KR101884999B1 - 젖산균을 이용한 항산화 효능이 있는 황칠나무 발효물 제조방법 - Google Patents
젖산균을 이용한 항산화 효능이 있는 황칠나무 발효물 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 젖산균을 이용한 항산화 효능이 있는 황칠나무 발효물 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 황칠나무의 수피, 잎, 가지 및 줄기로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 재료의 열수추출물에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 접종하고 발효시키는 것을 특징으로 하는 황칠나무 발효물 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면 비발효물에 비해 항산화 효능이 우수하고 조단백질, 조지방, 조회분, 당류, 아미노산류, 젖산, 호박산, 말레산, 옥살산 및 구연산 함량이 높은 황칠나무 발효물을 제조할 수 있다. 본 발명의 황칠나무 발효물 제조방법은 옹기에서 발효숙성하는 방식보다 발효시간이 대폭 단축되고 수율이 향상되어 생산이 용이하다는 장점이 있다. 또한 본 발명의 황칠나무 발효물은 여러 가지 형태로 추가가공할 수 있어 다양한 용도로 사용될 수 있으며, 특히 음료의 제조에 이용할 경우 기능성 및 풍미가 매우 우수한 음료를 제공할 수 있다.
본 발명에 따르면 비발효물에 비해 항산화 효능이 우수하고 조단백질, 조지방, 조회분, 당류, 아미노산류, 젖산, 호박산, 말레산, 옥살산 및 구연산 함량이 높은 황칠나무 발효물을 제조할 수 있다. 본 발명의 황칠나무 발효물 제조방법은 옹기에서 발효숙성하는 방식보다 발효시간이 대폭 단축되고 수율이 향상되어 생산이 용이하다는 장점이 있다. 또한 본 발명의 황칠나무 발효물은 여러 가지 형태로 추가가공할 수 있어 다양한 용도로 사용될 수 있으며, 특히 음료의 제조에 이용할 경우 기능성 및 풍미가 매우 우수한 음료를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은 젖산균을 이용한 항산화 효능이 있는 황칠나무 발효물 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 황칠나무의 수피, 잎, 가지 및 줄기로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 재료의 열수추출물에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 접종하고 발효시키는 것을 특징으로 하는 황칠나무 발효물 제조방법에 관한 것이다.
황칠나무(Dendropanax morbifera Lev.)는 두릅나무과 나무로, 만병통치 나무라는 뜻의 학명 덴드로 파낙스(Dendropanax morbifera)를 가지고 있을 정도로 그 약리학적 효능이 매우 뛰어난 약용식물이다. 세계에서 오직 한국에서만 서식하며, 한국에서도 해남 완도 등의 남부지역과 제주도에서만 자생하며 겨울에도 낙엽이지지 않는 수종으로 매우 귀한 약용식물이다.
황칠나무 수피에 상처를 주면 황색의 수액이 나오는데, 이를 황칠이라 하며 안식향을 함유하여 예로부터 약리효과가 탁월한 나무로 주목받았다. 삼국시대로부터 황제의 갑옷, 투구, 기타 금속 장신구의 황금색을 발하는 천연도료로 이용되어 왔다.
최근의 연구 결과에 따르면 황칠나무 추출물은 피부 미백 활성, 항암 활성, 항염증 활성, 항산화 활성, 숙취 해소 기능, 진해 활성, 간세포 보호효과, 경조직 재생 촉진 효과, 고혈압, 중풍, 치매예방 등에 효과적인 것으로 밝혀졌다(박수아 등, 한국미생물 생명공학회지 41(4):407-415, 2013; 유해양, 동아대학교 박사 학위논문, 2012; 문창곤, 인제대학교 석사 학위 논문, 2007; 한국공개특허 제10-2014-0070470호; 한국등록특허 제10-1162699호; 한국등록특허 제10-1333007호; 한국등록특허 제10-0494482호; 한국등록특허 제10-0457970호).
이와 같이 황칠은 항산화 효과, 항고혈압 효과, 항암 효과, 간세포 보호효과 등 현대인의 질환의 예방, 치료, 개선에 효과적인 것으로 알려져 있다. 그러나 황칠은 그 단위 중량당 약리활성이 강력하지 못하여 황칠이 원래 가지고 있는 약리 효과보다 증강된 약리활성을 나타내도록 할 수 있는 황칠 가공방법의 개발이 필요하다.
