KR100755515B1 - 함초를 이용한 기능성 음료 및 그 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 함초 추출물 함유 기능성 음료 및 이의 제조방법에 관한 것으로 함초에 1:1비율의 증류수를 가하여 3∼4시간동안 끓인 뒤 이를 여과하고 3000xg로 10∼15분간 원심분리하여 여과한 뒤 농축액으로 제조하거나 -70℃에서 동결건조시켜 분말 형태로 제조하고 상기 함초 추출물을 이용하여 함초의 기능성을 조사하고 이를 종래의 음료 제조공정에 첨가하여 함초 추출물 함유 기능성 음료를 제공할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.
함초, 기능성 음료, 활성산소, 고혈압예방, 미백작용, 노화
Description
도 1은 본 발명 함초 추출물의 SOD유사활성실험 과정을 도식적으로 나타낸다.
도 2는 본 발명 함초추출물의 전자공여능 실험과정을 도식적으로 나타낸다.
도 3은 본 발명 함초 추출물의 티로시나제저해활성 실험 과정을 배양시와 비배양시로 나누어 도식적으로 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명 함초 추출물의 TBARS 실험 과정을 도식적으로 나타낸다.
도 5는 본 발명 함초 추출물의 ACE저해 실험 과정을 도식적으로 나타낸다.
도 6은 본 발명 함초 추출물의 암세포증식 억제능 실험 과정을 도식적으로 나타낸다.
본 발명은 함초(Salicornia herbacea LINNE)를 이용한 기능성 음료 및 그 제조 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 함초의 기능성을 조사한 결과 함초를 열수추출하여 그 유효성분을 음료에 첨가하여 제조한 SOD유사활성능, 미백, 비만예방, 고지혈증예방, 동맥경화방지, 심근경색예방, 노화방지, 고혈압예방 및 항암에 효과적인 기능성 음료와 이의 제조방법에 관한 것이다.
함초는 우리나라의 울릉도와 중부지방, 남부서해안의 강하구언이나 갯벌 및 염전부근에서 자생하는 내염성 식물로서 [해연자]라고 불리기도 하는 명아주과의 1년생 초본으로 잎이 없는 식물이며 통통한 마디가 있기 때문에 [퉁퉁마디]라 부르며 민물과 바닷물이 교차하는 들녘에 자란다. 높이는 10-30cm 로 둥근 나무형이며 마주 달린 가시가 많이 있고 원줄기는 짙은 녹색에 두드러진 마디가 많이 있고 짠맛이 나며, 7-9월에 녹황색 꽃이 피고 10월에 납작하고 까만 열매가 맺히며 가을이 되면 함초 전체가 붉은 홍자색으로 변한다. 국립수산진흥원의 퉁퉁마디에 대한 부위별 성분분석에 따르면, 수분함량은 잎이 90.9%로 가장 높았고, 회분은 잎이 4.6%,줄기가 6.1%, 뿌리가 6.2%였다. 염분함량은 줄기에서 가장 높고 다음으로 잎, 뿌리의 순이었다. 회분 중 염분의 함량은 잎에서 약 70%를 차지하였다. 총당 및 환원당은 뿌리에서 각각 22.8% 및 13.4%로 가장 높았고, 우론산(uronic acid)의 함량은 시료 100g 당 잎이 0.31g, 줄기가 1.40g, 뿌리가 1.88g이였다. 아미노산은 잎의 경우 글루타민산(glutamic acid), 아스파르트산(aspartic acid) 등이 많았고, 줄기 및 뿌리에서 라이신(lysine), 글루타민산 등이 많았다. 잎에는 티로신(tyrosine)이 10.8mg/100g 함유되어 있고 줄기 및 뿌리에서는 검출되지 않았으며, 타우린은 잎보다 줄기와 뿌리에서 3 ~5배 가량 많았다. 프로린(proline)은 잎 및 뿌리에서 총 아 미노산 중 약 7%로 검출되었다. 무기질은 나트륨이 1333.8mg/100g으로 가장 많이 함유되어 있었다. 특히 퉁퉁마디에 칼륨이 많이 함유되어 있어 이뇨작용을 촉진시킬 것으로 생각되며, 또 체내에서 저항력과 골격의 건강을 유지하는 칼슘도 많이 함유되어 있었다. 부위별 무기질은 나트륨은 뿌리에서 가장높았고, 칼슘은 잎(650.1mg/100g)에서 뿌리(22.1mg/100g)의 약 20배 가량 많이 함유되어 있었다 마그네슘(46.5mg/100g ~ 54.0mg/100g) 및 칼륨(650.1 ~ 741.1mg/100g)은 부위에 따른 큰 차이를 볼 수 없었으며, 아연은 줄기에서 29.6mg/100g으로 가장 높았다. 철은 잎에서 31.5mg/100g, 줄기에서 66.2mg/100g, 뿌리에서 84.8mg/100g으로 나타났으며, 이 외에도 구리, 니켈, 망간등이 미량 함유되어 있었다.
