KR100963133B1 - 복분자와 클로렐라 혼합물을 이용한 기능성 발효식품 및그의 제조방법 - Google Patents
복분자와 클로렐라 혼합물을 이용한 기능성 발효식품 및그의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 복분자와 클로렐라의 혼합물을 이용한 기능성발효식품 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 복분자에 클로렐라를 혼합하여 혼합물을 제조하고, 상기 혼합물의 pH를 조절한 후에 발효미생물을 접종하여 온도 30~40℃의 조건에서 3 내지 7일간 발효시킨 후, 얻어진 발효원료를 가공하여 제품화하여 된 복분자와 클로렐라 혼합물을 이용한 기능성발효식품 및 이의 제조방법이 개시된다.
복분자, 복분자쥬스, 클로렐라, 발효미생물, 고초균, 젖산균, pH, 산도
Description
본 발명은 복분자와 클로렐라 혼합물을 이용한 기능성 발효식품 및 그의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 복분자에 클로렐라를 적정량 혼합하고, 상기 혼합물에 발효미생물을 접종하여 일정시간 발효시켜 된 발효원료를 가공하여 되는 기능성 발효식품 및 그의 제조방법에 관한 것이다.
복분자(覆盆子)는 고문헌인 명의별록 상품(名醫別錄 上品)에 “미감평무독주익기경신령발부백오월채(味甘平無毒主益氣經身令髮不白五月採)”로 기록된 이래 본초문헌(本草文獻)에 양위(陽), 유정(遺精), 한설(旱泄), 유뇨(遺尿), 소변과다(小便過多), 불임(不姙) 등 증(證)을 치료한다고 기록되어 있다. 복분자란? 고서를 비롯한 최근의 연구물을 기초로 엽경의 형태, 개화기, 과실의 형태와 색, 성숙시기 등의 기준을 종합하면 장미과 Rosaceae 딸기 속 Rubus에 속하는 복분자딸기 Rubus coreanus Miq.의 미성숙과실을 말하는 것으로 고증되었다. 복분자와 유연관계가 있는 동속식물의 과일들이 지역에 따라 복분자로용 또는 혼용하고 있으며, 야생의 동속식물 자원이 중국 50여종, 일본 27여종, 한국 22여종, 미국과 유럽에서는 Rubus속 식물의 열매를 나무딸기(raspberry)류로 통칭하며 이속의 식물이 400여종 이상이 조사된바 있다.
복분자로 이용되는 식물은 청나라 때부터 ‘樹’라는 掌葉覆盆子 Rubus chingii Hu.,를 사용해왔고, 지역에 따라서 R. palmatus Thunb., R. idaeus L., R. corchorifolius L., R. ieaeopsis Forke, R. foliolosus D. Don, R. lasiostylus Forke, R. crataegilifolius Bunge, R. idaeus var. concolor 등이 이용되고 있다.
복분자(Rubus coreanus Miq.)가 우리나라에서는 제한적으로 약용으로 또는 구황식물로 이용되어 왔으며, 1960년대부터 고창선운사 인근지역에서 재배가 시작되어 농가 소득 작목으로 육성하기 위하여 1989년 고창군 심원농협 및 1991년 고창군의 보조사업으로 활성화가 이루어지고, 1995년 고창군농업기술센터의 복분자 재배기술지도로 고창군의 농가소득 특용작물로 정착 되는 계기를 마련하게 되었다.
이제까지 복분자를 이용한 가공식품의 종류를 보면 단순가공인 복분자쥬스, 발효주, 차, 쨈, 젤리, 고추장, 청국장 등을 볼 수 있으며, 복분자의 과잉생산에 따른 문제점을 해결하기 위해서는 복분자의 새로운 기능물질을 탐색 및 이미 구명되어진 유효성분으로 기능성을 증가시키는 방법의 연구로 다양한 가공품 및 기능성 발효제품의 개발이 필요하다.
따라서, 본 발명은 복분자에 새로운 기능성 물질을 탐색하고 이미 구명되어진 유효성분을 첨가하여 복분자에 기능성을 증가시킨 기능성발효식품 및 그의 제조방법을 제공하는 것을 그 해결 과제로 한다.
이에, 본 발명자들은 단백질 함량이 높은 미생물로써 미생물의 증식촉진효과, 동물성장촉진효과, 생리활성물질로서의 작용, 식물호르몬효과, 정미작용과 chlorella growth factor(C.G.F.)로서의 작용 및 의료효과로서는 간장괴흔방지효과, 이질균에 대한 저항성 증가, 소화성 괴양의 치료, 장유동운동의 촉진 작용, 백혈구 감소 방지효과, 창상 치료효과, 항 바이러스(virus) 효과, 총콜레스테롤(total cholesterol) 저하효과, 어린이의 우유 알러지(allergy) 치유효과와 혈액의 성상 중 단백질성분과 전해질 및 알부민(albumin) 함량에 미치는 효과 등이 보고되어 있는 미세 녹조류인 클로렐라(chlorella)는 영양소가 풍부하여 식품의 기능적인 측면에서 다른 식품과 병용하면 제한 영양소의 보강으로 이용효율이 증대됨을 알게 되어, 이를 복분자와 혼합하여 발효시킬 경우 복분자의 기능성을 향상시키며 복분자의 영양성분 가운데 단백질의 보충효과(supplementary effect) 등이 있음을 알게 되어 본 발명을 완성하였다.
상기한 과제를 달성한 본 발명은 복분자 95~50중량%와 클로렐라 5~50중량%를 혼합한 혼합물에 젖산균, 고초균 또는 고초균과 젖산균의 2종혼합균주인 발효미생물을 접종하여 온도 30~40℃의 조건에서 3 내지 7일간 발효시킨 후, 얻어진 발효원료를 제형화한 것으로,
상기 발효원료의 제형화에 첨가제로 부형제, 점착제 및 붕해제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 첨가하며,
상기 젖산균은 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 플란타리움, 락토바실러스 락티스, 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 람노수스, 페디오코쿠스 펜토사세우스, 스트렙토코커스 테르모필루스, 비피도박테리움 부치네리, 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 롱움으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 또는 2종 이상의 혼합균주이고,
상기 고초균은 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리체니포미스, 바실러스 나토, 바실러스 시리우스, 바실러스 스피시즈(Chem) 및 바실러스 스피시즈(Ewha)로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 혼합균주이며,
상기 고초균과 젖산균의 혼합균주는 락토바실러스 카제이와 바실러스 서브틸리스의 혼합균주, 락토바실러스 카제이와 바실러스 스피시즈(캠)의 혼합균주, 락토바실러스 카제이와 바실러스 스피시즈(이화)의 혼합균주, 락토바실러스 플란타리움과 바실러스 서브틸리스의 혼합균주, 락토바실러스 플란타리움과 바실러스 스피시즈(캠)의 혼합균주 또는 락토바실러스 플란타리움과 바실러스 스피시즈(이화)의 혼합균주로 이루어진 군에서 선택된 1종이며,
상기 젖산균, 고초균 또는 고초균과 젖산균의 2종혼합균주인 발효미생물은 종배양하여 620㎚에서 측정한 흡광도(Abs.)가 1.0이 될 때까지 균을 증식시켜 증식된 균을 상기 혼합물에 접종하는 것으로, 그 접종량은 상기 혼합물 대비 2%(V/V)가 되도록 접종하는 것을 특징으로 하는 복분자와 클로렐라 혼합물을 이용한 기능성발효식품의 제조방법을 제공하다.
본 발명에서는 복분자 95~50중량%와 클로렐라 5~50중량%를 혼합한 혼합물에 젖산균, 고초균 또는 고초균과 젖산균의 2종혼합균주인 발효미생물을 접종하여 온도 30~40℃의 조건에서 3 내지 7일간 발효시킨 후, 얻어진 발효원료를 제형화하며, 상기 발효미생물이 2종 혼합균주이고, 각각의 균액을 1:1의 비율로 혼합하여 되는 혼합균주로 각각의 균액이 상기 혼합물 대비 1%(V/V)가 되도록 접종하는 것을 특징으로 하는 복분자와 클로렐라 혼합물을 이용한 기능성발효식품의 제조방법을 제공한다.
상기 발효원료의 제형화에 첨가제로 부형제, 점착제 및 붕해제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 첨가하며,
상기 젖산균은 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 플란타리움, 락토바실러스 락티스, 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 람노수스, 페디오코쿠스 펜토사세우스, 스트렙토코커스 테르모필루스, 비피도박테리움 부치네리, 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 롱움으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 또는 2종 이상의 혼합균주이고,
상기 고초균은 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리체니포미스, 바실러스 나토, 바실러스 시리우스, 바실러스 스피시즈(Chem) 및 바실러스 스피시즈(Ewha)로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 혼합균주이며,
상기 고초균과 젖산균의 혼합균주는 락토바실러스 카제이와 바실러스 서브틸리스의 혼합균주, 락토바실러스 카제이와 바실러스 스피시즈(캠)의 혼합균주, 락토바실러스 카제이와 바실러스 스피시즈(이화)의 혼합균주, 락토바실러스 플란타리움과 바실러스 서브틸리스의 혼합균주, 락토바실러스 플란타리움과 바실러스 스피시즈(캠)의 혼합균주 또는 락토바실러스 플란타리움과 바실러스 스피시즈(이화)의 혼합균주로 이루어진 군에서 선택된 1종이며,
상기 젖산균, 고초균 또는 고초균과 젖산균의 2종혼합균주인 발효미생물은 종배양하여 620㎚에서 측정한 흡광도(Abs.)가 1.0이 될 때까지 균을 증식시켜 증식된 균을 상기 혼합물에 접종하는 것으로, 그 접종량은 상기 혼합물 대비 2%(V/V)가 되도록 접종하는 것을 특징으로 하는 복분자와 클로렐라 혼합물을 이용한 기능성발효식품의 제조방법을 제공하다.
본 발명에서는 복분자 95~50중량%와 클로렐라 5~50중량%를 혼합한 혼합물에 젖산균, 고초균 또는 고초균과 젖산균의 2종혼합균주인 발효미생물을 접종하여 온도 30~40℃의 조건에서 3 내지 7일간 발효시킨 후, 얻어진 발효원료를 제형화하며, 상기 발효미생물이 2종 혼합균주이고, 각각의 균액을 1:1의 비율로 혼합하여 되는 혼합균주로 각각의 균액이 상기 혼합물 대비 1%(V/V)가 되도록 접종하는 것을 특징으로 하는 복분자와 클로렐라 혼합물을 이용한 기능성발효식품의 제조방법을 제공한다.
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본 발명에 따르면, 복분자의 주된 소비유형인 과즙과 와인이 주된 형태이며 기타 두류 및 곡류 가공품인 장류와 부수게, 떡, 국수 종류에 국한되어 있어, 새로운 고부가가치의 기능성발효식품을 제공함으로써 식품산업발전 및 농촌경제의 활성화에 기여하는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 연구결과에 따라 과채소류의 발효에도 본 연구로 개발한 발효기술을 적용하여 새로운 기능성발효제품의 개발에 활용할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 복분자와 클로렐라 혼합물을 발효시키면서 축적된 발효기 술(온도관리, pH관리, 미생물균주의 관리, 발효적정시간)을 활용하여 클로렐라를 대체한 기타 소재들을 이용한 발효관리 능력향상으로 새로운 건강기능식품을 개발하는데 활용할 수 있는 효과가 있다.
또한, 본 발명은 클로렐라 외에 복분자와 새로운 기능성 소재와 접목시켜 새로운 제품의 개발하는데 본연구로 개발된 발효기술을 새로운 웰빙식품개발 모델로 활용 가능한 효과가 있다.
또한, 본 발명은 복분자 외의 다른 기능성식품소재와 결합시켜 기능성이 강화된 새로운 발효식품 유형을 개발하고 생산함으로써 식품산업발전에 기여하는 효과가 있다.
이하, 본 발명은 보다 상세히 설명하면 다음과 같다.
