CN114686541A

CN114686541A - 一种化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法及其应用

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Publication number: CN114686541A
Application number: CN202210187474.6A
Authority: CN
Inventors: 殷昊
Original assignee: Beijing Yanzhishan Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Yanzhishan Technology Co ltd
Priority date: 2022-02-28
Filing date: 2022-02-28
Publication date: 2022-07-01

Abstract

本发明的实施例公开了一种化妆品级己糖‑6‑磷酸组合物的生物酶法合成方法及其应用，方法包括：将多聚磷酸盐依赖型激酶的编码基因17转化于大肠杆菌中，构建基因工程菌I；将磷酸甘露糖异构酶的编码基因BSMPI转化于枯草芽孢杆菌中，构建基因工程菌II；将所述基因工程菌I和所述基因工程菌II联合发酵，制备复合酶粗酶液；将所述复合酶粗酶液进行酶催化反应，制备得到化妆品级己糖‑6‑磷酸组合物。本发明既无需对生物酶进行纯化，也无需对酶催化产品进行精制和干燥，极大的降低了生产应用成本；并且，通过细胞实验、皮肤测试等手段证实了本发明所述己糖‑6‑磷酸组合物具有良好的提高细胞能领代谢效率、促进皮肤修复与再生、减轻皮肤褶皱等效果。

Description

一种化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物组合物制备技术领域，特别涉及一种化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法及其应用。

背景技术

延缓皮肤衰老是很多化妆品所宣称的功效之一。皮肤衰老一般认为是包括外源性环境刺激、内源性基因衰减等多种因素共同作用的结果。目前此领域现有自由基学说、衰老基因学说、线粒体DNA损伤学说等对皮肤衰老现象进行理论解释和生理学验证。而无论哪一种理论或学说，其研究基础都是建立在皮肤体表细胞的新陈代谢作用之上的，涉及到线粒体的物质和能量代谢过程更是研究的重点之一。

另一方面，磷酸己糖是线粒体维持正常生理机能、为新陈代谢提供能量基础的重要物质之一。其在线粒体内主要代谢过程为：甘露糖-6-磷酸在磷酸甘露糖异构酶催化下得到果糖-6-磷酸，果糖-6-磷酸在磷酸果糖异构酶催化下得到葡萄糖-6-磷酸，三者并先后或同时参与到糖酵解、磷酸戊糖途径、糖元异生等生物物质代谢过程，并同时产生与能量代谢密切相关的ATP、NADPH等高能化合物，为生化过程提供物质和能量。

因此，越来越多的美白、抗皱等化妆品开发和应用研究关注于磷酸己糖的制备和应用。如WO-03/013448公开了包括甘露糖-6-磷酸在内的磷酸己糖可作为表皮剥脱素，并同时可以提高皮肤细胞中糖胺聚糖含量，改善皮肤色调、使皮肤变得圆润和充盈、修复老化皮肤等，从而改善皮肤的外观。专利WO-2010142957中提供了甘露糖-6-磷酸有减少皮肤发红的用途，能够作为美容的皮肤改善剂，同时对于受损皮肤也适用。

然而，由于参与代谢的途径的区别，不同的磷酸己糖参与细胞代谢的时效性并不相同。经研究发现，线粒体内果糖-6-磷酸可作为一级代谢物直接参与到ATP相关能量代谢过程中，并作为二级代谢物间接参与到NADPH相关能量代谢过程中；而甘露糖-6-磷酸虽然可以直接作用于细胞内溶酶体酶的糖基化修饰过程中，但在线粒体中需要转化为果糖-6-磷酸才能间接进入到能量代谢途径中。两者生化代谢的途径不同，使得其作为化妆品的抗衰老功能组分的效果产生了差别。

发明内容

有鉴于此，本发明实施例的目的在于提供一种化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法及其应用，基于现有催化甘露糖制备甘露糖-6-磷酸的己糖激酶生产基因工程菌株，将其与催化甘露糖-6-磷酸制备果糖-6-磷酸的磷酸甘露糖异构酶生产基因工程菌株相联合发酵，得到含己糖激酶和磷酸甘露糖异构酶的复合酶粗酶液，并以此在一定条件下催化底物甘露糖转化为甘露糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸的组合物，作为抗衰老化妆品的活性剂。

第一方面，本发明实施例提供了一种化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法，其中，包括：

S1，将多聚磷酸盐依赖型激酶的编码基因17转化于大肠杆菌(E.coli)中，构建基因工程菌I。

S2，将磷酸甘露糖异构酶的编码基因BSMPI转化于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中，构建基因工程菌II。

S3，将所述基因工程菌I和所述基因工程菌II联合发酵，制备复合酶粗酶液。

S4，将所述复合酶粗酶液进行酶催化反应，制备得到化妆品级己糖-6-磷酸组合物。

结合第一方面，本发明实施例提供了第一方面的第一种可能的实施方式，其中，S1中，所述基因工程菌I通过对节杆菌(Arthrobacter sp.KM)的多聚磷酸盐依赖型激酶的编码基因l7进行克隆与载体构建，将该基因载体转化于大肠杆菌(E.coli)中得到，可异源表达多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶。

结合第一方面，本发明实施例提供了第一方面的第二种可能的实施方式，其中，S2中，所述基因工程菌II通过对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis str.168)的磷酸甘露糖异构酶的编码基因BSMPI进行克隆与载体构建，将该基因载体转化于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中得到，可异源表达磷酸甘露糖异构酶。

结合第一方面，本发明实施例提供了第一方面的第三种可能的实施方式，其中，S3中所述联合发酵包括：

S31，将所述基因工程菌I和所述基因工程菌II接种至LB液体培养基中，进行有氧发酵，得到液态联合发酵产物。

S32，对所述液态联合发酵产物进行分离，得到复合酶粗酶液。

结合第一方面，本发明实施例提供了第一方面的第四种可能的实施方式，其中，S31中，所述基因工程菌I和所述基因工程菌II的接种比为1.0～5.0:1.0，优选为2.5～3.0:1.0。

