-특이적 수송체 아단위 II(scrA) 및 수크로스-6-포스페이트 하이드롤라제(scrB)로 이루어진 살모넬라 티피무리움 scrYAB 유전자(서열번호 15)) 및/또는 (ii) 수크로스 포스페이트 신타제 유전자(예를 들면, 아나바에나 종 PCC7120 spsA 유전자(수탁 번호 AJ302071))와 조합된 이종성 PTS 의존성 수크로스 수성체 시스템(예를 들면, 클레브시엘라 뉴모니아에 scrYA 유전자 또는 살모넬라 티피무리움 scrYA 유전자) 및/또는 (iii) 프럭토키나제(cscK), 수크로스 하이드롤라제(cscA) 및 수크로스 퍼미아제(cscB)로 이루어진 이종성 PTS-비의존성 수크로스 이용 시스템(예를 들면, 이. 콜라이 W cscBKA 유전자(서열번호 16) 및/또는 (iv) 수크로스 포스포릴라제 유전자(예를 들면, 비피도박테리움 아돌레스센티스(Bifidobacterium adolescentis) basP 유전자(수탁 번호 WP_011742626)) 또는 수크로스 신타제 유전자(예를 들면, 아나바에나 종(Anabaena sp.) susA 유전자(수탁 번호 CAA09297))와 조합하여 수크로스 퍼미아제 유전자(예를 들면, 이. 콜라이 W cscB)로 이루어진 이종성 수크로스 이용 시스템을 코딩하는 하나 이상의 유전자를 포함한다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 미생물 세포는 세포로부터 목적 탄수화물을 외수송(exporting)하는 외수송 단백질(exporter protein) 또는 퍼미아제, 바람직하게는 당 유출 수송체(efflux transporter)를 포함한다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 숙주 세포는 미생물 세포, 바람직하게는 에스케리키아(Escherichia) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 속, 엔테로코쿠스(Enterococcus) 속, 락토코쿠스(Lactococcus) 속 및 클로스트리디움(Clostridium) 속의 세균으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 세균 세포, 바람직하게는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 클로스트리디움 셀룰로리티쿰(Clostridium cellulolyticum), 클로스트리디움 룬다리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 아우로테타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실루스 메가테리움(Bacillus megaterium), 락토바실루스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실루스 헬베티쿠스(Lactobacillus helveticus), 락토바실루스 델브루엑키(Lactobacillus delbrueckii) 및 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis)로 이루어진 세균 종의 그룹으로부터 선택되는 세균 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 미생물 세포는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)이다. 당업자는, 본 개시를 판독할 때, 추가의 세균 균주를 인식할 것이다.
제2 측면에 따르면, 목적 탄수화물의 생산을 위해 본원에 기재된 바와 같은 유전자 조작된 숙주 세포의 용도가 제공되고, 여기서 상기 숙주 세포는 글루코스, 및 프럭토스 및 갈락토스의 그룹의 적어도 제2 단당류로 이루어진 단당류 혼합물의 존재하에 배양된다. 상기 세포는 목적 탄수화물의 생산에 관련된 적어도 하나의 당 포스페이트의 세포내 이용가능성의 증가를 나타내도록 유전자 조작된다. 상기 당 포스페이트는 포스포에놀피루베이트(PEP), 디하이드록시아세톤 포스페이트, 프럭토스-6-포스페이트, 프럭토스-1-포스페이트, 프럭토스-1,6-비스포스페이트, 글루코스-6-포스페이트, 글루코스-1-포스페이트, 갈락토스-1-포스페이트, 만노스-1-포스페이트, 만노스-6-포스페이트, 글루코사민-6-포스페이트, 글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트, N-아세틸글루코사민-1-포스페이트, N-아세틸만노사민-6-포스페이트, UDP-글루코스, UDP-갈락토스, CMP-N-아세틸뉴라민산, GDP-만노스, GDP-푸코스 및 UDP-N-아세틸글루코사민으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
제3 양태에 따르면, 목적 탄수화물의 발효 생산을 위한 방법이 제공되고, 상기 방법은
a) 목적하는 탄수화물을 생산할 수 있는 유전자 조작된 미생물을 제공하는 단계로서, 상기 미생물은, 상기 조작된 미생물 내에서 상기 세포내 당 포스페이트의 소비를 유도하는 적어도 하나의 단백질의 발현 및/또는 활성의 저하 및/또는 감소에 기인하여 적어도 하나의 당 포스페이트의 세포내 이용가능성의 증가를 나타내는, 단계;
b) 상기 유전자 조작된 미생물을, 상기 목적 탄수화물의 생산을 허용하는 배양 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 주요 탄소 공급원은 글루코스, 및 프럭토스 및 갈락토스의 그룹의 적어도 제2 단당류로 이루어진 단당류 혼합물인, 단계; 및
c) 상기 목적 탄수화물을 회수하는 단계를 포함한다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 목적 탄수화물은 모유 올리고당 또는 이의 구성 블록이다. 유전자 변형 미생물 세포 및/또는 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성될 수 있는 목적 탄수화물의 목록은 표 1에 개시되어 있다. 바람직하게는, 목적 탄수화물은 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 2',3-디푸코실락토스, 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스, 3-푸코실-3'-시알릴락토스, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-푸코펜타오스 I, 락토-N-푸코멘토스 II, 락토-N-푸코펜타오스 III, 락토-N-푸코펜타오스 V, 락토-N-디푸포실헥사오스 I, 락토-N-디푸코실헥사오스 II, 락토-N-시알릴펜타오스 LSTa, LSTb, LSTc로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
바람직하게는, 글루코스 및 적어도 하나의 추가 단당류의 혼합물은, 바람직하게는 수크로스의 가수분해에 의해 수득된 글루코스 및 프럭토스의 혼합 공급원료이다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 수크로스 가수분해는 불완전하고, 상당한 양의 수크로스가 공급원료에 잔류한다. 따라서, 가수분해된 및/또는 열-멸균된 공급원료의 수크로스 양은 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75% 또는 80% 이상이다.
추가 및/또는 대안적 실시형태에서, 미생물 세포는, 특히 목적 올리고당의 생산을 위해 배양되는 경우, 수용자 기질, 예를 들면, N-아세틸글루코사민 또는 락토스의 외인성 공급 없이 배양된다.
본 발명은 특정 실시형태와 관련하여 및 도면을 참조하여 설명되지만, 본 발명은 이들로 한정되지 않고 청구범위에 의해서만 한정된다. 또한, 상세한 설명 및 청구범위에서 제1, 제2 등의 용어는 유사한 요소 사이를 구별하기 위해 사용되고, 시간적, 공간적, 순위적으로 또는 임의의 다른 방식으로 배열을 설명하기 위해 사용된다. 사용된 용어들은 적절한 환경하에서 상호 교환가능하고, 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시형태는 본 명세서에 기재 또는 예시 이외의 순서로 동작할 수 있다는 것을 이해해야 한다.
청구범위에서 사용되는 용어 "포함하는"은 그 후에 기재된 수단으로 제한되는 것으로 해석되어서는 않되고, 다른 요소 또는 단계를 배제하지 않는다. 따라서, 언급된 특징, 정수, 단계 또는 구성요소의 존재를 명시하는 것으로 해석될 수 있지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계 또는 구성요소 또는 이들의 그룹의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다. 따라서, "수단 A 및 B를 포함하는 장치"라는 표현의 범위는 구성요소 A 및 B만으로 이루어진 장치로 한정되지 않아야 한다. 이는, 본 발명과 관련하여, 장치의 유일한 관련 구성요소가 A 및 B임을 의미한다.
본 명세서 전반에 걸쳐, "한 가지 실시형태" 또는 "실시형태"에 대한 언급은, 실시형태와 관련하여 설명된 특정 특징, 구조 또는 특성이 본 발명의 적어도 하나의 실시형태에 포함된다는 것을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전반에 걸쳐 다양한 장소에 있어서 "한 가지 실시형태" 또는 "실시형태"라는 문구의 출현은 반드시 모두 동일한 실시형태를 지칭할 필요는 없지만, 그러한 경우도 있다. 또한, 특정 특징들, 구조들 또는 특성들은, 하나 이상의 실시형태에서, 본 개시로부터 당업자에게 명백한 바와 같이, 임의의 적절한 방식으로 조합될 수 있다.
유사하게는, 본 발명의 예시적 실시형태의 설명에 있어서, 본 발명의 다양한 특징은 본 개시를 합리화하고 이의 이해를 보조할 목적으로, 단일 실시형태, 도면 또는 이들의 상세한 설명과 함께 그룹화된다. 그러나, 이 개시 방법은 청구된 발명이 각 청구항에 명시적으로 기재되어 있는 것보다 많은 특징을 필요로 한다는 의도를 반영하는 것으로 해석되어서는 않된다. 오히려, 하기의 특허 청구의 범위가 반영하도록, 발명의 양태는 상기 개시된 실시형태의 모든 특징들에 비해 더 작은 특징이다. 따라서, 상세한 설명을 따르는 특허 청구의 범위는 본 명세서에 명백히 포함되고, 각 청구항은 본 발명의 개별 실시형태와 함께 그 자체로 존재한다.
또한, 본 명세서에 기재된 일부 실시형태는, 다른 실시형태에 포함되는 다른 특징이 아닌 일부 특징을 포함하지만, 상이한 실시형태의 특징의 조합은 본 발명의 범위 내에 있고, 당해 기술분야의 숙련자들에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 상이한 실시형태를 형성하는 것을 의미한다. 예를 들면, 하기 특허 청구의 범위에서, 특허청구된 실시형태 중 임의의 것이 임의의 조합으로 사용될 수 있다.
또한, 일부 실시형태는 컴퓨터 시스템의 프로세서에 의해 또는 기능을 실행하는 다른 수단에 의해 실시될 수 있는 방법 또는 방법 요소의 조합으로 본 명세서에서 기재된다. 따라서, 이러한 방법 또는 방법 요소를 실행하기 위해 필요한 명령을 갖는 프로세서는 방법 또는 방법 요소를 실행하기 위한 수단을 형성한다. 또한, 장치 실시형태의 본원에 기재된 요소는 본 발명을 실행하는 목적으로 요소에 의해 실행되는 기능을 실행하기 위한 수단의 예이다.
본 명세서에 제공된 설명 및 도면에서, 다수의 특정 상세가 기재되어 있다. 그러나, 본 발명의 실시형태는 이러한 특정 상세 없이 실시될 수 있다는 것이 이해된다. 다른 예에서, 이 설명의 이해를 모호하게 하지 않기 위해 보다 공지된 방법, 구조 및 기술은 상세히 제시되지 않았다.
[표 1]
유전자 변형된 미생물 세포 및/또는 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성될 수 있는 목적 탄수화물의 비-제한 목록
이제, 본 발명은 본 발명의 몇몇 실시형태의 상세한 설명에 의해 설명될 것이다. 본 발명의 다른 실시형태는, 본 발명의 진정한 정신 또는 기술적 교시를 벗어남이 없이 당업자의 지식에 따라 구성될 수 있으며, 본 발명은 첨부된 특허 청구의 범위의 조건에 의해서만 제한되는 것은 명백하다.
한 가지 실시형태에서, 유전자형 nagABE-를 갖는 이. 콜라이 균주, manXYZ-는 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 글루코스)를 사용하는 N-아세틸글루코사민(GlcNAc)의 효율적 생산자로서 대사적으로 조작된다. 따라서, 아세테이트를 아세틸-CoA로부터 글루코사민-6-포스페이트로 전달하여 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트를 생성할 수 있는, 글루코사민-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자의 이종성 발현이 필요하다. 바람직한 실시형태에서, 이 생산 균주는 포스포프럭톡키나제 유전자 pfkA 및/또는 pfkB 및/또는 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제(dehydrogenase) 유전자 zwf의 발현을 저하 및/또는 감소시킴으로써 추가로 유전자 조작된다. 이러한 추가 유전자 변형은 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스) 상에서 조작된 생산 균주의 배양을 가능하게 하고, 균주의 대사를 방해하는 것을 방지하고 N-아세틸글루코사민 생산을 위한 전구체 공급(프럭토스-6-포스페이트)를 증가시킨다. 추가의 실시형태에서, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트를 N-아세틸글루코사민으로 탈포스포릴화할 수 있는, 글루타민-프럭토스-6-포스페이트 아미노트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자(예를 들면, 이. 콜라이 GlmS) 및/또는 HAD-유사 당 포스파타제를 코딩하는 유전자(예를 들면, 이. 콜라이 YihX, 이. 콜라이 YqaB)는 GlcNAc의 합성을 촉진하기 위해 발현/과발현된다.
또 다른 실시형태에서, 유전자형 lacY+, lacZ-, fuclK-, wcaJ-를 갖는 이. 콜라이 균주는, 수용자 기질로서의 락토스 뿐만 아니라, 혼합 단당 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스)를 주요 탄소원 및 에너지원으로서 사용하여, L-푸코스의 효율적 생산자로서 대사적으로 조작된다. 따라서, 푸코스를 GDP-푸코스로부터 락토스로 전달하여 2'-푸코실락토스를 생성할 수 있는 이종성 α-1,2-푸코시다제, 및 2'-푸코실락토스로부터 유리 L-푸코스를 방출할 수 있는 α-1,2-푸코시다제의 발현이 필요하다. 바람직한 실시형태에서, 이 생산 균주는 포스포프럭토키나제 유전자 pfkA 및/또는 pfkB 및/또는 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 유전자 zwf의 발현을 저하 및/또는 감소시킴으로써 추가로 조작된다. 이러한 추가의 유전자 변형은 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스) 상에서 조작된 생산 균주의 배양을 가능하게 하고, 균주의 대사를 방해하는 것을 방지하지만, L-프럭토스 생산을 위한 전구체 공급(프럭토스-6-포스페이트)를 증가시킨다.
또 다른 실시형태에서, 유전자형 nanKETA-, nagAB-를 갖는 이. 콜라이 균주는 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스)를 사용하여 N-아세틸뉴라민산(Neu5Ac)의 효율적 생산자로서 대사적으로 조작된다. 따라서, (i) 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제 및 N-아세틸글루코사민-2 에피머라제 및 N-아세틸뉴라민산 신세타제 또는 (ii) UDP-N-아세틸글루코사민 2-에피머라제 및 N-아세틸뉴라민산 신세타제를 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 과발현이 필요하다. N-아세틸뉴라민산 합성은 포스포에놀피루베이트(PEP)-의존성 프로세스이기 때문에, PEP의 소비를 유도하는 경쟁 반응은 바람직하게는 회피된다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 이러한 생산 균주는, 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 의존성 메카니즘을 통해 상기 탄소- 및 에너지원(들)의 수입을 저하 및/또는 감소시킴으로써, 예를 들면, 글루코스 PEP 퍼미아제 유전자 ptsG 및/또는 프럭토스 PEP 퍼미아제 유전자 fruA 및/또는 만노스 PEP 퍼미아제 유전자 manXYZ의 발현을 저하 및/또는 감소시킴으로써 추가로 조작된다. 조작된 세포 내로 단당류(들) 전달을 가능하게 하는, 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 비의존성(비-PEP-PTS) 수송체를 코딩하는 적어도 하나의 유전자, 뿐만 아니라 프럭토스를 프럭토스-6-포스페이트로 및 글루코스를 글루코스-6-포스페이트로 각각 활성화시킬 수 있는 프럭토스 키나제(예를 들면, 이. 콜라이 W cscK 유전자) 및 글루코스 키나제(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 glk 유전자)의 발현/과발현과 함께, 이러한 추가의 유전자 변형은 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스) 상에서 조작된 생산 균주의 배양을 가능하게 하고, 균주의 대사를 방해하는 것을 방지하지만, N-아세틸뉴라민산 생산을 위한 전구체 공급(프럭토스-6-포스페이트, 포스포에놀피루베이트)을 증가시킨다.
