KR20190114633A

KR20190114633A - 항주름용 화장료 조성물 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR20190114633A
Application number: KR1020180037628A
Authority: KR
Inventors: 김학주
Original assignee: 주식회사 서진바이오텍
Priority date: 2018-03-30
Filing date: 2018-03-30
Publication date: 2019-10-10

Abstract

본 발명은 해양 미생물의 일종인 슈도알테로모나스 속(Pseudoalteromonas sp.)의 추출물, 특히 탄소원 함유 배지 중에서 슈도알테로모나스 속 균주를 배양한 후, 그 배양물을 에틸아세테이트로 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 항주름용 화장료 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 항주름용 화장료 조성물은 탄소원 함유 배지 중에서 배양된 슈도알테로모나스 속(Pseudoalteromonas sp.) 균주의 배양물을 에틸아세테이트로 추출한 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.

Description

항주름용 화장료 조성물 및 그의 제조방법{Cosmetic composition for anti-wrinkle and manufacturing method thereof}

본 발명은 항주름용 화장료 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것으로 특히, 해양 미생물의 일종인 슈도알테로모나스 속(Pseudoalteromonas sp .)의 추출물, 특히 탄소원 함유 배지 중에서 슈도알테로모나스 속 균주를 배양한 후, 그 배양물을 에틸아세테이트로 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 항주름용 화장료 조성물 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

사람의 피부는 외부로부터 피부 안쪽의 다양한 기관을 보호하고 있는 인체를 구성하는 기관들 중 가장 큰 기관으로서, 내부의 수분 및 유용성 성분의 피부 밖으로의 유출을 막아주는 장벽기능, 온도조절기능, 배설기능, 호흡기능 등 다양한 생리적 역할을 감당하고 있다.

그러나, 나이가 들면 피부의 생리적 기능이 저하되고 피부의 두께가 얇아져 피부장벽으로서의 기능이 저하될 뿐만 아니라, 자외선, 대기오염, 냉난방 시설 등 외적 요인과 과도한 피로, 스트레스 및 연령에 따른 호르몬 변화 등 내적 요인에 의해 피부의 건성화가 이루어지게 되며, 이와 같은 피부 건성화는 역시 피부의 생리적 기능을 떨어뜨려 외부의 작은 자극원에 의해서도 피부자극 및 손상이 쉽게 일어나게 하는 원인이 된다.

통상적으로 성장기에는 내부 및 외부로부터의 노화 요인에 대하여 피부의 다양한 방어 시스템에 의해 쉽게 대응을 할 수 있으나, 연령이 높아짐에 따라 자외선 등의 원인으로 생성된 활성산소종에 의해 항산화 시스템이 파괴되고 이로 인해 방어능력이 현저하게 저하된다. 상기한 바와 같이, 방어능력이 저하된 경우, 피부에 산화적 스트레스가 가해지면, 지질과산화, 단백질 산화, 탄력섬유인 콜라겐과 엘라스틴의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합, 히알루론산 사슬의 절단, DNA 산화 등 생체 구성성분의 손상을 가져오게 된다. 상기한 생체 구성성분의 손상으로 인하여, 피부 주름의 초기증상인 피부의 처짐, 거칠어짐, 건조함 등이 유발되며, 결과적으로 피부 주름이 형성되게 된다.

주름은 신체 내외의 여러 가지 요인들에 의하여 진피 속의 콜라겐섬유, 탄력섬유 등에 변성이 일어나고 피부 수분이 감소하여 피부의 탄력이 떨어져 피부가 접히는 현상을 말한다. 최근, 생활 수준이 향상되고 외모에 대한 관심이 증대하면서 피부 주름의 예방이나 개선에 대한 관심이 증대하고 있다.

지금까지 알려진 피부 노화 억제제로는 피부 노화 억제 기전에 따라 종류가 다양하다. 대표적인 예로는 콜라겐 생성 촉진제, 엘라스틴 활성화제, 히알루론산 생성 증가제, 자유라디칼 소거제, 세포 증식제, 광노화 억제제, 각질세포 증식억제제, 보습제, 유해 활성산소 생성방지제, 세포 재생물질 등이 있다.

또한, 피부 주름을 개선시키기 위한 방법으로 콜라겐을 포함시킨 화장료 또는 연고 등과 같은 피부 외용제 조성물을 사용하는 방법이 제시되었다. 이는 콜라겐의 주름 개선 및 피부 회복 효과를 이용하기 위하여 제시된 것이나, 고분자 물질인 콜라겐의 경피 흡수가 어려워 보습작용 또는 상처치유 효과를 기대할 수 없으므로 본질적인 피부기능 개선 및 상처치유의 기능을 나타낼 수 없다는 문제점이 지적되었다.

종래의 문제점을 해결하기 위해 제시된 것으로, 자유 라디칼의 형성이나 반응을 억제하는 비타민 C, 비타민 E 또는 카로티노이드와 같은 항산화제에 의해 주름의 형성을 예방하는 방법, 레티놀과 같이 진피 내의 콜라겐 생합성을 증가시키는 방법, 콜라겐을 피부내로 주입하는 방법 또는 보툴리눔 독소를 피부에 주사하는 방법 등이 제시되었다.

그러나, 상기 비타민 C, 비타민 E, 카로티노이드 및 레티놀은 모두 상온에서 쉽게 부서진다는 단점이 있고, 상기 레티놀은 처리농도가 높아지면 피부에 부작용을 나타내는 단점이 있는 것으로 알려져 있다. 또한, 콜라겐이나 보툴리눔 독소의 경우 피부적용시 자극과 발적 등의 안전성의 문제로 사용량의 제한이 있거나 효과가 미미하여 실질적으로 피부 기능 개선 또는 상처 치유의 효과를 기대할 수 없다는 단점이 지적되어 왔다.

이런 기능성 화장료의 원료와 관련하여, 기능성 소재와 관련된 최근 연구는 친환경 열풍과 맞물려 주로 천연물로부터 유래한 천연물질 소재에 집중이 되고 있으며, 주로 허브류나 한방에서 약재로 사용되던 물질들에 관해 연구가 진행되고 있다.

또한, 이러한 천연물 소재와 관련하여, 주로 허브류나 한방에서 약재로 사용되던 물질들에 관해 연구가 진행되고 있을 뿐이다.

따라서, 여전히 새로운 기능성 화장료의 소재, 특히 주름 예방 및 개선 효과를 가진 소재에 대한 연구의 필요성이 존재하고 있다.

기존의 해양유래 기능성 화장료 소재개발은 대부분 해조류 추출물을 대상으로 이루어졌지만 원재료 확보 및 특이취, 색깔 등의 문제로 그 사용이 제한되어 왔다. 따라서 해양 미생물 발효 추출물의 경우 원료확보가 용이한 장점을 가지고, 현재 항주름 기능성원료로 등록된 대부분의 원료는 식물/동물유래 원료로서, 해양으로부터 개발된 주름 기능성원료는 그 사례가 몇 건 되지 않는다. 따라서 본 연구를 통하여 항주름 기능성 원료를 등록함으로서 해양자원의 우수성을 알리고 이를 활용한 다양한 제품과 브랜드 개발이 이루어질 수 있을 것으로 판단된다.

대한민국 등록특허 등록번호 제10-1421537호(발명의 명칭: 다시마 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물)에는 "본 발명은 다시마(Laminaria japonica) 아임계수 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 유효성분인 다시마 아임계수 추출물은 1 MPa 내지 5 MPa 및 180℃ 내지 240℃의 아임계 조건에서 추출한 다시마 아임계수 추출물일 수 있다. 또한, 본 발명은 다시마로부터 항주름 활성이 가장 우수할 뿐만 아니라 추출수율도 가장 높은 다시마 아임계수 추출물의 제조방법에 관한 것이다. 상기 제조방법은 다시마를 분쇄하여 다시마 분쇄물을 제조하는 단계; 상기 다시마 분쇄물에 물을 첨가하는 단계; 및 상기 다시마 분쇄물 및 물을 3 MPa 및 180℃ 내지 240℃의 조건에서 반응시켜 다시마 아임계수 추출물을 제조하는 단계를 포함하는 주름 예방 또는 개선능을 가진 다시마 아임계수 추출물 제조방법일 수 있다. 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 다시마 아임계수 추출물은 에스터라제 저해 활성 및 콜라겐 합성능 즉, 항주름 활성이 우수할 뿐만 아니라, 식품으로 사용되던 해조류와 가장 안전한 용매인 수용매를 이용하는 것으로 부작용 등에 대한 안전성도 보장되며, 우리나라 서해안지역에서 풍부하게 생산되는 해조류를 이용하여 간단한 방법으로 제조될 수 있어 경제적으로도 유리하고, 지역경제 활성화 및 지역 농어민 소득향상에도 이바지할 수 있으므로, 본 발명의 화장료 조성물은 산업적 측면에서 그 효과가 매우 클 것으로 기대된다."라고 개시되어 있다.