结合第一方面，本发明实施例提供了第一方面的第五种可能的实施方式，其中，S31中，所述有氧发酵的条件为罐压0.05Mpa，空气流量3～5Nm³/h，优选为3.5～4.0Nm³/h，控制搅拌转速使溶氧于10～30％范围内保持稳定，保持30～37℃恒温，优选为25～30％。

结合第一方面，本发明实施例提供了第一方面的第六种可能的实施方式，其中，S32中，对所述液态联合发酵产物进行分离包括：

对所述液态联合发酵产物进行低温破碎和低温离心处理。

取上清液，得到包括己糖激酶和磷酸甘露糖异构酶的复合酶粗酶液。

对所述复合酶粗酶液进行低温保存备用。

结合第一方面，本发明实施例提供了第一方面的第七种可能的实施方式，其中，S32中，所述复合酶粗酶液中，所述己糖激酶含量为0.5～1.2U/mL，所述磷酸甘露糖异构酶含量为0.05～0.2U/mL，所述己糖激酶和所述磷酸甘露糖异构酶的含量比为3.0～5.0:1，优选为3.0～3.5:1。

结合第一方面，本发明实施例提供了第一方面的第八种可能的实施方式，其中，S4中所述酶催化反应包括：

将所述复合酶粗酶液与混合底物混合，得到复合酶催化体系。

所述复合酶催化体系进行酶催化反应，得到混合产物体系。

对所述混合产物体系进行低温离心分离，去除不溶物。

经膜过滤去除大分子蛋白。

分别进行阴、阳离子树脂交换，得到己糖-6-磷酸组合物。

结合第一方面，本发明实施例提供了第一方面的第九种可能的实施方式，其中，所述混合底物包括底物甘露糖、高能磷酸键供体、二价金属盐和水。

结合第一方面，本发明实施例提供了第一方面的第十种可能的实施方式，其中，所述酶催化反应的条件为搅拌和流加NaOH水溶液，恒温加热。

结合第一方面，本发明实施例提供了第一方面的第十一种可能的实施方式，其中，

所述底物甘露糖在所述复合酶催化体系中的浓度为0.05～0.2mol/L，优选为0.15～0.2mol/L。

所述高能磷酸键供体包括六偏磷酸钠、焦磷酸钠、三磷酸腺苷中的一种或几种。

所述高能磷酸键供体与所述底物甘露糖的摩尔比为1.0:0.3～7.0，优选为1.0:3.0～5.0。

结合第一方面，本发明实施例提供了第一方面的第十二种可能的实施方式，其中，

所述二价金属盐包括Mg2+、Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Ca2+、Cu2+及Zn2+的水溶性盐中的至少一种。

所述二价金属盐在所述复合酶催化反应体系中的浓度为0.5～10mmol/L，优选为4.0～5.0mmol/L。

结合第一方面，本发明实施例提供了第一方面的第十三种可能的实施方式，其中，所述底物甘露糖的添加量为20～300U/g，优选为80～100U/g甘露糖，按照己糖激酶酶活计。

结合第一方面，本发明实施例提供了第一方面的第十四种可能的实施方式，其中，所述酶催化反应的温度为15～40℃，优选为35～40℃，反应时间为1～12h，优选为8～10h，通过流加1mol/L的NaOH水溶液改变所述混合产物体系的pH值在8.0～8.5之间。

结合第一方面，本发明实施例提供了第一方面的第十五种可能的实施方式，其中，所述化妆品级己糖-6-磷酸组合物包含甘露糖-6-磷酸1.4～8.0wt％、果糖-6-磷酸0.7～2.0wt％、甘露糖0.3～4.0wt％、小分子多肽0.02～0.05wt％，其余质量分数为水。

第二方面，本发明实施例还提供了一种化妆品活性剂，包括如前所述的化妆品级己糖-6-磷酸组合物，还包括多元醇。

结合第二方面，本发明实施例提供了第二方面的第一种可能的实施方式，其中，各组分配比为甘露糖-6-磷酸0.7～4.0wt％、果糖-6-磷酸0.35～1.0wt％、甘露糖0.15～2.0wt％、磷酸钠≤0.2wt％、小分子多肽0.02～0.05wt％、水Qsp 100wt％和多元醇≤50wt％。

其中，甘露糖-6-磷酸与果糖-6-磷酸的摩尔比为3.0～5.0:1，优选为3.0～3.5:1。

其中，甘露糖-6-磷酸与甘露糖的摩尔比为1.0～2.0:1，优选为1.3～1.5:1。

结合第二方面，本发明实施例提供了第二方面的第二种可能的实施方式，其中，所述多元醇包括乙二醇、丙二醇、丁二醇、己二醇和甘油中的至少一种。

第三方面，本发明实施例还提供了一种抗衰老的化妆品组合物，其中，包括如前所述的化妆品活性剂，还包括化妆品溶剂、赋形剂和/或辅助剂。

其中，本发明所述化妆品中可接受的溶剂、赋形剂和/或其他辅助剂包括但不限于可影响本发明的化妆品活性剂的感官特性、皮肤渗透性和生物利用度的成分。更具体地，其包括：溶剂，诸如水或油，其中油包括石油、动物油、植物油或合成油，诸如但不限于花生油、大豆油、矿物油、芝麻油、蓖麻油；表面活性剂，诸如但不限于聚山梨醇酯、山梨坦酯；生物活性成分，诸如但不限于甜菜碱、糖苷、麦芽糖苷；增稠剂，诸如但不限于脂肪醇、壬苯醇醚、聚氧乙烯、聚乙二醇等。