또 다른 실시형태에서, 유전자형 nagABE-, manXYZ-, lacZ-를 갖는 이. 콜라이 균주는, 수용자 기질로서의 GlcNAc 뿐만 아니라, 주요 탄소원 및 에너지원으로서 공급 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스)를 사용하여, N-아세틸락토사민(LacNAc)의 효율적 생산자로서 대사적으로 조작된다. 따라서, 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제, N-아세틸-글루코사민을 세포 내로 전달할 수 있는 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 비의존성 수송체, 및 갈락토스를 UDP-Gal로부터 유리 N-아세틸글루코사민으로 전달하여 N-아세틸-락토사민을 형성할 수 있는 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자의 발현/과발현이 필요하다. 바람직한 실시형태에서, 이러한 생산 균주는 포스포프럭토키나제 유전자 pfkA 및/또는 pfkB 및/또는 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 유전자 pgi 및/또는 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 유전자 zwf의 발현을 저하 및/또는 감소시킴으로써 추가로 유전자 조작된다. 이러한 추가의 유전자 변형은, 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스) 상에서 조작된 생산 균주의 배양을 가능하게 하고, 균주의 대사를 방해하는 것을 방지하지만, N-아세틸락토사민 생산을 위한 전구체 공급(글루코스-6-포스페이트)을 증가시킨다. 추가의 실시형태에서, UDP-Gal의 합성을 촉진하기 위해, 이. 콜라이 유전자 pgm, galU 및 galE의 적어도 하나가 과발현된다.
또 다른 실시형태에서, 유전자형 nagAB-를 갖는 이. 콜라이 균주는 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로즈)를 주요 탄소원 및 에너지원으로서 사용하여 전체 발효에 의해 락토-N-비오스(LNB)의 효율적 생산자로서 대사적으로 조작된다. 따라서, 아세테이트를 아세틸-CoA로부터 글루코사민-6-포스페이트로 전달하여 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트를 생성할 수 있는 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트를 탈포스포릴화하여 N-아세틸글루코사민을 생성할 수 있는 HAD-유사 당 포스파타제, 및 갈락토스를 UDP-Gal로부터 유리 N-아세틸글루코사민으로 전달하여 락토-N-비오스를 생성할 수 있는 β-1,3-갈락토실트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자의 발현/과발현이 필요하다. 바람직한 실시형태에서, 이러한 생산 균주는, 포스포프럭토키나제 유전자 pfkA 및/또는 pfkB 및/또는 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 유전자 zwf의 발현을 저하 및/또는 감소시킴으로써 추가로 유전자 조작된다. 이러한 추가의 유전자 변형은, 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스) 상에서 조작된 생산 균주의 배양을 가능하게 하고, 균주의 대사를 방해하는 것을 방지하지만, 락토-N-비오스 생산을 위한 전구체 공급(프럭토스-6-포스페이트 및 글루코스-6-포스페이트)을 증가시킨다. 추가의 실시형태에서, GlcNAc 및/또는 UDP-Gal의 합성을 촉진하기 위해, 이. 콜라이 유전자 glmS, pgm, galU, galE 중의 적어도 하나가 과발현된다.
또 다른 실시형태에서, 유전자형 lacY+, lacZ-, nanKETA-, nagAB-를 갖는 이. 콜라이 균주는, 수용자 기질로서의 락토스 뿐만 아니라, 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스)를 주요 탄소원 및 에너지원으로서 사용하여 3'-시알릴락토스의 효율적 생산자로서 대사적으로 조작된다. 따라서, 기재된 바와 같은 N-아세틸뉴라민산 생산 균주는 이종성 CMP-N-아세틸뉴라민산 신세타제, N-아세틸뉴라민산 신타제, 및 N-아세틸뉴라민산을 CMP-Neu5Ac로부터 락토스로 전달하여 3'-시알릴락토스를 생성할 수 있는 α-2,3-시알릴트랜스퍼라제의 발현에 의해 유전자 조작된다. N-아세틸뉴라민산의 합성과 관련하여, 3'-SL 생산은 포스포에놀피루베이트(PEP-의존성 프로세스이다. 따라서, 바람직한 실시형태에서, 상기 3'-SL 생산 균주는, 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 의존성 메카니즘을 통해 상기 탄소원 및 에너지원의 수입을 저하 및/또는 감소시킴으로써, 예를 들면, 글루코스 PEP 퍼미아제 유전자 ptsG 및/또는 프럭토스 PEP 퍼미아제 유전자 fruA 및/또는 만노스 PEP 퍼미아제 유전자 manXYZ의 발현을 저하 및/또는 감소시킴으로써 추가로 조작된다. 조작된 세포로 단당류(들) 전달을 가능하게 하는 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 비의존성(비-PEP-PTS) 수송체, 뿐만 아니라 프럭토스를 프럭토스-6-포스페이트로 및 글루코스를 글루코스-6-포스페이트로 각각 활성화시킬 수 있는 프럭토스 키나제(예를 들면, 이. 콜라이 W cscK 유전자) 및 글루코스 키나제(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 glk 유전자)를 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현/과발현과 함께, 이러한 추가 유전자 변형은 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합 단당 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스) 상에서 조작된 생산 균주의 배양을 가능하게 하고, 균주의 대사를 방해하는 것을 방지하지만, 3'-시알릴락토스 생산을 위한 전구체 공급(프럭토스-6-포스페이트, 포스포에놀피루베이트)을 증가시킨다.
또 다른 실시형태에서, 유전자형 lacY+, lacZ-, fuclK-, wcaJ-를 갖는 이. 콜라이 균주는, 수용자 기질로서 락토스 뿐만 아니라, 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스)를 사용하여, 3-푸코실 I 락토스의 효율적 생산자로서 대사적으로 조작된다. 따라서, 이. 콜라이 유전자 manA, manC, manB, gmd 및 wcaG 중의 적어도 하나의 과발현, 게다가 푸코스를 GDP-푸코스로부터 락토스로 전달하여 3-푸코실락토스를 생성할 수 있는 이종성 α-1,3-푸코실트랜스퍼라제의 발현이 필요하다. 바람직한 실시형태에서, 이러한 생산 균주는, 포스포프럭토키나제 유전자 pfkA 및/또는 pfkB 및/또는 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 유전자 zwf의 발현을 저하 및/또는 감소시킴으로써 추가로 유전자 조작된다. 이러한 추가 유전자 변형은 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스) 상에서 조작된 생산 균주의 배양을 가능하게 하고, 균주의 대사를 방해하는 것을 방지하지만, 3-푸코실락토스 생산을 위한 전구체 공급(프럭토스-6-포스페이트)을 증가시킨다.
한 가지 실시형태에서, 유전자형 lacY+, lacZ-, angB-, wcaJ-를 갖는 이. 콜라이 균주는, 수용자 기질로서 락토스 뿐만 아니라, 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스)를 사용하여 락토-N-트리오스 II(LNT-II)를 효율적으로 생성하기 위해 대사적으로 조작된다. 따라서, N-아세틸글루코사민을 UDP-GlcNAc로부터 락토스로 전달하여 락토-N-트리오스 II를 생성할 수 있는 이종성 β-1,3-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제의 발현이 필요하다. 바람직한 실시형태에서, 이러한 생산 균주는 포스포프럭토키나제 유전자 pfkA 및/또는 pfkB 및/또는 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 유전자 zwf의 발현을 저하 및/또는 감소시킴으로써 추가로 유전자 조작된다. 이러한 추가의 유전자 변형은, 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스) 상에서 조작된 생산 균주의 배양을 가능하게 하고, 균주의 대사를 방해하는 것을 방지하지만, 락토-N-트리오스 II 생산을 위한 전구체 공급(프럭토스-6-포스페이트)을 증가시킨다. 추가의 실시형태에서, UDP-GlcNAc 합성을 촉진하기 위해, 이. 콜라이 유전자 glmS, glmU 및 glmM의 적어도 하나가 과발현된다.
또 다른 실시형태에서, 유전자형 lacY+, lacZ-, nagB-, wcaJ-를 갖는 이. 콜라이 균주는, 수용자 기질로서 락토스 뿐만 아니라, 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스)를 사용하여 락토-N-테트라오스(LNT)의 효율적 생산자로서 대사적으로 조작된다. 따라서, N-아세틸글루코사민을 UDP-GlcNAc로부터 락토스로 전달할 수 있는 이종성 β-1,3-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제, 및 갈락토스를 UDP-갈락토스로부터 락토-N-트리오스 II로 전달하여 락토-N-테트라오스를 생성할 수 있는 β-1,3-갈락토실트랜스퍼라제의 발현이 필요하다. 바람직한 실시형태에서, 이러한 생산 균주는 포스포프럭토키나제 유전자 pfkA 및/또는 pfkB 및/또는 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 유전자 zwf 및/또는 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 유전자 pgi의 발현을 저하 및/또는 감소시킴으로써 추가로 유전자 조작된다. 이러한 추가의 유전자 변형은 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스) 상에서 조작된 생산 균주의 배양을 가능하게 하고, 균주의 대사를 방해하는 것을 방지하지만, 락토-N-테트라오스 생산을 위한 전구체 공급(프럭토스-6-포스페이트 및 글루코스-6-포스페이트)을 증가시킨다. 추가의 실시형태에서, UDP-GlcNAc 및/또는 UDP-Gal의 합성을 촉진하기 위해 이. 콜라이 유전자 glmS, glmU, glmM, pgm, galU 및 galE 중의 적어도 하나가 과발현된다.
또 다른 실시형태에서, 유전자형 lacY+, lacZ-, nagB-, wcaJ-를 갖는 이. 콜라이 균주는, 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스)를 주요 탄소원 및 에너지원으로 사용하는 전체 발효에 의해 락토-N-네오테트라오스(LNnT)를 효율적으로 생성하도록 대사적으로 조작된다. 따라서, LNnT 생산 균주는 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 의존성 메카니즘을 통해 글루코스의 수입을 저하 및/또는 감소시킴으로써, 예를 들면, 글루코스 PEP 퍼미아제 유전자 ptsG의 발현을 저하 및/또는 감소시키는 한편, 조작된 세포로 글루코스 전달을 가능하게 하는 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 비의존성(비-PEP-PTS) 수송체를 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 발현시킴으로써 유전자 조작된다. 추가로, 글루코키나제 유전자 glk 및/또는 글루코스 데하이드로게나제 유전자 gcd의 발현은 저하 및/또는 폐지된다. 본질적으로, 갈락토스를 UDP-갈락토스로부터 글루코스 상으로 전달하여 락토스를 생성할 수 있는 β-1,4-갈락토트랜스퍼라제, 및 N-아세틸글루코사민을 UDP-GlcNAc로부터 락토스로 전달하여 락토-N-트리오스 II를 생성할 수 있는 β-1,3-N-아세틸글루코사미닐트랜스퍼라제, 및 갈락토스를 UDP-갈락토스로부터락토-N-트리오스 II로 전달하여 락토-N-네오테트라오스를 생성할 수 있는 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제의 이종성 발현이 필요하다. 바람직한 실시형태에서, 이러한 생산 균주는 포스포프럭토키나제 유전자 pfkA 및/또는 pfkB 및/또는 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 유전자 zwf 및/또는 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 유전자 pgi의 발현을 저하 및/또는 감소시킴으로써 추가로 조작된다. 이러한 추가의 유전자 변형은 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스) 상에서 조작된 생산 균주의 배양을 가능하게 하고, 균주의 대사를 방해하는 것을 방지하지만, 전체 발효에 의한 락토-N-네오테트라오스 생산을 위한 전구체 공급(글루코스 및 프럭토스-6-포스페이트 및 글루코스-6-포스페이트)을 증가시킨다. 추가의 실시형태에서, UDP-GlcNAc 및/또는 UDP-Gal의 합성을 촉진하기 위해, 이. 콜라이 유전자 glmS, glmU, glmM, pgm, galU 및 galE 중의 적어도 하나가 과발현된다.
또 다른 실시형태에서, 유전자형 yacY+, lacZ-, fuclK-, wcaJ-를 갖는 이. 콜라이 균주는, 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스)를 주요 탄소원 및 에너지원으로서 사용하는 전체 발현에 의해 2'-푸코실락토스를 효율적으로 생성하도록 대사적으로 조작된다. 따라서, 글루코키나제 유전자 glk 및/또는 글루코스 데하이드로게나 유전자 gcd의 발현, 게다가 포스포에놀피루베이트:글루코스 포스포트랜스퍼라제 의존성 메카니즘의 활성이 저하 및/또는 폐지된다. 또한, 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 비의존성(비-PEP-PTS) 수송체 유전자는 상기 이. 콜라이 균주에서 발현 또는 과발현된다. 추가로, 이. 콜라이 유전자 manA, manC, manB, gmd, wcaG, pgm, galU 및 galE 중의 적어도 하나, 게다가 갈락토스를 UDP-갈락토스로부터 글루코스로 전달하여 락토스를 생성할 수 있는 이종성 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제, 및 푸코스를 GDP-푸코스로부터 락토스로 전달하여 2'-푸코실락토스를 생성할 수 있는 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제가 발현/과발현된다. 바람직한 실시형태에서, 이러한 생산 균주는 포스포프럭토키나제 유전자 pfkA 및/또는 pfkB 및/또는 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 유전자 zwf 및/또는 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 유전자 pgi의 발현을 저하 및/또는 감소시킴으로써 추가로 조작된다. 이러한 추가의 유전자 변형은 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼한 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스) 상에서 조작된 생산 균주의 배양을 가능하게 하고, 균주의 대사를 방해하는 것을 방지하지만, 전체 발효에 의해 2'-푸코실락토스 생산을 위한 전구체 공급(글루코스 및 프럭토스-6-포스페이트 및 글루코스-6-포스페이트)을 증가시킨다.