도 1은 동결복분자 및 복분자쥬스와 클로렐라의 혼합비에 따른 수분함량 변화를 도시한 그래프이고, 도 2는 동결복분자 및 복분자쥬스와 클로렐라의 혼합비에 따른 수분함량 변화에 대한 젖산균과 고초균의 배양결과를 도시한 사진이고, 도 3a 내지 3j는 본 발명에 사용되는 젖산균의 클로렐라 첨가수준에 따른 젖산균의 산 생성량을 도시한 그래프이고, 도 4a 내지 4h는 본 발명에 사용되는 고초균의 클로렐라 첨가수준에 따른 젖산균의 산 생성량을 도시한 그래프이고, 도 5a 내지 5k는 본 발명의 일실시예에 따른 복분자에 클로렐라 첨가수준에 따른 선발균주의 산 생성량 변화를 도시한 그래프이고, 도 6a 내지 6f는 본 발명의 일실시예에 따른 복분자와 클로렐라 혼합물의 온도별 젖산생성량의 변화를 도시한 그래프이고, 도 7a 내지 7d는 본 발명의 일실시예에 따른 복분자와 클로렐라 혼합물의 pH별 젖산생성량의 변화를 도시한 그래프이고, 도 8a 내지 8e는 본 발명의 제품화 공정의 일실시예를 도시한 공정도이며, 도 9 및 10은 본 발명에 따라 제조된 기능성발효식품의 일실시형태를 도시한 사진으로, 이들 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명하기로 한다.
본 발명에 사용된 복분자와 클로렐라의 일반성분은 표 1과 같으며, 식품공전의 분석방법(식품의약품안전청, 2005)에 준하여 분석하였다.
상기 표 1의 복분자의 일반성분은 조단백질 1.13%, 탄수화물 8.0%, 조지방 3.30%, 수분 83.5%, 회분 4.0%로 클로렐라의 일반성분은 조단백질 49.49%, 탄수화물 29.1%, 조지방 7.90%, 수분 7.4%, 회분 8.60% 수준이어서 복분자에 클로렐라를 첨가하는 경우 영양성분이 증가될 것으로 생각되었다.
이러한 사실을 기초로 주재료로 복분자를 사용하고, 부재료로써 클로렐라를 이용할 경우에는 복분자에 부족한 영양성분의 보족효과를 기대 할 수 있을 것으로 생각되었고, 이들을 혼합하여 발효시키면 새로운 기능성을 지닌 웰빙기능성식품 신제품의 개발이 가능할 것으로 생각되었다.
본 발명에 따르는 복분자와 클로렐라 혼합물을 이용한 기능성발효식품의 제조방법은 복분자 95~50중량%와 클로렐라 5~50중량%를 혼합한 혼합물에 젖산균, 고초균 또는 고초균과 젖산균의 2종혼합균주인 발효미생물을 접종하여 온도 30~40℃의 조건에서 3 내지 7일간 발효시킨 후, 얻어진 발효원료를 제형화하여 이루어진다.
본 발명에 의하면, 상기 발효원료의 제형화에 첨가제로 부형제, 점착제 및 붕해제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 첨가하여 이루어진다. 상기 첨가제는 통상의 식품제조에 사용되는 것이면 본 발명을 저해하지 않는 범위 내에서 어느 것을 사용하여도 무방하다.
본 발명에 의하면, 상기 발효미생물의 접종 후 복분자 및 클로렐라 혼합물의 젖산생성량에 적합한 pH는 4∼6인 것이 좋으며, 복분자와 클로렐라 혼합 후, pH 측정기로 축정한 후 통상의 pH조절 방법에 의해 pH값을 조정할 수 있다.
상기 복분자와 클로렐라 혼합은 복분자 95~50중량%와 클로렐라 5~50중량%를 혼합한다. 더 바람직하게는 복분자 95~65중량%와 클로렐라 5~35중량%를 혼합하는 것이 더 좋다. 더 좋게는 복분자 70~65중량%와 30~35중량%를 혼합하는 것이 바람직하다. 만일, 상기 클로렐라의 혼합량이 50%를 초과할 경우에는 클로렐라가 가지고 있는 고유취 및 성분의 함량이 증가되어 기호성을 떨어뜨리는 단점이 있고, 5% 미만을 첨가할 경우에는 본 발명에서 얻고자 하는 영양성분의 상승효과를 기대할 수 없는 단점이 있다. 상기 복분자는 천연상태의 복분자, 동결한 복분자 또는 복분자 쥬스를 사용하며, 바람직하게는 동결건조한 복분자를 사용하는 것이 좋다. 그 이유는 열풍건조를 할 경우 생산원가를 줄일 수 있는 장점은 있으나, 혼합물 발효 후 제품회시의 색상이 진녹색이어서 외관상 검게 보이는 단점이 있기 때문이다.
상기 발효미생물은 젖산균, 고초균 또는 젖산균과 고초균을 혼합한 혼합균주를 사용하여 발효시키며, 상기 젖산균은 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei, 이하, “L. case”이라 한다), 락토바실러스 플란타리움(Lactobacillus plantarium,이하, “L. plantarium”이라 한다), 락토바실러스 락티스(Lactobacillus lactis, 이하,“L. lactis”라 한다), 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus, 이하, “L. acidophilus)”라 한다), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis, 이하,“L. brevis”라 한다), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus, 이하, “L. bulgaricus”라 한다), 락토바실러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus, 이하, “L. rhamnosus”라 한다), 페디오코쿠스 펜토사세우스(Pediococcus pentosaseus, 이하, “Pe. pentosaseus”라 한다), 스트렙토코커스 테르모필루스(Streptococcus thermophillus, 이하, “St. thermophillus”라 한다), 비피도박테리움 부치네리(Bifidobacterium buchneri, 이하, “Bi. buchneri”라 한다), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis, 이하, “Bi. infantis”라 한다), 비피도박테리움 롱움(Bifidobacterium longum, 이하, “Bi . longum”라 한다)으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 또는 2종 이상의 혼합균주를 사용하는 것이 좋으며, 바람직하게는 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 플란타리움, 락토바실러스 락티스, 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 람노수스, 페디오코쿠스 펜토사세우스, 스트렙토코커스 테르모필루스 또는 비피도박테리움 롱움으로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2 종 이상의 혼합균주를 사용하는 것이 바람직하며, 더 좋게는 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 플란타리움, 락토바실러스 락티스 또는 락토바실러스 아시도필루스로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 혼합균주를 사용하는 것이 좋다.
상기 고초균은 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtillis, 이하, “B. subtillis”라 한다), 바실러스 리체니포미스(Bacillus licheniformis, 이하, “B. lichenifomis”라 한다), 바실러스 나토(Bacillus natto, 이하, “B. natto”라 한다), 바실러스 시리우스(Bacillus cereus, 이하, “B. cereus”라 한다), 바실러스 스피시즈(캠)(Bacillus species(cham), 이하,“chem”이라 한다) 및 바실러스 스피즈(이화)(Bacillus species(ewha), 이하, “ewha"라 한다)로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 혼합균주를 사용하는 것이 좋으며, 바람직하게는 ewha, cham, B. subtillis 또는 B. natto로 이루어지 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 혼합균주를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 젖산균과 고초균의 혼합균주는 락토바실러스 카제이와 바실러스 서브틸리스의 혼합균주, 락토바실러스 카제이와 바실러스 스피시즈(캠)의 혼합균주, 락토바실러스 카제이와 바실러스 스피시즈(이화)의 혼합균주, 락토바실러스 플란타리움과 바실러스 서브틸리스의 혼합균주, 락토바실러스 플란타리움과 바실러스 스피시즈(캠)의 혼합균주 또는 락토바실러스 플란타리움과 바실러스 스피시즈(이화)의 혼합균주로 이루어진 군에서 선택된 1종을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 의하면, 상기 발효미생물의 접종량은 상기 혼합물 대비 2%(V/V)가 되도록 접종하는 것이 바람직하며, 상기 발효미생물이 2종 혼합균주인 경우 각각의 균액을 1:1의 비율로 혼합하여 사용하며, 상기 혼합균주를 구성하는 각각의 균액이 복분자와 클로렐라 혼합물 대비 1%(V/V)가 되도록 하여 접종하는 것이 바람직하며, 상기 복분자와 클로렐라 혼합물 대비 발효미생물의 최종 접종량은 2%(V/V)가 되도록 하여 접종하는 것이 바람직하다.
본 발명에 의하면, 복분자에 클로렐라를 적정량 혼합하고 발효미생물을 접종후 발효기간은 접종된 균주의 특성에 따라 3 내지 7일간 발효시키는 것이 바람직하다.
본 발명에 의하면, 도 9에 도시된 바와 같이 최종 제품화시 복분자 또는 복분자쥬스에 클로렐라를 혼합한 혼합물을 발효시킨 후의 발효물을 건조하는 방식에 있어서는 그 방식에 따라 제품의 색상이 현저한 차이를 보이는 바, 제품의 제형 즉, 캡슐, 정제, 과립, 환 등의 형태로 제조시에는 상기 발효물을 열풍건조하는 것이 바람직하고, 분말 또는 티백용으로 제조시에는 상기 발효물을 동결건조하는 것이 바람직하며, 도 10에 도시된 바와 같은 액상 또는 반고상의 제품으로 제조시에는 혼합물 발효원액을 그대로 사용하거나 농축하여 사용하는 것이 바람직하다. 여기서, 제품의 생리활성을 고려한 발효물의 처리방식은 동결건조가 바람직하다.
본 발명에 따르는 기능성발효식품은 분말제, 캡셀제, 과립제, 정제, 환제 또는 액상으로 제조되어 질 수 있다. 이들의 제조공정은 도 8a 내지 8f에 도시하였다.
이들 중 제조공정의 예를 도 8a를 참조하여 설명하면, 복분자와 클로렐라를 적정 비율로 혼합하여 혼합물을 제조하고, 상기 혼합물에 발효미생물을 혼합물 대비 2%(V/V)가 되도록 접종하여 발효온도 30~40℃ 범위에서 3 내지 7일간 발효시키고, 상기 발효시킨 후 발효물을 동결건조하여 발효물을 가공하고, 상기 가공된 발효물을 분쇄→체통과→칭량→봉입→실링→정립→포장하는 단계를 거쳐 최종 제품화 하게 된다.
본 발명에 의하면, 도 8a 내지 8e에 도시된 바와 같이 그 제품화 형태에 따라, 첨가제로 부형제, 점착제, 붕해제 또는 활택제를 더 첨가할 수 있으며, 상기 첨가제는 통상의 식품제조에 사용되는 것을 사용하고, 그 첨가량은 통상의 식품제조시의 기준을 따른다.
이하, 본 발명을 참조예 및 바람직한 실시예를 들어 설명하면 다음과 같으며, 본 발명이 하기에 개시되는 참조예 및 실시예로 한정되는 것은 아니다.
하기 기술되는 실시예에서는 복분자만을 사용하였으며, 본 발명에 사용되는 시험방법에 따라 최적조건을 갖는 발효미생물을 선별하여 사용하였으나, 본 발명이 이들로 한정되는 것은 아니다.
[본 발명에 사용되는 시험방법]
가. 복분자 및 클로렐라의 일반성분
복분자와 클로렐라의 일반성분은 수분, 조단백질, 조지방, 조섬유, 조회분을 AOAC방법(36)에 준하여 분석한다. 수분은 105℃ 상압가열건조법으로 분석하며, 조단백질은 semimicro Kjeldahl법으로, 조지방은 에테르 추출법으로, 조회분은 550℃ 회화로를 이용하여 분석한다(37). 조섬유는 fritted glass crucible method(38), 총식이섬유(39), 총당과 환원당은 DNS(3,5-dinitro -salicylic acid)법(40)으로 분석한다.
나. 복분자 및 클로렐라의 혼합비와 수분함량
복분자(함수량 87%, W/W) 및 복분자 쥬스(W/V)에 클로렐라(함수량 5%)를 5, 10, 20, 30, 35, 40, 50%가 되도록 첨가하여 잘 혼합한 후 의 수분함량을 조사하였다.