그러나 이러한 함초의 천연미네랄성분 이외의 생리활성기능에 대해서는 아직 보고된 바가 거의 없으며 유용한 성분을 함유하고 있고 이미 식품의약품안전청으로부터 식품원료로서의 사용가능성에 대해 인정을 받은 바 있는 함초의 음료로서의 활용이 이루어지지 않고 있는 실정이다.
본 발명자들은 상기와 같은 점을 착안하여 함초의 SOD유사활성(superoxide dismutase like activity), 티로시나제(tyrosinase)저해활성, TBARS (thiobarbituric acid reactive substances), 전자공여능, ACE(angiotensin converting enzyme) I 효소의 저해활성 및 MTT assay에 의한 암세포증식 억제능과 같은 생리활성기능을 다양한 각도에서 실험하고 기능을 검증하고 함초를 열수추출 후 농축액으로 제조하거나 동결건조하여 분말 형태로 제조하여 이를 음료 제조에 이용함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 함초를 이용하여 기능성 음료를 제조하는 방법을 제공함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기와 같은 방법으로 제조된 함초 추출물 함유 기능성 음료를 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 함초에 1:1비율의 증류수를 가하여 3∼4시간동안 끓인 뒤 이를 여과하고 3000xg로 10∼15분간 원심분리하여 여과한 뒤 농축하여 농축액을 제조하고 상기 추출액을 -70℃에서 동결건조시켜 분말 형태로 제조한 뒤 상기 농축액 및 분말을 이용하여 함초의 기능성을 조사하고 이를 종래의 음료 제조공정에 첨가하여 함초 추출물 함유 기능성 음료를 제조함으로써 달성하였다.
이하, 본 발명의 구성 및 작용을 설명한다.
본 발명은 함초에 1:1비율의 증류수를 가하여 3∼4시간동안 끓인 뒤 이를 여과하고 3000xg로 10∼15분간 원심분리하여 얻은 추출액을 농축시켜 농축액을 제조하고 상기 추출액을 -70℃에서 동결건조시켜 분말 형태로 제조하는 단계; 상기 단계의 함초분말을 희석하여 함초에 대한 항균력을 한천배지확산법 이용하여 조사하는 단계; 상기 단계의 함초 시료액을 이용하여 SOD유사활성을 조사하는 단계; 함초시료액의 전자공여능을 측정하는 단계; 함초 시료액에 인산 완충용액과 L-DOPA 용 액을 첨가하여 티로시나제 저해활성을 조사하는 단계; TBARS실험을 통해 함초의 항산화능을 조사하는 단계; 함초 추출물에 DPPH용액을 첨가하여 517nm에서의 흡광도 차이를 측정하여 전자공여능 실험을 하는 단계; 히퓨릴-엘-히스티딜-엘-로이신(Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine)에 함초시료를 가하여 안기오텐신 I -컨버팅 효소(Angiotensin I -Converting Enzyme, ACE)저해실험을 수행하는 단계; 유선암세포와 피부악성흑색종에 함초시료을 처리하여 암세포의 증식억제능을 MTT assay로 측정하는 단계; 상기 단계의 함초 농축액 및 분말을 종래의 음료 제조공정에 첨가하여서 함초성분 함유 음료를 제조하는 단계로 구성된다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 본 발명 함초 추출물의 제조
함초100g에 증류수 100ml를 가하여 3시간 끓여서 거즈로 여과하고 3000 xg로 10분간 원심분리후 여과하여 추출액을 만들었다. 상기 추출액을 종래의 농축법으로 고형분 농도 20∼30중량%까지 농축하여 함초 추출물 농축액을 얻었다. 상기 추출액을 -70℃에서 동결시킨 후 동결건조기(Freeze Dryer)로 동결건조시켜 함초 추출물을 분말 형태로 만들었다. 하기 각 실험에서는 상기 분말을 그램단위 또는 ppm단위로 희석하여 사용하였다. 함초와 비교실험을 위하여 선학초, 백화사설초, 백부자 등도 위와 같은 방법으로 열수추출하여 시료로 사용하였다.