또 다른 실시형태에서, 유전자형 lacY+, lacZ-, fuclK-, wcaJ-, manA-를 갖는 이. 콜라이 균주는, 수용자 기질로서 락토스 뿐만 아니라, 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스)를 사용하여, 2',3-디-푸코실락토스의 효율적 생산자로서 대사적으로 조작된다. 따라서, 프럭토키나제 활성을 나타내는 유전자(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 mak 유전자)의 발현 및 포스포에놀피루베이트:프럭토스 포스포트랜스퍼라제 의존성 메카니즘의 활성이 저하 및/또는 폐지된다. 이러한 세포는, 조작된 세포 내로 프럭토스 전달을 가능하게 하는 포스포에놀피루베이트:프럭토스 포스포트랜스퍼라제 비의존성(비-PEP-PTS) 수송체, 프럭토스를 만노스로 형질전환시킬 수 있는 만노스 이소머라제(예를 들면, 이. 콜라이 BL21 yihS, 아그로박테리움 라디오박터(Agrobacterium radiobacter) M-1 manI), 만노스를 만노스-6-포스페이트로 활성화시킬 수 있는 만노키나제(예를 들면, 프레보텔라 브리안티(Prevotella bryantii) B14 manK, 아르트로박터 종(Arthrobacter sp.) 균주 KM manK), 게다가 푸코스를 GDP-푸코스로부터 락토스 및/또는 2'-프코실락토스 및/또는 3-푸코실락토스로 전달하여 2'3-디푸코실-락토스를 생성할 수 있는 α-1,2- 및/또는 α-1,3-푸코실-트랜스퍼라제 활성을 나타내는 적어도 하나의 이종성 푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 적어도 하나의 유전자의 발현/과발현에 의해 추가로 유전자 조작된다. 이들 추가의 유전자 변형은 주요 탄소원 및 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스) 상에서 조작된 생산 균주의 배양을 가능하게 하고, 균주의 대사를 방해하는 것을 방지하지만, 2'3-디푸코실락토스 생산을 위한 전구체 공급(만노스/만노스-6-포스페이트)를 증가시킨다. 추가의 실시형태에서, GDP-Fuc의 합성을 촉진하기 위해, 이. 콜라이 유전자 manC, manB, gmd 및 wcaG 중의 적어도 하나가 과발현된다.
만노스 이소머라제(ManI) 활성 또는 만노키나제(ManK) 활성을 나타내는 적합한 단백질의 비제한적 예는 문헌[참조: Hirose et al., Biosci Biotechnol Biochem. 2001 Mar;65(3):658-61.; Hirose et al., Biotechnol Lett. 2003 Feb;25(4):349-52.; Patel et al., Appl Environ Microbiol. 2011 May;77(10):3343- 50.; Hu et al., Int J Biol Macromol. 2016 Aug;89:328-35.; Huang et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2018 Mar;102(5):2051-2062.; Mukai et al., Appl Environ Microbiol. 2003 Jul;69(7):3849-57.; Fields and Russel, Microbiology. 2001 Apr; 147(Pt 4): 1035-43.; Kroschewski et al., Mol Biochem Parasitol. 2000 Jan 5; 105(1):71-80]에서 발견할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 유전자형 nagAB-, fuclK-, wcaJ-를 갖는 이. 콜라이 균주는, 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스 및 가수분해된 락토스의 혼합물)을 주요 탄소원 및 에너지원으로 사용하는 전체 발효에 의해 H 항원 유형 I(HA-T I)의 효율적 생산자로서 대사적으로 조작된다. 따라서, 생산 균주는, 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 의존성 메카니즘을 통해 글루코스의 수입을 저하 및/또는 감소시키면서, 조작된 세포로 글루코스 및/또는 갈락토스의 이동을 가능하게 하고 이들 단당류를 각각 포스포릴화된 형태로 활성화시킬 수 있는 비-PEP-PTS 수송체 및 단당류 키나제를 코딩하는 적어도 하나의 유전자를 발현/과발현시킴으로써 유전자 조작된다. 추가로, 아세테이트를 아세틸-CoA로부터 글루코사민-6-포스페이트로 전달하여 N-아세틸글루코사민-6-포스페이트를 생성하는 글루코사민-6-포스페이트 아세틸트랜스퍼라제, N-아세틸글루코사민-6-포스페이트를 탈포스포릴화하여 N-아세틸글루코사민을 생성하는 HAD-유사 당 포스파타제, 갈락토스를 UDP-갈락토스로부터 N-아세틸글루코사민으로 전달하여 락토-N-비오스를 생성할 수 있는 이종성 β-1,3-갈락토실-트랜스퍼라제, 및 푸코스를 GDP-푸코스로부터 락토-N-비오스로 전달하여 H 항원 유형 I을 생성하는 α-1,2-푸코실트랜스퍼라제를 코딩하는 적어도 하나의 유전자가 발현/과발현된다. 바람직한 실시형태에서, 이러한 생산 균주는 포스포프럭토키나제 유전자 pfkA 및/또는 pfkB의 발현을 저하 및/또는 감소시킴으로써 추가로 유전자 조작된다. 이들 유전자 변형은 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합 단당류 공급원료(예를 들면, 가수분해된 수크로스 및 가수분해된 락토스의 혼합물) 상에서 조작된 생산 균주의 배양을 가능하게 하고, 균주의 대사를 방해하는 것을 방지하지만, H 항원 유형 I 생산을 위한 전구체 공급(N-아세틸글루코사민, 프럭토스-6-포스페이트 및 갈락토스-1-포스페이트)을 증가시킨다. 추가의 실시형태에서, GlcNAc 및/또는 UDP-Gal 및/또는 GDP-FUc의 합성을 촉진하기 위해 이. 콜라이 유전자 glmS, galT, galE, manC, manB, gmd 및 wcaG 중의 적어도 하나가 과발현된다.
도 1을 참조하면, 예시적 천연 미생물 세포가 개략적으로 제시되어 있다. 상기 미생물 세포는 글루코스 및 프럭토스로 이루어진 혼합 공급원료를 소비할 수 있고, 글루코스-6-포스페이트 및 프럭토스-6-포스페이트의 미소 세포내 풀을 유도한다. 미생물 세포는 세포로의 글루코스 및 프럭토스(PTS) 수입을 위한 포스포페놀-피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현한다. 반응 생성물은 주로 해당계로 들어간다.
도 2는, 글루코스 및 프럭토스로 이루어진 혼합 공급원료 상에서 배양하는 경우, 글루코스-6-포스페이트를 고도로 공급할 수 있는 본 발명의 예시적 미생물 세포를 개략적으로 나타낸다. 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 Pgi 및 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 Zwf 유전자의 발현은 pgi 및/또는 zwf 유전자(들)의 결실, 기능적 불활성화 또는 사일런싱(silencing)에 의해 저하 또는 감소되기 때문에, 세포로의 글루코스 수입에 의해 생성된 임의의 글루코스-6-포스페이트는 UDP-Glc 및/또는 UDP-Gal을 생성하기 위한 미생물 세포에 의해 이용될 수 있다. 미생물 세포의 변이체(도 3)에서, 프럭토스에 대한 세포의 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 시스템(들)은, 예를 들면, fruA 유전자의 결실에 의해 무력화(disabling)된다. 대신에, 프럭토스는 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 비의존성(비-PEP-PTS) 수송체를 통해 세포에 도입되고, 프럭토스 키나제(예를 들면, 이. 콜라이 W CscK)에 의해 프럭토스-6-포스페이트로 활성화된다. 미생물 세포의 변이체(도 4)에서, 글루코스에 대한 세포의 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 시스템(들)은, 예를 들면, ptsG 유전자의 결실에 의해 무력화된다. 대신에, 글루코스는 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 비의존성(비-PEP-PTS) 수송체를 통해 세포에 도입되고, 글루코스 키나제(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 Glk)에 의해 활성화되어 글루코스-6-포스페이트로 활성화된다.
도 5는, 글루코스 및 프럭토스로 이루어진 혼합 공급원료 상에서 배양되는 경우, 글루코스-6-포스페이트 및 프럭토스-6-포스페이트를 고도로 공급할 수 있는 본 발명의 예시적 미생물 세포를 개략적으로 나타낸다. 프럭토스에 대한 세포의 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 시스템(들)은, 예를 들면, fruA 유전자의 결실에 의해 무력화된다. 대신에, 프럭토스는 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 비의존성(비-PEP-PTS) 수송체를 통해 세포에 도입되고, 프럭토스 키나제(예를 들면, 이. 콜라이 W CscK)에 의해 프럭토스-6-포스페이트로 활성화된다. 미생물 세포의 변이체(도 6)에서, 포스포프럭토키나제(들) Pfk 및/또는 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 Zwf의 발현은 pfkA 및/또는 pfkB 및/또는 zwf 유전자(들)의 결실, 기능적 불활성화 또는 사일런싱에 의해 저하 또는 감소되어, 글루코스-6-포스페이트 및 프럭토스-6-포스페이트의 이용가능성의 증가를 제공하고, 이는 UDP-Gal 및/또는 GDP-Fuc 및/또는 UDP-GlcNAc 및/또는 CMP-Neu5Ac를 생성하기 위해 미생물 세포에 의해 이용될 수 있다. 미생물 세포의 변이체(도 7)에서, 세포는, 세포로의 글루코스 및 프럭토스(PTS) 수입을 위한 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현한다. 포스포프럭토키나제(들) Pfk 및/또는 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 Zwf의 발현은 pfkA 및/또는 pfkB 및/또는 zwf 유전자(들)의 결실, 기능적 불활성화 또는 사일런싱에 의해 저하 또는 감소되어, 글루코스-6-포스페이트 및 프럭토스-6-포스페이트의 이용가능성의 증가를 제공한다.
도 8은, 글루코스 및 프럭토스로 이루어진 혼합 공급원료 상에서 배양되는 경우, 글루코스-6-포스페이트 및 프럭토스-6-포스페이트를 고도로 공급할 수 있는 본 발명의 예시적 미생물 세포를 개략적으로 나타낸다. 세포는, 세포로의 글루코스 및 프럭토스(PTS) 수입을 위한 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 시스템을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현한다. 포스포프럭토키나제(들) Pfk 및/또는 글루코스-6-포스페이트 이소머라제 Pgi 및/또는 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 Zwf의 발현은 pkfA 및/또는 pfkB 및/또는 pgi 및/또는 zwf 유전자(들)의 결실, 기능적 불활성화 또는 사일런싱에 의해 저하 또는 감소되었다. 프럭토스-1,6-비스포스파타제(예를 들면, glpX, fbp)의 과발현과 함께, 글루코스-6-포스페이트 및 프럭토스-6-포스페이트의 이용가능성의 증가가 생성되고, UDP-Gal 및/또는 GDP-Fuc 및/또는 UDP-GlcNAc 및/또는 CMP-Neu5Ac를 생성하기 위해 미생물 세포에 의해 이용될 수 있다.
도 9는, 글루코스 및 프럭토스로 이루어진 혼합 공급원료 상에서 배양되는 경우, 글루코스-6-포스페이트 및 프럭토스-6-포스페이트 및 포스포에놀피루베이트의 높은 이용가능성을 생성할 수 있는 본 발명의 예시적 미생물 세포를 개략적으로 나타낸다. 글루코스 및 프럭토스에 대한 세포의 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 시스템은, 예를 들면, 각각 ptsG 및 fruA 유전자의 결실에 의해 무력화된다. 대신에, 프럭토스 및 글루코스는 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 비의존성(비-PEP-PTS) 수송체를 통해 세포에 도입되어, 프럭토스 키나제(예를 들면, 이. 콜라이 W CscK) 및 글루코스 키나제(예를 들면, 이. 콜라이 K-12 Glk)에 의해 각각 프럭토스-6-포스페이트 및 글루코스-6-포스페이트로 활성화된다. 더욱이, 포스포-에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 시스템에 의한 PEP 소비는 회피된다. pfkA 및/또는 pfkB 및/또는 zwf 유전자(들)에 의해 실현되는, 포스포프럭토키나제(들) Pfk 및/또는 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 Zwf의 발현의 저하 및/또는 감소와 함께, 글루코스-6-포스페이트 및 프럭토스-6-포스페이트 및 포스포-에놀피루베이트의 이용가능성의 증가가 달성된다. 이는, UDP-Gal 및/또는 GDP-Fuc 및/또는 UDP-GlcNAc 및/또는 CMP-Neu5Ac를 생성하기 위해 미생물 세포에 의해 이용될 수 있다.
도 10은, 글루코스 및 프럭토스로 이루어진 혼합 공급원료 상에서 배양되는 경우, 유리 글루코스 및 글루코스-6-포스페이트 및 프럭토스-6-포스페이트의 이용가능성의 증가를 생성할 수 있는 본 발명의 또 다른 예시적 미생물 세포를 개략적으로 나타낸다. 글루코스 및 프럭토스에 대한 세포의 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 시스템은, 예를 들면, 각각 ptsG 및 fruA 유전자의 결실에 의해 무력화된다. 대신에, 프럭토스 및 글루코스는 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 비의존성(비-PEP-PTS) 수송체를 통해 세포에 도입된다. glk 유전자의 결실과 함께, 미생물 세포는 유리 글루코스 단량체가 세포 내에서 이용가능하도록 유전자 조작되었다. 대신에, 프럭토스는 프럭토스 키나제(예를 들면, 이. 콜라이 W CscK)에 의해 프럭토스-6-포스페이트로 활성화된다. 포스포프럭토키나제(들) Pfk 및/또는 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제 Zwf의 발현은 pfkA 및/또는 pfkB 및/또는 zwf 유전자(들)의 결실, 기능적 불활성화 또는 사일런싱에 의해 저하 또는 감소된다. 전체로서, 이는 유리 글루코스 및 글루코스-6-포스페이트 및 프럭토스-6-포스페이트의 세포내 공급의 개선을 제공한다. 글루코스는 다양한 글리코실화 반응의 기질로서 이용가능하게 되지만, 글루코스-6-포스페이트 및 프럭토스-6-포스페이트는 UDP-Gal 및/또는 GDP-Fuc 및/또는 UDP-GlcNAc 및/또는 CMP-Neu5Ac를 생성하기 위해 미생물 세포에 의해 이용될 수 있다. 추가로, 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 시스템에 의한 PEP 소비는 회피된다.
도 11은, 글루코스 및 프럭토스로 이루어진 혼합 공급원료 상에서 배양되는 경우, 유리 만노스 및/또는 만노스-6-포스페이트의 세포내 이용가능성의 증가를 달성할 수 있는 본 발명의 또 다른 예시적 미생물 세포를 개략적으로 나타낸다. 프럭토스에 대한 세포의 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 시스템은, 예를 들면, fruA 유전자 및/또는 manXYZ 유전자의 결실에 의해 무력화된다. 대신에, 프럭토스는 당 퍼미아제 및/또는 채널을 통해 세포에 도입된다. 적합한 만노스 이소머라제(ManI) 및 만노키나제(ManK)의 발현/과발현 뿐만 아니라 프럭토스 키나제 활성(예를 들면, mak) 및/또는 만노스-6-포스페이트 이소머라제 활성(예를 들면, manA)의 나타내는 유전자의 결실과 함께, 미생물 세포는 만노스-6-포스페이트가 세포 내에서 이용가능하도록 유전자 조작되었다. 이는 GDP-Man 및/또는 GDP-Fuc를 생성하기 위해 미생물 세포에 의해 이용될 수 있다.