대한민국 등록특허 등록번호 제10-1414150호(발명의 명칭: 초고압 시스템에 의해 가수분해된 태반 추출물을 포함하는 항주름용 화장료 조성물)에는 "본 발명은 초고압 시스템에 의해 가수분해된 저분자 태반 추출물을 포함하는 항주름용 화장료 조성물에 대한 것이다. 본 발명의 조성물은 태반을 압력 10 내지 500 bar, 온도 120 내지 250℃의 조건에서 20 분 내지 3 시간 동안 가수분해하여 얻은 분자량 100 내지 1,500 Da의 저분자 태반 추출물을 포함하고 있기 때문에 피부에 사용 시 흡수율을 증가시킬 수 있다. 또한, MMP-2 및 엘라스타아제의 활성을 억제함으로써 항주름 효과를 볼 수 있다."라고 개시되어 있다.

대한민국 공개특허공보 공개번호 제10-2017-0143053호(발명의 명칭: 쌀뜨물 발효배양물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항주름 및 보습 개선 기능성 화장료 조성물 및 그 제조방법)에는 "본 발명은 쌀뜨물 발효배양물을 유효성분으로 함유하는 항산화, 항주름 및 보습 개선 기능성 화장료 조성물 및 그 제조방법에 관한 것으로 화장료로서 쌀뜨물의 발효 전과 후의 항산화, 항주름 및 보습 개선효과를 비교 확인함으로써 쌀뜨물 발효배양물을 유효성분으로 함유하는 기능성 화장료 조성물을 제공하는 뛰어난 효과가 있다."라고 개시되어 있다.

본 발명은 해양 미생물의 일종인 슈도알테로모나스 속(Pseudoalteromonas sp.)의 추출물, 특히 탄소원 함유 배지 중에서 슈도알테로모나스 속 균주를 배양한 후, 그 배양물을 에틸아세테이트로 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 항주름용 화장료 조성물 및 그의 제조방법을 제공함을 목적으로 한다.

본 발명에 따른 항주름용 화장료 조성물은, 탄소원 함유 배지 중에서 배양된 슈도알테로모나스 속(Pseudoalteromonas sp .) 균주의 배양물을 에틸아세테이트로 추출한 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 항주름용 화장료 조성물의 제조방법은, (1) 탄소원 함유 배지 중에서 슈도알테로모나스 속(Pseudoalteromonas sp .) 균주를 배양하여 배양물을 수득하는 배양단계; 및 (2) 배양단계에서 수득되는 배양물을 에틸아세테이트로 추출하는 추출단계;를 포함함을 특징으로 한다.

본 발명에 따르면 해양 미생물의 일종인 슈도알테로모나스 속(Pseudoalteromonas sp .)의 추출물, 특히 탄소원 함유 배지 중에서 슈도알테로모나스 속 균주를 배양한 후, 그 배양물을 에틸아세테이트로 추출한 추출물을 유효성분으로 포함하는 항주름용 화장료 조성물 및 그의 제조방법을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 슈덴 표준품에 대한 HPLC 분석 조건의 확립을 위한 크로마토그램이다.
도 2는 MMM broth에서의 균 성장 조건 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 탄소원 첨가 배지에서의 슈덴 생산량을 확인하기 위한 실험에서 탄소원 무첨가(대조) 배지에서 배양된 슈도알테르모나스 속 M2(Pseudoaltermonas sp . M2) 균주 배양물의 슈덴 분석 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 4 내지 도 8은 탄소원 첨가 배지에서의 슈덴 생산량을 확인하기 위한 실험에서 서로 다른 탄소원 첨가 배지에서 배양된 슈도알테르모나스 속 M2 균주 배양물의 슈덴 분석 결과를 나타내는 크로마토그램으로서, 도 4는 글루코스 첨가 배지, 도 5는 슈크로스 첨가 배지, 도 6은 갈락토스 첨가 배지, 도 7은 프룩토스 첨가 배지 그리고 도 8은 전분 첨가 배지를 사용한 결과이다.
도 9 내지 도 15는 탄소원 첨가 배지에서 탄소원으로서 프룩토스의 농도별 슈덴 생산량을 확인하기 위한 실험에서 배양된 슈도알테르모나스 속 M2 균주 배양물의 슈덴 분석 결과를 나타내는 크로마토그램으로서, 도 9는 프룩토스 0%, 도 10은 프룩토스 0.5%, 도 11은 프룩토스 1.0%, 도 12는 프룩토스 1.5%, 도 13은 프룩토스 2.0%, 도 14는 프룩토스 2.5% 그리고 도 15는 프룩토스 3.0%를 첨가한 결과이다.
도 16은 플라스크 배양에서의 산소전달율에 관한 배양조건에 따른 슈덴 생산량을 확인하기 위한 실험에서 배양된 슈도알테르모나스 속 M2 균주 배양물의 슈덴 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 17은 배양온도에 따른 슈덴 생산량의 변화를 확인하기 위한 실험에서 배양된 슈도알테르모나스 속 M2 균주 배양물의 슈덴 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 18은 3 ℓ 발효기를 이용하여 배양된 슈도알테르모나스 속 M2 균주 배양물의 슈덴 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 19는 3 ℓ 발효기를 이용하되 통기량의 변화에 따라 배양된 슈도알테르모나스 속 M2 균주 배양물의 슈덴 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 20은 3 ℓ 발효기를 이용하되 진탕 속도의 변화에 따라 배양된 슈도알테르모나스 속 M2 균주 배양물의 슈덴 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 21은 50 ℓ 발효기를 이용하여 배양된 슈도알테르모나스 속 M2 균주 배양물의 슈덴 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 22는 1 톤 발효기를 이용하여 배양된 슈도알테르모나스 속 M2 균주 배양물의 슈덴 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
도 23은 슈덴동결건조분말을 DMSO에 녹인후 HPLC로 분석하여 지표 및 효능물질을 선정하는 실험 결과를 나타내는 크로마토그램이다.
도 24는 슈도알테로모나스 속 M2 균주 배양액 추출물의 항산화 활성의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 25는 슈도알테로모나스 속 M2 균주 배양액 추출물의 티로시나아제 활성저해의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 26은 슈도알테로모나스 속 M2 균주 배양액 추출물의 콜라게나아제 활성 저해 효소 실험의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 27은 슈덴에 의한 NHDF 세포의 프로콜라겐 합성능을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 28은 슈덴에 의한 MMP-1 억제능을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 29 내지 도 31은 NHDF 세포에 대한 MAPKs 활성의 측정 결과를 나타내는 그래프로서, 도 29는 ERK 인산화 비율, 도 30은 p38 인산화 비율 그리고 도 31은 JNK 인산화 비율을 나타내는 그래프이다.
도 32는 배양최적화에 의하여 1톤 발효추출기를 이용한 슈도알테로모나스 속 M2 균주 배양액의 MMP-1 저해활성을 나타내는 그래프이다.
도 33 및 도 34는 원료의 열 안전성평가를 위하여 표준물질을 사용하여 가압멸균 이전(도 33) 및 가압멸균 이후(도 34)의 열분해를 측정한 실험 결과를 나타내는 크로마토그램이다.

이하, 본 발명을 구체적인 실시예를 참조하여 상세히 설명한다.

슈도알테로모나스 속(Pseudoalteromonas sp .) 균주는 바람직하게는 슈도알테르모나스 속 M2(Pseudoaltermonas sp . M2) 균주이며, 이는 한국 동해안의 붉은멍게 내장으로부터 분리한 미생물 중 항균활성 이차대사산물 생산능이 우수한 슈도알테르모나스 속의 신규 종으로 최종적으로 선별된 균주이다.

"붉은멍게(Halocynthia aurantium)"는 원색동물문 미색강 측성멍게목 우렁쉥이과에 속하며, 영명으로는 복숭아와 유사한 형태를 보이기 때문에 바다복숭아로 불리고 있다. 일본 북해도, 미국 베링해, 알래스카 반도, 캐나다 북부 연안과 한국 동해안에 주로 분포하고 있으며 산란기는 9월과 12월 사이에 알려져 있다. 한국 동해안에서의 서식형태는 암반이나 인공어초 등에 부착하여 군락으로 분포하며, 서식수심은 대략 20 내지 100 m 정도로 나타난다.

상기 슈도알테르모나스 속 균주는 특히 유효활성성분의 일종으로 슈덴을 생산한다. "슈덴(pseudane)"은 슈도모나스 속(Pseudomonas sp .) 세균이 분비하는 항균활성을 갖는 2-n-알킬-4-하이드록시퀴놀린의 일반식을 가진 수산화퀴놀린 유도체를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 슈도알테르모나스 속 M2(Pseudoaltermonas sp . M2)는 대한민국 등록특허 등록번호 제10-1725326호(발명의 명칭: 항균활성을 갖는 신규 미생물 및 그를 이용한 슈덴 생산방법)에 개시된 것일 수 있다.