실시예 2: 함초의 항균력 실험
항균력 실험에는 균주 Bacillus, Echarichia coli, Enterobacter, Listeria, Pseudomonas, Streptococcus를 사용하였다. 사면배지의 각 균주들을 백금니로 취해 10ml 뉴트리언트 브로스(nutrient broth) 생육배지에 접종하고 37℃에서 계대배양하면서 사용하였다. 평판배지는 뉴트리언트 브로스 생육배지에 뉴트리언트 아가(nutrient agar)를 1.5% 첨가하여 가압 멸균기(autoclave)로 멸균한 다음, 페트리 접시(petri dish)에 약 15ml 씩 분주하여 사용하였다. 시료의 항균실험은 한천배지확산법(paper disc plate method)으로 측정하였다. 먼저 각각의 시료용액을 필터멸균 시킨 다음, 가압 멸균시킨 filter paper disc를 핀셋으로 집어 배양배지위에 올려 놓고, 미리 여과멸균처리로 준비한 시료의 농도별(각각 0%, 3%, 7%, 10%의 함초추출액)로 100㎕씩 흡수시킨 후 균을 도말한 한천배지 위에 밀착시키고 37℃에서 16시간 배양한 다음 paper disc 주위의 clear zone을 관찰하였다.
상기 paper disc를 관찰한 결과 4가지 시료 중에서 함초를 비롯한 백부자와 백화사설초에서는 표 1에서와 같이 그램-양성(Gram-positive) 및 그램-음성(Gram-negative) 균에 대한 항균활성은 나타나지 않았다. 그러나 선학초에 있어서 Bacillus, Escharichia coli, Enterobacter, Listeria, Pseudomonas, Salmonella, Streptococcus균에 대해 농도의존적으로 clear zone을 형성하였으며 항균활성이 확인되었다. 특히 선학초의 항균활성이 그램-양성뿐만 아니라 그램-음성 균에 걸쳐 항균스팩트럼이 광범위하였다.
| 시료 및 농도(%) Strains | 함초 | 선학초 | 백부자 | 백화사설초 |
| 0 3 7 10 | 0 3 7 10 | 0 3 7 10 | 0 3 7 10 | |
| Bacillus | - - - - | - + ++ +++ | - - - - | - - - - |
| E.coli | - - - - | - + + + | - - - - | - - - - |
| Enterobacter | - - - - | - + ++ +++ | - - - - | - - - - |
| Listeria | - - - - | - + + ++ | - - - - | - - - - |
| Pseudomonas | - - - - | - + ++ +++ | - - - - | - - - - |
| Salmonella | - - - - | - - - + | - - - - | - - - - |
| Streptococcus | - - - - | - - - - | - - - - | - - - - |
실시예 3: 본 발명 함초 추출물의 SOD유사활성 실험
SOD(Superoxide dismutase)유사활성 측정은 도 1에서와 같이 농도별(각각 1%, 3%, 5%의 함초추출물)로 시료액 0.2ml를 준비하고 pH 8.5로 보정한 Tris-HCl 완충용액(50mM Tris + 10mM EDTA) 3ml와 7.2mM 피로갈롤(pyrogallol) 용액 0.2ml을 가하고 25℃에서 10분간 반응시킨 후 1N HCl 1ml로 반응을 정지시킨 후 420nm에서 흡광도를 측정하였다. SOD유사활성능은 하기 식 (Ⅰ)을 이용하여 백분율로 계산하였다.