도 12는, 글루코스 및 프럭토스 및 갈락토스로 이루어진 혼합 공급원료 상에서 배양되는 경우, 유리 프럭토스-6-포스페이트 및/또는 갈락토스-1-포스페이트의 높은 세포내 이용가능성을 생성할 수 있는 본 발명의 또 다른 예시적 미생물 세포를 개략적으로 나타낸다. 글루코스에 대한 세포의 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 시스템은, 예를 들면, ptsG 유전자의 결실에 의해 무력화되었다. 대신에, 글루코스는 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 비의존성(비-PEP-PTS) 수송체를 통해 세포에 도입된다. 포스포프럭토키나제(들) Pfk의 발현은 pfkA 및/또는 pfkB 유전자(들)의 결실, 기능적 불활성화 또는 사일런싱에 의해 저하 또는 감소되었다. 각각 갈락토스-1-포스페이트로의 이의 활성화 뿐만 아니라 조작된 세포 내로 갈락토스 전달을 가능하게 하는, 단당류 키나제 뿐만 아니라 적합한 비-PEP-PTS 수송체의 발현/과발현과 함께, 미생물 세포는 프럭토스-6-포스페이트 및 갈락토스-1-포스페이트가 세포에서 이용가능하게 되도록 유전자 조작되었다. 이들은 GlcNAc 및/또는 GDP-Fuc 및/또는 UDP-Gal 및/또는 CMP-Neu5Ac를 생성하기 위해 미생물 세포에 의해 이용될 수 있다.
제4 국면에 따르면, 약제학적 및/또는 영양적 조성물에서 목적 탄수화물의 용도가 제공되고, 여기서 목적 탄수화물은 바람직하게는 본 발명에 따른 방법 또는 유전자 조작된 숙주 세포에 의해 생산된다.
실시예
실시예 1 - 혼합 단당류 공급원료의 제조
500g의 수크로스를 물에 용해시킴으로써 50%(w/v)의 수크로스 용액을 제조했다. 용액의 최종 용적은 1리터였다. 30℃ 내지 35℃의 온도에서, 96%(v/v) 황산을 사용하여 pH를 조정했다. 그 후, 용액을 수직 오토클레이브(Systec VX-65, Linden, Germany)에서 121℃에서 45분 동안 멸균시켰다. 열 멸균의 전후에 샘플을 채취하고, 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 분석 전에 동결 보존했다. HPLC는 RID-10A 굴절 지수 검출기(Shimadzu, Germany) 및 시마주 HPLC 시스템에 접속된 Waters XBridge 아미드 컬럼 3.5 pm(250×4.6mm)(Eschborn, Germany)를 사용하여 실시했다. 등용매 용출은, 30% 용매 A(재증류수 중의 50%(v/v) 아세토니트릴, 0.1%(v/v) NH4OH) 및 70% 용매 B(재증류수 중의 80%(v/v) 아세토니트, 0.1%(v/v) NH4OH)을 사용하여 35℃에서 1.4 mL min-1의 유량으로 실시했다. 샘플은 이온 교환 매트릭스(Atrata ABW, Phenomenex)에서 고상 추출에 의해 정화했다. 10 마이크로리터의 샘플(1:5의 희석)을 컬럼에 적용했다. 최후로, 검출된 당의 상대량이 결정되었다. 표 2에 제시된 바와 같이, 단당류 글루코스 및 프럭토스로의 수크로스 전환은 열 처리 전에 용액의 pH 값의 저하와 함께 증가했다. 황산으로 산성화를 수행한 경우, pH 값 ≤3.50에서 완전한 수크로스 절단이 관찰되었다.
| pH | 상대 조성[%] | ||
| 수크로스 | 글루코스 | 프럭토스 | |
| 열 멸균 전 | |||
| 3.50 ~ 7.10 | 100 | - | - |
| 열 멸균 후 | |||
| 7.10 (산성화되지 않음) |
100 | - | - |
| pH 5.50 | 87.55 | 6.30 | 6.15 |
| pH 5.05 | 68.25 | 16.62 | 15.13 |
| pH 3.87 | 13.90 | 45.05 | 41.06 |
| pH 3.50 | - | 51.68 | 48.32 |
pH 조정은 96%(v/v) 황산을 사용하여 실시했다. 제시된 것은 HPLC에 의해 검출되는 당의 퍼센트 양(곡선하 면적; AUC)이다.
실시예 2 - 다양한 유전자 결실 균주의 공급원료-의존성 성장
이. 콜라이 BL21(DE3) 균주(야생형) 및 변이체 균주 이. 콜라이 pfkA-(△pfkA), 이. 콜라이 pfkB-(△pfkB), 이. 콜라이 pfkA- pfkB-(△pfkA △pfkA)의 성장 거동을 비교했다. 게놈 결실은 문헌[참조: Datsenko and Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)]의 방법에 따라 실행했다. 모든 균주는 30℃에서 100mL-진탕 플라스크에서 10mL 무기 염 배지로 배양되고, 이는 7g·L-1 NH4K2HPO4, 7g·L-1 K2HPO4, 2g·L-1 KOH, 0.3g·L-1 시트르산, 2g·L-1 MgSO4×7·H2O 및 0.015g·L-1 CaCl2×6·H2O를 함유하고, 1mL·L-1 미량 원소 용액(54.4g·L-1 암모늄 철 시트레이트, 9.8g·L-1 MnCl2×4·H2O, 1.6g·L-1 CoCl2×6·H2O, 1g·L-1 CuCl2×2·H2O, 1.9g·L-1 H3BO3, 9g·L-1 ZnSO4×7·H2O, 1.1g·L-1 Na2MoO4×2·H2O, 1.5g·L-1 Na2SeO3, 1.5g·L-1 NiSO4×6·H2O)가 보충되고 탄소원으로서 2%(m/v) 글루코스(A) 또는 1%(w/v) 글루코스/1%(w/v) 프럭토스(B)를 함유한다. 배양물에 OD 0.1로 접종하고, OD600 측정에 의해 26시간에 걸쳐 성장 발달을 모니터링했다. 도 2에 제시된 바와 같이, 이. 콜라이 pfkA-pfkB-는, 유일한 탄소원 및 에너지원으로서 글루코스가 제공되는 경우, 거의 성장을 나타내지 않은 반면, 이의 성장은, 혼합 단당류 공급원료가 이용가능한 경우, 야생형 균주 및 단일 결실 돌연변이체와 구별할 수 없었다.
실시예 3: 조작된 이. 콜라이 균주에 의한 2'-푸코실락토스의 생산
유전자형 lacY+, lacZ-, fuclK-, wcaJ-, pfkA-를 나타내는 이. 콜라이 BL21(DE3) 균주는, GDP-푸코스(ManB, ManC, Gmd, WcaG), 이. 콜라이:O126으로부터의 2'-푸코실트랜스퍼라제 유전자 wbgL, 예르시니아 베르코비에리(Yersinia bercovieri) ATCC 43970으로부터의 당 유출 수송체 및, 유일한 탄소원으로서 수크로스 상에서 균주를 성장시킬 수 있는, 전사 억제인자(각각 유전자 cscB, cscK, cscA 및 cscR) 뿐만 아니라 수크로스 퍼미아제, 프럭토키나제, 수크로스 하이드롤라제를 위한 유전자를 포함하는 이. 콜라이 W의 csc-유전자 클러스터(수탁 번호 CP002185.1)의 드 노보 합성(de novo synthesis)을 위한 효소를 과발현시킴으로써 추가로 유전자 조작했다. 문헌[참조: Datsenko and Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000)]의 방법에 따라 게놈 결실을 실행했다. 이종성 유전자의 게놈 통합은 전좌에 의해 실행했다. EZ-Tn5TM 트랜스포사제(Epicentre, USA)를 사용하여 선형 DNA-단편을 통합하거나, 마리너 트랜스포사제 HimarI(Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, USA 96: 11428-11433)의 고활성 C9-돌연변이체를 전좌에 사용했다. 유전자는, 이. 콜라이에서 발현을 위해 코돈-최적화했고, GenScript의 협력에 의해 합성적으로 제조했다. 수득된 균주는 30℃에서 100mL-진탕 플라스크에서 20ml 미네랄 염 배지로 배양하고, 이는 3 g/L KH2PO4, 12 g/L K2HPO4, 5 g/L (NH4)2SO4, 0.3 g/L 시트르산, 2 g/L MgSO4 × 7H2O, 0.1 g/L NaCl 및 0.015 g/L CaCl2 × 6H2O를 1 mL/L 미량 원소 용액(54.4 g/L 암모늄 철 시트레이트, 9.8 g/L MnCl2 × 4H2O, 1.6 g/L C0Cl2 × 6H2O, 1 g/L CuCl2 × 2H2O, 1.9 g/L H3BO3, 9 g/L ZnSO4 × 7H2O, 1.1 g/L Na2MoO4 2H2O, 1.5 g/L Na2SeO3, 1.5 g/L NiSO4 × 6H2O)와 함께 함유하고, 2%(v/v) 글리세롤, 2%(m/v) 멸균-여과된 수크로스 또는 2% 수크로스 가수분해물을 유일한 탄소원으로서 함유한다. 또한, 15mM 락토스를 첨가하고, 2'-푸코실락토스 생성을 위한 수용자 기질로서 수득했다. 배양물을 OD 0.1까지 접종하고, 26시간 후에 배양을 중지했다. 배양 브로쓰 중의 2'-FL을 정량화하기 위해, 시차 굴절률 검출기(RID-10A)(Shimadzu, Germany) 및 HPLC 시스템(Shimadzu, Germany)에 접속된 Waters XBridge 아미드 컬럼 3.5mm(250×4.6mm)(Eschborn, Germany)를 사용하여 HPLC 분석을 수행했다. 용출은, 35℃, 유량 1.4 ml·min-1에서 용출액으로서 30% A:ddH2O 중의 50%(v/v) ACN, 0.1%(v/v) NH4OH 및 70% B: ddH2O 중의 80%(v/v) ACN, 0.1%(v/v)를 사용하여 등용매로 수행했다. 배양 상청액을 멸균 여과하고(세공 크기 0.22㎛), 이온 교환 매트릭스(Strata ABW, Phenomenex)에서 고상 추출에 의해 정화했다. 10 pi의 샘플을 컬럼에 적용하고, 2'-푸코실 I 락토스 농도를 표준 곡선에 따라 계산했다. 글리세롤 상에서 성장 동안 조작된 균주의 생산성은 100%로 설정했다. 표 3에 제시된 바와 같이, 2'-FL의 생성은 탄소원 및 에너지원으로서 수크로스 가수분해물이 제공될 때에 최고였다.
| 글리세롤 | 수크로스 | 수크로스 가수분해물 | |
| 상대적 2'-FL 생성 | 100% | 199% | 482% |
글리세롤의 생산성은 100%로 설정했다.
실시예 4 - 혼합 단당류 공급원료 상에서 성장 동안 조작된 이. 콜라이 균주에 의한 2'-푸코실 락토스의 전체 발효
유전자형 pfkA-, lacZ-, fuclK-, wcaJ-, glk-, gcd-, ptsG-을 나타내는 이. 콜라이 BL21(CD3) 균주는, GDP-푸코스(ManB, ManC, Gmd, WcaG), 이. 콜라이:O126 유래의 2'-푸코실트랜스퍼라제 유전자, 예르시니아 베르코비에리 ATCC 43970 유래의 당 유출 수송체 유전자 yberc0001_9420, 지모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis) 유래의 글루코스 촉진 유전자 gif, 파스테우렐라 멀토시다(Pasteurella multocida)(Genbank: AEC04686) 유래의 β-1,4-갈락토실트랜스퍼라제 유전자 galTpm1141, 및 UDP-글루코스 4-에피머라제 및 포스포글루코뮤타제를 각각 코딩하는 이. 콜라이 유전자 galE 및 pgm의 드 노보 합성을 위해 효소를 과발현시킴으로써 추가로 유전자 조작했다. 문헌[참조: Datsenko and Wanner (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645 (2000))]의 방법에 따라 게놈 결실을 수행했다. 이종성 유전자의 게놈 통합은 전좌에 의해 실행했다. EZ-Tn5TM 트랜스포사제(Epicentre, USA)를 사용하여 선형 DNA-단편을 통합하거나, 마리너 트랜스포사제 Himari의 고활성 C9 돌연변이체(Proc. Natl. Acad. Sci. 1999, USA 96: 11428-11433)을 전좌에 사용했다. 유전자는, 이. 콜라이에서의 발현을 위해 최적화되었고, GenScript 협력에 의해 합성적으로 제조했다.
수득된 이. 콜라이 균주는 100mL의 미네랄 염 배지로 개시하여 3L 발효조(New Brunswick, Edison, USA)에서 30℃로 배양했고, 상기 배지는 7 g·L-1 NH4H2PO4, 7 g·L-1 K2HPO4, 2 g·L-1 KOH, 0.3 g·L-1 시트르산, 2 g·L-1 MgSO4 × 7·H2O 및 0.015 g·L-1 CaCl2 × 6·H2O를 함유하고, 1 mL·L-1 미량 원소 용액(54.4 g·L-1 암모늄 철 시트레이트, 9.8 g·L-1 MnCl2 × 4·H2O, 1.6 g·L-1 CoCl2 × 6 H2O, 1 g·L-1 CuCl2 × 2 H2O, 1.9 g·L-1 H3BO3, 9 g·L-1 ZnSO4 × 7·H2O, 1.1 g·L-1 Na2MoO4 × 2 H2O, 1.5 g·L-1 Na2SeO3, 1.5 g·L-1 NiSO4 × 6 ·H2O)가 보충되고, 탄소원으로서 2% (m/v) 가수분해된 수크로스를 함유한다. 배양은 동일한 배지에서 성장시킨 사전-배양으로부터 2.5%(v/v) 접종물의 첨가로 개시했다. 배치 상의 종료는 용존 산소 수준의 상승에 의해 특성화했다. 2 g·L-1 MgSO4 ×7·H2O, 0.015 g·L-1 CaCl2 ×6·H2O 및 1 mL·L-1 미량 원소 용액이 보충된 완전 가수분해된 수크로스로 이루어진 탄소 공급물은 배치 상을 종료한 직후에 적용했다. 개시 용적으로 지칭되는 12.0 내지 15.0 mL·L-1·h-1의 공급 속도를 적용했다. 통기는 3L·min-1로 유지했다. 용존 산소는 교반 속도를 조절함으로써 20 내지 30%의 포화 상태로 유지했다. 25% 암모늄 용액을 첨가함으로써 pH를 6.7로 유지했다. 배양은 86시간 동안 지속하고, 배양 상청액에서 상당한 양의 2'-FL이 수득되었다.