박수아 등, "황칠나무 잎 추출물의 세포 항산화 활성과 미백활성 측정" 한국미생물 생명공학회지 41(4):407-415, 2013.
유해양, "황칠나무와 혈통령 추출물에 의한 항암 및 항염증 효과에 관한 연구" 동아대학교 박사 학위논문, 2012.
문창곤, "黃漆나무 추출물의 항산화 기능성에 관한 연구" 인제대학교 석사 학위 논문, 2007.
따라서 본 발명의 주된 목적은 황칠 본래의 약리활성을 증강 또는 개선할 수 있는 황칠의 가공방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 황칠의 가공방법을 이용한 황칠음료를 제공하는데 있다.
본 발명의 한 양태에 따르면, 본 발명은 황칠나무(Dendropanax morbifera)의 수피, 잎, 가지 및 줄기로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 재료의 열수추출물에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 접종하고 발효시키는 것을 특징으로 하는 황칠나무 발효물 제조방법을 제공한다.
본 발명의 황칠나무 발효물 제조방법에 있어서, 상기 열수추출물의 고형분 함량이 1 내지 2브릭스(Brix)인 것이 바람직하다.
본 발명의 황칠나무 발효물 제조방법에 있어서, 상기 접종은 상기 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 MRS 액체배지에서 35 내지 39℃, 100 내지 140rpm으로 4 내지 20시간 진탕배양하여 수득한 전배양액을 상기 열수추출물에 1 내지 4%(v/v)로 첨가하는 방법으로 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명의 황칠나무 발효물 제조방법에 있어서, 상기 발효는 35 내지 39℃, 100 내지 140rpm으로 12 내지 24시간 진탕배양하여 이루어지는 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 황칠나무 발효물을 여과한 여과액을 포함하는 황칠나무 발효음료를 제공한다.
본 발명에 따르면 비발효물에 비해 항산화 효능이 우수하고 조단백질, 조지방, 조회분, 당류, 아미노산류, 젖산, 호박산, 말레산, 옥살산 및 구연산 함량이 높은 황칠나무 발효물을 제조할 수 있다. 본 발명의 황칠나무 발효물 제조방법은 옹기에서 발효숙성하는 방식보다 발효시간이 대폭 단축되고 수율이 향상되어 생산이 용이하다는 장점이 있다. 또한 본 발명의 황칠나무 발효물은 여러 가지 형태로 추가가공할 수 있어 다양한 용도로 사용될 수 있으며, 특히 음료의 제조에 이용할 경우 기능성 및 풍미가 매우 우수한 음료를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시형태에 따른 황칠나무 발효물 제조방법을 개략적으로 나타낸 순서도이다.
도 2는 본 발명에서 황칠 발효 미생물을 선정하기 위해 실험한 후보 미생물의 생장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에서 황칠 발효 미생물을 선정하기 위해 실험한 후보 미생물의 배양에 따른 pH 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에서 황칠 발효 미생물을 선정하기 위해 실험한 후보 미생물의 단독 또는 조합에 따른 생장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에서 황칠 발효 미생물을 선정하기 위해 실험한 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)의 현미경 사진이다.
도 6은 본 발명에서 황칠 발효 미생물을 선정하기 위해 실험한 후보 미생물의 단독 또는 조합 배양에 따른 pH 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에서 황칠 발효공정 최적화를 위해 실험한 황칠나무 열수추출액에 과당의 첨가량에 따른 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)의 생장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에서 황칠 발효 미생물을 선정하기 위해 실험한 후보 미생물의 생장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명에서 황칠 발효 미생물을 선정하기 위해 실험한 후보 미생물의 배양에 따른 pH 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명에서 황칠 발효 미생물을 선정하기 위해 실험한 후보 미생물의 단독 또는 조합에 따른 생장곡선을 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명에서 황칠 발효 미생물을 선정하기 위해 실험한 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)의 현미경 사진이다.