其中，采用细胞实验、皮肤测试等方式，分析和比较了所述抗衰老化妆品组合物的功效。

本发明实施例的有益效果是：

1.本发明所提供的化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法及其应用，基于己糖激酶生产基因工程菌和磷酸甘露糖异构酶生产基因工程菌的联合发酵培养所得到的复合酶粗酶液，以甘露糖为底物，催化磷酸供体的高能磷酸键转移到己糖中，得到以甘露糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸和甘露糖为主要功能组分的己糖-6-磷酸组合物，并辅以多种助剂得到抗衰老化妆品活性剂以及抗衰老化妆品组合物。

2.本发明所述磷酸己糖由基因工程菌所制备的粗酶液进行生物催化得到，省去了传统酶催化工艺中己糖激酶和磷酸甘露糖异构酶的分离纯化过程，极大的减少了工艺路线、降低了工艺难度、节省了生产成本。

3.基于本发明所述的抗衰老妆品活性剂以及抗衰老化妆品组合物的应用方式，使得本发明所述己糖-6-磷酸组合物的产品维持生物催化反应体系的水溶液状态即可，免去了甘露糖-6-磷酸及果糖-6-磷酸的结晶、干燥等纯化工艺，同样减少了工艺路线、降低了工艺难度、节省了生产成本。

4.本发明所提供的己糖-6-磷酸组合物所包含的甘露糖-6-磷酸和果糖-6-磷酸两种功能性组分，相对于单一功能组分产物，应用于抗衰老化妆品中能够互相促进以达到更好的功能性和更优的时效。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法的流程图；

图2为本发明四因素三水平正交分析效应曲线图；

图3为本发明人皮肤成纤细胞毒性试验(对NHDFs细胞存活率的影响)示意图；

图4为本发明体外线粒体能量代谢功效评价(表皮细胞HaCaT线粒体活性及增殖能力)示意图；

图5为本发明体外能量代谢功效评价(表皮细胞HaCaT中ATP含量测定)示意图；

图6为本发明体外皮肤修复与再生功效评价(NHDFs细胞增殖能力)示意图；

图7为本发明体外紧致抗皱功效评价(胶原蛋白I含量)示意图；

图8为本发明体外抗衰老功效评价(羟脯氨酸含量测定)示意图；

图9为本发明体外抗氧化功效评价(DPPH自由基清除能力测定)示意图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件能够以各种不同的配置来布置和设计。

实施例一：基因工程菌I发酵制备己糖激酶粗酶液

(1)菌体发酵：

将所述可异源表达多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的基因工程菌I接种至50mL的LB液体培养基(50mg/L Kana)中，发酵8h，温度37℃，搅拌转速180rpm；再将发酵产物按照1‰接种到2L的LB液体培养基(50mg/L Kana)中，在温度30℃、pH为7的条件下，控制空气流量为4Nm³/h；待发酵体系溶氧稳定在10％后，添加诱导剂IPTG，并维持上述发酵条件12h，得到发酵液。

(2)粗酶液制备：

将所述发酵液在4℃、转速8000rpm条件下离心并收集菌体，并用pH为8、浓度为0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液重悬细胞；将重悬好的菌液在0℃下使用细胞破碎仪对其进行细胞破碎，破胞时间为3s，间隔3s，总破胞时间为210s；将破碎后的蛋白溶液4℃、转速8000rpm条件下离心，取上清即己糖激酶粗酶液。

(3)酶活测定：

准确量取1mL所述粗酶液、0.4mL甘露糖水溶液(400g/L)、0.6mL(NaPO3)6水溶液(400g/L)加入到10mL离心管中，准确称取5mM MgCl2加入其中并完全溶解，以0.1M Tris–HCl(pH 8.5)缓冲液将反应体系定容为4mL。将装有上述反应体系的离心管置于30℃恒温水浴中，反应10min后，用100℃沸水处理3min使酶失活，得到待测样品。

将所述待测样品稀释1000倍后，取样并用K-MANGL试剂盒检测其中的甘露糖-6-磷酸，其结果为0.593mg/L。若将酶活单位U定义为每mL体积酶液可在1min内转化1μmol底物(单位μmol/mL)，则根据公式：

U＝(甘露糖6磷酸检测值×1000×4×1000)/(1000×260×10)

可计算得到所述己糖激酶粗酶液的酶活为0.91U。

实施例二：基因工程菌II发酵制备磷酸甘露糖异构酶粗酶液

菌体发酵：

将所述可异源表达磷酸甘露糖异构酶的基因工程菌II接种至50mL的LB液体培养基(50mg/L Kana)中，发酵8h，温度37℃，搅拌转速180rpm；再将发酵产物按照0.5‰接种到2L的LB液体培养基(50mg/L Kana)中，在温度30℃、pH为7的条件下，控制空气流量为4Nm³/h；待发酵体系溶氧稳定在10％后，添加诱导剂IPTG，并维持上述发酵条件12h，得到发酵液。

粗酶液制备：

按照如实施例一所述方法进行。

酶活测定：

准确量取1mL所述粗酶液、0.4mL甘露糖-6-磷酸水溶液(150g/L)加入到10mL离心管中，准确称取5mM MgCl2加入其中并完全溶解，以0.1M Tris–HCl(pH 8.5)缓冲液将反应体系定容为4mL。将装有上述反应体系的离心管置于30℃恒温水浴中，反应10min后，用100℃沸水处理3min使酶失活，得到待测样品。

将所述上清液稀释100倍后，取样并用K-MANGL试剂盒检测其中的果糖-6-磷酸，其结果为0.508mg/L。若将酶活单位U定义为每mL体积酶液可在1min内转化1μmol底物(单位μmol/mL)，则根据公式：

U＝(果糖6磷酸检测值×100×4×1000)/(1000×260×10)