다. 복분자 및 클로렐라 혼합물의 발효특성
1) 복분자와 클로렐라 혼합물 발효에 적합한 미생물의 선발
복분자와 클로렐라의 혼합군을 증자한 후 발효에 적합한 유산균 12종 Lactobacillus casei(L. casei), Lactobacillus plantarium(L. plantarium), Lactobacillus lactis(L. lactis), Lactobacillus acidophilus(L. acidophilus), Lactobacillus brevis(L. brevis), Lactobacillus bulgaricus(L. bulgaricus), Lactobacillus rhamnosus(L. rhamnosus), Pediococcus pentosaseus(Pe. pentosaseus), Streptococcus thermophillus(St . thermophillus), Bifidobacterium buchneri(Bi . buchneri), Bifidobacterium infantis(Bi . infantis), Bifidobacterium longum(Bi . longum)과 고초균 6종 Bacillus species(Cham), Bacillus subtillis(B. subtillis), Bacillus species(Ewha), Bacillus licheniformis(B. lichenifomis), Bacillus subtillis natto(B. natto)과 식품위생상 문제가 되는 Bacillus cereus(B. cereus)을 종배양하여 620nm에서 측정한 흡광도(Abs.)가 1.0이 될 때가지 균을 증식시켜 단독배양의 경우 2%(v/v), 2종 혼합배양의 경우는 각각의 균액을 1%(v/v)씩 가하여 합이 2%(v/v)가 되도록 접종하고, 발효기간 동안의 산의 생성량과 균체 증식 속를 조사하여 복분자와 클로렐라의 혼합물 발효에 적합한 균주를 선발하였다.
2) 최적 온도
복분자와 클로렐라 혼합물의 발효적온을 조사하기 위하여 20, 25, 30, 35, 40, 45℃의 조건에서 3일간 배양하여 산의 생성량을 분석한 결과로 발효 온도범위 및 최적온도를 결정하였다.
3) 최적 pH
복분자와 클로렐라 혼합물의 발효에 이용한 균주의 증식 및 산생성에 적합한 pH를 조사하기 위하여 4, 5, 6, 7의 조건에서 4일간 배양하여 산의 생성량을 분석한 결과로 발효에 적합한 pH범위 및 최적 pH를 결정하였다.
라. 발효 제품의 성분 및 생리활성
1) 일반성분
복분자와 클로렐라 혼합 발효제품의 일반성분은 수분, 조단백질, 조지방, 조섬유, 총식이섬유, 조회분을 AOAC방법(36)에 준하여 분석한다. 수분은 105℃ 상압가열건조법으로 분석하며, 조단백질은 semimicro Kjeldahl법으로, 조지방은 에테르 추출법으로, 조회분은 550℃ 회화로를 이용하여 분석한다(37). 조섬유는 fritted glass crucible method(38), 총당과 환원당은 DNS(3, 5 - dinitrosalicylic acid)법(40)으로 분석한다.
2) pH, 산도, 가용성 고형분 및 색도
pH와 산도는 복분자와 클로렐라 혼합된 발효제품을 시료로 사용하여 pH는 pH meter(Mettler-Toledo AG, Switzerland)를 이용하여 측정하고, 산도는 pH값이 8.2가 되는데 소요되는 0.1N NaOH의 소비량을 구한 후 젖산으로 환산하여 총산 함량(%)으로 나타낸다. 가용성 고형분과 색도는 복분자 착즙액을 증류수와 1:1로 희석하여 여과한 액으로 가용성 고형분은 디지털 광도계(PR-32, Atago, Co., Japan)로 측정하고, 색도는 색차계(JX-777, Japan)를 이용하여 L, a, b값을 측정한다. 이때 사용한 백색판은 L: 92.68, a: 0.83,ｂ: 0.85의 값을 가진 표준색판을 사용하였다.
3) 유리당 함량
건조시킨 복분자와 클로렐라 혼합 발효제품의 유리당 분석은 AOAC법(36)에 따라 시료를 추출한 후 이를 실온까지 방냉 시킨 다음 초기의 부피(무게)가 되도록 에탄올을 가하여 정용한 후 추출액을 0.45㎛ membrane filter로 여과한 여액을 HPLC로 분리, 정량한다.
4) 구성아미노산 함량
구성아미노산은 건조시킨 복분자와 클로렐라 혼합 발효제품을 500㎎씩 정확히 취하여 ampule에 넣고 6N-HCl 15㎖를 가한 다음 질소가스를 주입하여 신속하게 밀봉한 후 110℃ 오븐에서 24시간 가수분해 후 방냉하여 탈 이온수를 사용하여 50㎖로 정용 한 후 0.2㎛ membrane filter로 여과한 다음 적당하게 희석하여 AccQ-Tag의 방법(41)에 따라 HPLC로 분리, 정량한다. 아미노산 표준물질(Wako, type H, Japan)은 0.1N-HCl을 용매로 하여 0.125 μ㏖/㎖ 되도록 조제하여 사용한다.
5) 유기산 함량
건조시킨 복분자와 클로렐라 혼합 발효제품의 유기산은 Cristina와 Luh(42)의 방법에 따라 시료를 전처리 한다. 즉, 시료 3g에 50% 에탄올 100㎖를 가하여 150rpm에서 약 2시간 정도 교반한 후 여과하고 감압농축하여 에탄올을 제거 한다. 이를 amberlite IRA 95 음이온 교환수지(Biored, USA)에 통과하여 유기산을 흡착시킨 후 약 100㎖의 이온교환수로 수지를 세척한다. 흡착된 유기산은 6N formic acid로 유리시켜 감압 건조한 후 여기에 이온교환수 10㎖를 넣고 잘 혼합한 다음 0.45㎛ membrane filter로 여과하여 HPLC로 분리, 정량 한다. 유기산 표준물질로는 citric acid, lactic acid, formic acid, acetic acid, propionic acid, tartaric acid, malic acid, succinic acid(Sigma Co., USA)를 사용한다.
6) 무기질 함량
무기질은 건조시킨 복분자와 클로렐라 혼합 발효제품을 시료로 하여 분석 한다. 미리 항량한 도가니에 시료를 취하고 예비 탄화시킨 후 560℃의 회화로에서 백색이나 회백색이 될 때까지 회화시켰다. 회화된 회분을 소량의 이온교환수로 재가 흩어지지 않도록 적신 후 염산용액(염산:이온교환수 = 1:1) 5㎖를 가하여 hot plate에서 증발 건조시킨 다음, 다시 5㎖의 염산 용액(염산:이온교환수 = 1:3)을 가하여 5분간 가열 용해한 후 여과하여 100㎖로 정용한다. 이 액중 5㎖를 25㎖ 메스플라스크에 취한 후 공존 이온의 영향을 제거하기 위해 5% La2O3용액 5㎖를 가한 다음 0.1N-HCl로 정용하여 ICP(Inductively Coupled Plasma, Jobin Yvon Co., France)로 정량, 분석 한다.
7) 미생물수 측정
복분자와 클로렐라 혼합 발효제품의 총균수는 Plate count ager(PCA)배지를 사용하여 100∼109까지 희석한 시료를 1㎖씩 분주한 후 표준한천배양법(43)으로 실시하고, 37℃에서 하룻밤 배양한 후 계수한다. 젖산균은 0.133%의 초산을 가하여 최종 pH를 5.5로 조정한 Rogosa SL agar(Difco Co., MI USA) 배지를 사용하여 37℃에서 24∼72시간 배양한 후 계수한다.
8) 항균활성
복분자와 클로렐라 혼합 발효제품의 항균활성을 측정하기 위해서 Escherichia coli O-157L:H7, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium를 검정균주로 사용한다. 항균성 검정은 검정균 1백금이를 5㎖의 액체배지에 접종하여 1∼2일간 배양한 후 신선한 배지 5㎖를 함유한 시험관에 복분자와 클로렐라 혼합 발효제품과 상기 검정균의 배양액 0.1㎖를 각각 넣고 37℃에서 24시간 배양한 후 표준평판 배양법에 의하여 생균수를 측정한다. 복분자 시료를 첨가하지 않은 검정균의 배양액을 대조액으로 하여 아래 식에 의하여 항균효과를 확인한다.
9) 총페놀성화합물 함량 측정
복분자와 클로렐라 혼합 발효제품 추출물의 총페놀성화합물 함량은 Folin-Denis법(44-46)에 의해 비색정량 한다. 즉, 추출액을 100배 희석한 검액 5㎖에 Folin-Ciocalteu 시약 5㎖를 가하여 혼합하고 3분 후 10% Na2CO3 5㎖를 넣어 진탕하고 1시간 실온에서 방치하여 700㎚에서 흡광도를 측정한다. 대조구는 검액 대신 증류수를 넣어 동일하게 처리한다. 이때 표준물질로는 tannic acid를 5∼50㎍/㎖의 농도로 조제하여 검량곡선의 작성에 사용한다.
10) 전자공여능 측정
복분자와 클로렐라 혼합 발효제품 추출액의 전자공여능(electron donating ability, EDA)시험은 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)를 사용한 방법(47)으로 측정한다. 즉 DPPH 시약 12㎎을 absolute ethanol 100㎖에 용해한 후 증류수 100㎖를 가하고 50% ethanol 용액을 blank로 하여 517㎚에서 DPPH 용액의 흡광도를 약 1.0으로 조정한 후 이 용액 5㎖와 시료용액 0.5㎖를 가하여 혼합한 후 30초 후에 517㎚에서 흡광도를 측정한다. 이때 전자공여능은 시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도 차이를 백분율(%)로 표시하였다.
11) 아질산염 소거능 측정
복분자와 클로렐라 혼합 발효제품 추출액이 발암성 nitrosamine 생성의 전구물질인 아질산염을 소거하거나 또는 분해하는 작용을 알아보기 위하여 Do등과 Gray(48-49)의 방법으로 520㎚에서 비색정량 하였다. 즉, 1mM NaNO2용액 1㎖에 소정 농도의 복분자와 클로렐라 혼합 발효제품 추출액을 첨가하고 여기에 0.1N HCl(pH 1.2)과 0.2M 구연산 완충액(pH 3.0, 4.2 및 6.0)을 사용하여, 반응 용액의 pH를 각각 1.2, 3.0, 4.2, 6.0으로 조정하여 반응용액의 부피를 10㎖로 한다. 이를 37℃에서 1시간동안 반응시켜서 얻은 반응용액을 각각 1㎖씩 취하고 여기에 2% 초산용액 5㎖를 첨가한 다음, Griess 시약(30% acetic acid로 각각 조제한 1% sulfanilic acid와 1% α-naphtylamine을 1:1비로 혼합한 것으로 사용직전에 조제) 0.4㎖를 가하여 잘 혼합시킨 다음 실온에서 15분간 방치시킨 후 분광광도계(Shimadzu UV-1601PC, Japan)를 사용하여 520㎚에서 흡광도를 측정하고 아래의 식에 의하여 아질산염 소거율을 구한다.
12) 관능검사
관능검사는 훈련된 패널을 선정하여 9점 채점법으로 실시하였다. 이때 채점기준은 아주강하다(아주좋다):9점, 보통으로 강하다(좋다):7점, 적당하다(좋지도 나쁘지도 않다): 5점, 보통으로 약하다(나쁘다):3점, 아주 약하다(나쁘다): 1점이었다. 관능검사 결과는 Excel software(Microsoft Corp., Redmond, USA)을 사용하여 Duncan‘s의 다중검정을 실시하였다.
[참조예 1] 클롤렐라의 혼합비에 따른 수분함량 및 발효수준
복분자열매, 복분자쥬스, 클로렐라, 복분자열매 + 클로렐라 혼합물 및 복분자쥬스 + 클로렐라 혼합물의 수분함량을 조사하여 발효에 적합한 수분 수준을 조사하기 위하여 표 2과 같은 조합을 하여 수분을 정량하였고, 그 결과는 표 2, 도 1 및 도 2에 도시한 바와 같다.
표 2, 도 1 및 도 2를 보면 클로렐라의 혼합비가 증가 할수록 함수량이 감소되는 경향을 보이나, 젖산균과 고초균을 접종하여 배양할 경우 균체의 증식에 수분함량이 끼치는 영향은 미약할 것으로 판단된다.