도 6은 본 발명에서 황칠 발효 미생물을 선정하기 위해 실험한 후보 미생물의 단독 또는 조합 배양에 따른 pH 변화를 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에서 황칠 발효공정 최적화를 위해 실험한 황칠나무 열수추출액에 과당의 첨가량에 따른 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)의 생장곡선을 나타낸 그래프이다.
본 발명의 황칠나무 발효물 제조방법은 황칠나무(Dendropanax morbifera)의 수피, 잎, 가지 및 줄기로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 재료의 열수추출물에 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 접종하고 발효시키는 것을 특징으로 한다.
상기 열수추출물은 황칠나무 재료에 물을 가하고 가열하여 추출하는 방법으로 수득할 수 있다. 이때 황칠나무 재료는 건조시켜 파쇄 또는 분쇄한 것을 사용하는 것이 바람직하며, 물의 양은 황칠나무 재료의 5 내지 20배 중량을 사용하는 것이 바람직하다. 가열추출은 50 내지 100℃로 5 내지 20시간 동안 이루어지는 것이 황칠나무로부터 유용성분을 충분히 추출하기 위해 바람직하다. 열수추출 후 여과하여 건더기를 제거한 다음 농축과정을 거치는 것이 바람직하다. 농축은 고형물의 함량이 1 내지 2브릭스(Brix)가 되도록 하는 것이 효율적인 발효를 위해 바람직하다.
상기 열수추출물은 발효과정에 발생할 수 있는 잡균의 증식으로 인한 잘못된 발효를 방지하기 위하여 젖산균을 접종하기 전에 멸균하는 과정을 거치는 것이 바람직하다. 이때 멸균은 미세공 필터를 사용한 여과방법, 고온고압 가열 방법 등 통상적인 액체의 멸균방법을 사용할 수 있다.
상기 접종은 상기 젖산균의 액체배양액을 상기 열수추출물에 첨가하는 방법으로 이루어질 수 있다. 이때 젖산균의 액체배양액은 젖산균이 생장할 수 있는 액체배지에 각 젖산균을 접종하여 배양하는 방법으로 수득할 수 있으나, 바람직하게는 MRS 액체배지에서 35 내지 39℃, 100 내지 140rpm으로 4 내지 20시간 진탕배양하는 방법을 사용하는 것이 좋다. 보다 바람직하게는 9 내지 15시간 진탕배양하는 것이 좋으며 이에 따르면 황칠나무 열수추출물의 발효효율을 높일 수 있다. 젖산균의 액체배양액은 상기 열수추출물에 1 내지 4%(v/v)로 첨가하는 것이 황칠나무 열수추출물의 발효효율을 높이기 위해 바람직하다. 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 각각 별도로 배양하여 각각의 배양액을 황칠나무 열수추출물에 첨가할 수 있으나, 본 발명에 따르면 두 균주를 함께 배양하더라도 서로의 생장에 악영향을 미치지 않으므로 하나의 액체배지에 두 균주를 함께 배양하고 수득한 배양액을 사용할 수도 있다. 두 균주를 별도로 배양한 배양액을 이용할 경우 각각 0.5 내지 1.5%(v/v)로 첨가하는 것이 바람직하며, 두 균주를 함께 배양한 배양액을 이용할 경우 1.5 내지 2.5%(v/v)로 첨가하는 것이 바람직하다.
상기 발효는 상기 젖산균이 접종된 열수추출물을 젖산균의 생장 및 발효가 가능한 온도를 적절한 시간동안 유지하는 방법으로 이루어질 수 있다. 바람직하게는 35 내지 39℃, 100 내지 140rpm으로 12 내지 24시간 진탕배양하는 것이 좋다. 이에 따르면 보다 효율적인 발효가 이루어지도록 할 수 있다.
보다 효율적인 발효를 위해 상기 황칠나무 열수추출물에 당과 질소원을 첨가하고 젖산균을 접종하여 발효하는 것이 바람직하다. 당은 과당과 같은 상기 젖산균이 탄소원으로 이용할 수 있는 것을 사용할 수 있으며, 질소원은 효모추출물(yeast extract)와 같은 상기 젖산균이 질소원으로 이용할 수 있는 것을 사용할 수 있다. 과당은 상기 열수추출물에 0.5 내지 1.5%(v/v)로 첨가하는 것이 효율적인 발효를 위해 바람직하며, 효모추출물은 0.05 내지 0.2%(w/v)로 첨가하는 것이 효율적인 발효를 위해 바람직하다.