| SOD유사활성능(%) | = ( 1 - | 시료첨가구의 흡광도 | ) ×100 ---(Ⅰ) |
| 무첨가구의 흡광도 |
생물체의 생체내에서 불가피하게 생성되는 환원산소종은 생체세포의 구성요소에 유해한 수산기나 유도체를 생성시키므로 세포에 있어서 매우 해롭다. SOD(Superoxide dismutase)는 세포에 피해를 입히는 환원산소종을 과산화수소로 전 환시키는 반응을 촉매하는 효소이며 SOD에 의해 생성된 과산화수소는 페록시다아제(peroxidase)나 카탈라제(catalase)에 의해 무해한 물분자와 산소분자로 전환된다. 함초의 열수추출물을 이용한 SOD유사활성의 측정결과, 표 2와 같이 각 식물체 추출물에 있어서 모두 농도에 의존적으로 활성증가를 나타내었으나, SOD유사활성이 비교적 높게 나타나는 것으로 알려져 있는 선학초 추출물이나 백화사설초 추출물에 비해 함초 추출물이 보다 높은 수치를 나타내어 항산화력이 탁월함을 알 수 있었다. 특히 3%의 저농도에서 비교해 볼 때, 함초추출물의 SOD유사활성이 60%이상을 나타내었다.
| 추출물 | 농도(%) | SOD유사활성(%) |
| 함초 | 1 3 5 | 31.30 60.92 72.41 |
| 선학초 | 1 3 5 | 30.95 48.76 62.39 |
| 백부자 | 1 3 5 | 21.28 23.76 26.69 |
| 백화사설초 | 1 3 5 | 21.17 38.96 64.08 |
실시예 4 : 본 발명 함초 추출물의 전자공여능 실험
전자공여능(electron donating ability, EDA)실험은 도 2에서와 같이 각 농 도별(500ppm과 1000ppm) 함초추출액 2ml에 2 x 10-4M DPPH(α,α-diphenyl -picrylhydrazyl)용액 1ml씩을 첨가한 후 10초간 vortex mix후 30분간 실온에 정치시킨 다음, 분광광도계(spectrophotometer)로 517nm에서 흡광도 변화를 측정하고 전자공여능은 시료첨가구와 무첨가구의 흡광도 차이를 하기 식 (Ⅱ)를 이용하여 백분율로 나타내었다.
전자공여능 = (100 - 시료첨가구 / 시료 무첨가구) × 100 ---(Ⅱ)
자유 라디칼(free radical)은 미토콘드리아(mitochondria), 식세포 또는 세포질 중의 크산틴 산화효소(xanthine oxidase)나 글루타티온 환원효소(glutathione reductase)와 같은 플라빈 효소(flavoenzyme)에 의한 대사과정 중에서 생물학적 반응으로 발생하며, 전자공여작용은 이러한 산화성 자유 라디칼(free radical)에 전자를 제공하여 산화를 억제하게 된다.