대한민국 등록특허 등록번호 제10-1725326호 발명에서 상기 슈도알테르모나스 속 M2 균주는 MMM broth 중에서 배양시켰으며, MMM broth는 0.3% 효모 추출물(Difco)과 0.5% 프로테오스 펩톤(Difco)이 첨가된 Marine broth 2261 배지(Difco)이며, 이는 구체적으로는 펩톤 5.0 g, 효모 추출물 1.0 g, 구연산철 0.1 g, 염화나트륨 19.45 g, 염화마그네슘 5.9 g, 황산마그네슘 3.24 g, 염화칼슘 1.8 g, 염화칼륨 0.55 g, 중탄산나트륨 0.16 g, 브롬화칼륨 0.08 g, 염화스트론튬 34.0 ㎎, 붕산 22.0 ㎎, 규산나트륨 4.0 ㎎, 불화나트륨 2.4 ㎎, 질산암모늄 1.6 ㎎, 인산수소이나트륨 8.0 ㎎, 37.4 g/ℓ로 이루어지나, 본 발명에서는 탄소원 함유 배지 중에서 배양시킴을 특징으로 한다. 즉, MMM broth에 탄소원을 더 첨가하여 구성된 배지 중에서 배양시킴을 특징으로 한다. MMM broth에 첨가되는 탄소원은 글루코스, 프룩토스, 슈크로스, 전분 및 갈락토스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 프룩토스일 수 있다.

프룩토스는 MMM broth 총 중량을 기준으로 0.5 내지 2.5중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 프룩토스의 첨가량이 MMM broth 총 중량을 기준으로 0.5 내지 2.5중량%의 범위를 벗어나는 경우, 슈덴의 생산량이 감소되는 문제점이 있을 수 있다.

또한, MMM broth는 질소공급원의 농도가 낮을수록 슈덴의 생산량이 증가하는 효과가 있다. 따라서, 질소공급원의 농도가 낮을수록 유리하고, 바람직하게는 질소공급원이 없는 것이 유리할 수 있다. 따라서, MMM broth 중의 펩톤의 농도가 낮을수록 유리하고, 바람직하게는 펩톤이 없는 것이 유리할 수 있다.

또한, MMM broth는 효모 추출물의 농도가 높을수록 슈덴의 생산량이 증가하는 효과가 있다. 따라서, 효모 추출물의 농도가 높을수록 유리하고, 바람직하게는 효모 추출물의 농도가 MMM broth 총 중량을 기준으로 0.5 내지 1.5중량%의 양으로 첨가될 수 있다. 효모 추출물의 첨가량이 MMM broth 총 중량을 기준으로 0.5 내지 1.5중량%의 범위를 벗어나는 경우, 슈덴의 생산량이 감소되는 문제점이 있을 수 있다.

기타 배양조건의 매개변수로서는 통기조건에서 20 내지 52시간의 범위 이내의 시간 동안 배양시키는 것이 바람직할 수 있으며, 이 시간 범위를 벗어나는 경우, 슈덴의 생산량이 감소되는 문제점이 있을 수 있다.

기타 배양조건의 매개변수로서 온도조건은 20 내지 25℃의 범위 이내가 적절하며, 30℃ 초과 시, 슈덴이 거의 생산되지 않게 되는 문제점이 있을 수 있다.

상기한 바와 같은 배양조건에서 슈도알테로모나스 속 균주의 배양물을 에틸아세테이트로 추출하여 유효성분으로서 슈덴을 포함하는 본 발명에 따른 화장료 조성물을 수득하였으며, 이는 특히 항주름에 효과가 있는 것으로 확인되었다.

상기 (1)의 배양단계는 탄소원 함유 배지 중에서 슈도알테로모나스 속 균주를 배양하여 배양물을 수득하는 것으로 이루어진다. 상기 배양단계에서의 배양 조건은 상기한 바와 동일 및/또는 유사한 것으로 이해될 수 있다.

상기 (2)의 추출단계는 상기 배양단계에서 수득되는 배양물을 에틸아세테이트로 추출하는 것으로 이루어진다.

이하에서 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예들이 기술되어질 것이다.

이하의 실시예들은 본 발명을 예증하기 위한 것으로서 본 발명의 범위를 국한시키는 것으로 이해되어져서는 안될 것이다.

1. 미생물 유래 기능성 화장료 생산 방법 최적화

1-1. 미생물 배양액으로부터 기능성 화장료 최적 생산 조건 확립

(1) 미생물 배양액으로부터 슈덴 생성 확인을 위한 기준 및 시험법 확립

1) 미생물배지

국립수산과학원으로부터 제공받은 슈도알테로모나스 속 M2(Pseudolateromonas sp. M2) 균주를 배양하기 위해 해양 미생물 배양 배지인 Difco사 MMM broth(펩톤 5.0 g, 효모 추출물 1.0 g, 구연산철 0.1 g, 염화나트륨 19.45 g, 염화마그네슘 5.9 g, 황산마그네슘 3.24 g, 염화칼슘 1.8 g, 염화칼륨 0.55 g, 중탄산나트륨 0.16 g, 브롬화칼륨 0.08 g, 염화스트론튬 34.0 ㎎, 붕산 22.0 ㎎, 규산나트륨 4.0 ㎎, 불화나트륨 2.4 ㎎, 질산암모늄 1.6 ㎎, 인산수소이나트륨 8.0 ㎎, 37.4 g/ℓ로 이루어짐)를 사용하였다.

2) 배양온도 및 배양시간

국립수산과학원 선행연구결과를 근거로 슈도알테로모나스 속 M2(Pseudolateromonas sp. M2) 균주 배양온도 및 배양시간은 22℃, 48시간 동안 배양하였다.

3) 기준 및 시험법 확립

국립수산과학원 선행연구결과에 의하면 기존의 Pseudane(이하, 슈덴으로 표기)의 경우 LC-MS/MS로 분석 조건은 이동상으로 0.1% 포름산이 포함된 아세토니트릴(acetonitrile)과 물을 이용하여 0.4 ㎖/분의 속도로 HPLC를 수행하였다.

4) 분석시료의 제조

MMM broth에 슈도알테로모나스 속 M2 균주를 22℃에서 48시간 배양한 후, 원심분리(8,000 rpmX15분, 4℃)하여 균체를 제거한 후, 상등액 : 에틸아세테이트(EA) = 1 : 1로 첨가하여 상온에서 24시간 추출한 후, EA 층을 회수하여 EA를 제거한 후, 회수된 시료를 동결건조하였다. 동결건조물은 디메틸설폭사이드(DMSO)에 희석하여 0.2 ㎛ 주사기 여과를 수행하여 분석에 사용하였다.

5) 표준시료의 합성

총 8종류(A0, A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7)의 합성된 슈덴을 국립수산과학원에서 제공받아 표준시료로 정량 및 정성분석실험에 사용하였다. 슈덴합성물 8종은 1 ㎎/㎖ 농도로 DMSO에 희석하여 0.2 ㎛ 주사기 여과 후, 표준물로 사용하였다.

(2) MMM 배지에서 균 성장 조건 분석

250 ㎖ 삼각플라스크에 MMM broth 50 ㎖를 제조하여 슈도알테로모나스 속 M2 균주를 접종하여 22℃에서 48시간 동안 150 rpm으로 진탕배양하여 종균배양을 진행한 후, 2 ℓ 삼각플라스크에 400 ㎖의 MMM broth를 넣고 본 배양을 진행하였다. 배양조건은 종균배양과 동일한 조건으로 하였으며, 1% 종균을 접종하여 4시간 단위로 10 ㎖ 씩 샘플링 하였으며, 균 성장을 확인하기 위해 600 ㎚에서 흡광도를 측정하였고, 원심분리하여 회수된 세포를 증류수로 현탁하여 재회수하는 방식으로 3회 세척한 후, 건조중량을 측정하여 균성장 패턴을 분석하였다. 또한 균 성장에 따른 pH변화를 관찰하였다.

(3) 균 성장에 따른 슈덴 생산량 분석

슈도알테로모나스 속 M2 균주 성장과 슈덴 생산량을 비교분석하기 위하여 배양시간에 따른 슈덴생산 패턴을 HPLC를 사용하여 분석하였다. 시료는 배양시간 별로 회수된 배양액을 원심분리 하여 균체를 제거한 후, 상등액과 동량의 EC를 첨가하여 상온에서 24시간 추출하였다. EA 추출물은 회수하여 동결건조한 후, DMSO에 20 ㎎/㎖ 농도로 희석하여 0.2 ㎛ 주사기 여과하여 분석에 사용하였다.