可计算得到所述磷酸甘露糖异构酶粗酶液的酶活为0.086U。

实施例三：混合酶粗酶液的联合发酵制备

(1)菌体发酵：

将所述可异源表达多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的基因工程菌I接种至50mL的LB液体培养基(50mg/L Kana)中；同时将所述可异源表达磷酸甘露糖异构酶的基因工程菌II接种至50mL的LB液体培养基(50mg/LKana)中；两者的发酵条件均为37℃、8h、180rpm；再将基因工程菌I的发酵产物按照1‰、基因工程菌II的发酵产物按照0.5‰接种到2L的LB液体培养基(50mg/L Kana)中，在温度30℃、pH为7的条件下，控制空气流量为4Nm³/h；待发酵体系溶氧稳定在10％后，添加诱导剂IPTG，并维持上述发酵条件12h，得到发酵液。

(2)粗酶液制备：

按照如实施例一所述方法进行。

(3)酶活测定：

准确量取1mL所述粗酶液、0.4mL甘露糖水溶液(400g/L)、0.6mL(NaPO₃)6水溶液(400g/L)加入到10mL离心管中，准确称取5mM MgCl2加入其中并完全溶解，以0.1M Tris–HCl(pH 8.5)缓冲液将反应体系定容为4mL。将装有上述反应体系的离心管置于30℃恒温水浴中，反应12h后用0.2mol/L CaCl2去除过量的(NaPO₃)₆，并离心取上清液。所述上清液中含反应得到的甘露糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸和未反应的甘露糖。

将所述上清液稀释1000倍后，取样用K-MANGL试剂盒检测其中的甘露糖-6-磷酸含量，其结果为0.589mg/L。按实施例1所述定义，可计算得到所述混合酶粗酶液中己糖激酶的酶活为0.91U。

另外，将所述上清液稀释100倍后，取样用K-MANGL试剂盒检测其中的果糖-6-磷酸含量，其结果为0.513mg/L。按实施例1所述定义，可计算得到所述混合酶粗酶液中磷酸甘露糖异构酶的酶活为0.082U。

将实施例三的结果与实施例一和二相对比(见表1)，可知相对于单独发酵，联合发酵的两种基因工程菌基本无相互竞争和抑制，其发酵产物的酶活基本无变化。

表1 联合发酵产物酶活对比

实施例四：联合发酵的中试放大

(1)菌体发酵中试放大：

将所述可异源表达多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶的基因工程菌I接种至50mL的LB液体培养基(50mg/L Kana)中；同时将所述可异源表达磷酸甘露糖异构酶的基因工程菌II接种至50mL的LB液体培养基(50mg/LKana)中；两者的发酵条件均为37℃、8h、180rpm；再将基因工程菌I的发酵产物按照1‰、基因工程菌II的发酵产物按照0.5‰接种到3个2L的LB液体培养基((50mg/L Kana))中，共6L，发酵3.5h，温度37℃，转速180rpm；最后将其接种到100L发酵罐中，进行60L的大肠杆菌高密度发酵。

发酵培养基如表2，其中流加的碳源为50％甘油，灭菌方式选择实消，磷酸盐与培养基其他成分分开灭菌；发酵温度30℃；pH值为7，利用氨水进行调节；罐压0.05MPa；空气流量4Nm³/h；初始转速为150rpm，随着大肠杆菌的生长，溶氧低至30时，提升转速，直至300rpm；溶氧降到零并开始反弹时，流加50％甘油，将溶氧稳定在10左右；当添加诱导剂IPTG后，发酵温度变化至25℃；发酵过程中每隔一小时取样，检测菌体生长情况，记录OD600数值，并通过显微镜观察菌体的生长情况。添加诱导剂后发酵12h下罐。

表2 大肠杆菌高密度发酵培养基

粗酶液制备：

按照如实施例一所述方法进行。

酶活测定：

依照实施例三所述方法，可以测得复合酶粗酶液中己糖激酶酶活为0.89U，磷酸甘露糖异构酶的酶活为0.078U。对比实施例三的结果，可知本发明所述联合发酵工艺可以进行工业化放大生产，且控制工艺条件后的放大生产对产物酶活的影响不大。

实施例五：酶催化己糖-6-磷酸反应的正交优化

以实施例三所述复合酶粗酶液为酶催化剂，以甘露糖为底物、六偏磷酸钠(两者摩尔比1:1.2)为高能磷酸键供体，在水溶液中及Mg²⁺(浓度为0.7mmol/L)存在下恒温加热30℃下反应一定时间，得到己糖-6-磷酸酶催化产物。所述己糖-6-磷酸酶催化产物经膜过滤后，再先后经过阴离子、阳离子树脂柱去除部分离子，得到己糖-6-磷酸组合物。所述己糖-6-磷酸组合物经液质联用分析仪检测，结果显示其主要组成为甘露糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、甘露糖、小分子多肽、水和少量磷酸盐。

对上述酶催化反应条件进行分析，以粗酶液浓度(A)、甘露糖浓度(B)、反应温度(C)、反应时间(D)这四个因素作为自变量，以被转化的甘露糖量(转化率，％)作为因变量，设计四因素三水平实验(表3)，并利用正交分析优化酶催化反应条件(表4)。

表3 四因素三水平实验表

表4 酶催化反应工艺条件的正交分析

由表3、4可见，由均值Kj可知，酶催化反应的最优条件为A2B2C2D2,；由R和F0.05可知，粗酶液浓度为影响酶催化反应的显著性因素，而甘露糖浓度、反应温度、反应时间则为非显著性因素。该结果也可通过效应曲线图(图2)直观的看出。

实施例六：抗衰老化妆品活性剂的制备

将实施例五方法得到的己糖-6-磷酸溶液在蒸汽加热90℃条件下，灭菌30min。所得到的灭菌溶液按质量比1:1加入甘油作为抑菌组分，得到抗衰老妆品活性剂，低温、避光保存。