함초를 비롯한 와송과 어성초에 대해서 각각의 전자공여능을 비교분석한 결과, 표 3에서와 같이 모두 농도의존적으로 전자공여능을 나타내었으며, 특히 함초추출물과 어성초추출물의 경우는 500ppm의 낮은 농도에서도 전자공여능이 50%이상 나타나 자유 라디칼(free radical) 소거작용이 탁월한 것으로 나타났다. 이것을 이용하면 생체에 있어서 세포막의 손상으로 인한 노화예방과 자유라디칼(free
radical) 저해물질로 기능성 음료로서의 개발이 가능할 것이다.
| EDA(%) | |||
| Control | 0 | ||
| 함초 | Sample | 500 ppm | 54.8 |
| 1,000 ppm | 62.9 | ||
| blank | 500 ppm | 0 | |
| 1,000 ppm | 0 | ||
| 어성초 | sample | 500 ppm | 56.1 |
| 1,000 ppm | 61.2 | ||
| blank | 500 ppm | 0 | |
| 1,000 ppm | 0 | ||
| 와송 | sample | 500 ppm | 42.4 |
| 1,000 ppm | 46.9 | ||
| blank | 500 ppm | 0 | |
| 1,000 ppm | 0 | ||
실시예 5: 본 발명 함초 추출물의 티로시나제저해활성 실험
티로시나제(Tyrosinase)저해활성의 측정은 37℃ 수조에서 온도를 미리 조정한 pH 6.8의 0.175M 인산 완충용액(phosphate buffer) 1ml, 5mM L-DOPA 용액 0.5ml 및 시료(각각 0.05%, 0.1%, 0.5%, 1%의 함초추출액 농도)용액 1ml의 혼합액에 머쉬룸 티로시나제(mushroom tyrosinase)(110 units/ml) 0.5ml를 첨가하여 도 3a에서와 같이 37℃에서 2분간 반응시킨 다음 475nm에서 흡광도를 측정한 대조구의 수치를 A, 시료액의 수치를 C로 하고, 도 3b에서와 같이 37℃에서 2분간 반응시키는 단계를 거치지 않은 대조구의 수치를 B, 시료액의 수치를 각각 D라고 하여 하기 식(Ⅲ)에 의해 백분율로 계산하였다.
억제 비율(Inhibition rate)(%) = {(A-B)-(C-D)}/A-B × 100 ---(Ⅲ)
A: 반응시킨 경우의 대조구 B: 반응시키지 않은 경우의 대조구
C: 반응시킨 경우의 시료액 D: 반응시키지 않은 경우의 시료액
멜라닌(melanin)은 동식물과 미생물계에 널리 존재하는 고분자의 천연색소이며 페놀류의 효소반응 및 산화, 중합 등 여러 단계를 거쳐 합성된다. 알칼리용해도 및 발색특성에 따라 유 멜라닌(eumelanin)과 페오 멜라닌(pheomelanin)으로 구분하고 있으나 생합성 경로에 있어서는 공통적으로 티로시나제에 의해 티로신에서 생성되는 도파퀴논(dopaquinone)을 거쳐 합성이 되며, 미생물의 경우는 티로시나제의 작용에 의해 퀴논(quinone)의 생성이 된 다음, 아미노산 및 단백질과의 중합반응으로 인해 멜라닌(melanin)이 합성된다. 티로시나제활성의 저해효과는 특히 화장품산업의 미백효과를 비롯한 식품산업의 갈변화 방지에 있어서 매우 중요한 분야를 차지하고 있다. 표 4에서 각 식물추출물들의 티로시나제저해활성은 모두 농도의존적으로 나타났으며, 예로부터 미백효과가 있다고 전해져 온 천화분과 백부자추출물은 티로시나제저해활성이 매우 낮게 나타나 멜라닌형성을 저해하는 미백작용은 없음을 알 수 있었다. 이에 비해 함초추출물은 0.5%의 농도에서 43.29%로서 천화분이나 백부자의 티로시나제 저해활성능에 비해 매우 높은 수치를 보였다.