(4) 최적배양조건 검토

1) 탄소원별 배양조건의 최적화

슈도알테로모나스 속 M2 균주 배양의 최적화를 위해 탄소원 5종(글루코스, 프룩토스, 슈크로스, 전분, 갈락토스)을 MMM broth에 각 1%씩 첨가하여 슈도알테로모나스 속 M2를 22℃에서 36시간 진탕배양(150 rpm)하였다. 배양종료 후, 원심분리(5000 rpm, 15분)하여 균체를 제거하고, 상등액을 회수하여 동량의 EC로 상온에서 24시간 추출하였다. 추출물은 동결건조하여 DMSO에 3 ㎎/㎖농도로 희석한 후, 0.2 ㎛ 주사기 여과하여 분석에 사용하였다.

2) 질소원별 배양조건의 최적화

MMM broth의 질소원인 펩톤과 효모 추출물에 대해서 질소원의 농도변화에 따른 슈덴 생성량을 HPLC로 분석하였다. 배양 및 분석 방법은 탄소원별 배양조건의 최적화때 사용한 동일한 조건으로 시료를 제조하여 분석에 사용하였다.

3) 통기량에 따른 배양최적화

산소는 25℃ 액상에서 9 ppm의 아주 낮은 포화농도를 가지며, 균체가 이용하는 산소 흡입율(Oxygen uptake rate)은 다음 식을 따른다.

N_a: 산소 흡입율(mmol litre^-1h^-1)

K_L: 물질전달계수(litre h^-1)

a: 물질전달에 대한 계면 면적(litre^-1)

C_g: 액체 중의 O₂에 대한 포화 수준(mmol litre^-1)

C^*: 실제 용해 수준(mmol litre^-1)

플라스크 배양에서 가장 중요한 것은 산소전달율(OTR: oxygen transfer rate)로서 주로 K_La값에 의해서 구해지며, K_La는 물질전달계수로서 배양 플라스크 형태에 따라 달라진다. Erlenmeyer flask의 K_La값은 500/h이며 베플 플라스크의 K_La값은 1200/h이다. 본 실험에서는 500 ㎖ Erlenmeyer flask와 베플 플라스크를 이용하여 MMM broth를 250 ㎖ 삼각플라스크와 250 ㎖ 베플플라스크(Baffled Erlenmeyer Flask)에 각각 50 ㎖씩 넣고 종균배양액 1%를 접종한 후, 36시간 동안 배양한 후, 슈덴 생산량을 분석하였다.

4) 배양온도에 따른 최적배양 조건검토

슈도알테로모나스 속 M2 균주의 배양온도(20℃, 22℃, 25℃ 및 30℃)에 따른 슈덴 생산량의 변화를 관찰하였다. 250 ㎖ 삼각플라스크에 MMM broth 50 ㎖를 넣고 멸균한 후, 1% 종균을 접종하였으며, 48시간 배양 후, 슈덴 생산량을 관찰하였다.

(5) 3 ℓ 발효기를 이용한 슈덴 생산량 분석

1) 기본 배양

3 ℓ 발효기를 사용하여 슈덴생산최적화배지(POM: Pseudane Optimization Medium) 2 ℓ를 넣고 22℃에서 1.0 vvm 공기를 넣고 150 rpm에 종균량 1%를 접종한 후, 72시간 동안 배양하여 슈덴 생산량을 분석하였다.

2) 통기량에 따른 생산 최적화

3 ℓ 발효기를 사용하여 POM 배지 2 ℓ를 넣고 22℃에서 통기량을 0.5, 1.0, 1.5 및 2.0 vvm 공기를 넣고 종균배양액을 각각 1%를 접종한 후, 72시간 동안 배양하여 통기량에 따른 슈덴 생산량을 분석하였다.

3) 교반 속도에 따른 생산 최적화

3 ℓ 발효기를 사용하여 POM 배지 2 ℓ를 넣고 22℃에서 교반 속도 변화(50, 100, 150 및 200 rpm)에 따른 슈덴 생산량의 변화를 관찰하였다. 종균배양액을 각각 1%를 접종한 후, 48시간 동안 배양하였으며, 슈덴 생산량은 HPLC로 분석하였다.

(6) 파일럿 확대생산(pilot scale up)에 따른 슈덴 생성량 분석

1) 50 ℓ 발효기를 이용한 슈덴 생산량분석

50 ℓ 발효기를 사용하여 POM 배지 30 ℓ를 넣고 종균배양액 1%(300 ㎖)를 접종하여 25℃에서 72시간 배양하여 원심분리 후, 균체를 제거하고 배양액에 동량의 EA로 슈덴을 추출하였다. 추출물은 동결 건조하여 수율을 체크하였다.

2) 1 톤 발효기를 이용한 슈덴 생산량분석

1 톤 발효기에 POM 배지 500 ℓ를 넣고 121℃에서 20분간 멸균한 후, 종균배양액 1%(5 ℓ)를 접종한 후, 25℃, 150 rpm, 1.5 vvm에서 48시간 배양을 한 후, 총 수율은 EA추출하여 회수한 시료를 동결건조한 회수량으로 계산하였으며, 총 슈덴 함량과 지표물질의 함량을 분석하였다.

<시험결과>

(1) 슈덴 분석법 확립 및 표준시료분석

대한민국 소재 국립수산과학원에서 제공된 합성시료를 표준품으로 하여 HPLC 분석방법을 확립하였으며, 분석조건은 다음과 같다.

분석에 사용된 HPLC는 Waters Delta 600을 사용하였으며, 검출기는 PDA(Photodiode Array Dtector), 사용된 컬럼은 CAPCELL PAK C18 UG120 (SHISHEIDO Co., Ltd. Japan), 유속은 1 ㎖/분, 시료주입량은 50 ㎕(슈덴합성물 0.125 ㎎/㎖), 사용된 용매는 물(A)과 아세토니트릴(B)(0.1% 포름산)을 사용하였으며, 분리 조건은 하기 표 1과 같다.

표준품(A0, A1, A2, A3, A4, A5, A6, A7) 분석결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 각각 물질에 대한 RT값이 A-0; 20.262, A-1; 22.440, A-2; 22.800, A-3; 23.967, A-4; 25.521, A-5; 28.389, A-6; 31.344, A-7; 34.187으로 확인되었다.

(2) MMM 배지에서 균 성장 조건 분석 결과

배양시간에 따른 균 성장 곡선을 분석한 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 세포건조중량과 600 ㎚에서 균성장 곡선은 거의 일치하였으며, 균이 성장함에 따라 pH의 변화도 6.9에서 8.0으로 증가함을 알 수 있었다. 배양 28시간 내지 36시간까지 안정기로 접어들었다가 이후부터 균의 사멸이 시작되었다.

(3) 균 성장에 따른 슈덴 생산량 분석

슈도알테로모나스 속 M2 균주 성장과 슈덴 생산에 대한 상관관계를 분석하기 위해, 배양시간별로 회수된 배양액을 원심분리 하여 균체를 제거한 후, 상등액과 동량의 EC를 첨가하여 상온에서 24시간 추출하여 회수한 시료를 동결건조한 후, DMSO에 20 ㎎/㎖ 농도로 희석하여 0.2 ㎛ 주사기 여과하여 HPLC분석에 사용하였다.

슈도알테로모나스 속 M2 균주는 슈덴을 생합성하며, 균 성장에 있어 안정기에 접어드는 시간은 28시간 내지 36시간이며, 이때부터 슈덴 합성량이 급격히 증가하였으며, 36시간 때 슈덴 생산량이 최고로 확인되었다. 48시간 이후부터 사멸기에 접어들면서 슈덴생산량은 감소하는 것으로 나타났다.

(4) 최적배양조건 검토

1) 탄소원별 배양조건의 최적화

슈도알테로모나스 속 M2 균주 배양의 최적화를 위해 탄소원 5종 (글루코스, 프룩토스, 슈크로스, 전분, 갈락토스)을 MMM broth에 각 1%씩 첨가하여 슈도알테로모나스 속 M2 균주를 22℃에서 36시간 진탕배양(150rpm)하였다. 배양종료 후, 원심분리 (5000 rpm, 15분)하여 균체를 제거하고 상등액을 회수하여 동량의 EC로 상온에서 24시간 추출하였다. 추출물은 동결건조하여 DMSO에 3 ㎎/㎖ 농도로 희석한 후, 0.2 ㎛ 주사기 여과하여 HPLC분석에 사용하였다.