实施例七：抗衰老化妆品组合物的制备

将实施例六方法得到的抗衰老化妆品活性剂与溶剂、赋形剂和其他辅助剂按先后顺序混合，搅拌均匀后得到抗衰老化妆品组合物，其配方见表5。

表5 美白/抗皱化妆品组合物配方

实施例八：安全性评价

(1)化妆品眼刺激性/腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验

依据中华人们共和国出入境检验检疫行业标准SN/T2329-2009《化妆品眼刺激性/腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验》，将实施例一、二、三得到粗酶液按实施例五所述方法分别制备得到己糖-6-磷酸，并进行安全性评价。试验所需材料和设备包括：白莱杭鸡SPF级受精鸡胚、NaCl、SDS、孵化箱、体式显微镜、混匀仪。孵化条件为：相对湿度52％、孵化温度37.5℃、相对湿度60％、转盘频率3次/h。试验样品经0.9％NaCl水溶液稀释至2.5％浓度后，分别采用终点评价法和反应时间法进行检测。试验另设置阴性对照：0.9％NaCl水溶液，阳性对照：1％SDS。

试验方法包括：

(a)CAM制备、实验前测试和预实验按照前述行业标准SN/T2329-2009进行；

(b)终点评价法：取固体受试物直接作用于CAM，确保至少50％的CAM表面被受试物覆盖。作用3min后，用生理盐水轻轻冲洗CAM受试物，冲洗后约30s后观察每种毒性效应变化的程度。根据毒性效应变化程度，依据下列公式计算终点评分(ES)：

ES＝6只鸡胚观察到的出血、凝血和血管融解程度的总和

其中，ES≤12为无/轻刺激性、12<ES<16为中度刺激性、ES≥16为强刺激性/腐蚀性。

(c)反应时间法：取经过样品0.3mL直接滴加于膜表面，观察CAM反应情况，并记录作用5min内每种毒性效应出现的时间。根据毒性效应出现时间，采用刺激评分法，依据下列公式计算终点评分(IS)：

IS＝((301-secH)×5)/300+((301-secL)×7)/300+((301-secC)×9)/300

其中，sec H为出血时间，即CAM膜上观察到开始发生出血的平均时间；sec L为血管融解时间，即CAM膜上观察到开始发生血管融解的平均时间；sec C为凝血时间，即CAM膜上观察到开始出现凝血的平均时间。并且，IS<1为无刺激性、1≤IS<5为轻刺激性、5≤IS<9为中度刺激性、IS≥10为强刺激性/腐蚀性。

上述试验结果见表6，可见实施例一、二、三所制备的己糖-6-磷酸样品无论终点评价法还是反应时间法均无刺激性。

表6 鸡胚绒毛尿囊膜试验评价结果

(2)人皮肤成纤细胞毒性试验

将实施例一、二、三得到粗酶液按实施例五所述方法分别制备得到己糖-6-磷酸，考察其对人皮肤成纤细胞的细胞毒性作用，以进行安全性评价。试验所需材料和设备包括：人皮肤成纤细胞(NHDFs)、PBS、FM培养基、DMEM培养基、0.25％胰蛋白酶、CCK-8试剂盒、CO₂培养箱、生物安全柜、倒置显微镜、酶标仪、水浴锅、混匀仪。测试样品经培养基稀释，分别得到浓度为0.20、0.40、1.00、1.50、2.00(％，W/V)的待测样品，并以未处理细胞作为阴性对照。

试验方法包括：

(a)收集对数生长期细胞，按照细胞密度为8×103个/孔接种至96孔板，每孔含培养液100μL。

(b)在培养箱(37℃，5％CO₂)中培养24h后，将不同浓度的待测样品和阴性对照加入其中，且每组设置3个重复孔。

(c)在培养箱(37℃，5％CO₂)中继续培养48h后，进行CCK-8试验，于450nm下检测吸光度OD值，按下述公式计算细胞存活率，其中空白孔中仅添加含CCK-8的培养基：

细胞存活率％＝(给药孔OD-空白孔OD)/(对照孔OD-空白孔OD)×100％

上述试验结果见图3。可见，相对于阴性对照组，试验样品在低浓度范围内的细胞毒性很小。

实施例九：体外功效评价

(1)体外线粒体能量代谢功效评价(表皮细胞HaCaT线粒体活性及增殖能力)

将实施例一、二、三得到粗酶液按实施例五所述方法分别制备得到己糖-6-磷酸，考察其对表皮细胞HaCaT线粒体活性及增殖能力的影响，以进行线粒体能量代谢功效评价及体外功效评价。试验所需材料和设备包括：HaCaT细胞、DK-SFM培养基、0.25％胰蛋白酶、PBS、XTT、PMS、维生素A、CO2培养箱、生物安全柜、倒置显微镜、酶标仪、离心机、水浴锅。测试样品经培养基稀释，分别得到浓度为0.01、0.20、1.00、2.00、10.00(％，W/V)的待测样品，并以未加入待测样品作为阴性对照，以0.1％维生素A为阳性对照。

试验方法包括：

(a)细胞复苏及培养：将冻存的HaCaT细胞接种于培养瓶中，第二天换液，以后为隔天换液，培养时间约7d至细胞融合约达80％。将细胞铺于96孔板中，8000个/孔，培养24h。

(b)细胞加药：将不同浓度的待测样品和阴性对照分别加入到培养基中，每组六个复孔，培养72h。

(c)XTT试剂配制及检测：用60℃预热培养液将XTT配制成0.2mg/mL的溶液，过滤除菌，现配现用；用PBS配制成5mmol/L吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)；XTT与PMS按200:1混合得到XTT/PMS溶液；将96孔板中的细胞培养液移除，并在每孔中加入XTT/PMS溶液125μL，混匀后再培养2h，以酶标仪在450nm处测定光吸光度。