[참조예 2]클로렐라 첨가에 따른 발효능 우수 젖산균의 선발
도 3a 내지 3j에 도시된 바와 같은 그래프는 MRS 배지에 클로렐라를 0.5, 1.0% 되도록 첨가하고 10종의 젖산균을 각각 접종한 후의 젖산 생성량이 우수한 균은 L. plantarium > L. casei > L. lactis > L. acidophilus > L. brevis > Pe . pentosaseus > L. bulgaricus > St . thermophillus > L. rhamnosus > Bi . longum 순서임을 알 수 있었다. 이중 24시간 경과시 1% 이상의 젖산 생성량을 보인 균주는 4종 L. plantarium, L. casei, L. acidophilus 및 L. lactis이었고 이들 가운데 발효적성이 우수한 균으로 L. plantarium와 L. casei를 최종 선발하여 본 발명에 사용하였다.
[참조예 3] 클로렐라 첨가수준에 따른 발효능 우수 젖산균의 선발
도 4a 내지 4f에 도시된 바와 같은 그래프는 MRS 배지에 클로렐라 0.5, 1.0% 되도록 첨가하고 8종의 고초균을 개별적으로 접종하였으며, 그 결과 산생성이 우수한 균은 Bacillus species(ewha) > Bacillus species(cham) > B. subtilis > B. licheniformis > B. natto 순서임을 알 수 있었으며, 이중 B. subtilis, Bacillus species(cham), Bacillus species(ewha) 3종을 발효적성이 우수한 균으로 선발하여 본 발명에 사용하였다.
[실시예1 내지 11]
복분자에 클로렐라를 5, 10, 20%가 되도록 첨가하고 상기 참조예 2 및 3의 결과에 의하여 선발된 젖산균 L. plantarium과 L. casei 및 고초균 Bacillus species(ewha), Bacillus species(cham), B. subtilis 그리고 이들을 2 균주 조합으로 만든 혼합균주를 복분자와 클로렐라 혼합물 대비 2%(V/V)가 되도록 접종하고, 배양한 후, 상기 균들의 젖산 생성량을 조사하였으며 그 결과는 도 5a 내지 5k에 도시한 바와 같으며, 선발된 균들의 단독 배양시 젖산생성량은 L. casei 보다 L. plantarium이 많았고, B. subtilis < Bacillus species(cham) < Bacillus species(ewha) 순으로 많아졌다. 2균주 조합의 경우 젖산의 생성량 또한 L. casei + B. subtilis, L. casei + Bacillus species(cham) 및 L. casei + Bacillus species(ewha) 보다 L. plantarium + B. subtilis, L. plantarium + Bacillus species(cham) 및 L. plantarium + Bacillus species(ewha)에서 높았으며 그 순서는 L. plantarium + B. subtilis < L. plantarium + Bacillus species(cham) < L. plantarium + Bacillus species(ewha) 순이었으며, 상대적으로 젖산의 생성이 우수한 균주의 조합은 L. plantarium + Bacillus species(ewha)임을 확인 할 수 있었다.
한편 2균주 조합은 상호보완 작용 즉, L. plantarium은 젖산의 생성량을 높이는데 그리고 Bacillus species(ewha)의 경우 젖산의 분비량은 적으나 섬유소 및 단백질 분해 효소를 분비하는 특성을 가지고 있기 때문에 2 균주 조합으로 만들면 상호보완 작용을 할 것으로 예견되어 2 균주 조합을 접종발효시킬 경우 복분자와 클로렐라 혼합물의 소화흡수가 높아질 것으로 생각되었다.
[실시예 12 내지 17]
복분자 및 클로렐라 혼합물(95:5, 90:10, 80:20)의 온도를 20, 25, 30, 35, 40, 45℃로 설정한 후, 상기 선발균주중 상대적으로 젖산생성량이 많았던 L. plantarium 및 L. plantarium + Bacillus species(ewha)를 접종하여 발효경과일별로 젖산의 생성량을 조사하였으며, 그 결과는 도 6a 내지 6f에 도시한 바와 같다.
L. plantarium의 접종 후 젖산생성량이 높았던 복분자 및 클로렐라 혼합비율 즉, (95:5)와 (90:10)에서의 온도범위는 30∼40℃이고 최적온도는 40℃이었으나, (80:20)에서의 온도범위는 35∼40℃이고 최적온도는 35℃로 판단되었다. L. plantarium + Bacillus species(ewha)의 접종 후 복분자 및 클로렐라 혼합비율 즉, (95:5)과 (90:10)에서의 젖산생성량이 높았던 온도범위는 30∼40℃이고 최적온도는 40℃이었으나 (80:20)에서의 젖산생성량이 높았던 온도범위는 35∼40℃이고 최적온도는 35℃로 판단되었다. 클로렐라 첨가량이 20% 수준으로 높아지면 35℃의 온도에서 젖산의 생성량이 많아지고 있어 클로렐라의 첨가량이 발효최적 온도를 낮출 수 있을 것으로 생각되었다.
L. plantarium + Bacillus species(ewha)는 L. plantarium 보다 젖산의 생성량은 약간 낮으나 Bacillus species(ewha)는 탄수화물 및 단백질 분해효소의 분비가 이루어지기 때문에 복분자 및 클로렐라 혼합물에 이용하는 것이 바람직할 것으로 생각되었다.
[실시예 18 내지 21]
복분자 및 클로렐라 혼합물(95:5, 90:10, 80:20)의 pH를 4, 5, 6, 7로 조정한 후 L. plantarium 및 L. plantarium + Bacillus species(ewha) 접종하여 발효경과일별로 젖산의 생성량을 조사한 결과는 도 7a 내지 7d와 같다.
L. plantarium에 의한 복분자 및 클로렐라 혼합물(90:10)의 젖산생성량에 미치는 pH의 영향은 발효 2일째 까지 pH 4< pH 7< pH 6< pH 5 순이었으나 발효종료일인 4일째의 젖산 생성량의 차이는 미소하나 pH 5 < pH 7< pH 6 pH 4 순으로 젖산생성량이 높았던 pH는 4∼6 범위이고 발효종료일을 기준한 최적 pH는 4로 판단되었다.
L. plantarium에 의한 복분자 및 클로렐라 혼합물(80:20)의 젖산생성량에 미치는 pH의 영향은 발효 1일째의 pH 7< pH 4< pH 6< pH 5 순서를 제외하고는 발효가 종료될 때까지 젖산 생성량은 pH 7< pH 4< pH 5< pH 6 순으로 젖산생성량이 높았던 pH는 4∼6 범위이고 발효종료일을 기준한 최적 pH는 6으로 판단되었다.
[실시예 22 내지 33]
복분자 및 클로렐라 혼합물(95:5, 90:10, 80:20)을 제조하고 상기 혼합물에 접종균주로 L. plantarium 과 L. plantarium + Bacillus species(ewha)를 접종하여 발효온도 35℃, 40℃에서 4일간 발효시켜 발효제품을 제조하고, 상기 발효제품의 성분 및 생리활성을 조사하였으며 그 결과는 표 3 내지 14에 기재된 바와 같다.
1)일반성분
발효제품의 수분, 조단백질, 조지방, 조회분, 총당, 환원당 및 조섬유 등의 일반성분은 표 3과 같다.
가) 수분함량
표 3의 복분자와 클로렐라 혼함물의 발효 후 수분함량 범위는 66.22～80.14%로 가장 높았던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 95:5, L. plantarium + Bacillus species(ewha) 접종하여 35℃ 로 발효시킨 4번 발효구이었고, 수분의 함량이 제일 적었던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 80:20, L. plantarium 접종하여 35℃로 발효시킨 3번 발효구임을 알 수 있었다.
복분자와 클로렐라 혼합물 각각시험구의 평균수분 함량은 7, 8, 9 번의 40℃ L. plantarium 발효시 72.96% < 1, 2, 3번의 35℃ L. plantarium 발효시 73.06% < 4, 5, 6번의 35℃ L. plantarium + Bacillus species(ewha) 발효시 75.03% < 10, 11, 12번의 40℃에서의 L. plantarium + Bacillus species(ewha) 발효시 75.43% 순서이었다. 이러한 결과는 L. plantarium 균만을 이용한 것 보다 L. plantarium과 Bacillus species(ewha) 균주 2종을 동량 접종하여 발효되는 과정에서 Bacillus species(ewha)속이 분비하는 효소들에 의하여 복분자와 클로렐라 혼합물이 분해되는 과정에서 결합수가 유리되어진 것으로 생각 되었으며, Bacillus species(ewha)속의 증식 및 효소분비력이 40℃ 조건이 더 좋은 것으로 추정되었다.
나) 조단백질 함량
표 3의 복분자와 클로렐라 혼함물의 발효 후 조단백질함량 범위는 2.64～12.89 %로 가장 높았던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 80:20, L. plantarium 35℃로 발효시킨 3번 발효구 이었고, 조단백질의 함량이 제일 적었던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 95:5, L. plantarium + Bacillus species(ewha) 접종하여 35℃로 발효시킨 4번 발효구임을 알 수 있었다.
복분자와 클로렐라 혼합물 각각 발효시험구의 조단백질함량은 클로렐라 혼합량이 많아질수록 증가가 뚜렷하여 복분자만을 섭취하는 것 보다 조단백질의 보충(보족)효과가 뚜렷해 질 것으로 추정되었다. 발효조건에 따라 조단백질의 함량에 차이가 있어 L. plantarium에 의한 발효의 경우는 35℃보다 40℃의 경우가 증가되는 경향이었으나 L. plantarium + Bacillus species(ewha)에 의한 발효의 경우 35℃ 보다 40℃의 경우 조단백질 함량이 감소되는 경향이었다.
본 발명에 사용한 발효미생물과 온도에 의한 조단백질 함량의 감소를 보인 것은 미생물의 생리적인 특성이 다르고 또 분비하는 효소의 종류와 역가 등에 의하여 분해반응에 있어 상승작용이 예견될 뿐 아니라 온도조건에 따른 효소반응의 활성화 정도가 다르기 때문으로 생각되었다.
다) 조지방 함량
표 3의 복분자와 클로렐라 혼함물의 발효 후 조지방 함량 범위는 3.3454～5.8821%로 가장 높았던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 80:20, L. plantarium + Bacillus species(ewha) 40℃ 로 발효시킨 12번 시료 이었고, 조지방 함량이 제일 적었던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 95:5, L. plantarium + Bacillus species(ewha) 접종하여 35℃로 발효시킨 4번구임을 알 수 있었다.
복분자와 클로렐라 혼합물 각각 발효구의 조지방 함량은 클로렐라 혼합량이 많아질수록 증가하는 경향을 보였다. 발효조건에 따라 조지방의 함량이 미소한 차이가 있어 35℃의 L. plantarium 또는 L. plantarium + Bacillus species(ewha) 구보다 40℃의 L. plantarium 및 L. plantarium + Bacillus species(ewha) 구들의 경우 조지방 함량이 증가되는 경향이었다.
라) 조회분 함량
표 3의 복분자와 클로렐라 혼함물의 발효 후 조회분 함량 범위는 3.22～6.37%로 가장 높았던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 80:20, L. plantarium 40℃로 발효시킨 9번구이었고, 조회분 함량이 제일 적었던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 95:5, L. plantarium + Bacillus species(ewha) 접종하여 35℃로 발효시킨 4번구임을 알 수 있었다.
복분자와 클로렐라 혼합물 각각 발효구의 조회분 함량은 클로렐라 혼합량이 많아질수록 증가하는 경향을 보였다. 발효조건에 따라 조회분의 함량이 미소한 차이가 있어 35℃의 L. plantarium 또는 L. plantarium + Bacillus species(ewha) 구보다 40℃의 L. plantarium 및 L. plantarium + Bacillus species(ewha) 들의 경우 증가되는 경향이었다.
발효조건에 따라서 조회분의 함량이 미소한 증가를 보이고 있으나 일반적인 식품규격의 규제수준 이하로 문제가 되지 않을 것으로 생각되었다.
마) 총당 함량
표 4의 복분자와 클로렐라 혼함물의 발효 후 총당 함량 범위는 5.54～12.37%로 가장 높았던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 95:5, L. plantarium + Bacillus species(ewha) 35℃로 발효시킨 1번구이었고, 총당 함량이 제일 적었던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 80:20, L. plantarium + Bacillus species(ewha) 접종하여 40℃로 발효시킨 12번구임을 알 수 있었다.