도 3(대조(Control): MMM broth), 도 4(글루코스 첨가 배지), 도 5(슈크로스 첨가 배지), 도 6(갈락토스 첨가 배지), 도 7(프룩토스 첨가 배지) 및 도 8(전분 첨가 배지)에 나타난 바와 같이, 탄소원별 배양 결과 슈덴 8종(A0 내지 A7) 모두 프룩토스 첨가 배지에서 가장 높은 패턴을 나타냈다.

2) 프룩토스 농도에 따른 슈덴 최적생산량 분석

프룩토스를 농도별((0, 0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, 3%)로 첨가한 MMM broth에 슈도알테로모나스 속 M2 균주를 2%로 접종하여 22℃에서 36시간 진탕배양(150 rpm)하였다. 배양종료 후, 원심분리하여 균체를 제거한 후 상등액에 동량의 EC를 첨가하여 상온에서 24시간 추출하였다. 추출액은 농축 및 동결건조하여 HPLC분석에 사용하였다. 정량분석을 위해 합성슈덴 표준품 A-0, A-1, A-2, A-3, A-4, A-5, A-6, A-7을 농도별로 분석한 후 각각의 표준품에 대해 면적비로 정량분석을 위한 표준곡선을 작성한 후, 프룩토스 각 농도별로 각각의 슈덴에 대해 정량분석을 실시하였다.

프룩토스 농도별(0.5%, 1%, 1.5%, 2%, 2.5% 및 3%) 배양액 EA 추출물 20 ㎎/㎖를 주사기 여과 후, 50 ㎕ 주사하였으며, 분석결과를 도 9(프룩토스 0%), 도 10(프룩토스 0.5%), 도 11(프룩토스 1.0%), 도 12(프룩토스 1.5%), 도 13(프룩토스 2.0%), 도 14(프룩토스 2.5%) 및 도 15(프룩토스 3.0%)에 나타내었다.

MMM broth에 프룩토스를 첨가하지 않은 배지와 프룩토스를 첨가한 배지를 비교한 결과, 프룩토스를 첨가하지 않은 배지의 총 슈덴함량은 0.787 ㎎/㎖로 분석되었으며, 프룩토스를 0.5% 첨가 시 2.35 ㎎/㎖, 1.0% 첨가 시 4.05 ㎎/㎖, 1.5% 첨가 시 6.02 ㎎/㎖, 2.0% 첨가 시 3.24 ㎎/㎖, 2.5% 첨가 시 3.14 ㎎/㎖, 3.0% 첨가 시 0.307 ㎎/㎖로 확인 되었다. 따라서 프룩토스를 첨가하지 않은 배지보다 1.5% 첨가한 배지가 슈덴 생산량이 6.02배 생산량이 증가하는 것으로 확인되었다. 슈덴을 생산하는 슈도알테로모나스 속 M2 균주의 경우 프룩토스의 영향을 받는 것으로 확인되었으며, 3.0% 첨가 시에는 프룩토스를 첨가하지 않는 배지보다 생산량이 줄어드는 것으로 확인하였다. 따라서 탄소원인 프룩토스의 경우 1.5%의 사용할 때 슈덴 생산량이 가장 많은 것으로 확인되었다.

2) 질소원별 배양조건의 최적화

MMM broth의 질소원인 펩톤과 효모 추출물에 대해서 질소원의 농도변화에 따른 슈덴 생성량을 HPLC로 분석하였다. 배양시간은 최적배양시간인 36시간으로 고정하였으며, 배양온도는 22℃에서 진행하였다. 배양결과 총슈덴 함량의 경우, 펩톤에서는 오히려 농도가 높을수록 슈덴 생산을 억제하는 것으로 확인되어 슈덴 배지로는 적합하지 않는 것으로 확인되었으며, 효모 추출물의 경우, 농도 의존적으로 슈덴 생산량이 증가하였으며, 1.0% 이상의 경우 농도대비 슈덴 생산량이 높지 않아 1.0% 농도가 가성비가 더 좋을 것으로 판단된다. 효모 추출물 농도에 따른 슈덴 종류별 생산 패턴을 살펴보면, 하기 표 2에 나타난 바와 같이, 효모 추출물 농도가 높아질수록 A-0 A-2, A-4, A-5, A-6가 증가하는 것으로 분석되었다.

3) 통기량에 따른 배양최적화

산소는 25℃ 액상에서 9ppm의 아주 낮은 포화농도를 가지며, 균체가 이용하는 산소 흡입율(Oxygen uptake rate)은 다음 식을 따른다:

N_a: 산소 흡입율(mmol litre^-1h^-1)

K_L: 물질전달계수(litre h^-1)

a: 물질전달에 대한 계면 면적(litre^-1)

C_g: 액체 중의 O₂에 대한 포화 수준(mmol litre^-1)

C^*: 실제 용해 수준(mmol litre^-1)

플라스크 배양에서 가장 중요한 것은 산소전달율로서 주로 K_La값에 의해서 구해지며, K_La는 물질전달계수로서 배양 플라스크 형태에 따라 달라진다. Erlenmeyer flask(E-Flask)의 K_La값은 500/h이며 베플 플라스크의 K_La값은 1200/h이다. 본 실험에서는 500㎖ Erlenmeyer flask와 베플 플라스크를 이용하여 MMM broth를 250 ㎖ 삼각플라스크와 250 ㎖ 베플 플라스크(Baffled Erlenmeyer Flask; B-Flask)에 각각 50 ㎖씩 투입고 종균배양액 1%를 접종한 후, 72시간 동안 배양한 후 슈덴 생산량을 분석하였으며, 그 결과를 도 16 및 표 3에 나타내었다.

도 16 및 표 3에 나타난 바와 같이, 삼각플라스크와 베플 플라스크를 사용하여 균주를 배양한 결과, 슈덴 생산량이 가장 많은 시간인 36시간 배양 시 베플 플라스크가 삼각플라스크에 비해 12% 정도 슈덴생산량이 증가하는 것으로 확인 되어 미생물 호흡시 용존산소량의 영향이 있는 것으로 판단된다.

4) 배양온도에 따른 최적배양 조건검토

슈도알테로모나스 속 M2 균주의 배양온도(20℃, 22℃, 25℃ 및 30℃)에 따른 슈덴 생산량의 변화를 관찰하였다. 250 ㎖ 삼각플라스크에 MMM broth 50 ㎖를 투입하고 멸균한 후, 1% 종균을 접종하였으며, 72시간 배양 후, 슈덴 생산량을 관찰하였으며, 그 결과를 도 17 및 표 4에 나타내었다.

도 17 및 표 4에 나타난 바와 같이, 배양온도에 따른 슈덴 생산량을 비교해본 결과, 슈도알테로모나스 속 M2 균주의 경우, 해양에서 분리한 저온 미생물로 30℃에서는 미생물 성장에는 문제가 없지만, 슈덴 생산이 거의 되지 않는 것으로 확인되었으며, 20 내지 25℃에서는 슈덴 생산량이 오차 범위 내에서 비슷한 양이 생산되는 것으로 확인되었다.

(5) 3 ℓ 발효기를 이용한 슈덴 생산량 분석

1) 기본 배양

3 ℓ 발효기를 사용하여 슈덴생산최적화배지(Pseudane Optimization Medium, 이하 POM)(ℓ 당 프룩토스 15 g, 효모 추출물 10 g, 시트르산철 0.1 g, 염화나트륨 19.45 g, 염화마그네슘 5.9 g, 황산마그네슘 3.24 g, 염화칼슘 1.8 g, 염화칼륨 0.55 g, 중탄산나트륨 0.16g, 브롬화칼륨 0.08 g, 염화스트론튬 34.0 ㎎, 붕산 22.0㎎, 규산나트륨 4.0 ㎎, 불화나트륨 2.4 ㎎, 질산암모늄 1.6 ㎎, 인산수소이나트륨 8.0 ㎎) 2 ℓ를 투입하고 22℃에서 1.0 vvm 공기를 넣고 150 rpm에 종균량 1%를 접종한 후, 72시간 동안 배양하여 슈덴 생산량을 분석하였다. 그 결과, 도 18에 나타난 바와 같이, 36시간에서 4.7 g/ℓ의 슈덴을 생산하는 것으로 확인하였으며, pH는 플라스크 배양에서도 확인된 바와 같이 배양이 진행함에 따라 pH가 8.0 이상으로 증가하는 것으로 확인되었다.

2) 통기량에 따른 생산 최적화

3 ℓ 발효기를 사용하여 POM 배지 2 ℓ를 투입하고 22℃에서 통기량을 0.5, 1.0, 1.5 및 2.0 vvm 공기를 넣고 종균배양액을 각각 1%를 접종한 후, 72시간 동안 배양하여 통기량에 따른 슈덴 생산량을 분석하였으며, 그 결과를 도 19 및 표 5에 나타내었다.

그 결과, 1.5 vvm에서 슈덴 생산량이 5.78 g/ℓ에서 가장 많은 것으로 확인되었다. 따라서, 통기량은 1.5 vvm이 최적 농도인 것으로 확인되었다.