SEQUENCE LISTING
<110> Jennewein Biotechnologie GmbH
<120> Fermentative production of carbohydrates by microbial cells
utilizing a mixed feedstock
<130> P 1901 WO
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1395
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 1
atgcctgacg ctaaaaaaca ggggcggtca aacaaggcaa tgacgttttt cgtctgcttc 60
cttgccgctc tggcgggatt actctttggc ctggatatcg gtgtaattgc tggcgcactg 120
ccgtttattg cagatgaatt ccagattact tcgcacacgc aagaatgggt cgtaagctcc 180
atgatgttcg gtgcggcagt cggtgcggtg ggcagcggct ggctctcctt taaactcggg 240
cgcaaaaaga gcctgatgat cggcgcaatt ttgtttgttg ccggttcgct gttctctgcg 300
gctgcgccaa acgttgaagt actgattctt tcccgcgttc tactggggct ggcggtgggt 360
gtggcctctt ataccgcacc gctgtacctc tctgaaattg cgccggaaaa aattcgtggc 420
agtatgatct cgatgtatca gttgatgatc actatcggga tcctcggtgc ttatctttct 480
gataccgcct tcagctacac cggtgcatgg cgctggatgc tgggtgtgat tatcatcccg 540
gcaattttgc tgctgattgg tgtcttcttc ctgccagaca gcccacgttg gtttgccgcc 600
aaacgccgtt ttgttgatgc cgaacgcgtg ctgctacgcc tgcgtgacac cagcgcggaa 660
gcgaaacgcg aactggatga aatccgtgaa agtttgcagg ttaaacagag tggctgggcg 720
ctgtttaaag agaacagcaa cttccgccgc gcggtgttcc ttggcgtact gttgcaggta 780
atgcagcaat tcaccgggat gaacgtcatc atgtattacg cgccgaaaat cttcgaactg 840
gcgggttata ccaacactac cgagcaaatg tgggggaccg tgattgtcgg cctgaccaac 900
gtacttgcca cctttatcgc aatcggcctt gttgaccgct ggggacgtaa accaacgcta 960
acgctgggct tcctggtgat ggctgctggc atgggcgtac tcggtacaat gatgcatatc 1020
ggtattcact ctccgtcggc gcagtatttc gccatcgcca tgctgctgat gtttattgtc 1080
ggttttgcca tgagtgccgg tccgctgatt tgggtactgt gctccgaaat tcagccgctg 1140
aaaggccgcg attttggcat cacctgctcc actgccacca actggattgc caacatgatc 1200
gttggcgcaa cgttcctgac catgctcaac acgctgggta acgccaacac cttctgggtg 1260
tatgcggctc tgaacgtact gtttatcctg ctgacattgt ggctggtacc ggaaaccaaa 1320
cacgtttcgc tggaacatat tgaacgtaat ctgatgaaag gtcgtaaact gcgcgaaata 1380
ggcgctcacg attaa 1395
<210> 2
<211> 1422
<212> DNA
<213> Zymomonas mobilis
<400> 2
atgagttctg aaagtagtca gggtctagtc acgcgactag ccctaatcgc tgctataggc 60
ggcttgcttt tcggttacga ttcagcggtt atcgctgcaa tcggtacacc ggttgatatc 120
cattttattg cccctcgtca cctgtctgct acggctgcgg cttccctttc tgggatggtc 180
gttgttgctg ttttggtcgg ttgtgttacc ggttctttgc tgtctggctg gattggtatt 240
cgcttcggtc gtcgcggcgg attgttgatg agttccattt gtttcgtcgc cgccggtttt 300
ggtgctgcgt taaccgaaaa attatttgga accggtggtt cggctttaca aattttttgc 360
tttttccggt ttcttgccgg tttaggtatc ggtgtcgttt caaccttgac cccaacctat 420
attgctgaaa ttcgtccgcc agacaaacgt ggtcagatgg tttctggtca gcagatggcc 480
attgtgacgg gtgctttaac cggttatatc tttacctggt tactggctca tttcggttct 540
atcgattggg ttaatgccag tggttggtgc tggtctccgg cttcagaagg cctgatcggt 600
attgccttct tattgctgct gttaaccgca ccggatacgc cgcattggtt ggtgatgaag 660
ggacgtcatt ccgaggctag caaaatcctt gctcgtctgg aaccgcaagc cgatcctaat 720
ctgacgattc aaaagattaa agctggcttt gataaagcca tggacaaaag cagcgcaggt 780
ttgtttgctt ttggtatcac cgttgttttt gccggtgtat ccgttgctgc cttccagcag 840
ttagtcggta ttaacgccgt gctgtattat gcaccgcaga tgttccagaa tttaggtttt 900
ggagctgata cggcattatt gcagaccatc tctatcggtg ttgtgaactt catcttcacc 960
atgattgctt cccgtgttgt tgaccgcttc ggccgtaaac ctctgcttat ttggggtgct 1020
ctcggtatgg ctgcaatgat ggctgtttta ggctgctgtt tctggttcaa agtcggtggt 1080
gttttgcctt tggcttctgt gcttctttat attgcagtct ttggtatgtc atggggccct 1140
gtctgctggg ttgttctgtc agaaatgttc ccgagttcca tcaagggcgc agctatgcct 1200
atcgctgtta ccggacaatg gttagctaat atcttggtta acttcctgtt taaggttgcc 1260
gatggttctc cagcattgaa tcagactttc aaccacggtt tctcctatct cgttttcgca 1320
gcattaagta tcttaggtgg cttgattgtt gctcgcttcg tgccggaaac caaaggtcgg 1380
agcctggatg aaatcgagga gatgtggcgc tcccagaagt ag 1422
<210> 3
<211> 1248
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 3
atggcactga atattccatt cagaaatgcg tactatcgtt ttgcatccag ttactcattt 60
ctctttttta tttcctggtc gctgtggtgg tcgttatacg ctatttggct gaaaggacat 120
ctagggttga cagggacgga attaggtaca ctttattcgg tcaaccagtt taccagcatt 180
ctatttatga tgttctacgg catcgttcag gataaactcg gtctgaagaa accgctcatc 240
tggtgtatga gtttcatcct ggtcttgacc ggaccgttta tgatttacgt ttatgaaccg 300
ttactgcaaa gcaatttttc tgtaggtcta attctggggg cgctattttt tggcttgggg 360
tatctggcgg gatgcggttt gcttgatagc ttcaccgaaa aaatggcgcg aaattttcat 420
ttcgaatatg gaacagcgcg cgcctgggga tcttttggct atgctattgg cgcgttcttt 480
gccggcatat tttttagtat cagtccccat atcaacttct ggttggtctc gctatttggc 540
gctgtattta tgatgatcaa catgcgtttt aaagataagg atcaccagtg cgtagcggca 600
gatgcgggag gggtaaaaaa agaggatttt atcgcagttt tcaaggatcg aaacttctgg 660
gttttcgtca tatttattgt ggggacgtgg tctttctata acatttttga tcaacaactt 720
tttcctgtct tttattcagg tttattcgaa tcacacgatg taggaacgcg cctgtatggt 780
tatctcaact cattccaggt ggtactcgaa gcgctgtgca tggcgattat tcctttcttt 840
gtgaatcggg tagggccaaa aaatgcatta cttatcggag ttgtgattat ggcgttgcgt 900
atcctttcct gcgcgctgtt cgttaacccc tggattattt cattagtgaa gttgttacat 960
gccattgagg ttccactttg tgtcatatcc gtcttcaaat acagcgtggc aaactttgat 1020
aagcgcctgt cgtcgacgat ctttctgatt ggttttcaaa ttgccagttc gcttgggatt 1080
gtgctgcttt caacgccgac tgggatactc tttgaccacg caggctacca gacagttttc 1140
ttcgcaattt cgggtattgt ctgcctgatg ttgctatttg gcattttctt cttgagtaaa 1200
aaacgcgagc aaatagttat ggaaacgcct gtaccttcag caatatag 1248
<210> 4
<211> 735
<212> DNA
<213> Leuconostoc pseudomesenteroides
<400> 4
atggcacaaa acgcgcaaca tcataatccg cgaagcattt caatgagcaa atcacttatg 60
ttttttgcca tctcattgat tttaaatgcg atgggaaatg ttttgacgct cgtcacagct 120
tcacatataa aacccgcttt tttgggatca gcttattgga ctgctgcaga ggctaatcta 180
ggtcaagctt tattaggaaa taattcactt gtcttgtttt gggcattttt agttcttggc 240
atgcttattt cattcctgaa tgcgttatta atgaaaaagt tagattggca tcgtatcatt 300
ggtaatttct tgtttatgtt accattttca atttttattc aatggttttc aaatattttc 360
aatcaaatta tgccaaatgc taattcagtg gcagcaactg tgttatatac agtaattaat 420
tttattggtg ttggcttgat cgccgttgct atttcgattt atcaacgtgt gaatttagtg 480
ttacaccctg ccgatgattt gatgcaaatt ttacgtttca aatattttca cgggtcggct 540
ttcaaggcta tgtgggcgtc ctatattccg ccaacgattt ttgcaattat tgcctttgtg 600
atcactttcc ctaatttgta taatttcggg ttaggaatta tttttgcatt cttattccag 660
ggtggcatca caggaatcgc ggacaagtac gtctttaaga atttaaagca tcaggcaata 720
gatgttggta attaa 735
<210> 5
<211> 1254
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 5
atgtactatt taaaaaacac aaacttttgg atgttcggtt tattcttttt cttttacttt 60
tttatcatgg gagcctactt cccgtttttc ccgatttggc tacatgacat caaccatatc 120
agcaaaagtg atacgggtat tatttttgcc gctatttctc tgttctcgct attattccaa 180
ccgctgtttg gtctgctttc tgacaaactc gggctgcgca aatacctgct gtggattatt 240
accggcatgt tagtgatgtt tgcgccgttc tttattttta tcttcgggcc actgttacaa 300
tacaacattt tagtaggatc gattgttggt ggtatttatc taggcttttg ttttaacgcc 360
ggtgcgccag cagtagaggc atttattgag aaagtcagcc gtcgcagtaa tttcgaattt 420
ggtcgcgcgc ggatgtttgg ctgtgttggc tgggcgctgt gtgcctcgat tgtcggcatc 480
atgttcacca tcaataatca gtttgttttc tggctgggct ctggctgtgc actcatcctc 540
gccgttttac tctttttcgc caaaacggat gcgccctctt ctgccacggt tgccaatgcg 600
gtaggtgcca accattcggc atttagcctt aagctggcac tggaactgtt cagacagcca 660
aaactgtggt ttttgtcact gtatgttatt ggcgtttcct gcacctacga tgtttttgac 720
caacagtttg ctaatttctt tacttcgttc tttgctaccg gtgaacaggg tacgcgggta 780
tttggctacg taacgacaat gggcgaatta cttaacgcct cgattatgtt ctttgcgcca 840
ctgatcatta atcgcatcgg tgggaaaaac gccctgctgc tggctggcac tattatgtct 900
gtacgtatta ttggctcatc gttcgccacc tcagcgctgg aagtggttat tctgaaaacg 960
ctgcatatgt ttgaagtacc gttcctgctg gtgggctgct ttaaatatat taccagccag 1020
tttgaagtgc gtttttcagc gacgatttat ctggtctgtt tctgcttctt taagcaactg 1080
gcgatgattt ttatgtctgt actggcgggc aatatgtatg aaagcatcgg tttccagggc 1140
gcttatctgg tgctgggtct ggtggcgctg ggcttcacct taatttccgt gttcacgctt 1200
agcggccccg gcccgctttc cctgctgcgt cgtcaggtga atgaagtcgc ttaa 1254
<210> 6
<211> 1317
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 6
atgggaaaca catcaataca aacgcagagt taccgtgcgg tagataaaga tgcagggcaa 60
agcagaagtt acattattcc attcgcgctg ctgtgctcac tgttttttct ttgggcggta 120
gccaataacc ttaacgacat tttattacct caattccagc aggcttttac gctgacaaat 180
ttccaggctg gcctgatcca atcggccttt tactttggtt atttcattat cccaatccct 240
gctgggatat tgatgaaaaa actcagttat aaagcaggga ttattaccgg gttattttta 300
tatgccttgg gtgctgcatt attctggccc gccgcagaaa taatgaacta caccttgttt 360
ttagttggcc tatttattat tgcagccgga ttaggttgtc tggaaactgc cgcaaaccct 420
tttgttacgg tattagggcc ggaaagtagt ggtcacttcc gcttaaatct tgcgcaaaca 480
tttaactcgt ttggcgcaat tatcgcggtt gtctttgggc aaagtcttat tttgtctaac 540
gtgccacatc aatcgcaaga cgttctcgat aaaatgtctc cagagcaatt gagtgcgtat 600
aaacacagcc tggtattatc ggtacagaca ccttatatga tcatcgtggc tatcgtgtta 660
ctggtcgccc tgctgatcat gctgacgaaa ttcccggcat tgcagagtga taatcacagt 720
gacgccaaac aaggatcgtt ctccgcatcg ctttctcgcc tggcgcgtat tcgccactgg 780
cgctgggcgg tattagcgca attctgctat gtcggcgcac aaacggcctg ctggagctat 840
ttgattcgct acgctgtaga agaaattcca ggtatgactg caggctttgc cgctaactat 900
ttaaccggaa ccatggtgtg cttctttatt ggtcgtttca ccggtacctg gctcatcagt 960
cgcttcgcac cacacaaagt cctggccgcc tacgcattaa tcgctatggc actgtgcctg 1020
atctcagcct tcgctggcgg tcatgtgggc ttaatagccc tgactttatg cagcgccttt 1080
atgtcgattc agtacccaac aatcttctcg ctgggcatta agaatctcgg ccaggacacc 1140
aaatatggtt cgtccttcat cgttatgacc attattggcg gcggtattgt cactccggtc 1200
atgggttttg tcagtgacgc ggcgggcaac atccccactg ctgaactgat ccccgcactc 1260
tgcttcgcgg tcatctttat ctttgcccgt ttccgttctc aaacggcaac taactga 1317
<210> 7
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<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 7
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gcattttccg ctgcctggtt gggatatctg cttgacggtt ttgatttcgt tttaatcgcc 120