上述试验结果见图4。可见，相对于阴性对照组，试验样品在低浓度范围内对人皮肤成纤细胞的细胞增殖能力具有较好的促进作用，且较高浓度下对人皮肤成纤细胞的细胞增殖能力优于阳性对照；同时，实施例三所得到的样品优于相同条件下实施例一和二样品的检测结果。

(2)体外能量代谢功效评价(表皮细胞HaCaT中ATP含量测定)

将实施例一、二、三得到粗酶液按实施例五所述方法分别制备得到己糖-6-磷酸，考察其对表皮细胞HaCaT中ATP含量的影响，以进行能量代谢功效评价及体外功效评价。试验所需材料和设备包括：HaCaT细胞、DK-SFM培养基、0.25％胰蛋白酶、PBS、维生素A、ATP检测试剂盒、CO₂培养箱、生物安全柜、倒置显微镜、荧光/化学发光酶标仪、离心机、细胞计数板。测试样品经培养基稀释到浓度为1.00(％，W/V)作为待测样品，并以未加入待测样品作为阴性对照，以0.1％维生素A为阳性对照。

试验方法包括：

(b)细胞加药：将不同浓度的待测样品和阴性对照分别加入到培养基中，每组六个复孔，培养36h。

(c)ATP含量检测：严格按照ATP检测试剂盒的操作方法，使用亮度计测量荧光亮度。

上述试验结果见图5。可见，相对于阴性对照组，试验样品在低浓度范围内对人皮肤成纤细胞的细胞增殖能力具有较好的促进作用，且较高浓度下对人皮肤成纤细胞的细胞增殖能力优于阳性对照；同时，实施例3所得到的样品优于相同条件下实施例一和二样品的检测结果。

(3)体外皮肤修复与再生功效评价(NHDFs细胞增殖能力)

将实施例一、二、三得到粗酶液按实施例五所述方法分别制备得到己糖-6-磷酸，考察其对人皮肤成纤细胞的细胞增殖能力，以进行体外皮肤修复与再生功效评价。试验所需材料和设备包括：人皮肤成纤细胞(NHDFs)、PBS、FM培养基、DMEM培养基、0.25％胰蛋白酶、BrdU试剂盒、CO2培养箱、生物安全柜、倒置显微镜、酶标仪、水浴锅、混匀仪。测试样品经培养基稀释，分别得到浓度为0.20、0.40、1.00、1.50、2.00(％，W/V)的待测样品，并以10％PBS作为阳性对照、以未处理细胞作为阴性对照、以不做BrdU处理作为空白对照。

试验方法包括：

(b)在培养箱(37℃，5％CO2)中培养24h后，将不同浓度的待测样品和阴性对照加入其中，且每组设置6个重复孔。

(c)在培养箱(37℃，5％CO2)中继续培养48h后，进行BrdU试验，每个浓度设置3个背景对照，于450/690nm下检测吸光度OD值，且空白对照平均OD值应小于1。按下述公式计算细胞相对增殖能力：

细胞相对增殖能力％＝(给药孔OD-给药背景OD)/(溶剂对照孔OD-溶剂对照背景OD)×100％

上述试验结果见图6。可见，相对于阴性对照组，试验样品在低浓度范围内对人皮肤成纤细胞的细胞增殖能力具有较好的促进作用，且较高浓度下对人皮肤成纤细胞的细胞增殖能力优于阳性对照；同时，实施例三所得到的样品优于相同条件下实施例一和二样品的检测结果。

(4)体外紧致抗皱功效评价(胶原蛋白I含量测定)

将实施例一、二、三得到粗酶液按实施例五所述方法分别制备得到己糖-6-磷酸，考察其对人皮肤成纤细胞中胶原蛋白I含量的影响，以进行体外紧致抗皱功效评价。试验所需材料和设备包括：人皮肤成纤细胞(NHDFs)、PBS、FM培养基、I型胶原蛋白ELISA试剂盒、维生素C、0.25％胰蛋白酶、CO2培养箱、生物安全柜、倒置显微镜、酶标仪、水浴锅、混匀仪。测试样品经培养基稀释至0.32(％，W/V)，并以100μg/mL维生素C作为阳性对照、以未处理细胞作为阴性对照、以反应体系试剂及溶剂作为空白对照。

试验方法包括：

(a)收集对数生长期细胞，按照细胞密度为6×104个/孔接种至12孔板，每孔含培养液100μL。

(b)在培养箱(37℃，5％CO2)中培养24h后，将不同浓度的待测样品和阴性对照加入其中，且每组设置4个重复孔。

(c)在培养箱(37℃，5％CO2)中继续培养48h后，收集培养液，采用Col I ELISA试剂盒进行培养液中I型胶原蛋白含量的检测，按下述公式计算I型胶原蛋白相对于空白对照的相对含量：

I型胶原蛋白相对含量＝给药孔胶原蛋白含量/空白对照胶原蛋白含量

上述试验结果见图7。可见，相对于阴性对照组，试验样品对提高人皮肤成纤细胞的I型胶原蛋白含量具有较好的促进作用，且同样优于阳性对照；同时，实施例三所得到的样品略优于相同条件下实施例一和二样品的检测结果。

(5)体外抗衰老功效评价(羟脯氨酸含量测定)

将实施一、二、三得到粗酶液按实施例五所述方法分别制备得到己糖-6-磷酸，考察其对人皮肤成纤细胞中羟脯氨酸含量的影响，以进行胶原蛋白含量评价及体外抗皱功效评价。试验所需材料和设备包括：人皮肤成纤细胞(NHDFs)、DMEM培养基、0.25％胰蛋白酶、PBS、维生素A、羟脯氨酸试剂盒、CO2培养箱、生物安全柜、倒置显微镜、酶标仪、离心机、细胞计数板、分光光度计。测试样品经培养基稀释到浓度为10.0(％，W/V)作为待测样品，并以未加入待测样品作为阴性对照，以0.1％维生素A为阳性对照。