복분자와 클로렐라 혼합물 각각 발효구의 총당 함량은 클로렐라 혼합량이 많아질수록 감소하는 경향을 보였다. 발효조건에 따라 총당의 함량이 감소되고 있는 경향을 보인 것은 35, 40℃의 L. plantarium에 의한 발효구이고, 35, 40℃의 L. plantarium + Bacillus species(ewha)에 의한 발효구들의 경우 역시 감소되는 경향이나 예외적으로 복분자와 클로렐라 혼합비가 90:10인 5번 발효구와 11번 발효구에서는 증가되었다.
바) 환원당 함량
표 3의 복분자와 클로렐라 혼함물의 발효 후 환원당 함량 범위는 0.51～2.23%로 가장 높았던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 90:10, L. plantarium + Bacillus species(ewha) 40℃로 발효시킨 11번구이었고, 환원당 함량이 제일 적었던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 80:20, L. plantarium 접종하여 40℃로 발효시킨 9번구임을 알 수 있었다.
복분자와 클로렐라 혼합물 각각 발효구의 환원당 함량은 클로렐라 혼합량이 많아질수록 감소하는 경향을 보였다. 발효조건에 따라 환원당의 함량이 감소되고 있는 경향을 보인 것은 35, 40℃의 L. plantarium에 의한 발효구이고, 35, 40℃의 L. plantarium + Bacillus species(ewha)에 의한 발효구들의 경우 역시 감소되는 경향이나 예외적으로 복분자와 클로렐라 혼합비가 90:10인 5번 발효구와 11번 발효구 및 80:20인 9번 발효구에서는 증가되었다.
사) 조섬유 함량
표 3의 복분자와 클로렐라 혼함물의 발효 후 조섬유 함량 범위는 0.38～2.86%로 가장 높았던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 80:20, L. plantarium을 접종하여 35℃로 발효시킨 3번 발효구이었고, 조섬유 함량이 제일 적었던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 95:5, L. plantarium + Bacillus species(ewha) 접종하여 40℃로 발효시킨 10번 발효구임을 알 수 있었다.
복분자와 클로렐라 혼합물 각각 발효구의 조섬유 함량은 클로렐라 혼합량이 증가할수록, 발효온도가 높아질수록 조섬유의 함량이 감소되는 경향이었다. 또한 L. plantarium과 L. plantarium + Bacillus species(ewha)에 의한 발효구들의 경우 L. plantarium + Bacillus species(ewha) 발효구가 더 감소되는 경향이었다.
2) pH, 산도 및 색도
상기 발효제품의 pH, 산도, Brix 및 색상의 조사 결과는 하기의 표 4와 같다.
가) 발효제품의 pH
표 4의 복분자와 클로렐라 혼합물의 발효 후 pH 범위는 3.31～3.72로 가장 높았던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 95:5, L. plantarium + Bacillus species(ewha) 40℃로 발효시킨 12번구이었고, pH가 제일 낮았던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 95:5, L. plantarium 접종하여 35℃로 발효시킨 4번구임을 알 수 있었다.
복분자와 클로렐라 혼합물 각각 발효구의 pH는 클로렐라 혼합량이 많아질수록 증가하는 경향을 보였으나, 복분자와 클로렐라 혼합비별(95:5, 90:10, 80:20) 발효온도를 35, 40℃로 하고 L. plantarium 및 L. plantarium + Bacillus species(ewha)를 각각 접종하여 발효시킨 결과와 pH의 변화가 크지 않아 온도의 영향은 인정하기 어려웠다.
나) 발효제품의 산도
표 4의 복분자와 클로렐라 혼합물의 발효 후 산도 범위는 1.98～2.72로 가장 높았던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 80:20, L. plantarium 35℃로 발효시킨 3번구이었고, 산도가 제일 낮았던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 95:5, L. plantarium 접종하여 35℃로 발효시킨 1번구임을 알 수 있었다. 복분자와 클로렐라 혼합물별 발효구의 산도는 클로렐라 혼합량이 많아질수록 증가하는 경향을 보였다.
복분자와 클로렐라 혼합비별(95:5, 90:10, 80:20) 발효온도를 35℃로 하고 L. plantarium 및 L. plantarium + Bacillus species(ewha)을 각각 접종하여 발효시킨 결과 산도가 L. plantarium로 발효시킨 경우 미소한 증가를 보였으나 발효온도를 40℃로 하고 L. plantarium 및 L. plantarium + Bacillus species(ewha)을 각각 접종하여 발효시킨 결과 L. plantarium + Bacillus species(ewha)로 발효시킨 경우 산도가 미소한 증가를 보였다. 즉, 35℃에서는 L. plantarium으로 발효시키었을 때, 40℃에서는 L. plantarium + Bacillus species(ewha)로 발효시키었을 때 산도가 미소한 증가를 보였다.
다) 발효제품의 당도
표 4의 복분자와 클로렐라 혼합물의 발효 후 당도 범위는 4.7～11.7 Brix로 가장 높은 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 80:20, L. plantarium 35℃로 발효시킨 6번구이었고, 당도가 제일 낮았던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 90:10, L. plantarium 접종하여 40℃로 발효시킨 11번구임을 알 수 있었다. 복분자와 클로렐라 혼합물 각각 발효구의 당도는 클로렐라 혼합량이 많아질수록 증가하는 경향을 보였다. 복분자와 클로렐라 혼합비별(95:5, 90:10, 80:20) L. plantarium 및 L. plantarium + Bacillus species(ewha)를 각각 접종하여 발효시킨 결과 35℃에서는 당도의 감소가 L. plantarium + Bacillus species(ewha)에서 적었으나 40℃에서는 당도가 오히려 더 감소하는 경향을 보였다. 즉, 35℃에서는 L. plantarium + Bacillus species(ewha)로 발효시키었을 때, 40℃에서는 L. plantarium로 발효시키었을 때 당의 소비가 억제되어 당도가 감소가 미약하게 되었을 것으로 생각되었다.
이러한 결과는 35℃의 조건에서는 Bacillus species(ewha)가 분비하는 효소에 의하여 생성되는 당의 양보다 L. plantarium에 의하여 소비되는 당의 량이 적어 미량이지만 축적된 결과로 생각되었고, 40℃ L. plantarium의 경우 생육이 억제되어 생성된 당의 소비가 미약하여 감소가 적게된 것으로 생각되었고, L. plantarium + Bacillus species(ewha) 혼합 접종한 경우 L. plantarium은 증식이 억제되지만 오히려 Bacillus species(ewha) 증식은 촉진되어 당의 소비량이 증가된 결과 당도가 감소된 것으로 생각되었다.
라) 발효제품의 현색계
표 4의 색 표현에는 명도(Value), 채도(chroma; 색도), 색상(Hue)으로 불리어지는 3가지 독립된 성질이 있다. 즉 명도는 어두운 흑색으로부터 밝은 흰색까지의 정도를 나타내고, 채도는 색의 선명도를 표시하며 회색 또는 무색을 0으로 하여 색이 진해지는 것을 표현하며, 색상은 다섯가지 기본색인 적색, 황색, 녹색, 청색, 자색과 5가지의 중간색으로 표시한다.
복분자와 클로렐라 혼합물의 발효후의 미건조물 및 동결건조물의 현색계는 클로렐라의 혼합비가 증가 할수록 L(밝기), a(+ 적색, - 녹색)값은 감소하는 경향을 보인데 반하여 b값(+ 황색, - 청색)은 증가하는 경향을 보였다. 미건조 발효제품 보다 동결건조 발효제품의 Hunter 색계의 L, a, b 값이 모두 증가되어 색상이 밝아짐을 알 수 있었는데 함수량의 감소되기 때문인 것으로 생각되었다.
발효제품의 L값(명도)의 범위는 30.27～37.95로 가장 높은 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 95:5, L. plantarium + Bacillus species(ewha)를 40℃로 발효시킨 7번구이었고, L값이 제일 낮았던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 90:10, L. plantarium + Bacillus species(ewha)를 접종하여 40℃로 발효시킨 8번구이었다.
복분자와 클로렐라 혼합비별(95:5, 90:10, 80:20) L. plantarium 및 L. plantarium + Bacillus species(ewha)을 각각 접종하여 35℃와 40℃온도에서 발효시킨 결과 35℃에서는 Hunter 색계의 L값이 L. plantarium 보다 L. plantarium + Bacillus species(ewha)에서 감소, a, b 값은 증가되는 경향이었고, 40℃에서는 L값과 b값이 L. plantarium 보다 L. plantarium + Bacillus species(ewha)에서 증가된데 반하여 a 값은 감소되는 경향을 보였다.
또한 복분자와 클로렐라 혼합비별 발효시킨 발효물을 동결건조 한 결과 함수율이 낮아지는 반면에 Hunter 색계의 L, a, b의 값이 모두 증가하는 결과를 볼 수 있었다.
3) 유리당의 함량
상기 발효제품의 유리당을 분석한 결과는 표 5에 개시한 바와 같다.
표 5에서 보는 바와 같이 복분자와 클로렐라 혼합물의 발효된 시료의 미검출 유리당의 종류와 유리당의 최고 및 최저함량은 L. plantarium으로 35℃에서 발효된 1번 발효구는 2종 즉, maltose, lactose이며, 최고 및 최저 유리당의 함량은 23.28 ㎎/㎏의 fructose과 1.62 ㎎/㎏ sucrose이었고, 2번 발효구는 3종 즉, sucrose, maltose, lactose이며, 최고 및 최저 유리당의 함량은 14.07 ㎎/㎏의 fructose와 14.04 ㎎/㎏ glucose이었고, 3번 발효구는 2종 즉, maltose, lactose이며, 최고 및 최저 유리당의 함량은 10.66 ㎎/㎏의 fructose와 0.85 ㎎/㎏ sucrose이었으나, 40℃에서 발효된 복분자와 클로렐라 혼합물의 유리당 분석결과 검출되지 않은 경우는 7번 발효구는 1종 즉, glucose이며, 최고 및 최저 유리당의 함량은 4.25 ㎎/㎏의 frucose와 1.38 ㎎/㎏ maltose이었고, 8번 발효구는 모두 검출되었으며, 최고 및 최저 유리당의 함량은 27.87 ㎎/㎏의 glucose와 0.30 ㎎/㎏ sucrose이었고, 9번 발효구는 2종 즉, sucrose, maltose이며, 최고 및 최저 유리당의 함량은 10.01 ㎎/㎏의 fructose와 0.93 ㎎/㎏ lactose이었다.
L. plantarium + Bacillus species(ewha)으로 35℃에서 발효된 복분자와 클로렐라 혼합물의 미검출 당류는 4번 발효구는 3종 즉, sucrose, maltose, lacrose 이며, 최고 및 최저 유리당의 함량은 17.09 ㎎/㎏의 fructose와 9.98 ㎎/㎏ glucose이었고, 5번 발효구는 3종 즉, sucrose, maltose, lacrose이며, 최고 및 최저 유리당의 함량은 19.23 ㎎/㎏의 fructose와 14.70 ㎎/㎏ glucose이었고, 6번 발효구는 2종 즉, sucrose, maltose이며, 최고 및 최저 유리당의 함량은 10.97 ㎎/㎏의 fructose와 5.39 ㎎/㎏ glucose이었으나, 40℃에서 발효된 10번 발효구는 2종 즉, sucrose, lactose이며, 최고 및 최저 유리당의 함량은 18.07 ㎎/㎏의 fructose와 3.46 ㎎/㎏ maltose이었고, 11번 발효구는 2종 즉, sucrose, lactose이며, 최고 및 최저 유리당의 함량은 16.32 ㎎/㎏의 fructose와 1.72 ㎎/㎏ maltose이었고, 12번 발효구는 2종 즉, maltose, lactose이며, 최고 및 최저 유리당의 함량은 12.39 ㎎/㎏의 fructose와 0.28 ㎎/㎏ sucrose이었다.