3) 진탕 속도에 따른 생산 최적화

3 ℓ 발효기를 사용하여 POM 배지 2 ℓ를 넣고 22℃에서 진탕 속도 변화(100, 150 및 200 rpm)에 따른 슈덴 생산량의 변화를 관찰하였다. 종균배양액을 각각 1%를 접종한 후, 72시간 동안 배양하였으며, 슈덴 생산량을 HPLC로 분석하였다. 그 결과, 도 20 및 표 6에 나타난 바와 같이, 진탕 속도가 150 rpm과 200 rpm일 때 36시간 기준으로 5.68 g/ℓ로 오차 범위 내에서 비슷한 생산량을 보였다.

(6) 파일럿 확대생산에 따른 슈덴 생성량 분석

1) 50 ℓ 발효기를 이용한 슈덴 생산량분석

50 ℓ 발효기를 사용하여 POM 배지 30 ℓ를 투입하고 종균배양액 1%(300 ㎖)를 접종하여 22℃에서 72시간 배양하여 원심분리 후, 균체를 제거하고, 배양액에 동량의 EA로 슈덴을 추출하였다. 추출물은 동결 건조하여 수율을 체크하였으며, 그 결과를 도 21에 나타내었다.

3 ℓ 발효기를 이용한 최적화 조건을 근거로 50 ℓ 발효기를 사용하여 파일럿 확대생산시험을 진행하였다. POM 배지에 공기주입량 1.5 vvm, 진탕 속도 150 rpm으로 22℃에서 배양한 결과, 36시간 배양 시, 약 6.076 g/ℓ의 슈덴이 생성되는 것으로 확인되었다. 따라서 이 데이터를 근거로 1 톤 발효기에서 발효를 진행하였다.

2) 1 톤 발효기를 이용한 슈덴 생산량 분석

1 톤 발효기에 POM 배지 500 ℓ를 투입하고 121℃에서 20분간 멸균한 후, 종균배양액 1%(5L)를 접종한 후, 22℃, 150 rpm, 1.5 vvm에서 72시간 배양을 한 후, 총 수율은 EA 추출하여 회수한 시료를 동결건조한 회수량으로 계산하였으며, 총 슈덴 함량과 지표물질의 함량을 분석하였다. 그 결과, 도 22에 나타난 바와 같이, 36시간 배양 시 슈덴은 5.82 g/ℓ가 생산되었으며, 이는 50 ℓ 배양 시 보다 약 0.15 g/ℓ가 적게 생산되었으나, 이는 가공과정 중에 생길 수 있는 손실로 판단된다.

2. 기능성 화장료의 표준화

(1) 종균관리 및 보관

슈도알테로모나스 속 M2 종균관리는 1차로 특허균주로 KCTC에 기탁(기탁번호 KCCM11518P)하여 보존하고 있으며, 본 연구 및 제품생산을 위하여 미합중국 소재 Difco사 Marine broth 2216 배지로 500 ㎖ 배양하여, 배양액 : 글리세롤 = 8 : 2 (v/v) 비율로 혼합하여 -75℃ 초저온 냉동고에 1.5 ㎖씩 분주하여 관리번호를 부착하여 관리하였다.

(2) 발효생산표준화

1 톤 발효기를 사용하여 최적화된 배지(POM)와 최적발효조건(배양시간, 배양온도, 통기량, 교반 속도 등)을 기반으로 배양을 생산하며, 배양 후, 멸균하여 원심분리하여 균체를 제거한 후, 상등액을 농축하여 EA로 추출한 후, 농축기로 EA를 완전제거한 후 동결건조하여 회수하였다.

(3) 지표물질

슈덴동결건조분말을 DMSO에 녹인 후, HPLC로 분석하여 지표 및 효능물질을 선정하고 효능과 관련된 농도기준을 설정한 후 배합하였다.

(4) 원료배합

화장료원료로 사용하기 위해 탄소원 함유 배지 중에서 배양된 슈도알테로모나스 속(Pseudoalteromonas sp .) 균주의 배양물을 에틸아세테이트로 추출한 추출물(이하 '함슈덴 추출조성물'이라 함), 정제수, 1,3-프로판디올, 1,2-헥산디올을 혼합하여 배합하였다.

<실험결과>

(1) 발효생산공정표준화

1 톤 발효기를 사용하여 최적화된 배지(POM)와 최적발효조건(36시간, 22℃, 150 rpm, 1.5 vvm 등)을 기반으로 발효를 진행하며, 발효 후, 멸균, 원심분리, 여과과정을 거쳐 원심분리상등액을 회수하고 65℃에서 농축기로 50 ℓ까지 농축한 후, EA 50 ℓ를 첨가하여 상온에서 교반기로 12시간 추출한 후 EA층을 회수한 후, 농축과정을 거쳐 EA를 완전히 제거한 후, 동결건조하여 분말을 회수하였다. 현재 발효조건대로 생산할 경우 5.82 g/ℓ의 함슈덴 추출조성물을 회수할 수 있으며, 500 ℓ 발효 시 약 2.9 ㎏의 함슈덴 추출조성물을 생산할 수 있다.

(2) 지표물질

슈덴동결건조분말을 DMSO에 녹인후 HPLC로 분석하여 지표 및 효능물질을 선정하고 효능과 관련된 농도기준을 설정한 후 배합한다. 1 톤 발효기에서 생산된 함슈덴 추출조성물의 경우, HPLC를 분석한 결과를 도 23에 나타내었으며, 도 23에 나타난 바와 같이, 지표물질은 가장 생산량이 많은 A-5를 정하는 것이 바람직할 것으로 판단된다.

(3) 원료배합

화장료로 사용하기 위해, 하기 표 7과 같이, 함슈덴 추출조성물, 정제수, 1,3-프로판디올, 1,2-헥산디올을 혼합하여 배합하였다.

3. 함슈덴 추출조성물의 생리활성 및 효능검증

3-1. 미백 활성 검증

(1) DPPH 소거능(전자공여능측정)

- 슈도알테로모나스 속 M2 균주를 MMM broth에 22℃, 48시간 진탕배양(150 rpm) 한 후, 원심분리하여 균체 제거 후, 배양액과 동량의 EA로 함슈덴 추출조성물을 수득한 후, 시료로 사용하였다. 이 시료는 200, 400, 600, 800 및 1000 ㎍/㎖의 농도로 DMSO에 용해시켰으며, 양성대조로 아스코르빈산을 동일한 농도로 제조하여 사용하였다.

- 2,2-디페닐-1-피크릴히드라질 라디칼(DPPH)은 유리 라디칼에 대한 시료의 항산화 효능을 확인하기 위하여 사용한다.

에탄올에 용해시킨 0.4 mM DPPH 용액 0.8 ㎖에 시료 0.2 ㎖를 첨가하여 와류 믹서(vortex mixer)로 5초간 진탕하고, 암소에서 10분 동안 방치 후, 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 다음 식에 의하여 DPPH 유리 라디칼 소거능을 나타내었다.

(2) 머쉬룸 티로시나아제(mushroom tyrosinase) 활성저해

티로신이 티로시나아제에 의해 산화되어 멜라닌이 생성되게 되는데, 이 생성 과정중에 생기는 중간물질인 도파크롬(DOPA chrome)을 검출할 수 있는 흡광도인 475 ㎚의 파장에서 측정하였다.

<재료 및 시약>

① 100 mM 인산나트륨 완충제(pH 6.5)

- 효소를 위한 완충용액으로서의 역할

- pH가 6.5인 완충제 제조법(1 ℓ 기준)

1 M NaH₂PO₄(685 ㎖) + 1 M Na₂HPO₄(315 ㎖) -> 1 M 인산나트륨 완충제(pH 6.5)(1 ℓ)

* 일염기(NaH₂PO₄)와 이염기(Na₂HPO₄)를 혼합하여 pH를 맞춤.

② 200 U/㎖ 티로시나아제(분석 완충제 중)

③ 10 mM L-DOPA

④ 아스코르빈산 (1 ㎎/㎖)

·실험 방법

① 아스코르빈산(대조) 및 샘플을 희석하였다.

② 시험관에 100 mM 인산나트륨 완충제(pH 6.5)를 100 ㎕, 10 mM L-DOPA를 40 ㎕씩 첨가하였다.

③ 대조와 샘플을 20 ㎕씩 첨가하였다.

④ 200 U/㎖ 티로시나아제를 20 ㎕ 첨가하여 25℃에서 5분간 반응시켰다.