试验方法包括：

(a)细胞复苏及培养：将冻存的细胞接种于培养瓶中，次天换液并以后隔天换液，培养时间4d至细胞融合约达80％。之后将细胞铺板于12孔板，接种量为1.5×105个/孔，培养24h。。

(b)细胞加药：分别设置阴性对照组以及加药组，每组3个复孔，培养72h。

(c)羟脯氨酸含量的测定：根据试剂盒组成与配制方法进行配置，直接取细胞培养液进行检测，按下述公式计算羟脯氨酸含量含量：

羟脯氨酸含量(μg/mL)＝((测定管吸光度-空白管吸光度))/((标准管吸光度-空白管吸光度))×标准管浓度×样本测试前稀释倍数

上述试验结果见图8。可见，相对于阴性对照组，试验样品对提高人皮肤成纤细胞的I型胶原蛋白含量具有较好的促进作用，且同样优于阳性对照；同时，实施例三所得到的样品略优于相同条件下实施例一和二样品的检测结果。

(6)体外抗氧化功效评价(DPPH自由基清除能力测定)

将实施例一、二、三得到粗酶液按实施例五所述方法分别制备得到己糖-6-磷酸，考察其对DPPH自由基清除能力的影响，以进行体外抗氧化功效评价。试验所需材料和设备包括：DDPH、维生素C、无水乙醇、酶标仪、混匀仪。测试样品经蒸馏水稀释，分别得到浓度为0.20、0.40、1.00、1.50、2.00(％，W/V)的待测样品，并以未加入样品的反应体系作为阴性对照。

试验方法包括：

(a)以维生素C作为体系参考品，经蒸馏水分别稀释至5、10、20、40、80μg/mL后，按表7中各试剂添加量配置反应体系并混匀后，将其置于室温下并避光反应20min。

表7 DDPH自由基清除试验反应体系

反应结束后依次取反应液200μL加入到96孔板，于517nm下读取吸光度OD值，并按照下述公式计算样品对DPPH自由基的清除率，其中A1为空白有DPPH体系的吸光度值、A2为空白无DPPH体系的吸光度值、T1为样品组有DPPH体系的吸光度值、T2为样品组无DPPH体系的吸光度值：

样品对DPPH自由基的清除率％＝((A1-A2)-(T1-T2))/((A1-A2))×100％

根据上述检测结果，以参考品浓度为x轴、DPPH自由基清除率为y轴，绘制体系参考品维生素C的DPPH自由基清除参考曲线。其结果见表8。

表8 不同浓度维生素C的DPPH自由基清除率

依据上述结果，通过拟合可得到曲线方程为：y＝Ymin+A[1-e^(-k*x)]，其中，Ymin＝53.79919，k＝0.10626，r^2＝0.99900，其偏差在合理范围内。

(b)将不同浓度的样品分别按照表9的各试剂添加量配制得到反应体系，并混匀后将其置于室温下并避光反应20min。反应结束后依次取反应液200μL加入到96孔板，于517nm下读取吸光度OD值，并按照前述公式计算样品对DPPH自由基的清除率，其结果见图9。可见，相对于阴性对照组，样品对DPPH自由基的清除率表现优秀，且实施例三所得到的样品清除效果较其它两个样品更好。

实施例九：人体皮肤实验

(1)人体皮肤斑贴试验(封闭型)

依据《化妆品安全技术规范》(2015版)要求，将实施例一、二、三得到粗酶液按实施例五所述方法分别制备得到己糖-6-磷酸，按实施例七所述方法分别制备得到美白/抗皱化妆品组合物作为测试样品，以去离子水为空白对照品，检测受试产品引起人体皮肤不良反应的潜在可能性。

所述试验以Finn Chambers on Scanpor(D-8mm)为斑试器，选取志愿者32名(女性29名，年龄22～59岁，平均年龄34.5岁；男性3名，年龄分别为27岁、31岁、55岁)，测试区域为背部，贴敷时间为24h。评价时间点选取去除斑试器后0.5h、24h、48h，由皮肤科医生检查测试区和对照区的皮肤反应。测试结果见表9，其结果均判定有效，可见与空白对照相比，3组试验配方的人体皮肤斑贴实验结果良好。

表9 人体皮肤斑贴试验评估统计结果

*：--为阴性反应；

±为可疑反应，仅有微弱红斑；

+为弱阳性反应(红斑反应)，红斑、浸润、水肿、可有丘疹；

++为强阳性反应(疱疹反应)，红斑、浸润、水肿、丘疹、疱疹，反应可超出受试区；

+++为极强阳性反应(融合性疱疹反应)，明显红斑、严重浸润、水肿、融合性疱疹，反应超出受试区。

(2)人体皮肤抗皱实验

将实施例一、二、三得到粗酶液按实施例五所述方法分别制备得到己糖-6-磷酸，按实施例7所述方法分别制备得到美白/抗皱化妆品组合物，以无己糖-6-磷酸为空白对照品，寻找42名志愿者(女性，年龄45～59岁，平均年龄53.1岁)并平均分成4组以对应上述试验组和对照组。

测试方法为：测试温度20-22℃，湿度40-60％，志愿者面部必须存在皱纹，受试部位为双侧外眼角，每天涂抹两次(早晚各一次)，测试时间为28天和56天。采用VISIA CR面部分析仪，进行面部图像采集，并统计鱼尾纹减少率。