ctggtactca ccgaagtaca aggtgaattc gggctgacga cggtgcaggc ggcaagtctg 180
atctctgcag cctttatctc tcgctggttc ggcggcctga tgctcggcgc tatgggtgac 240
cgctacgggc gtcgtctggc aatggtcacc agcatcgttc tcttctcggc cgggacgctg 300
gcctgcggct ttgcgccagg ctacatcacc atgtttatcg ctcgtctggt catcggcatg 360
gggatggcgg gtgaatacgg ttccagcgcc acctatgtca ttgaaagctg gccaaaacat 420
ctgcgtaaca aagccagtgg ttttttgatt tcaggcttct ctgtgggggc cgtcgttgcc 480
gctcaggtct atagcctggt ggttccggtc tggggctggc gtgcgctgtt ctttatcggc 540
attttgccaa tcatctttgc tctctggctg cgtaaaaaca tcccggaagc ggaagactgg 600
aaagagaaac acgcaggtaa agcaccagta cgcacaatgg tggatattct ctaccgtggt 660
gaacatcgca ttgccaatat cgtaatgaca ctggcggcgg ctactgcgct gtggttctgc 720
ttcgccggta acctgcaaaa tgccgcgatc gtcgctgttc ttgggctgtt atgcgccgca 780
atctttatca gctttatggt gcagagtgca ggcaaacgct ggccaacggg cgtaatgctg 840
atggtggtcg tgttgtttgc tttcctctac tcatggccga ttcaggcgct gctgccaacg 900
tatctgaaaa ccgatctggc ttataacccg catactgtag ccaatgtgct gttctttagt 960
ggctttggcg cggcggtggg atgctgcgta ggtggcttcc tcggtgactg gctgggaacc 1020
cgcaaagcgt acgtttgtag cctgctggcc tcgcagctgc tgattattcc ggtatttgcg 1080
attggcggcg caaacgtctg ggtgctcggt ctgttactgt tcttccagca aatgcttgga 1140
caagggatcg ccgggatctt accaaaactg attggcggtt atttcgatac cgaccagcgt 1200
gcagcgggcc tgggctttac ctacaacgtt ggcgcattgg gcggtgcact ggccccaatc 1260
atcggcgcgt tgatcgctca acgtctggat ctgggtactg cgctggcatc gctctcgttc 1320
agtctgacgt tcgtggtgat cctgctgatt gggctggata tgccttctcg cgttcagcgt 1380
tggttgcgcc cggaagcgtt gcgtactcat gacgctatcg acggtaaacc attcagcggt 1440
gccgtgccgt ttggcagcgc caaaaacgat ttagtcaaaa ccaaaagtta a 1491
<210> 8
<211> 1278
<212> DNA
<213> Xanthomonas campestris
<400> 8
atgactaccg ccaggcccgc aaatcccgtt gtctcgatcg ccatcgtcgg cgtgctgttt 60
ttcatcatcg gctttttcac ctggatcaac gggccgctga tcaccttcgt gcggctggcg 120
ttcgacctca acgaggtcaa tgcgttcctg gtgctgatgg tgttctacct gtcgtacttc 180
ttcctggcgc tgccctcgtc atggatcctc aagcgcaccg gcatgaaaaa aggcctggcg 240
ctgagtctgg tggtgatggc gctgggcgcc gcagcattcg ggcaattcgc tacgcaacgc 300
tggtatccgg gcgcactggc cggcatgttc gtgatcggta gcggcctggc gttgttgcag 360
accgcgatca acccatacat cagtattctc gggccaatcg aaagtgcggc gcggcgcatc 420
gcgctgatgg gcatctgtaa caagattgcc ggcatcctgg cgccgatcct gatcggctcg 480
ctggtgctgc atggcatcgg cgatctctcc acgcaggtgg ccgcggccga tgcggcgacc 540
aagcagcaac tgctcaacgc gtttgccgcc aagatccatg caccatatct ggtgatgtcc 600
ggcgtgttgc tggtgctggc ggtgggcgtg ttgttctcgc cgctgcccga actcaaggcc 660
tccgaagcca atgccacgcc gggcagcggt ggcgcggcgc agaagtccag catcttccag 720
ttcccgcatc tgtggctggg cgtgttgtgc ctgttcgtgt atgtcggtgt ggaagtgatg 780
gccggcgatg ccatcggcac ttacggacac ggcttcaatt tgccgctgga cagcaccaag 840
ctgttcacct cctacacgct gggcgcaatg ttgctgggct atatcgccgg cctggtgctg 900
attccgcggg tgatttcgca ggcgcgctac ctgagcgtgt ctgcgctgct gggcgtgctg 960
ttctcgctgg gggcgctgtt cacccacggc tatgtgtcgg tggggttcgt ggccgcgctc 1020
ggttttgcca acgccatgat gtggccggcg atctttccgc tggccatccg cggcctgggc 1080
cggttcaccg agatcggttc ggcgttgctg gtgatgggca ttgccggcgg cgcgatcatt 1140
ccgcagctgt tcgccattct gaaacagcat tacgacttcc aggtggtgtt cgccgcgctg 1200
atggtgccgt gctacctgta catcctgttc tattcgctgc gcggccaccg tgtggggctg 1260
ccggctcaac cgaaatga 1278
<210> 9
<211> 1554
<212> DNA
<213> Bifidobacterium longum
<400> 9
atgacgacga caacggcatc acccgtatcg aaacagacgg catccgcggc gcaggaaacc 60
agcgcaaccg gtgcggcggc caccgcaatc gaaaccatcg aaaccggcgt ggccggagtg 120
gcgggcgcgg ccacaaacgc ggcagccaac gcaatcgagg acctcgaagc cgccgaatcg 180
cacggcttct ccacgcgctt cccgctcaac agcgcattca tcttcacctt cggcgcgctc 240
ggcggcatgc tgttcggttt cgacaccggc atcatctccg gcgcctcccc gcttatcgaa 300
tcggacttcg gcctgagcgt ctctcagacc ggcttcatca cctcctcggt gctgatcggc 360
tcgtgcgcag gcgcgctgtc gatcggcgca ctgtctgacc ggttcggccg caagaagctg 420
ctcatcgtct ccgcgctgct gttcctgctc ggctcaggcc tgtgcgcctc ctccaccgga 480
ttcgcgatga tggtgtgcgc ccgcatcatc ctgggtctcg ccgtcggcgc ggcctccgcc 540
ctgaccccgg cgtacttggc cgaactggcg ccgaaggagc gtcgcggctc actgtccacg 600
ctgttccagc tcatggtcac cttcggcatt ctgctggcct acgcctccaa cctcggattc 660
ctgaaccaca acctcttcgg catccgcgac tggcgctgga tgctcggttc ggcgctggtg 720
ccggccgcct tgttgctgct cggcggcctg ttgctgcccg aatccccgcg ttatctggtg 780
aacaagggcg acacccgcaa cgccttcaaa gtgcttacgc tgattcgcaa ggacgtggat 840
cagacccagg tgcagattga gctggacgaa atcaaggccg tggccgcaca ggacaccaag 900
ggtggtgtgc gcgaactgtt ccgtatcgct cgtccggcgc tggtggccgc catcggtatc 960
atgctgttcc agcagctcgt gggcatcaac tcggtgatct acttcctgcc gcaggtgttc 1020
atcaagggct tcggcttccc tgaaggcgac gcgatctggg tgtcggtggg catcggcgtg 1080
gtgaacttcg tgagcaccat cgtggccacg cttatcatgg atcgtttccc gcgcaagggc 1140
atgctgatct tcggttccat cgtgatgacc gtttcgctcg cggtgctcgc cgtgatgaac 1200
ttcgtgggcg acgtggccgt gctggcagtg ccgacgatga ttctcatcgc tttctatatc 1260
ctcggctttg cggtctcgtg gggcccgatc gcctgggtgc ttatcggcga gatcttcccg 1320
ctgagcgtgc gcggcatcgg ctcatccttc ggctcggcgg cgaactggct gggcaacttc 1380
atcgtctccc agttcttcct cgtgctgctc gatgcgttcg gcaacaatgt gggcggcccg 1440
ttcgcgattt tcggcgtgtt ctcggccctg tccatcccgt tcgtgctgcg cttggtgccc 1500
gagaccaagg gcaagtcgct ggaggaaatc gagaaggaaa tgaccaagcg ctag 1554
<210> 10
<211> 1206
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 10
atgttaagag ggacatattt atttggatat gctttctttt ttacagtagg tattatccat 60
atatcaacag ggagtttgac accattttta ttagaggctt ttaacaagac aacagatgat 120
atttcggtca taatcttctt ccagtttacc ggatttctaa gcggagtatt aatcgcacct 180
ttaatgatta agaaatacag tcattttagg acacttactt tagctttgac aataatgctt 240
gtagcgttaa gtatcttttt tctaaccaag gattggtatt atattattgt aatggctttt 300
ctcttaggat atggagcagg cacattagaa acgacagttg gttcatttgt tattgctaat 360
ttcgaaagta atgcagaaaa aatgagtaag ctggaagttc tctttggatt aggcgcttta 420
tctttcccat tattaattaa ttccttcata gatatcaata actggttttt accatattac 480
tgtatattca cctttttatt cgtcctattc gtagggtggt taattttctt gtctaagaac 540
cgagagtacg ctaagaatgc taaccaacaa gtgacctttc cagatggagg agcatttcaa 600
tactttatag gagatagaaa aaaatcaaag caattaggct tttttgtatt tttcgctttc 660
ctatatgctg gaattgaaac aaattttgcc aactttttac cttcaatcat gataaaccaa 720
gacaatgaac aaattagtct tataagtgtc tcctttttct gggtagggat catcatagga 780
agaatattga ttggtttcgt aagtagaagg cttgattttt ccaaatacct tctttttagc 840
tgtagttgtt taattgtttt gttgattgcc ttctcttata taagtaaccc aatacttcaa 900
ttgagtggta catttttgat tggcctaagt atagcgggga tatttcccat tgctttaaca 960
ctagcatcaa tcattattca gaagtacgtt gacgaagtta caagtttatt tattgcctcg 1020
gcaagtttcg gaggagcgat catctctttc ttaattggat ggagtttaaa ccaggatacg 1080
atcttattaa ccatgggaat atttacaact atggcggtca ttctagtagg tatttctgta 1140
aagattagga gaactaaaac agaagaccct atttcacttg aaaacaaagc atcaaaaaca 1200
cagtag 1206
<210> 11
<211> 1593
<212> DNA
<213> Vibrio parahaemolyticus
<400> 11
atggtcttcg ccatttatgt cgcaattatc attggggtcg gactttgggt atctcgtgat 60
aaaaaaggca ctcagaaaag tacggaagat tatttcttgg cgggaaaatc tttgccttgg 120
tgggctgtcg gtgcttcgct aattgctgca aatatttctg cggaacaatt tataggaatg 180
tctggttcag gctattcaat tggcttggct atcgcatctt atgaatggat gtcggcaata 240
acattgatta ttgttggtaa gtactttcta cctattttca ttgaaaaagg aatctatacc 300
attcctgaat ttgttgaaaa acgcttcaat aaaaaactaa aaacaatttt ggccgttttt 360
tggatttcct tgtacatttt tgtaaaccta acttcagtac tgtatttagg tggtttggct 420
ctcgaaacca ttttgggtat tccgttgatg tactcaattc taggtcttgc gctgtttgcg 480
ttggtgtact caatttatgg tggtttatcg gcagtagtat ggaccgatgt catccaagtg 540
ttcttcttag ttttgggtgg ttttatgact acctacatgg cagtgagctt tattggtggt 600
acggacggtt ggttcgctgg ggtgtctaaa atggtcgatg cagctcctgg ccactttgag 660
atgatcttgg atcaaagtaa tccacaatac atgaaccttc ctggtattgc cgtattaatt 720
ggtggtcttt gggtagcaaa cttatattac tggggcttta accagtacat tattcaaaga 780
acgcttgctg caaaatcagt atcggaagct cagaaaggta ttgtttttgc agcgtttttg 840
aaacttatcg ttccgtttct cgtggtattg ccaggtattg ccgcttacgt tattacttcg 900
gacccacaac taatggcaag ccttggtgat attgcagcaa caaaccttcc aagtgctgct 960
aatgcggata aagcataccc ttggctaact cagttcttgc ctgttggtgt taaaggtgtt 1020
gtttttgcgg ctcttgctgc tgcaattgtt tcttcactag catcaatgct taactcaaca 1080
gccactatct tcactatgga tatttacaaa gagtatatct ctcctgactc aggtgaccac 1140
aagttggtga atgttgggcg tactgcagct gtggtggcac taattattgc ttgcctaatt 1200
gccccaatgt taggtggtat tggccaagca ttccaataca tccaagaata tacaggttta 1260
gttagccctg gtattttggc tgtattctta cttggcttat tctggaagaa aacaaccagt 1320
aaaggggcta ttattggtgt agtagcatca ataccatttg ccttgttctt gaaatttatg 1380
ccactttcca tgccatttat ggatcaaatg ctatacacat tattgtttac aatggttgtt 1440
atcgcattta caagtttgag cacatcaatt aatgatgatg atcctaaagg tattagtgtt 1500
acatcatcga tgtttgtaac agatcgaagc tttaatatcg ctgcttacgg cataatgatt 1560
gttttggcag tgttatatac attgttctgg taa 1593
<210> 12
<211> 1476
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 12
atgaataccc agtataattc cagttatata ttttcgatta ccttagtcgc tacattaggt 60
ggtttattat ttggctacga caccgccgtt atttccggta ctgttgagtc actcaatacc 120
gtctttgttg ctccacaaaa cttaagtgaa tccgctgcca actccctgtt agggttttgc 180
gtggccagcg ctctgattgg ttgcatcatc ggcggtgccc tcggtggtta ttgcagtaac 240
cgcttcggtc gtcgtgattc acttaagatt gctgctgtcc tgttttttat ttctggtgta 300
ggttctgcct ggccagaact tggttttacc tctataaacc cggacaacac tgtgcctgtt 360
tatctggcag gttatgtccc ggaatttgtt atttatcgca ttattggcgg tattggcgtt 420
ggtttagcct caatgctctc gccaatgtat attgcggaac tggctccagc tcatattcgc 480
gggaaactgg tctcttttaa ccagtttgcg attattttcg ggcaactttt agtttactgc 540
gtaaactatt ttattgcccg ttccggtgat gccagctggc tgaatactga cggctggcgt 600
tatatgtttg cctcggaatg tatccctgca ctgctgttct taatgctgct gtataccgtg 660
ccagaaagtc ctcgctggct gatgtcgcgc ggcaagcaag aacaggcgga aggtatcctg 720
cgcaaaatta tgggcaacac gcttgcaact caggcagtac aggaaattaa acactccctg 780