⑤ 96-웰 플레이트에 옮겨 475 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

A : 탈이온수를 넣고 진행

A' : A 조건에서 티로시나아제를 투입하지 않고 진행

B : 시료를 투입하고 진행

B' : B 조건에서 티로시나아제를 투입하지 않고 진행

3-2. 항주름 효능 검증

슈도알테로모나스 속 M2 균주가 생산하는 함슈덴 추출조성물의 항주름 활성을 확인하기 위하여 MMM broth에 22℃에서 48시간 진탕배양(150 rpm)한 배양상등액을 EA를 동량 첨가하여 추출한 후 동결건조하여 실험에 사용하였다.

(1) 콜라게나아제 활성 저해 효소 실험

피부, 혈관, 근육 등 결합조직의 주된 단백질인 콜라겐은 세포간의 기질로 피부의 탄력을 유지시켜주는데 중요한 역할을 한다. 콜라겐의 감소는 피부가 탄력을 잃을 뿐만 아니라 피부가 얇아지며 주름을 유발한다. 콜라게나아제는 이런 피부탄력을 유지시켜주는 콜라겐을 분해하는 효소이다.

·실험방법

1) 얼음 상에서 마이크로 시험관에 50 mM Tris-HCl 완충제 50 ㎕와 콜라게나아제 (1 ㎎/㎖) 10 ㎕ 넣고 혼합하였다.

2) 샘플 100 ㎕씩 첨가하였다.

3) 얼음 상에서 젤라틴(6 ㎎/㎖) 500 ㎕을 첨가하고 혼합한 다음 37℃에서 30분간 반응시켰다. 혼합은 반응 중에 2회 수행하였다.

4) 10% 트리카르복실산(TCA)를 500 ㎕ 첨가한 후, 10분간 반응시키고, 50 ㎕를 다른 마이크로 시험관에 옮기고 2% 닌히드린 용액 500 ㎕을 첨가한 후, 10분간 비등점까지 가열한 후, 5분 동안 실온까지 냉각시켰다.

5) 50% 1-프로판올을 500 ㎕ 첨가하여 충분히 진탕한 후, 15분간 방치시켰다.

6) 96-웰 플레이트에 200 ㎕ 씩 옮겨 담고 570 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

(2) 정상 인간 진피 섬유아세포(NHDF: Normal human dermal fibroblast)를 이용한 주름개선 활성

A. 프로콜라겐 합성능 (R&D systems DY6220-05 kit 사용)

- 프로콜라겐은 콜라겐의 전구체로 피부 탄력을 유지하는데 중요한 역할을 한다. NHDF 세포의 프로콜라겐 합성능을 측정하였다.

·실험방법

① 48-웰 플레이트에 NHDF 8X10⁴ cell을 분주하고, 24시간 동안 5% CO₂, 37℃에서 배양시켰다.

② 1XPBS로 한번 세척한 후, 각 웰 당 200 ㎕의 1XPBS를 첨가하여 UV 처리군의 경우, UVA를 2 J/㎠을 조사하였다.

③ 혈청이 첨가되지 않은 배지로 모두 교체한 후, 시료를 농도별(레티놀 1 ㎍/㎖, 합성물/배양액 추출물 시료 10 ㎍/㎖)로 처리하였다.

④ 48시간 동안 5% CO₂, 37℃의 조건에서 배양시켰다.

⑤ 배양액을 회수하여 kit 분석에 이용하고, 세포는 MTT 분석을 실행하였다.

B. NHDF를 이용한 MMP-1 억제능 (R&D systems DY901 kit 사용)

·실험방법

① 48-웰 플레이트에 NHDF 8X10⁴ cell을 분주하고, 24시간 5% CO₂, 37℃에서 배양시켰다.

② 1XPBS로 한번 세척한 후, 각 웰 당 200 ㎕의 1XPBS를 첨가하여 UV 처리군의 경우 UVA를 2 J/㎠을 조사하였다.

③ 혈청이 첨가되지 않은 배지로 모두 교체한 후, 시료를 농도별(레티놀 1 ㎍/㎖, 합성물/배양액 추출물 시료 1, 5 및 10 ㎍/㎖)로 처리하였다.

④ 48시간 5% CO₂, 37℃의 조건에서 배양시켰다.

C. MAPKs 활성(NHDF cell, RayBiotech CBEL-ERK-SK 사용)

- UV가 세포 내 활성산소종(ROS)을 증가시키고 그에 따른 MAPKs 단백질 인산화가 활성화 되면 기질이 분해가 촉진 되고, 콜라겐 생성이 감소하여 최종적으로 주름이 발생하게 된다. 이에 따라 합성물과 배양액 추출물의 인산화 억제 활성을 측정하기 위해 ELISA법을 이용하여 ERK 인산화, p38 인산화, JNK 인산화 억제활성을 측정하였다.

·실험방법

③ 혈청이 첨가되지 않은 배지로 모두 교체한 후, 시료를 농도별(합성물/배양액 추출물 시료 5 ㎍/㎖)로 처리하였다.

④ 48시간 5% CO₂, 37℃의 조건에서 배양시켰다.

⑤ 배양액을 회수하여 kit 분석에 이용하였다.

<실험결과>

3-1. 미백 활성 검증

(1) DPPH 소거능(전자공여능측정)

- 슈도알테로모나스 속 M2 균주를 MMM broth에 22℃, 48시간 진탕배양(150 rpm) 한 후, 원심분리하여 균체 제거 후, 배양액과 동량의 EA로 함슈덴 추출조성물을 수득한 후, 시료로 사용하였다. 이 시료는 200, 400, 600, 800 및 1000 ㎍/㎖의 농도로 DMSO에 용해시켰으며, 양성 대조로 아스코르빈산을 동일한 농도로 제조하여 사용하였다.

·결론 및 고찰

슈도알테로모나스 속 M2 균주 배양액 추출물의 항산화 활성을 살펴본 결과, 도 24에 나타난 바와 같이, 배양액 추출물에서는 항산화 활성이 전혀 나오지 않았다. 양성 대조인 아스코르빈산은 농도의존적으로 DPPH 소거능이 증가하며 400 ㎍/㎖ 농도 이상에서 거의 100% 활성을 나타내는 것으로 보아 배양액 추출물인 함슈덴 추출조성물은 항산화 활성을 가지지 않는 것으로 판단된다. 항산화 활성을 제외한 다른 활성의 체크가 필요한 것으로 여겨진다.

(2) 머쉬룸 티로시나아제 활성저해

티로신이 티로시나아제에 의해 산화되어 멜라닌이 생성되게 되는데, 이 생성 과정중에 생기는 중간물질인 도파크롬을 검출할 수 있는 흡광도인 475 ㎚의 파장에서 측정하였으며, 그 결과를 도 25에 나타내었다.

·결론 및 고찰

슈도알테로모나스 속 M2 균주 배양액 추출물의 티로시나아제 억제 활성을 살펴본 결과, 도 25에 나타난 바와 같이, 약간의 활성을 보였지만 농도의존적이지 않았다. 따라서, 슈도알테로모나스 속 M2 균주 배양액 추출물은 티로시나아제 저해 활성이 없다고 결론 내릴 수 있다.

3-2. 항주름 효능 검증

(1) 콜라게나아제 활성 저해 효소 실험

도 26에 나타난 바와 같이, 슈덴 A-3, A-5의 콜라게나아제 저해활성이 가장 좋았으며, A-4, A-7은 콜라게나아제 저해능이 나타나지 않았다.

(2) 정상 인간 진피 섬유아세포(NHDF)를 이용한 주름개선 활성

A. 프로콜라겐 합성능(R&D systems DY6220-05 kit 사용)

도 27에 나타난 바와 같이, 슈덴 합성물 A-0, A-1, A-4에서 프로콜라겐 합성능이 가장 좋았다. 특히, A-0는 양성대조로 사용한 레티놀보다 높은 합성률을 보였다. A-5, A-6, A-7의 경우 NHDF 세포에서의 프로콜라겐 합성능은 나타나지 않았다.

B. 정상 인간 진피 섬유아세포(NHDF)를 이용한 MMP-1 억제능(R&D systems DY901 kit 사용)

실험결과를 도 28 및 표 8에 나타내었다.

슈덴 합성물 8종 및 슈도알테로모나스 속 M2 균주 배양배지에서 수득되는 함슈덴 추출조성물 모두 MMP-1 억제 효과가 있었으며, 특히 A-1이 IC₅₀ 1.26 ㎍/㎖ 으로 가장 높은 활성을 나타냈다. A-4, A-5 역시 MMP-1 억제 효과가 뛰어났으며, 특히 A-5의 경우 1 ㎍/㎖의 낮은 농도에서도 MMP-1 저해율이 약 63% 정도로 슈덴 8종 중에 가장 뛰어난 활성을 보였다. 따라서, 슈덴 생성에 A-5비율이 높아진다면 더 뛰어난 활성을 가지는 기능성 원료를 생산 할 수 있을 것으로 판단된다.