| 추출물 | 농도(%) | Tyrosinase Inhibition Ratio(%) |
| 함초 | 0.05 0.1 0.5 1 | 9.52 17.46 43.29 75.76 |
| 천화분 | 0.05 0.1 0.5 1 | 14.00 32.04 20.85 32.97 |
| 백부자 | 0.05 0.1 0.5 1 | 9.02 9.67 25.83 37.30 |
실시예 6: 본 발명 함초 추출물의 TBARS 실험
TBARS(Thiobarbituric acid reactive substances)는 도 4에서 나타낸 바와 같이 측정하였다. 먼저 1ml의 반응 혼합물이 채워진 시험관을 37℃ 수조(water bath)에서 각각 1시간, 24시간, 48시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝나자마자 7.2%의 디부틸히드로옥시톨루엔(dibutylhydroxytoluene,BHT) 50㎕를 시료에 첨가하였다. 반응 혼합물을 잘 섞은 다음 2ml TCA/TBA 시약을 가하고 다시 혼합 후 끓는 물에서 15분간 가열시켰다. 가열 후 찬물에서 식힌 후 3,000×g의 속도로 15분간 원심분리 하였다. 상등액을 흡광도 531nm에서 측정하였고, 공시료는 시료대신 증류수를 첨가하여 같은 방법으로 측정하였다. 항산화능은 하기 식(Ⅳ)에 의해 산출하여 백분율로 나타내었다.
항산화능(%)=100-[(시료첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)×100] ---(Ⅳ)
포화지방산과 콜레스테롤의 과량섭취는 비만과 고지혈증, 동맥경화 및 심근경색 등의 질환을 유발하고 지질과 산화물은 생체 내에서 암, 노화, 생체막의 변동 및 파괴와 같은 작용을 나타낸다. 표 5에서는 함초 추출물, 선학초 추출물 그리고 합성 항산화제인 BHT를 이용하여 각각의 농도별 지질 항산화 정도를 시간의 경과에 따라 TBARS(Thiobarbituric acid reactive substances)의 양을 측정하여 파악하였다. 함초추출물의 경우, 24시간이내에 지질의 항산화력이 인정되지만 48시간이 경과하면서 항산화능이 현저히 줄어들었다.
| 시간 시료 및 농도(ppm) | 1hr | 24hr | 48hr | |
| 대조구 | 0 | 0.068 | 0.243 | 0.563 |
| 함초 | 100 500 1000 | 0.055 0.044 0.036 | 0.092 0.087 0.077 | 0.563 0.273 0.195 |
| 선학초 | 100 500 1000 | 0.062 0.056 0.039 | 0.087 0.072 0.062 | 0.203 0.175 0.078 |
| BHA | 100 500 1000 | 0.031 0.022 0.013 | 0.035 0.026 0.015 | 0.038 0.027 0.017 |
실시예 7: 본 발명 함초추출물의 AngiotensinⅠ-Converting Enzyme(ACE)저해실험
AngiotensinⅠ-Converting Enzyme저해실험은 도 5에 나타난 바와 같이 기질인 50mM 히퓨릴-엘-히스티딜-엘-로이신(Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine)을 0.3M NaCl 및 pH 8.3의 100mM 인산 칼륨 완충용액(Potassium phosphate buffer)에 녹여 0.15ml을 준비하고 시료(각 농도별로 1%, 3%, 5%의 함초추출액) 100㎕를 가하여 37℃에서 10분간 전배양하고 이 반응액에 ACE조효소액 100㎕를 가하여 37℃에서 30분간 반응시킨 후 1N HCl 350㎕를 가하여 반응을 중지시킨 다음, 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 3ml를 첨가하여 15초간 혼합하여 정치시킨 후 상등액을 취하여 증발관(evaporator)으로 농축시키고 다시 증류수 1ml를 가하여 용해시킨 다음 228nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 공시험에는 추출물대신 증류수를 100㎕ 가하였고 대조구는 반응정지액을 먼저 넣은 후 ACE조효소액 100㎕를 첨가하였으며 ACE저해효과는 추출물 무첨가구에 대한 추출물첨가구의 흡광도 차이를 하기 식(Ⅴ)을 이용하여 백분율로 나타내었다.