이러한 결과는 복분자와 클로렐라 혼합비에 따른 발효온도와 발효균주 차이에 따른 유리당은 클로렐라 혼합량이 증가 할수록 감소하는 경향을 보였으나 예외적으로 5번 발효구와 8번 발효구의 경우 유리당의 함량이 증가됨을 알 수 있었다. 또한 모든 발효구의 미검출 당류의 빈도는 fructose < glucose < sucrose < maltose = lactose 순으로 0, 1, 7, 8, 8 증가 되고 있음을 알 수 있었다. L. plantarium으로 40℃에서 복분자와 클로렐라 혼합비를 달리하여 발효시킨 경우는 대조원료중의 maltose, lactose 함량보다 증가되었고, L. plantarium + Bacillus species(ewha)으로 발효시킨 경우는 maltose가 증가된 결과를 보였다.
4) 구성아미노산 함량
복분자와 클로렐라 혼합물의 발효온도 및 균주에 따른 발효구별 아미노산 함량은 표 6과 같다.
복분자와 클로렐라 혼합물(95:5, 90:10, 80:20)의 온도와 균종을 달리하여 얻은 발효구별 16종의 아미노산 가운데 미검출 아미노산은 L. plantarium로 35℃에서 발효된 1번 발효구는 6종 즉, aspartate, histidine, tyrosine, cystine, methionine, isoleucine이며, 최고 및 최저 아미노산의 함량은 246.0 ㎎/㎏의 arginine과 21.95 ㎎/㎏ serine이었고, 2번 발효구는 2종 즉, methionine, isoleucine이며, 최고 및 최저 아미노산의 함량은 85.06 ㎎/㎏의 glycine과 9.66 ㎎/㎏ cystine이었고, 3번 발효구는 1종 즉, isoleucine이며, 최고 및 최저 아미노산의 함량은 104.13 ㎎/㎏의 glycine과 8.03 ㎎/㎏ methionine이었으나, 40℃에서 발효된 복분자와 클로렐라 혼합물의 아미노산 분석결과 미검출된 경우는 7번 발효구는 3종 즉, cystine, methionine, isoleucine이며, 최고 및 최저 아미노산의 함량은 99.89 ㎎/㎏의 arginine과 9.74 ㎎/㎏ tyrosine 이었고, 8번 발효구는 5종 즉, histidine, tyrosine, cystine, methionine, isoleucine이며, 최고 및 최저 아미노산의 함량은 256.54 ㎎/㎏의 arginine과 11.82 ㎎/㎏ aspartate이었고, 9번 발효구는 1종 즉, histidine, tyrosine, cystine, methionine, isoleucine이며, 최고 및 최저 아미노산의 함량은 119.31 ㎎/㎏의 glycine과 10.43 ㎎/㎏ methionine이었다.
또한 L. plantarium + Bacillus species(ewha)로 35℃에서 발효된 복분자와 클로렐라 혼합물의 아미노산 분석결과 미검출된 경우는 4번 발효구는 6종 즉, aspartate, histidine, tyrosine, cystine, methionine, isoleucine이며, 최고 및 최저 아미노산의 함량은 247.67 ㎎/㎏의 arginine과 21.73 ㎎/㎏ valine이었고, 5번 발효구는 3종 즉, cystine, methionine, isoleucine이며, 최고 및 최저 아미노산의 함량은 116.97 ㎎/㎏의 glycine과 12.45 ㎎/㎏ valine이었고, 6번 발효구는 2종 즉, cystine, methionine이며, 최고 및 최저 아미노산의 함량은 105.33 ㎎/㎏의 glycine과 9.46 ㎎/㎏ isoleucine이었으나, 40℃에서 발효된 복분자와 클로렐라 혼합물의 아미노산 분석결과 미검출된 경우는 10번 발효구는 2종 즉, cystine, methionine이며, 최고 및 최저 아미노산의 함량은 103.84 ㎎/㎏의 glycine과 6.64 ㎎/㎏ isoleucine이었고, 11번 발효구는 3종 즉, cystine, methionine, isoleucine이며, 최고 및 최저 아미노산의 함량은 188.56 ㎎/㎏의 arginine과 11.77 ㎎/㎏ tyrosine이었고, 12번 발효구는 1종 즉, cystine이며, 최고 및 최저 아미노산의 함량은 123.39 ㎎/㎏의 glycine과 8.79 ㎎/㎏ methionine이었다.
이러한 결과는 복분자와 클로렐라 혼합비에 따른 발효온도와 발효균주 차이에 따른 아미노산의 함량수준이 일정한 경향을 보이지 않았으나 모든 발효구의 부족한 아미노산의 빈도 순위는 aspartate < histidine < tyrosine < isoleucine < methionine < cystine 임이 밝혀져 이들 아미노산을 보완하면 영양적으로 우수한 아미노산의 조성을 유지 할 수 있을 것으로 생각된다.
발효온도 및 발효균주에 따른 복분자와 클로렐라 혼밥발효 제품의 총아미노산 함량 범위는 502.3～727.1 ㎎/㎏로 가장 높은 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 90:10, L. plantarium 40℃로 발효시킨 8번구이었고, 가장 낮았던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 90:10, L. plantarium 접종하여 35℃로 발효시킨 2번구임을 알 수 있었다.
복분자와 클로렐라 혼합물 각각 발효구의 총아미노산 함량은 클로렐라 혼합량의 증가와는 일정한 관계를 나타내지 않았다.
복분자와 클로렐라 혼합비별(95:5, 90:10, 80:20) L. plantarium 및 L. plantarium + Bacillus species(ewha)을 각각 접종하여 35℃에서 발효시킨 결과 총아미노산 함량은 클로렐라를 20% 혼합한 경우를 제외하고는 L. plantarium 보다 L. plantarium + Bacillus species(ewha)의 균을 접종한 경우에 증가하였다.
복분자와 클로렐라 혼합비별(95:5, 90:10, 80:20) L. plantarium 및 L. plantarium + Bacillus species(ewha)을 각각 접종하여 40℃에서 발효시킨 결과 총아미노산 함량은 클로렐라를 5% 혼합한 경우를 제외하고는 L. plantarium 발효구가 오히려 높은 경향을 보였다.
즉, 35℃에서는 L. plantarium + Bacillus species(ewha)로 발효시켰을 때, 40℃에서는 L. plantarium로 발효시켰을 때 총아미노산의 함량이 높았다.
5) 유기산 함량
복분자와 클로렐라 혼함물(95:5, 90:10, 80:20)의 발효온도 및 균주를 달리하여 발효시킨 후의 citric acid, lactic acid, formic acid, acetic acid, propionic acid, tartaric acid, malic acid, succinic acid의 함량을 분석한 결과는 표 7과 같다.
표 7에서 보는 봐와 같이 35℃와 40℃에서 복분자와 클로렐라 혼합물을 L. plantarium을 접종하여 얻은 발효구들의 유기산 중 propionic acid, succinic acid가 미검출 되었고, 35℃에서 발효된 1번 발효구의 경우 최고 및 최저 유기산의 함량은 2.96 g/㎏의 malic acid와 0.05 g/㎏ acetic acid이었고, 2번 발효구의 경우 최고 및 최저 유기산의 함량은 2.57 g/㎏의 malic acid와 0.05 g/㎏ acetic acid이었고, 3번 발효구의 경우 최고 및 최저 유기산의 함량은 2.97 g/㎏의 lactic acid와 0.07 g/㎏ acetic acid이었으나, 40℃에서 발효된 7번 발효구의 경우 최고 및 최저 유기산의 함량은 2.75 g/㎏ malic acid와 0.06 g/㎏ acetic acid이었고, 8번 발효구의 경우 최고 및 최저 유기산의 함량은 2.74 g/㎏ malic acid와 0.22 g/㎏ formic acid이었고, 9번 발효구의 경우 최고 및 최저 유기산의 함량은 3.13 g/㎏의 lactic acid와 0.07 g/㎏ acetic acid이었다.
또한 L. plantarium + Bacillus species(ewha)로 35℃에서 발효된 복분자와 클로렐라 혼합물의 아미노산 분석결과 미검출된 경우는 4번 발효구는 6종 즉, aspartate, histidine, tyrosine, cystine, methionine, isoleucine이며, 최고 및 최저 아미노산의 함량은 247.67 ㎎/㎏의 arginine과 21.73 ㎎/㎏ valine이었고, 5번 발효구는 3종 즉, cystine, methionine, isoleucine이며, 최고 및 최저 아미노산의 함량은 116.97 ㎎/㎏의 glycine과 12.45 ㎎/㎏ valine이었고, 6번 발효구는 2종 즉, cystine, methionine이며, 최고 및 최저 아미노산의 함량은 105.33 ㎎/㎏의 glycine과 9.46 ㎎/㎏ isoleucine이었으나, 40℃에서 발효된 복분자와 클로렐라 혼합물의 아미노산 분석결과 미검출된 경우는 10번 발효구는 2종 즉, cystine, methionine이며, 최고 및 최저 아미노산의 함량은 103.84 ㎎/㎏의 glycine과 6.64 ㎎/㎏ isoleucine이었고, 11번 발효구는 3종 즉, cystine, methionine, isoleucine이며, 최고 및 최저 아미노산의 함량은 188.56 ㎎/㎏의 arginine과 11.77 ㎎/㎏ tyrosine이었고, 12번 발효구는 1종 즉, cystine이며, 최고 및 최저 아미노산의 함량은 123.39 ㎎/㎏의 glycine과 8.79 ㎎/㎏ methionine이었다.
이러한 결과는 복분자와 클로렐라 혼합비에 따른 발효온도와 발효균주 차이에 따른 아미노산의 함량수준이 일정한 경향을 보이지 않았으나 모든 발효구의 부족한 아미노산의 빈도 순위는 aspartate < histidine < tyrosine < isoleucine < methionine < cystine 임이 밝혀져 이들 아미노산을 보완하면 영양적으로 우수한 아미노산의 조성을 유지 할 수 있을 것으로 생각된다.
발효온도 및 발효균주에 따른 복분자와 클로렐라 혼밥발효 제품의 총아미노산 함량 범위는 502.3～727.1 ㎎/㎏로 가장 높은 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 90:10, L. plantarium 40℃로 발효시킨 8번구이었고, 가장 낮았던 발효구는 복분자와 클로렐라 혼합비가 90:10, L. plantarium 접종하여 35℃로 발효시킨 2번구임을 알 수 있었다.
복분자와 클로렐라 혼합물 각각 발효구의 총아미노산 함량은 클로렐라 혼합량의 증가와는 일정한 관계를 나타내지 않았다.
복분자와 클로렐라 혼합비별(95:5, 90:10, 80:20) L. plantarium 및 L. plantarium + Bacillus species(ewha)을 각각 접종하여 35℃에서 발효시킨 결과 총아미노산 함량은 클로렐라를 20% 혼합한 경우를 제외하고는 L. plantarium 보다 L. plantarium + Bacillus species(ewha)의 균을 접종한 경우에 증가하였다.
복분자와 클로렐라 혼합비별(95:5, 90:10, 80:20) L. plantarium 및 L. plantarium + Bacillus species(ewha)을 각각 접종하여 40℃에서 발효시킨 결과 총아미노산 함량은 클로렐라를 5% 혼합한 경우를 제외하고는 L. plantarium 발효구가 오히려 높은 경향을 보였다.
즉, 35℃에서는 L. plantarium + Bacillus species(ewha)로 발효시켰을 때, 40℃에서는 L. plantarium로 발효시켰을 때 총아미노산의 함량이 높았다.
6) 무기질 함량
복분자와 클로렐라 혼함물(95:5, 90:10, 80:20)의 발효온도 및 균주를 달리하여 발효시킨 후의 무기질 함량을 분석한 결과는 표 8과 같다.
표 8에서 보는 봐와 같이 35℃와 40℃에서 복분자와 클로렐라 혼합물을 L. plantarium과 L. plantarium + Bacillus species(ewha)을 접종하여 발효시켜 얻은 발효구의 Ca, K, Mg 및 Na의 함량은 클로렐라 혼합량에 따라서 미약하게 증가되었고, 전체적인 경향은 40℃의 L. plantarium > 35℃의 L. plantarium > 35℃의 L. plantarium + Bacillus species(ewha) > 40℃의 L. plantarium + Bacillus species(ewha) 순이었다.
선발균주별 발효온도에 따른 Ca, K 및 Mg의 함량은 L. plantarium은 40℃가 L. plantarium + Bacillus species(ewha)은 35℃가 약간 높은 경향을 보임을 알 수 있었으며, Na 함량은 L. plantarium가 40℃, L. plantarium + Bacillus species(ewha)는 35℃와 40℃ 사이에 차이가 없었다.