gatcatggcc gcaaaaccgg tggtcgtctg ctgatgtttg gcgtgggcgt gattgtaatc 840
ggcgtaatgc tctccatctt ccagcaattt gtcggcatca atgtggtgct gtactacgcg 900
ccggaagtgt tcaaaacgct gggggccagc acggatatcg cgctgttgca gaccattatt 960
gtcggagtta tcaacctcac cttcaccgtt ctggcaatta tgacggtgga taaatttggt 1020
cgtaagccac tgcaaattat cggcgcactc ggaatggcaa tcggtatgtt tagcctcggt 1080
accgcgtttt acactcaggc accgggtatt gtggcgctac tgtcgatgct gttctatgtt 1140
gccgcctttg ccatgtcctg gggtccggta tgctgggtac tgctgtcgga aatcttcccg 1200
aatgctattc gtggtaaagc gctggcaatc gcggtggcgg cccagtggct ggcgaactac 1260
ttcgtctcct ggaccttccc gatgatggac aaaaactcct ggctggtggc ccatttccac 1320
aacggtttct cctactggat ttacggttgt atgggcgttc tggcagcact gtttatgtgg 1380
aaatttgtcc cggaaaccaa aggtaaaacc cttgaggagc tggaagcgct ctgggaaccg 1440
gaaacgaaga aaacacaaca aactgctacg ctgtaa 1476
<210> 13
<211> 1395
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 13
atgaagaata ctccaactca attagaacca aatgttcctg taacaagaag ccattcaatg 60
ggatttgtca ttttgatctc atgtgcggcg gggcttggcg gcttattgta tggctatgac 120
acggcagtga tttctggcgc catcggtttt ctgaaagatt tatacagcct gagtccgttt 180
atggagggac ttgtcatttc aagcattatg attggaggag ttgtgggcgt cgggatatcc 240
ggatttttaa gtgacagatt cggccggaga aaaattttaa tgacagccgc tttgttattt 300
gcgatatcag caatcgtttc agcgctttct caagacgtgt ccaccttaat cattgcaagg 360
attatcgggg ggctgggaat cgggatgggc tcatcgctct ctgttacgta tattacagaa 420
gcggcaccgc ccgctatacg cggaagttta tcttcgttat atcagctctt tacgatactg 480
ggtatttccg caacatactt tattaatcta gctgtgcagc ggtccggaac atacgaatgg 540
ggcgtgcaca ccggctggag atggatgctt gcttatggaa tggtgccatc cgtcattttt 600
ttccttgtcc tgctcgtcgt cccggaaagt ccgagatggc tggcgaaagc gggcaaaaca 660
aatgaagctt taaagatcct gacacgtatt aatggagaaa ctgttgcaaa agaagaatta 720
aagaacattg agaactcttt aaaaatagaa caaatggggt cgctctccca gctgtttaag 780
ccgggtctca gaaaggcgct tgtcattgga atcctgctgg cgctgtttaa ccaagtcatc 840
ggcatgaacg cgattactta ctacgggccg gaaatcttta aaatgatggg attcgggcaa 900
aacgccggat ttgtgacgac ttgtatcgtc ggggttgtag aagttatttt taccgttatt 960
gcggtgttgc tgattgataa agtcggacga aaaaaactga tgtccatcgg ttctgctttt 1020
atggctattt ttatgatttt aatcgggacg tcgttttatt ttgagttaac aagcgggatc 1080
atgatgatcg tccttatatt aggttttgtc gctgctttct gtgtctcggt cggaccgatc 1140
acatggatta tgatttctga aatcttcccg aaccatctgc gtgcgcgggc cgcgggcatt 1200
gcgaccatct ttttatgggg agcaaactgg gcgatcggac agtttgtgcc aatgatgatc 1260
gattctttcg ggctcgccta tacattttgg atctttgcgg tgattaacat cctttgtttc 1320
ctgtttgtcg ttacgatctg tccagaaacg aagaacaaat cgctcgagga aattgaaaag 1380
ctttggataa aatga 1395
<210> 14
<211> 4393
<212> DNA
<213> Klebsiella pneumoniae
<400> 14
atgtataaaa aacggaagtt agccattctt attgctttgc taaccggcac cgccgccgcc 60
catgggcaga cagacctgaa cagcattgaa gcgcgtctcg ccgccctgga aaaacgcctg 120
caggacgccg agacccgcgc cagcactgcc gaaagccgcg ccgcctcagc ggagcagaaa 180
gttcagcagt taacccagca gcagcagcaa acccaggcca ccacccagca ggtggccagg 240
cgcaccactc aactggaaga aaaagccgaa cggcccggcg gctttgagtt ccatggctat 300
gcgcgttccg gggtgatcat gaacgactcg gccgccagta ccaaatccgg cgcttatatg 360
acccccgccg gggagaccgg cggcgccatt ggtcgcctgg gcaaccaggc cgacacctat 420
gtggaaatga acctcgaaca taaacagacc ctggacaacg gggcgaccac ccgtttcaaa 480
gtgatggtgg ccgacggaca gaccacctat aacgactgga cggcaagcag cagcgacctg 540
aacgtacgcc aggcgttcgt cgagctgggc aatctgccga ccttcgaagg cccgttcaaa 600
ggctcgaccc tgtgggccgg gaaacgcttt gaccgcgaca acttcgacat ccactggatt 660
gactcggatg tggtgttcct cgccgggacc ggcggcggga tctacgacgt gaaatggaac 720
gacagcctgc gcagcaactt ctcgttatac ggccgcaact ttggcgatat cgccgacagc 780
agcaacagcg tgcagaacta tatcgtcagc atgaataact ttgccggccc ggtgcagatg 840
atggtcagcg ggatgcgggc gaaagataat gacgaccgcc aggacgcgaa cggcaatctg 900
gtgaaaggcg atgccgctaa caccggggtt catgccctgc tgggcctgca caatgagagc 960
ttctatggcc tgcgcgacgg gaccagcaaa acggccctgc tgtacggcca cgggctgggc 1020
gccgaggtta aaggcatcgg ctccgacggc gcgctgcgcc cgggggccaa tacctggcgc 1080
ttcgccagct atggcactac gccgctgagc gatcgctggt ttattgcccc ggccgtgctg 1140
gcgcagagca gtaaagatcg ttatgtcgat ggcgacagct atcagtgggc caccctcaac 1200
ctgcgtctga ttcaggaagt gacgcagaac ttcgccctcg cctgggaggg cagctatcag 1260
tacatggatc tgcagcctga aggctacaac gatcgccatg cggtcaatgg cagcttctac 1320
aagctgacct tcgccccgac cttcaaggtg ggcagcatcg gcgacttctt ctcgcggccg 1380
gagatccgct tctatacatc gtggatggac tggagcaaaa aactggacaa ctacgccaac 1440
gatgacgcgt taggcagcaa cggattcaaa tcgggcggcg aatggtcgtt cggtatgcaa 1500
atggagacct ggttctgacg gccaccgggg cgacagggta aataacacat aaatataagg 1560
ttcgcggcgc ctgccacggc tggcgccgcc cacgccatat catcatgcat ttagagggta 1620
ctatggattt tgaacagatt tcccgctcac tgcttcccct gctgggcggc aaggaaaata 1680
tcgccagcgc cgcgcactgc gccacccgcc tgcggctggt gctggtcgac gacgcgctcg 1740
ccgatcagca ggcgattggc aaaatcgacg gggtgaaagg ctgctttcgc aatgccggac 1800
agatgcagat catcttcggc accggggtgg tcaataaagt ctatgccgcc tttatccagg 1860
ccgcaggcat cagcgaatcg agcaaatccg aagccgccga cctggcggcg aaaaagctga 1920
acccgttcca gcgcatcgcc cgcctgctgt ccaacatctt cgtgccgatt attccggcca 1980
tcgtcgcctc cggcctgctg atgggcctgc tggggatggt gaaaacctac ggttgggtcg 2040
acccgagcaa cgctctctat atcatgctgg atatgtgcag ttcggcggcg tttatcattc 2100
tgccgatcct gatcggcttt accgccgccc gcgaatttgg cggtaacccc tatctgggcg 2160
cgaccctcgg cgggatcctc acccacccgg cgctgaccaa cgcctggggc gtcgccgccg 2220
gcttccacac catgaatttc ttcggcatcg aagtggcgat gatcggctac cagggcaccg 2280
tcttcccggt gctgctggcg gtgtggttta tgagcatggt cgagaagcgg ctgcgccgcg 2340
tgatccctga cgcgctggac ctgatcctca ctccgttcct gacggtgatt atctccggct 2400
ttatcgccct gctgctgatc ggcccggccg gtcgcgcgct cggcgacggc atttcgttta 2460
tcctcagcac gcttatcagc catgccggct ggctggcggg cctgctgttc ggcggcctct 2520
attcggtgat cgtcattacc ggtatccatc acagcttcca tgccatcgag gccggactgc 2580
tgggcaaccc atcgattggc gtcaacttcc tgctgccgat ctgggcgatg gccaacgtcg 2640
cccagggcgg cgcctgcttt gcggtgtggt ttaaaaccaa agatgccaaa ataaaagcca 2700
tcaccctgcc gtcggcgttt tcggcgatgc tggggatcac cgaggcggca atcttcggga 2760
ttaacctgcg ctttgtgaaa ccgtttatcg ccgcgctggt gggcggtgcc gccggcggcg 2820
cctgggtggt gtcgatgcac gtctacatga ccgcggtggg cctgacggcg atcccgggaa 2880
tggctatcgt gcaggccagc tcgctgctga actacattat cggaatggcg atcgccttcg 2940
ccgtggcctt cgcgctctct ctgacgctga aatacaaaac ggacgctgaa taatgtcatt 3000
accgtcacgt ctgcctgcga tcctgcaggc cgttatgcag ggccagccgc aggcgctggc 3060
cgacagccat tatccgcaat ggcatctggc gccggtcaac ggactgctga acgatcctaa 3120
cggcttttgc caggtcgccg ggcgttacca cctgttttat cagtggaacc cgctcgcctg 3180
cgaccatacc tataagtgct ggggacactg gagctctgcc gatctgctgc actggcggca 3240
cgaacctatc gccctgatgc cggatgaaga gtatgaccgc aacggctgct actctggcag 3300
cgcggtcgag ttcgagggtg ccctgactct gtgctacacc ggcaacgtga aattccccga 3360
cggcgggcgc accgcctggc aatgtctggc gaccgagaat gccgatggca ccttccgcaa 3420
gctggggccg gtgctgccgc tgccagaagg ctataccggc catgtgcgcg accctaaagt 3480
gtggcggcag gacgggcgct ggtacatggt tcttggggcg caggatgtgc aacagcgcgg 3540
caaagtgctg ctgtttaccg ccagcgacct gcgggagtgg cgcctggtgg gcgagatcgc 3600
cgggcacgac gtgaacggcc tggcgaacgc cggctacatg tgggagtgcc cggatctctt 3660
tccgctggcg gacacccacc tgctgatctg ctgcccgcag gggctggccc gcgaagcgca 3720
gcgctttctc aatacctatc cggcggtgtg gatggcaggc cgcttcgacg ccgaacgcgg 3780
gatcttcgac cacggcccgc tgcacgagct ggacagcgga tttgagttct acgcgccgca 3840
gaccatgcag gccgacgatg gccgccgcct gctggtcggc tggatgggcg tccccgacgg 3900
ggacgagatg catcagccca cccgcgcgca gggctggatc catcagatga cctgcgtgcg 3960
tgagctggag tggcaggctg gcactctgta tcagcgtccg ctgcgcgagc tggtcgccct 4020
gcgcggggaa gcccagggct ggtgcggaca gaccctgccc ctcgccccga tggagctggc 4080
ctttgacctt tcccccgaca gcacgctggg gctggacttt gccggcgccc tgcagctcac 4140
cgtcaatcgc gacggcctac gtctgtcgcg ccgcggcctg cagacggcag agatgcatca 4200
ccgctactgg cgcggcgagg cgcgacgcct gcggatcttt atcgaccgct ccagcgtgga 4260
gattttcatc aacgatggcg agggggtgat gagcagccgc ttctttccgg gctatccggg 4320
gcagctcatc ttcagcggtg cgacgccggt ggcattctgc cgctggctgc tgcggccatg 4380
catggtagaa taa 4393
<210> 15
<211> 4423
<212> DNA
<213> Salmonella typhimurium
<400> 15
atgtacagaa aaagcacact tgcgatgctt atcgctttgc taaccagcgc tgcctcagcc 60
catgcgcaaa cggatataag caccattgaa gcccgactca acgcgctgga aaaacgcctg 120
caggaggcag aaaacagggc gcaaacggcg gaaaaccgcg ccggggcggc ggagaaaaaa 180
gttcagcaac tcaccgcgca gcagcaaaaa aaccagaact cgactcagga agtggctcag 240
cgtaccgcca gacttgagaa aaaagccgat gacaaaagcg gatttgagtt tcacggttac 300
gcccgctccg gcgtgataat gaatgattcc ggcgccagca ccaaatccgg agcctacata 360
acgccggcag gtgaaaccgg cggagctatc ggccgtctgg gaaaccaggc cgatacctat 420
gttgaaatga atcttgaaca taagcagacc ctggataatg gggccacgac ccgctttaag 480
gtgatggtcg ccgacgggca aacctcttat aacgactgga ctgcaagcac cagcgatctg 540
aacgttcgtc aggcctttgt cgaattgggt aacctgccga cgttcgctgg gccatttaag 600
ggctccaccc tgtgggccgg gaaacgtttc gaccgcgaca atttcgatat tcactggatt 660
gactctgatg tcgtgttcct cgccggtacc ggtggtggta tctatgacgt gaagtggaac 720
gacggcctgc ggagtaattt ctccctgtac gggcgtaact tcggcgacat tgatgattcc 780
agcaacagcg tgcagaacta tatcctcacc atgaatcact tcgcaggtcc gctgcagatg 840
atggtcagcg gtctgcgggc gaaggataac gacgagcgta aagatagcaa cggcaatctg 900
gcaaaaggcg atgcggcaaa caccggcgtg catgcgctgc tcggcctgca taacgacagt 960
ttctacggcc tgcgcgacgg tagcagtaaa accgctctgc tttatggtca tggtctgggc 1020
gcagaggtta aaggtatcgg atctgatggc gcacttcgtc cgggagccga cacatggcgc 1080
attgccagtt acggcaccac gccgctcagc gaaaactggt ctgttgcccc ggcaatgctg 1140
gcgcaacgca gtaaagaccg ctatgccgat ggcgacagct atcagtgggc aacattcaac 1200
ctgcgtctga ttcaggcaat caatcagaat ttcgctctcg cctacgaagg cagctaccag 1260
tacatggatc ttaaacccga aggttataac gatcgtcagg cggtgaacgg tagcttctac 1320
aagctcacct tcgccccgac atttaaggtc ggcagtatcg gtgatttctt cagtcgcccg 1380
gagattcgtt tctatacctc ctggatggac tggagcaaaa aactgaataa ttacgccagc 1440