| 저해율(%) | = 1 - | Sample의 huppuric acid 생성량 | × 100 ---(Ⅴ) |
| 대조구의 huppuric acid 생성량 |
ACE(angiotensin converting enzyme: kinase II. EC 3.4.15.1)는 레닌-안지오텐신 알도스테론(renin-angiotensin aldosterone)계의 안지오텐신(angiotensin) I을 생리적 혈압상승물질인 안지오텐신(angiotensin) II로 전환시키고, 혈관이완에 작용하는 브래디키닌(bradykinin)을 분해하는 효소이다. 안지오텐신(Angiotensin) II가 증가되면 카테콜아민(catecholamine)값이 증가되고 혈관이 수축되며 항이뇨 호르몬인 알도스테론(aldosterone)의 분비가 촉진된다. 동시에 Na+ 및 수분배설이 억제되어 순환혈액량이 증가되어 혈압상승의 원인이 된다. 따라서 ACE저해작용은 혈관수축을 막고 체내 수분의 저류를 막아 혈압을 낮추는 효과가 있다. 함초 추출물의 ACE저해활성을 측정한 결과, 표 6에서 나타난 것과 같이 농도의존적으로 저해활성이 나타났으며, 1%농도에서도 50%이상의 높은 ACE저해활성이 있었다. 또한 3-5%의 농도에서는 90%이상의 매우 높은 ACE저해활성을 나타내 함초추출물의 고혈압억제 효과를 확인할 수 있었다.
| 추출물 | 농도(%) | ACE저해활성(%) |
| 함초 | 1 | 55.47 |
| 3 | 90.83 | |
| 5 | 90.84 |
실시예 8: 본 발명 함초 추출물의 암세포증식 억제능 조사
암세포 성장억제 실험에 사용된 세포주는 각각 유선암세포와 피부악성흑색종이며 세포주는 한국세포주은행에서 분양받아 배양하였고 배양배지는 RPMI1640 90%에 FBS(Fetal Bovine Serum) 10%로 구성된 배지를 사용하였다.
암세포의 증식억제능은 도 6에서 나타낸 바와 같이 MTT assay로 측정하였다. 96-well microplate에 세포(1 x 104/ 180㎕)를 각각 분주한 후, 세포의 안정화를 위해 4시간동안 37℃, 5% CO2 배양기(Incubator)에서 배양하였다. 그 후 시료액, Blank, 대조구로 각각 나눈 뒤, Blank와 대조구에는 각각 PBS 20㎕, 시료액에는 추 출물 20㎕ (각 well 당 1%, 2.5%, 5%, 10%의 함초추출물)를 넣고, 추출물에 의한 암세포의 증식억제능을 보기 위하여 72부터 96시간까지 연속 배양하였다. 또 추출물의 색에 의한 background를 없애기 위해 상층액을 제거한 뒤 PBS로 씻어내고, 180㎕ media(without FBS) 넣었다. 살아 있는 세포의 미토콘드리아 탈수소효소들의 반응에 의하여 노란색의 MTT[5㎎/㎖(PBS) : 0.22㎛ filteration]를 푸른색의 formazan product로 변화시켰다. 이것을 37℃, 5% CO2 배양기(Incubator)에서 4시간동안 배양하여 1,200 xg에서 15분간 원심분리하여 상층액을 제거하고 DMSO(DMSO: EtOH=1: 1) 150㎕를 가하여 30분동안 정치시켜 푸른색의 formazan product를 완전용해시킨 후 엘라이자 리더(ELISA reader)로 550㎚에서 흡광도를 측정하였다.
MTT assay(Tetrazolium based colorimeteric assay)는 96 well microplate를 사용하고 검사결과를 엘라이자 리더(ELISA reader, multiwell microplate reader임)를 이용하여 많은 시료를 빠른 시간에 판독할 수 있어 세포독성 및 세포증식 검색법으로서 설포호다민 B(sulforhodamin B, SRB) 검색법과 함께 널리 사용되고 있는 분석방법이다. 암세포의 경우 대사과정에서 미토콘드리아의 탈수소효소 작용에 의해 노란색 수용성 MTT tetrazolium을 자주색으로 나타내어 비수용성 MTT formazan으로 환원시키며, MTT formazan의 흡광도는 540nm에서 최대를 나타내어 각 well에서의 세포농도를 나타내게 된다.