测试结果见表10。可见与空白对照相比，3组试验配方的人体皮肤抗皱实验结果表现良好，其中实施例三的样品最优。

表10 人体皮肤抗皱实验结果

在本发明中的提到的任何数值，如果在任何最低值和任何最高值之间只是有两个单位的间隔，则包括从最低值到最高值的每次增加一个单位的所有值。例如，如果声明一种组分的量，或诸如温度、时间等工艺变量的值为50-90，在本说明书中它的意思是具体列举了51-89、52-88……以及69-71以及70-71等数值。对于非整数的值，可以适当考虑以0.1、0.01、0.001或0.0001为一单位。这仅是一些特殊指明的例子。在本申请中，以相似方式，所列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能组合都被认为已经公开。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims

1.一种化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法，其特征在于，包括：

S1，将多聚磷酸盐依赖型激酶的编码基因17转化于大肠杆菌(E.coli)中，构建基因工程菌I；

S2，将磷酸甘露糖异构酶的编码基因BSMPI转化于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中，构建基因工程菌II；

S3，将所述基因工程菌I和所述基因工程菌II联合发酵，制备复合酶粗酶液；

2.根据权利要求1所述的化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法，其特征在于，

S1中，所述基因工程菌I通过对节杆菌(Arthrobacter sp.KM)的多聚磷酸盐依赖型激酶的编码基因17进行克隆与载体构建，将该基因载体转化于大肠杆菌(E.coli)中得到，可异源表达多聚磷酸盐依赖型甘露糖激酶。

3.根据权利要求1所述的化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法，其特征在于，

S2中，所述基因工程菌II通过对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis str.168)的磷酸甘露糖异构酶的编码基因BSMPI进行克隆与载体构建，将该基因载体转化于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中得到，可异源表达磷酸甘露糖异构酶。

4.根据权利要求1所述的化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法，其特征在于，S3中所述联合发酵包括：

S31，将所述基因工程菌I和所述基因工程菌II接种至LB液体培养基中，进行有氧发酵，得到液态联合发酵产物；

5.根据权利要求4所述的化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法，其特征在于，S31中，所述基因工程菌I和所述基因工程菌II的接种比为1.0～5.0∶1.0。

6.根据权利要求4所述的化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法，其特征在于，S31中，所述有氧发酵的条件为罐压0.05Mpa，空气流量3～5Nm³/h，控制搅拌转速使溶氧于10～30％范围内保持稳定，保持30～37℃恒温。

7.根据权利要求4所述的化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法，其特征在于，S32中，对所述液态联合发酵产物进行分离包括：

对所述液态联合发酵产物进行低温破碎和低温离心处理；

取上清液，得到包括己糖激酶和磷酸甘露糖异构酶的复合酶粗酶液；

对所述复合酶粗酶液进行低温保存备用。

8.根据权利要求7所述的化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法，其特征在于，S32中，所述复合酶粗酶液中，所述己糖激酶含量为0.5～1.2U/mL，所述磷酸甘露糖异构酶含量为0.05～0.2U/mL，所述己糖激酶和所述磷酸甘露糖异构酶的含量比为3～10∶1。

9.根据权利要求1所述的化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法，其特征在于，S4中所述酶催化反应包括：

将所述复合酶粗酶液与混合底物混合，得到复合酶催化体系；

所述复合酶催化体系进行酶催化反应，得到混合产物体系；

对所述混合产物体系进行低温离心分离，去除不溶物；

经膜过滤去除大分子蛋白；

分别进行阴、阳离子树脂交换，得到己糖-6-磷酸组合物。

10.根据权利要求9所述的化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法，其特征在于，所述混合底物包括底物甘露糖、高能磷酸键供体、二价金属盐和水。

11.根据权利要求9所述的化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法，其特征在于，所述酶催化反应的条件为搅拌和流加NaOH水溶液，恒温加热。

12.根据权利要求10所述的化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法，其特征在于，

所述底物甘露糖在所述复合酶催化体系中的浓度为0.1～0.5mol/L；

所述高能磷酸键供体包括六偏磷酸钠、焦磷酸钠、三磷酸腺苷中的一种或几种；

所述高能磷酸键供体与所述底物甘露糖的摩尔比为1.0∶0.3～7.0。

13.根据权利要求10所述的化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法，其特征在于，

所述二价金属盐包括Mg2+、Mn2+、Fe2+、Co2+、Ni2+、Ca2+、Cu2+及Zn2+的水溶性盐中的至少一种；

所述二价金属盐在所述复合酶催化反应体系中的浓度为0.5～10mmol/L。

14.根据权利要求10所述的化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法，其特征在于，所述底物甘露糖的添加量为20～300U/g，按照己糖激酶酶活计。

15.根据权利要求11所述的化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法，其特征在于，所述酶催化反应的温度为15～40℃，反应时间为1～12h，通过流加1mol/L的NaOH水溶液改变所述混合产物体系的pH值在8.0～8.5之间。

16.根据权利要求1所述的化妆品级己糖-6-磷酸组合物的生物酶法合成方法，其特征在于，所述化妆品级己糖-6-磷酸组合物包含甘露糖-6-磷酸1.4～8.0wt％、果糖-6-磷酸0.7～2.0wt％、甘露糖0.3～4.0wt％、小分子多肽0.02～0.05wt％，其余质量分数为水。

17.一种化妆品活性剂，其特征在于，包括如权利要求1-16任一项所述的化妆品级己糖-6-磷酸组合物，还包括多元醇。

18.根据权利要求17所述的化妆品活性剂，其特征在于，各组分配比为甘露糖-6-磷酸0.7～4.0wt％、果糖-6-磷酸0.35～1.0wt％、甘露糖0.15～2.0wt％、磷酸钠≤0.2wt％、小分子多肽0.02～0.05wt％、水Qsp 100wt％和多元醇≤50wt％。

19.根据权利要求17所述的化妆品活性剂，其特征在于，所述多元醇包括乙二醇、丙二醇、丁二醇、己二醇和甘油中的至少一种。

20.一种抗衰老的化妆品组合物，其特征在于，包括如权利要求17所述的化妆品活性剂，还包括化妆品溶剂、赋形剂和/或辅助剂。