gacgacgccc tgggcagtga cggttttaac tcgggcggcg aatggtcttt cggtgtgcag 1500
atggaaacct ggttctgacg cttacgcctg atgacaggaa tagccggggg tcagagcatc 1560
tttgtcaccc cggactcaac taagacgcag aaaaagcgct cccgtgaacg cgggacgaca 1620
acataaaaat gtttaagcct taagagggta ctatggattt tgaacagatt tcctgctcgc 1680
tgcttccgct tcttggaggc aaagaaaata tcgccagcgc cgcgcactgc gccacgcgcc 1740
tgcgcctggt gctggtcgat gattcgctgg ccgaccagca ggccatcggc aaagttgaag 1800
gggtgaaggg ctgttttcgt aatgccggac agatgcagat tattttcggc accggggtgg 1860
taaataaggt ctacgctgcc tttactcagg cggcgggtat tagcgaatcc agcaaatcgg 1920
aagccgccga catcgcggca aaaaagctca atccgttcca gcgcatcgcc cgcctgctat 1980
caaacatctt cgtgccgata atccctgcca tcgtcgcctc tggtctgctg atgggcctgc 2040
tgggaatggt caaaacatac ggctgggttg acccgggcaa cgccatctac atcatgctgg 2100
atatgtgcag ctcggcggca tttatcattc tgccgattct gattggcttt accgccgccc 2160
gcgaattcgg cggtaatcct tatctcggcg cgacgcttgg cggcattctg actcatccag 2220
cgctgactaa cgcctggggc gtggccgcgg gtttccacac catgaacttt ttcggcttcg 2280
aaattgccat gatcggctat cagggtacgg tgttcccggt actgctggca gtatggttta 2340
tgagcatcgt tgagaagcag ttgcgtcgcg caatccccga tgccctggat ttgatcctga 2400
cgccgttcct gacggtgatt atatccggtt ttatcgccct gttgattatc ggcccggccg 2460
gtcgcgcact gggcgacggt atctcgtttg tcctcagcac cctgattagc cacgccggct 2520
ggctcgccgg gttactgttt ggcggtctct attcagttat cgtcattacc ggtattcatc 2580
acagcttcca tgcggttgaa gccgggttgc tgggcaatcc ctccatcggc gtcaacttcc 2640
tgctgccgat ttgggcgatg gccaacgtcg ctcagggcgg agcctgtctg gcggtgtggt 2700
tcaaaaccaa agatgcaaaa attaaagcca ttactctgcc ctcggcgttt tccgccatgc 2760
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cggcgctgat tggtggtgcg gcgggcggcg catgggtggt atctgtacac gtctacatga 2880
ccgcggtcgg cttgacagcg atccccggca tggccatcgt gcaggccagt tcgctgttga 2940
actacattat cgggatggtt atcgcctttg gcgtcgcctt tacggtctcc ctggttttga 3000
aatacaaaac ggacgctgaa taatgtctct tccatcacga ctgcctgcga ttttgcaggc 3060
cgtaatgcag ggccagccgc gcgcgctggc cgatagccac tatccgcgct ggcaccatgc 3120
gccggtcacc gggctgatga acgaccccaa cggctttatc gaatttgccg gacgctatca 3180
tctgttttat cagtggaacc cgctcgcctg cgatcatacg tttaagtgct gggcgcactg 3240
gagttccatc gatctgctgc actggcagca tgagcccatt gcgctgatgc cggacgaaga 3300
gtatgaccgt aacggctgct actccggcag cgcggtggat aacaacggta cgcttaccct 3360
gtgctatacc ggcaacgtga agtttgccga gggagggcga accgcctggc aatgcctggc 3420
aacggaaaac gctgacggca ccttccgcaa aatcggtccg gtcctgccgc tgccggaggg 3480
ctacaccggc cacgtgcgcg acccaaaagt ctggcgacac gaagacctgt ggtacatggt 3540
gctgggcgcg caggatcggc aaaagcgcgg caaggtgctg ctgttcagct ctgcggatct 3600
ccatcagtgg acgagtatgg gtgaaatcgc cggccacggc atcaatggcc tcgacgacgt 3660
cggctatatg tgggagtgcc cggatctttt tccactcggc gaccagcata ttctaatctg 3720
ctgtccgcag gggattgccc gtgaggaaga gtgctacctg aacacctacc cggcagtatg 3780
gatggcgggc gagtttgatt acgctgctgg cgctttcaga cacggcgaac tgcacgaact 3840
ggacgccggg tttgagttct acgccccgca aaccatgctt accagtgatg gccgtcgtct 3900
gctggtcggc tggatgggcg tgccggaggg cgaagagatg cttcagccga ccctgaacaa 3960
cggctggatc catcagatga cctgcctgcg tgagctggag tttatcaacg gtcagctcta 4020
tcagcgtccg ctacgggaac tgagcgccct gcgcggtgaa gcgaacggct ggtcggggaa 4080
cgccctgccg ctggcaccga tggaaatcga tttgcaaacc cgcgggggcg atatgttgag 4140
cctcgatttt ggcggcgtat taacccttga gtgcgatgcc agcggactcc gcctggcccg 4200
acgcagtctc gccagtgacg agatgcatta tcgttactgg cgcggaaacg tccgctcgct 4260
gcgtgttttc atcgaccagt cgagcgtgga gattttcata aacggcggtg aaggggtgat 4320
gagcagccgc tacttcccgg cctgctccgg tcagctaaca ttctccggca tcacgccgga 4380
cgcattctgc tactggccgc tgcgaacttg catggtagaa taa 4423
<210> 16
<211> 3883
<212> DNA
<213> Eastern equine encephalomyelitis virus
<400> 16
ctatattgct gaaggtacag gcgtttccat aactatttgc tcgcgttttt tactcaagaa 60
gaaaatgcca aatagcaaca tcaggcagac aatacccgaa attgcgaaga aaactgtctg 120
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aaaaatgtta tagaaagacc acgtccccac aataaatatg acgaaaaccc agaagtttcg 600
atccttgaaa actgcgataa aatcctcttt ttttacccct cccgcatctg ccgctacgca 660
ctggtgatcc ttatctttaa aacgcatgtt gatcatcata aatacagcgc caaatagcga 720
gaccaaccag aagttgatat ggggactgat actaaaaaat atgccggcaa agaacgcgcc 780
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cgccattttt tcggtgaagc tatcaagcaa accgcatccc gccagatacc ccaagccaaa 900
aaatagcgcc cccagaatta gacctacaga aaaattgctt tgcagtaacg gttcataaac 960
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tcgattgcat gcggcgcaaa acgccctagc aaaacttcat gagcaccggg gtaacacttt 2520
ctatccccat tttcacctcg cgcctcctgc cgggtggatg aacgatccaa acggcctgat 2580
ctggtttaac gatcgttatc acgcgtttta tcaacatcat ccgatgagcg aacactgggg 2640
gccaatgcac tggggacatg ccaccagcga cgatatgatc cactggcagc atgagcctat 2700
tgcgctagcg ccaggagacg ataatgacaa agacgggtgt ttttcaggta gtgctgtcga 2760
tgacaatggt gtcctctcac ttatctacac cggacacgtc tggctcgatg gtgcaggtaa 2820
tgacgatgca attcgcgaag tacaatgtct ggctaccagt cgggatggta ttcatttcga 2880
gaaacagggt gtgatcctca ctccaccaga aggaatcatg cacttccgcg atcctaaagt 2940
gtggcgtgaa gccgacacat ggtggatggt agtcggggcg aaagatccag gcaacacggg 3000
gcagatcctg ctttatcgcg gcagttcgtt gcgtgaatgg accttcgatc gcgtactggc 3060
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tcagcattat ctgatgtttt ccccgcaggg aatgaatgcc gagggataca gttaccgaaa 3180
tcgctttcaa agtggcgtaa tacccggaat gtggtcgcca ggacgacttt ttgcacaatc 3240
cgggcatttt actgaacttg ataacgggca tgacttttat gcaccacaaa gctttttagc 3300
gaaggatggt cggcgtattg ttatcggctg gatggatatg tgggaatcgc caatgccctc 3360
aaaacgtgaa ggatgggcag gctgcatgac gctggcgcgc gagctatcag agagcaatgg 3420
caaacttcta caacgcccgg tacacgaagc tgagtcgtta cgccagcagc atcaatctgt 3480
ctctccccgc acaatcagca ataaatatgt tttgcaggaa aacgcgcaag cagttgagat 3540
tcagttgcag tgggcgctga agaacagtga tgccgaacat tacggattac agctcggcac 3600
tggaatgcgg ctgtatattg ataaccaatc tgagcgactt gttttgtggc ggtattaccc 3660
acacgagaat ttagacggct accgtagtat tcccctcccg cagcgtgaca cgctcgccct 3720
aaggatattt atcgatacat catccgtgga agtatttatt aacgacgggg aagcggtgat 3780
gagtagtcga atctatccgc agccagaaga acgggaactg tcgctttatg cctcccacgg 3840
agtggctgtg ctgcaacatg gagcactctg gctactgggt taa 3883
Claims (15)
- 목적 탄수화물을 생산하기 위한 유전자 조작된 미생물 세포(genetically engineered microbial cell)로서,
상기 미생물 세포는 야생형 세포와 비교하여 적어도 하나의 당 포스페이트의 증가된 세포내 이용가능성을 갖고, 주요 탄소원 및 에너지원으로서 혼합된 단당류 공급원료를 포함하는 배양 배지에서 배양되면 목적 탄수화물을 생성하고,
상기 혼합 단당류 공급원료는 글루코스, 및 프럭토스 및 갈락토스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 추가 단당류로 이루어지는, 유전자 조작된 미생물 세포. - 제1항에 있어서, 상기 유전자 조작된 미생물 세포가 UDP-갈락토스의 세포내 형성을 위한 UDP-갈락토스 생합성 경로를 추가로 포함하는, 유전자 조작된 미생물 세포.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자 조작된 미생물 세포가 GDP-L-푸코스의 세포내 형성을 위한 GDP-푸코스 생합성 경로를 추가로 포함하는, 유전자 조작된 미생물 세포.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 조작된 미생물 세포가 UDP-N-아세틸글루코사민의 세포내 형성을 위한 UDP-N-아세틸글루코사민 생합성 경로를 추가로 포함하는, 유전자 조작된 미생물 세포.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 조작된 미생물 세포가 CMP-N-아세틸뉴라민산의 세포내 형성을 위한 CMP-N-아세틸뉴라민산/CMP-시알산 생합성 경로를 추가로 포함하는, 유전자 조작된 미생물 세포.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 조작된 미생물 세포가 적어도 하나의 글리코실트랜스퍼라제를 추가로 포함하는, 유전자 조작된 미생물 세포.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 조작된 미생물 세포가 포스포에놀피루베이트의 증진된 합성(enhanced synthesis)을 추가로 포함하는, 유전자 조작된 미생물 세포.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 조작된 미생물 세포가 단당류를 상기 배지로부터 상기 미생물 세포의 세포질 내로 전좌(translocating)시키기 위한 적어도 하나의 단당류 수송체(transporter)를 추가로 포함하는, 유전자 조작된 미생물 세포.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 조작된 미생물 세포가 목적 탄수화물의 생합성과 경쟁하는 단백질을 코딩하는(encoding) 적어도 하나의 유전자의 발현 저하 또는 감소, 및/또는 목적 탄수화물의 생합성과 경쟁하는 적어도 하나의 단백질의 활성 저하 또는 감소를 추가로 포함하는, 유전자 조작된 미생물 세포.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 미생물 내에서 상기 세포내 당 포스페이트의 소비를 유도하는 단백질이, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 글루코스-6-포스페이트 데하이드로게나제(dehydrogenase), 포스포에놀피루베이트:당 포스포트랜스퍼라제 시스템의 성분으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 유전자 조작된 미생물 세포.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 조작된 미생물 세포가 상기 세포로부터 목적 탄수화물을 외수송(exporting)하는 적어도 하나의 외수송 단백질(exporter protein) 또는 퍼미아제(permease)를 추가로 포함하는, 유전자 조작된 미생물 세포.
- 목적 탄수화물의 생산을 위한, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 유전자 조작된 미생물 세포의 용도.
- 목적 탄수화물의 발효적 생산(fermentative production)을 위한 방법으로서,
a) 목적 탄수화물을 생산할 수 있는 유전자 조작된 미생물을 제공하는 단계로서, 상기 미생물은, 상기 조작된 미생물 내에서 상기 세포내 당 포스페이트의 소비를 유도하는 적어도 하나의 단백질의 발현 및/또는 활성의 저하 및/또는 감소에 기인하여 적어도 하나의 당 포스페이트의 세포내 이용가능성의 증가를 나타내는, 단계;
b) 상기 유전자 조작된 미생물을, 상기 목적 탄수화물의 생산을 허용하는 배양 배지에서 배양하는 단계로서, 상기 주요 탄소 공급원은 글루코스, 및 프럭토스 및 갈락토스의 그룹의 적어도 제2 단당류로 이루어진 단당류 혼합물인, 단계; 및
c) 상기 목적 탄수화물을 회수하는 단계를 포함하는, 방법. - 제13항에 있어서, 상기 목적 탄수화물이 만노스, 푸코스, N-아세틸글루코사민, N-아세틸만노사민, N-아세틸뉴라민산, 락토-N-비오스, N-아세틸-락토사민, 2'-푸코실락토스, 3-푸코실락토스, 2',3-디푸코실락토스, 혈액형 H 항원 유형 I(blood group H antigen type I), 혈액형 H 항원 유형 II, 혈액형 항원 루이스a,(Lewisa) 혈액형 항원 루이스b, 혈액형 항원 루이스x, 혈액형 항원 루이스y, 혈액형 항원 시알릴-루이스x, 락토-N-트리오스 II, 락토-N-테트라오스, 락토-N-네오테트라오스, 락토-N-푸코펜타오스 I, 락토-N-네오펜코-펜타오스 I, 락토-N-푸코펜타오스 II, 락토-N-푸코펜타오스 III, 락토-N-푸코-펜타오스 V, 락토-N-네오푸코펜타오스 V, 락토-N-디푸코헥사오스 I, 락토-N-디푸코헥사오스 II, 6'-갈락토실락토스, 3'-갈락토실락토스, 락토-N-헥사오스, 락토-N-네오헥사오스, 파라-락토-N-헥사오스, 파라-락토-N-네오헥사오스, 디푸코실-락토-N-네오헥사오스, 3'-시알릴락토스, 6'-시알릴락토스, 3'-시알릴-N-아세틸락토사민, 6'-시알릴-N-아세틸락토사민, 락토-N-시알릴펜타오스 a, 락토-N-시알릴펜타오스 b, 락토-N-시알릴펜타오스 c, 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 a, 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 b, 푸코실-락토-N-시알릴펜타오스 c, 디시알실-락토-N-테트라오스, 디시알실-락토-N-푸코펜타오스, 3-푸코실-3'-시알릴락토스, 3-푸코실-6'-시알릴락토스, 락토-N-네오디푸코헥사오스 I로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
- 의약 및/또는 영양 조성물의 제조를 위한, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 미생물 세포 및/또는 제13항 또는 제14항에 따른 방법에 의해 생산되는 목적 탄수화물의 용도.
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