본 실험에서는 함초, 백화사설초, 백부자의 추출물을 이용하여 각각의 전체농도를 0.1%, 0.25%, 0.5%와 1%가 되도록 각 well에 분주하여 배양하였고 MTT assay로서 각종 식물체 추출물에 의한 세포증식능의 억제효과를 측정하였다. 표 7에서 확인할 수 있듯이 함초추출물은 유선암세포인 MDA-MB-231에 대해 1%에서 31.3%의 세포증식억제능을 나타내었고, 피부흑색종인 SK-MEL-2에 대해서는 1%농도에서 51.6%의 세포증식억제능을 나타내었다. 이에 대해 백화사설초와 백부자는 각각의 암세포에 대해 1%농도에서 40%이상의 증식억제능을 나타내었으나 선학초에 미치지 못하였다.
| 시료액 | 암세포 성장억제(%) | |||
| 함초 | 백화사설초 | 백부자 | ||
| Strains | 대조구l 전체농도 | 0 | 0 | 0 |
| MDA- MB-231 | 0.1% | 5.6 | 0 | 0 |
| 0.25% | 10.2 | 0 | 2.8 | |
| 0.5% | 14.6 | 5.3 | 2.4 | |
| 1% | 31.3 | 6.6 | 9.3 | |
| SK- MEL-2 | 0.1% | 28.7 | 23.6 | 34.1 |
| 0.25% | 33.1 | 24.9 | 38.3 | |
| 0.5% | 41.0 | 33.2 | 42.9 | |
| 1% | 51.6 | 43.6 | 43.1 | |
실시예 9: 함유 추출물 함유 기능성음료 제조
상기 실시예 1에서 제조한 함초 추출물 농축액 또는 분말을 농도에 따라 음료에 0.01중량%에서 10중량%까지 첨가시키고 표 8에 나타낸 바와 같이 김 엑기스, 구연산, 비타민C, 과당, 스테비온, 파래 향, 사이다 향 및 물로 구성된 함초 추출물을 유효성분으로 하는 기능성 음료를 제조하였다.
| 함초 추출물 | 0.3% (68.44브릭스) |
| 김 엑기스 | 0.4% |
| 구연산 | 0.19% |
| 비타민C | 0.03% |
| 과당 | 9.39% |
| 스테비온 | 0.03% |
| 파래 향 | 0.03% |
| 사이다 향 | 0.01% |
| 물 | 잔량 |
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 본 발명은 SOD유사활성실험, 전자공여능실험, 티로시나제저해활성실험, TBARS 실험, 전자공여능 실험, ACE저해실험 및 MTT assay를 통해 효능이 입증된 함초를 열수추출하여 얻은 함초유효성분을 음료에 첨가함으로서 SOD유사활성능, 미백, 노화지연, 고혈압예방, 항암 및 피로회복에 효과적인 함초 추출물 함유 기능성 음료 및 그 제조방법을 제공하는 뛰어난 효과가 있으므로 국민건강증진 및 식품가공산업상 매우 유용한 발명인 것이다.
Claims (3)
- 함초에 1:1 비율의 증류수를 가하여 3~4시간동안 끓인 뒤 3000xg로 10~15분간 원심분리하여 여과한 뒤 얻은 추출액을 20~30중량%까지 농축하여 얻은 함초 추출물 함유 농축액 또는 상기 함초 추출액을 -70℃에서 동결건조시켜 분말 형태로 제조한 함초 추출물 0.3중량%, 김 엑기스 0.4중량%, 구연산 0.19중량%, 비타민C 0.03중량%, 과당 9.39중량%, 스테비온 0.03중량%, 파래 향 0.03중량%, 사이다 향 0.01중량% 및 잔량의 물로 구성됨을 특징으로 하는 함초 추출액을 유효성분으로 하는 유선암 또는 피부암 예방용 기능성 음료.
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