발효제품의 무기질 수준은 Ca의 경우 0.2421±0.0031～0.4714± 0.0037 mg/g, K의 경우 2.1287± 0.0356～3.7777± 0.0706 mg/g, Mg의 경우 0.2705± 0.0017～2.0811± 0.0076 mg/g 및 Na의 경우 0.1551± 0.0039～1.0422± 0.0105 mg/g 수준이었다.
7) 미생물수 측정
복분자와 클로렐라 혼합물(95:5, 90:10, 80:20)의 40℃조건에서 발효시킨 후의 생균수를 계측한 결과는 표 9와 같다.(실시예 28 내지 33의 발효물)
표 9는 복분자와 클로렐라 혼함물을 40℃조건에서 발효시킨 결과 클로렐라의 혼합량이 증가 할수록 L. plantarium 생균수는 7번 발효구(95 : 5)의 3.3×108 CFU/g < 8번 발효구(90:10), 2.88×1011 CFU/g < 9번 발효구(80:20), 1.08×1012 CFU/g 순서로 증가하였고, L. plantarium + Bacillus species(ewha)의 생균수는 11번 발효구(90:10), 4.67×1011 CFU/g < 10번 발효구(95:5), 4.61×1011CFU/g < 12번 발효구(80:20), 9.17×1010 CFU/g 순이었다. 이렇게 L. plantarium과 L. plantarium + Bacillus species(ewha)의 균체수가 클로렐라 혼합량의 증가에 따른 균체수의 증가가 이루어지지 않은 것은 Bacillus species(ewha) 혼합배양으로 인하여 미약하나 각각의 균주가 생육되면서 분비하는 물질과 영양성분 등에 의한 20% 클로렐라 혼합구에서 저해작용을 받아 생균수가 적은 것으로 추정되었다.
8) 항균활성
40℃에서 복분자와 클로렐라 혼합(95:5, 90:10, 80:20) 발효물에 의한 유해세균 S. aureus, E. coli, Salmonella의 항균활성을 조사한 결과는 표 10과 같다.(실시예 28 내지 33의 발효물)
표 10은 복분자와 클로렐라 혼합물을 40℃조건에서 발효시킨 결과 클로렐라의 혼합량이 증가 할수록 항균활성이 감소하는 결과를 보였다.
표 10에서 보는 바와 같이 S. aureus에 관한 항균력은 L. plantarium으로 발효된 7번 발효구는 21.28%, 8번 발효구는 18.52%, 9번 발효구는 -1.20%이었고, L. plantarium+ Bacillus species(ewha)으로 발효된 10번 발효구는 1.90%, 11번 발효구는 4.60%, 12번 발효구는 2.90%로 9번 발효구를 제외하고는 L. plantarium의 항균활성이 높았으며 L. plantarium+ Bacillus species(ewha) 혼합균주로 발효시킨 경우 11번 발효구가 약간 높았다.
E. coli에 관한 항균활성은 클로렐라의 혼합량이 6, 10, 20%로 많아질수록 감소하는 경향을 보였고, L. plantarium으로 발효된 7번 발효구와 L. plantarium+ Bacillus species(ewha)으로 발효된 11번 발효구에서만 항균활성이 각각 3.64% 및 1.94%이었다. 전체적으로 E. coli에 관한 복분자와 클로렐라 혼합물의 항균활성이 미약함을 알 수 있었다.
Salmonella에 관한 항균활성은 복분자에 클로렐라의 혼합량과는 상관성을 보이지 않았고, 10% 클로렐라를 혼합하였을때 항균활성이 높은 경향을 나타내었다. 그러나 발효균주로 L. plantarium과 L. plantarium + Bacillus species(ewha) 사용한 결과 L. plantarium + Bacillus species(ewha)에서는 항균활성이 낮았으며, 7번과 8번 발효구에서만 항균활성이 각각 7.64% 및 13.15%이었다. 전체적으로 Salmonella에 관한 복분자와 클로렐라 혼합물의 항균활성이 미약함을 알 수 있었다.
9) 총페놀성 화합물 함량 측정
복분자와 클로렐라 혼합물에 L. plantarium, L. plantarium + Bacillus species(ewha)를 접종하여 35℃와 40℃로 발효시켜 얻은 추출물의 폴리페놀 함량을 조사한 결과는 표 11과 같다.
표 11에서 보는 바와 같이 L. plantarium으로 35℃와 40℃에서 발효된 복분자와 클로렐라 혼합발효물의 폴리페놀 함량은 35℃에서 발효된 1번 발효구의 경우 0.59 g/kg, 2번 발효구의 경우 0.15 g/kg, 3번 발효구의 경우 0.31 g/kg이었으나, 40℃에서 발효된 7번 발효구의 경우 0.50 g/kg, 8번 발효구의 경우 0.59 g/kg, 9번 발효구의 경우 0.41 g/kg으로 폴리페놀 함량이 35℃ 보다 40℃에서 발효된 경우 증가하였다.
L. plantarium + Bacillus species(ewha)으로 35℃, 40℃에서 발효된 복분자와 클로렐라 혼합물의 폴리페놀함량은 35℃에서 발효된 4번 발효구의 경우 0.72 g/kg, 5번 발효구의 경우 0.45 g/kg, 6번 발효구의 경우 0.43 g/kg이었으나, 40℃에서 발효된 10번 발효구의 경우 0.51 g/kg, 11번 발효구의 경우 0.72 g/kg, 12 발효구의 경우 0.46 g/kg이었다.
이러한 결과는 복분자에 클로렐라 혼합량이 증가할수록 폴리페놀의 함량이 감소하는 경향을 보였고, L. plantarium로 발효시킨 경우의 폴리페놀함량은 35℃ 보다 40℃에서 증가되는 경향이었고, L. plantarium + Bacillus species(ewha)로 35℃ 및 40℃에서 발효시킨 경우 폴리페놀 함량이 약간 증가되는 경향이었고, 예외적으로 클로렐라 혼합구인 4번과 11번 발효구가 더 높았다.
발효온도별 폴리페놀함량이 L. plantarium 보다 L. plantarium + Bacillus species(ewha)로 발효시킨 경우 증가경향을 보였으며, 35℃ 보다는 40℃에서 발효된 경우가 높음을 알 수 있었다.
10) 전자공여능 측정
인체내의 지질대사는 세포수준에서 산화과정을 거쳐 분해되며 이때 발생되는 free radical는 세포의 노화촉진 뿐 아니라 방어기전을 저하시키는 등 세포의 활성을 저하시키기 때문에 free radical 생성을 억제 또는 소거시키는 일은 생체세포를 보호하는데 매우 중요한데, 전자공여능은 활성이 강한 free radical에 전자를 공여하여 세포성분의 산화를 억제하는 기능을 말한다(박영서, 장학길). 발효온도를 35℃와 40℃로 하여 복분자와 클로렐라 혼합물을 발효시켜 얻은 발효물을 추출하여 전자공여능을 조사함으로써 생체내에서의 free radical에 의한 세포의 노화 및 방어기전 저하 억제력이 우수한 발효구를 선발하고자 전자공여능을 조사한 결과는 표 12와 같다.
표 12에서 보는 봐와 같이 L. plantarium으로 35℃와 40℃에서 발효된 복분자와 클로렐라 혼합발효물의 전자공여능은 35℃에서 발효된 1번 발효구의 경우 71.24%, 2번 발효구의 경우 76.33%, 3번 발효구의 경우 80.25% 이었으나, 40℃에서 발효된 7번 발효구의 경우 75.45%, 8번 발효구의 경우 76.06%, 9번 발효구의 경우 80.51%이었다.
L. plantarium + Bacillus species(ewha)으로 35℃, 40℃에서 발효된 복분자와 클로렐라 혼합물의 전자공여능은 35℃에서 발효된 4번 발효구의 경우 72.00%, 5번 발효구의 경우 72.93%, 6번 발효구의 경우 81.59%이었으나, 40℃에서 발효된 10번 발효구의 경우 70.96%, 11번 발효구의 경우 72.96%, 12 발효구의 경우 81.49%이었다.
이와 같은 결과를 종합하면 복분자에 클로렐라 혼합량이 증가할수록 전자공여능은 증가하는 경향이었으나 L. plantarium + Bacillus species(ewha) 접종하여 40℃에서 발효된 발효물 역시 증가하는 경향을 보였다. L. plantarium과 L. plantarium + Bacillus species(ewha)로 발효시킨 경우의 전자공여능은 35℃ 보다 40℃에서 증가되는 경향을 보여 균주와 발효온도의 차이로 인하여 전자공여능이 달라짐을 알 수 있었다. 발효온도가 동일 한 경우 전자공여능이 L. plantarium < L. plantarium + Bacillus species(ewha)이 높음을 알 수 있었다. 따라서 전자공여능이 가장 우수한 발효구는 20% 클로렐라를 혼합한 12번 발효구임을 알 수 있었다.
한편 복분자 농축액의 발효전 전자공여능이 71.1%, 발효후의 전자공여능이 69.0%이었던 박과 장의 알려진 결과보다 본 발효제품들의 전자공여능이 70.96∼ 81.59%을 보여 복분자에 클로렐라를 혼합하여 발효시킨 제품의 경우 전자공여능이 우수함을 알 수 있었다.
11) 아질산염 소거능 측정
암유발 원인물질의 하나인 nitrite은 식품첨가물, 음료수 및 타액에 소량 함유되어 있고, 야채 및 과일에 많은 양의 nitrate가 함유되어 타액 또는 위액, 식품의 저장 중 nitrate redutase에 의하여 nitrite로 환원되는 사실이 보고되었다. 또 혈액에 일정수준 이상의 nitrite가 존재하면 hemoglobin과 산화반응을 일으켜 methemo-globin을 형성하며 이에 의한 질병이 발생하는 등 인체에서의 대사를 교란하여 독작용이 일어나는 것으로 알려졌다. 단백질식품, 의약품 및 잔류농약 등에 함유된 amine들과 반응하여 nitrosoamine을 생성하여 핵산, 단백질, 세포내의 성분들을 alkyl화시켜 암이 발생되는 사실이 구명되었다. 이러한 nitrosoamine은 식품자체의 성분간의 반응 또는 위장에서 음식물이 소화되는 과정에 분비되는 위액의 pH 2～3으로 nitroso화 반응이 쉽게 일어날 수 있는 조건이 되기 때문에 관심이 높다. 인체에서 해롭게 작용하는 아질산염의 생성량을 경감시키는 효과가 있는지를 구명하고자 복분자와 클로렐라 혼합물에 L. plantarium, L. plantarium + Bacillus species(ewha) 접종하여 얻은 발효구들의 아질산염 소거능을 조사한 결과는 표 13과 같다.
표 13에서 보는 봐와 같이 L. plantarium으로 35℃와 40℃에서 발효된 복분자와 클로렐라 혼합발효물의 아질산염 소거능은 클로렐라의 혼합량이 많아질수록 아질산염의 소거능이 감소하는 경향을 보였다.
pH 1.2에서의 아질산염 소거능은 35℃에서 발효된 1, 2, 3번 발효구 중 아질산염 소거능이 가장 높은 발효구는 클로렐라 5% 혼합한 1번 발효구로 86.35±6.507%이었는데 비하여 40℃에서 발효된 7, 8, 9번 발효구 가운데 아질산염 소거능이 높은 발효구는 클로렐라 5% 혼합한 7번 발효구로 76.40±2.119%였다. 따라서 복분자와 클로렐라 혼합물의 발효온도에 의한 아질산염의 소거능은 L. plantarium의 경우 35℃가 40℃ 보다 효과적인 사실을 알 수 있었다. L. plantarium + Bacillus species(ewha)으로 35℃, 40℃에서 발효된 복분자와 클로렐라 혼합물의 아질산염 소거능은 35℃에서 발효된 4, 5, 6번 발효구와 40℃에서 발효된 10, 11, 12번 발효구 가운데 클로렐라를 5% 혼합한 4번과 10% 혼합한 11번이 높아는데 전자는 83.77±4.750%, 후자는 85.20±4.731%이었으며, 아질산염 소거능에 관한 발효온도의 효과는 40℃의 경우가 높았다.
pH 3.0, 4.2, 6.0에서의 아질산염 소거능은 35℃에서 발효된 1, 2, 3번 발효구 중 아질산염 소거능이 가장 높은 발효구는 클로렐라 5% 혼합한 1번 발효구로 각각 80.96±4.730, 51.11±31.298, 39.66±22.405%이었는데 비하여 40℃에서 발효된 7, 8, 9번 발효구 가운데 아질산염 소거능이 높은 발효구는 클로렐라 5% 혼합한 7번 발효구로 각각 47.14±7.683, 21.39±8.507, 24.25±8.361%였다. 따라서 복분자와 클로렐라 혼합물의 발효온도에 의한 아질산염의 소거능은 L. plantarium의 경우 35℃가 40℃ 보다 효과적인 사실을 알 수 있었다.