C. MAPKs 활성(NHDF cell, RayBiotech CBEL-ERK-SK 사용)

- UV가 세포 내 ROS를 증가시키고 그에 따른 MAPKs 단백질 인산화가 활성화 되면 기질이 분해가 촉진 되고, 콜라겐 생성이 감소하여 최종적으로 주름이 발생하게 된다. 이에 따라 합성물과 배양액 추출물의 인산화 억제 활성을 측정하기 위해 ELISA법을 이용하여 ERK 인산화, p38 인산화, JNK 인산화 억제활성을 측정하였으며, 그 결과를 도 29(ERK 인산화 비율), 도 30(p38 인산화 비율) 및 도 31(JNK 인산화 비율)에 나타내었다.

도 29 내지 도 31에 나타난 바와 같이, 슈덴 합성물 A-7이 ERK 인산화 억제능이 가장 좋았다. A-1, A-6를 제외한 모든 슈덴 합성물이 p38 인산화 억제능을 나타냈다. JNK 인산화 억제능은 A-1, A-7를 제외한 모든 슈덴 합성물에서 활성을 나타냈다. 슈도알테로모나스 속 M2 균주 배양액 추출물의 경우 p38, JNK 인산화 억제능을 나타냈다.

·결과 및 고찰

슈덴 합성물 A-0부터 A-7까지 총 8종의 NHDF 세포에서의 주름개선활성을 측정한 결과, 각 슈덴별로 나타내는 활성이 조금씩 차이가 있었다. 콜라게나아제 저해 활성은 대부분의 슈덴이 거의 비슷한 수준의 활성을 나타냈으나, A-7 만 저해활성이 없었다. 프로콜라겐 합성능은 A-0가 10 ㎍/㎖에서 레티놀 1 ㎍/㎖ 보다 높은 수준의 활성을 보였으며, A-1, A-4, A-2 순서로 활성을 나타냈다. MMP-1 저해활성의 경우 A-5, A-4, A-1번이 높은 활성을 보였으며, A-2의 경우 IC₅₀이 꽤 높은 수치를 나타내는 것으로 보아 다른 슈덴에 비해 MMP-1 저해활성은 현저히 떨어지는 것을 알 수 있다. 따라서, 앞으로의 배지 최적화는 A-0, A-1, A-4, A-5번의 수율을 향상시키는데 초점을 맞추는 것이 유리하다고 판단된다.

D. 배양최적화 1톤 발효추출기를 이용한 배양액의 MMP-1 저해활성

탄소원 및 질소원 배양 최적화 후 규모확대에 따른 배양액의 주름개선효과를 검증하기 위하여 1톤 발효추출기를 이용한 배양액 500L 배양액 추출물의 NHDF cell에서의 MMP-1 저해활성을 분석하였으며, 그 결과를 도 32에 나타내었다.

도 32에 나타난 바와 같이, 규모확대에 따른 1 톤 발효 추출기를 이용한 발효액 (500 ℓ)의 EA 추출물의 MMP-1 저해효과를 분석한 결과, 배양액 1 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖의 농도에서 MMP-1 저해율이 35.6%, 56.9%, 84.0%로 농도의존적으로 증가했으며, 레티놀 1 ㎍/㎖을 처리했을 때 MMP-1 저해율이 79.5%로 배양액 10 ㎍/㎖ 농도와 비슷한 수준이었다. 이는 배지 최적화되기 이전의 MMP-1 저해율과 비교했을 때 모든 농도에서 MMP-1 저해율이 30% 이상 증가한 수치이다. 특히, 배지최적화 이전에는 배양액 1 ㎍/㎖의 농도에서 MMP-1 저해율이 거의 없었으나, 35% 수준으로 급격히 증가하여 배지 최적화로 슈덴의 생산량의 증가 뿐 만 아니라 주름개선 효과 또한 증가한 것을 확인할 수 있었다.

5. 원료 제형 개발

주름기능성 화장료인 레티놀의 경우, 화장료 제형에의 적용 시 그 사용량이 2500 IU를 기준으로 하고 있으며, 이것은 화장료 100 g 당 0.075%에 해당되는 양으로 본 제품의 경우, 총 슈덴 함량을 기준으로 환산하여, 그 최적농도를 확정하였으며, 원료제형에 사용될 원료로는 정제수, 1,3-프로판디올, 1,2-헥산디올을 첨가하여 상기 표 7과 같이 제형을 완성하였다.

(1) 열안전성 평가

원료의 열 안전성평가를 위하여 표준물질(A-0~A-7)을 혼합하여 121℃ 가압멸균기를 사용하여 원료가 열분해가 되는지 확인하기 위해 30분간 가압멸균을 실시하였다. 가압멸균 전(도 33)과 후(도 34)를 도면에 나타내었다. HPLC 크로마토그램으로 비교한 결과 비교적 안정적인 구조 물질임을 확인하였다.

(2) 물리화학적 안정성 분석

슈덴 원료물질의 용해도 시험을 위하여 정제수에 슈덴 원료를 중량으로 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%, 0.7%, 0.8%, 0.9%, 1.0%, 2.0% 및 3.0% 비율로 처리하여 정제수 69%, 1,3-프로판디올 30%, 1,2-헥산디올 2%인 혼합용매에 넣고 각 농도별로 처리한 후, pH는 6.5로 조정하여 용해도를 분석하였다. 그 결과 2.0% 이상 첨가할 시, 약간 탁해지는 것으로 보아 최대 용해도는 1.0%로 예상된다. 이 농도 기준으로 제형의 변화를 측정하였고, 측정 방법으로는 온도별(-20, 4, 25, 45, 50℃), UV-A/B, 형광조건 등에서 60일 동안 취, 상의 분리, 색상, 점성 등 다양한 제형의 변화를 관찰하였다. 관능적 검사로 제형의 분리, 침전, 색도변화 등을 수행함에 있어서 추출물이 제형에 미치는 영양을 평가한 결과를 표 9에 나타내었으며, 60일간의 안정성 시험에서 모두 안정함을 알 수 있었다.

인체적용시험에 사용될 제형은 에센스 제형으로 하기 표 10의 처방에 따라 혼합하여 사용하였다.

이상에서 본 발명은 기재된 구체예에 대해서만 상세히 설명되었지만 본 발명의 기술사상 범위 내에서 다양한 변형 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속함은 당연한 것이다.

(도면 부호 없음)

Claims

탄소원 함유 배지 중에서 배양된 슈도알테로모나스 속(Pseudoalteromonas sp.) 균주의 배양물을 에틸아세테이트로 추출한 추출물을 유효성분으로 포함함을 특징으로 하는 항주름용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
슈도알테로모나스 속(Pseudoalteromonas sp .) 균주가 슈도알테르모나스 속 M2(Pseudoaltermonas sp. M2; 기탁번호 KCCM11518P)임을 특징으로 하는 항주름용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
탄소원 함유 배지가 MMM broth에 탄소원을 더 첨가하여 구성되며, MMM broth가 효모 추출물 1.0 g, 구연산철 0.1 g, 염화나트륨 19.45 g, 염화마그네슘 5.9 g, 황산마그네슘 3.24 g, 염화칼슘 1.8 g, 염화칼륨 0.55 g, 중탄산나트륨 0.16 g, 브롬화칼륨 0.08 g, 염화스트론튬 34.0 ㎎, 붕산 22.0 ㎎, 규산나트륨 4.0 ㎎, 불화나트륨 2.4 ㎎, 질산암모늄 1.6 ㎎, 인산수소이나트륨 8.0 ㎎, 32.4 g/ℓ로 이루어짐을 특징으로 하는 항주름용 화장료 조성물.
제 3 항에 있어서,
탄소원이 글루코스, 프룩토스, 슈크로스, 전분 및 갈락토스로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 항주름용 화장료 조성물.
제 4 항에 있어서,
탄소원이 프룩토스임을 특징으로 하는 항주름용 화장료 조성물.
제 5 항에 있어서,
프룩토스가 MMM broth 총 중량을 기준으로 0.5 내지 2.5중량%의 양으로 첨가됨을 특징으로 하는 항주름용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
배양이 통기조건에서 20 내지 52시간의 범위 이내의 시간 동안 수행됨을 특징으로 하는 항주름용 화장료 조성물.
제 1 항에 있어서,
배양이 20 내지 25℃의 범위 이내의 온도에서 수행됨을 특징으로 하는 항주름용 화장료 조성물.
(1) 탄소원 함유 배지 중에서 슈도알테로모나스 속(Pseudoalteromonas sp .) 균주를 배양하여 배양물을 수득하는 배양단계; 및
(2) 배양단계에서 수득되는 배양물을 에틸아세테이트로 추출하는 추출단계;
를 포함함을 특징으로 하는 항주름용 화장료 조성물의 제조방법.