L. plantarium + Bacillus species(ewha)으로 35℃, 40℃에서 발효된 복분자와 클로렐라 혼합물의 pH 3.0, 4.2, 6.0에서의 아질산염 소거능은 35℃에서 발효된 4, 5, 6번 발효구와 40℃에서 발효된 10, 11, 12번 발효구 가운데 pH 3.0의 경우 클로렐라를 5% 혼합한 4번만 예외적으로 높았고 그 외에는 10% 혼합한 5, 11번이 높았으며, pH 4.2, 6.0에서는 모두 클로렐라를 10% 혼합한 5, 11번의 경우 아질산염소거능이 높음을 알 수 있었다. 아질산염 소거능에 관한 L. plantarium + Bacillus species(ewha) 혼합균의 발효온도 효과는 35℃의 경우가 높았다.
복분자 클로렐라 발효구들의 아질산염소거능 순서는 pH 1.2의 경우 1 > 11 > 4 > 2 > 5 > 10 > 7 > 8 > 9 > 12 > 3 > 6 발효구, pH 3.0의 경우 1 > 4 > 2 > 5 > 11 > 7 > 8 > 12 > 10 > 3 > 6 > 9 발효구, pH 4.2의 경우 1 > 5 > 4 > 2 > 7 > 7 > 3 > 8 > 11 > 9 > 10 > 12 발효구, pH 6.0의 경우 1 > 5 > 2 > 8 > 7 > 4 > 11 > 3 > 10 > 9 > 12 > 6 발효구로 복분자에 5% 클로렐라를 혼합하여 30℃에서 L. plantarium로 발효한 1번 발효구의 경우가 가장 우수 하였으나 그 외의 발효구들은 일정한 경향을 보이지 않았다.
따라서 L. plantarium과 L. plantarium + Bacillus species(ewha)의 아질산염 소거능의 수준은 pH 1.2의 반응조건에서 전자의 경우 30℃는 53.01～86.35%, 40℃는 58.46～76.46%, 후자의 경우 30℃는 46.10～83.77%, 40℃는 56.53～77.93% 범위, pH 3.0의 반응조건에서 전자의 경우 30℃는 35.26～80.96%, 40℃는 29.32～47.14%, 후자의 경우 30℃는 33.62～77.42%, 40℃는 40.35～58.99% 범위, pH 4.2의 반응조건에서 전자의 경우 30℃는 20.70～51.11%, 40℃는 18.08～21.39%, 후자의 경우 30℃는 22.87～37.70%, 40℃는 16.96～19.73% 범위, pH 6.0의 반응조건에서 전자의 경우 30℃는 20.02～39.66%, 40℃는 18.79～24.25%, 후자의 경우 30℃는 18.30～36.29%, 40℃는 18.58～21.18% 범위이었다. pH가 산성영역에서 중성영역에 가까워질수록 아질산염 소거능은 감소되는 경향을 보이고 있어 nitrite나 nitrate의 생성반응이 잘 일어나는 환경에서 아질산염의 소거반응이 활발하게 일어나고 있음을 시사하고 있다. 즉, pH 1.2, pH 3.0, pH4.2, pH 6.0으로 올라갈수록 아질산염 소거능은 감소됨을 알 수 있었다.
한편 복분자 농축액을 젖산균으로 발효시킨 경우 박과 장(15)은 pH 1.2에서 38.3%, pH 3.0에서 13.10%, pH 4.2에서 4.56, pH 6.0에서 1.34% 이었던 결과 보다 본 연구의 결과 pH 1.2에서 46.10～86.35%, pH 3.0에서 29.32～80.96%, pH 4.2에서 16.96～51.11%, pH 6.0에서 18.30～39.66%로 확인되어 발효제품들이 pH 1.2 와 3.0에서 아질산소거능이 우수하여 위에서의 음식물이 분해되는 과정에서 생성되어 암을 유발시킬 수 있는 nitrosoamine의 함량을 효과적으로 감소시킬 수 있을 것으로 판단되었다.
12) 관능검사
복분자와 클로렐라 혼함물(95:5, 90:10, 80:20)의 발효온도 및 균주를 달리하여 발효시킨 후의 발효구별 색, 향, 단맛, 신맛의 관능평가를 실시한 결과는 표 14와 같다.
복분자와 클로렐라 혼합물(95:5, 90:10, 80:20) 발효구의 발효제품의 색상에 관한 관능평가 결과 12번 발효구의 점수가 7.49±0.08로 가장 높았고, 2번 발효구의 점수가 6.87±0.35로 가장 낮았으며 발효구들 사이에 유의성이 인정되었다(p<0.05)).
복분자와 클로렐라 혼합물(95:5, 90:10, 80:20) 발효구의 발효제품의 향에 관한 관능평가 결과 10번 발효구의 점수가 6.52±0.18로 가장 높았고, 5번 발효구의 점수가 5.38±0.05로 가장 낮았으며 발효구들 사이에 유의성이 인정되었다(p<0.05)).
복분자와 클로렐라 혼합물(95:5, 90:10, 80:20) 발효구의 발효제품의 단맛에 관한 관능평가 결과 1번 발효구의 점수가 5.93±0.12로 가장 높았고, 3번 발효구의 점수가 5.08±0.08로 가장 낮았으며 발효구들 사이에 유의성이 인정되었다(p<0.05)).
복분자와 클로렐라 혼합물(95:5, 90:10, 80:20) 발효구의 발효제품의 신맛에 관한 관능평가 결과 12번 발효구의 점수가 8.48±0.06로 가장 높았고, 3번 발효구의 점수가 7.00±0.02로 가장 낮았으며 발효구들 사이에 유의성이 인정되었다(p<0.05)).
복분자와 클로렐라 혼합물(95:5, 90:10, 80:20)발효제품의 색, 향미, 단맛, 신맛 등을 종합하여 관능평가한 결과는 10번 발효구의 점수가 6.97±0.11로 가장높았고, 6번 발효구의 점수가 6.25±0.10로 가장 낮았으며 발효구들 사이에 유의성이 인정되었다(p<0.05)).
이상의 관능평가를 종합하면 40℃에서 L. plantarium과 L. plantarium + Bacillus species(ewha)로 발효된 각각의 복분자와 클로렐라 혼합(95:5, 90:10, 80:20)발효물 가운데 plantarium + Bacillus species(ewha)을 사용하여 발효시켜 제품화를 하는 것이 이상적일 것으로 판단되었다.
이상에서 설명한 바와 같은 본 발명에 따르는 실시예들을 종합하여 보면 복분자 또는 복분자쥬스에 클로렐라를 혼합한 혼합물을 발효시켜 된 발효물질의 각종 물성이 복분자만을 가공하여 되는 종래의 식품들에 대비하여 볼 때 영양, 맛 등에서 우수한 성질을 가지게 됨을 알 수 있어, 상기 실시예들의 결과로 복분자 또는 복분자 쥬스에 클로렐라를 적정비율로 혼합하여 발효시킨 발효물질을 가공하게 되면 새로운 기능성발효식품을 제조할 수 있게 되는 것이다.
도 1은 동결복분자 및 복분자쥬스와 클로렐라의 혼합비에 따른 수분함량 변화를 도시한 그래프.
도 2는 동결복분자 및 복분자쥬스와 클로렐라의 혼합비에 따른 수분함량 변화에 대한 젖산균과 고초균의 배양결과를 도시한 사진.
도 3a 내지 3j는 본 발명에 사용되는 젖산균의 클로렐라 첨가수준에 따른 젖산균의 산 생성량을 도시한 그래프.
도 4a 내지 4f는 본 발명에 사용되는 고초균의 클로렐라 첨가수준에 따른 젖산균의 산 생성량을 도시한 그래프.
도 5a 내지 5k는 본 발명의 일실시예에 따른 복분자에 클로렐라 첨가수준에 따른 선발균주의 산 생성량 변화를 도시한 그래프.
도 6a 내지 6f는 본 발명의 일실시예에 따른 복분자와 클로렐라 혼합물의 온도별 젖산생성량의 변화를 도시한 그래프.
도 7a 내지 7d는 본 발명의 일실시예에 따른 복분자와 클로렐라 혼합물의 pH별 젖산생성량의 변화를 도시한 그래프.
도 8a 내지 8e는 본 발명의 제품화 공정의 일실시예를 도시한 공정도.
도 9 및 10은 본 발명에 따라 제조된 기능성발효식품의 일실시형태를 도시한 사진.
Claims (13)
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- 복분자 95~50중량%와 클로렐라 5~50중량%를 혼합한 혼합물에 젖산균, 고초균 또는 고초균과 젖산균의 2종혼합균주인 발효미생물을 접종하여 온도 30~40℃의 조건에서 3 내지 7일간 발효시킨 후, 얻어진 발효원료를 제형화한 것으로,상기 발효원료의 제형화에 첨가제로 부형제, 점착제 및 붕해제로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 첨가하며,상기 젖산균은 락토바실러스 카제이, 락토바실러스 플란타리움, 락토바실러스 락티스, 락토바실러스 아시도필루스, 락토바실러스 브레비스, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 람노수스, 페디오코쿠스 펜토사세우스, 스트렙토코커스 테르모필루스, 비피도박테리움 부치네리, 비피도박테리움 인판티스, 비피도박테리움 롱움으로 이루어진 군에서 선택된 1 종 또는 2종 이상의 혼합균주이고,상기 고초균은 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리체니포미스, 바실러스 나토, 바실러스 시리우스, 바실러스 스피시즈(Chem) 및 바실러스 스피시즈(Ewha)로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 혼합균주이며,상기 고초균과 젖산균의 혼합균주는 락토바실러스 카제이와 바실러스 서브틸리스의 혼합균주, 락토바실러스 카제이와 바실러스 스피시즈(캠)의 혼합균주, 락토바실러스 카제이와 바실러스 스피시즈(이화)의 혼합균주, 락토바실러스 플란타리움과 바실러스 서브틸리스의 혼합균주, 락토바실러스 플란타리움과 바실러스 스피시즈(캠)의 혼합균주 또는 락토바실러스 플란타리움과 바실러스 스피시즈(이화)의 혼합균주로 이루어진 군에서 선택된 1종이며,상기 젖산균, 고초균 또는 고초균과 젖산균의 2종혼합균주인 발효미생물은 종배양하여 620㎚에서 측정한 흡광도(Abs.)가 1.0이 될 때까지 균을 증식시켜 증식된 균을 상기 혼합물에 접종하는 것으로, 그 접종량은 상기 혼합물 대비 2%(V/V)가 되도록 접종하는 것을 특징으로 하는 복분자와 클로렐라 혼합물을 이용한 기능성발효식품의 제조방법.
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- 복분자 95~50중량%와 클로렐라 5~50중량%를 혼합한 혼합물에 젖산균, 고초균 또는 고초균과 젖산균의 2종혼합균주인 발효미생물을 접종하여 온도 30~40℃의 조건에서 3 내지 7일간 발효시킨 후, 얻어진 발효원료를 제형화하며,상기 발효미생물이 2종 혼합균주이고, 각각의 균액을 1:1의 비율로 혼합하여 되는 혼합균주로 각각의 균액이 상기 혼합물 대비 1%(V/V)가 되도록 접종하는 것을 특징으로 하는 복분자와 클로렐라 혼합물을 이용한 기능성발효식품의 제조방법.
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