상기와 같은 발효과정을 통해 항산화 효능이 우수하고 조단백질, 조지방, 조회분, 당류, 아미노산류, 젖산, 호박산, 말레산, 옥살산 및 구연산 함량이 높은 황칠나무 발효물을 제조할 수 있다. 본 발명에 따르면 비발효물에 비해서 총 폴리페놀과 총 플라보노이드 함량이 발효에 의하여 약간 줄어듬에도 불구하고 우수한 항산화능을 나타내는데, 이는 황칠나무가 함유하고 있는 여러 가지 생리활성 물질들이 발효로 인하여 항산화 효과를 나타내는 새로운 생리활성 물질로 전환되었기 때문이라 생각된다.
상기와 같은 제조방법을 통해 수득한 황칠나무 발효물은 추가 가공과정을 거쳐 여러 가지 형태로 제조하여 다양한 분야에 이용할 수 있다. 예를 들어 여과과정을 거쳐 여과액을 수득하여 이용하거나 건조분말화 과정을 거쳐 분말화하여 이용할 수 있다.
본 발명의 황칠나무 발효물은 우수한 항산화 효능을 바탕으로 의약품, 기능성식품 또는 기능성화장품의 제조에 이용될 수 있다.
특히 본 발명의 황칠나무 발효물을 이용하여 음료를 제조하면 항산화 효과 등 기능성이 우수하며 풍미가 우수한 음료를 제조할 수 있다. 이러한 음료는 통상의 음료에 본 발명의 황칠나무 발효물을 첨가하는 방법으로 제조할 수 있으며, 황칠나무 발효물을 여과하여 수득한 여과액 자체가 음료가 될 수도 있다. 바람직하게는 황칠나무 발효물을 여과하여 수득한 여과액에 감로차 착즙액을 0.5 내지 2%(v/v)로 첨가하여 음료로 제조하는 것이 바람직하다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1. 황칠 발효 미생물 및 발효방법 선정
1-1. 황칠 발효에 적합한 최적 미생물 선별
황칠의 발효에 적합한 미생물을 선별하기 위해 식품에 이용되는 미생물 및 식물유래 미생물 중 유산균류, 그리고 다양한 효소를 생산하는 것으로 알려진 청국장과 김치에서 분리한 Bacillus sp., Lactobacillus sp., Saccharomyces sp.에 주목하여 선정하였다. 발효 미생물의 선정은 제품의 품질 뿐만 아니라 안전성과 사후 인증과정의 용이성을 위해서도 매우 중요하다.
본 실시예에서는 표 1과 같은 (재)인천경제산업정보테크노파크 연구진이 보유하고 있는 미생물을 이용하였으며, 이들 미생물은 미생물 자원 기탁 및 분양 기관 등으로부터도 쉽게 입수할 수 있다.
| 균주 | 분리원 |
| Lactobacillus plantarum | 김치 |
| L. brevis | 김치 |
| L. sakei | 김치 |
| L. casei | 김치 |
| Leuconostoc mesenteroides | 김치 |
| Bacillus subtilis | 청국장 |
1-2. 배양조건 확립
상기 표 1의 6가지 미생물의 배양조건을 탐색하기 위하여 온도별로 각 미생물의 성장속도를 측정하여 배양조건을 설정하였다.
1-2-1. 미생물의 성장속도 측정
MRS 배지(protease peptone, beef extract, yeast extract, polysorbate 80, ammonium citrate, sodium acetate, mangesium sulfate, manganese sulfate, dipotassium phosphate, glucose) 20㎖에 표 1의 미생물 중 Lactobacillus 속 균주 및 Leuconostoc mesenteroides를 각각 접종하여 37℃에서 15시간 동안 120rpm 조건으로 진탕배양기에서 전배양하였다. Bacillus subtilis는 MRS 배지 대신 NB 배지를 이용하였다.
새로운 MRS 배지 100㎖에 상기 전배양액을 이용하여 초기 세포 농도 0.02 ~ 0.05(OD600)로 미생물을 접종하고, 37℃에서 120rpm 조건으로 세포배양기에서 배양하면서 1시간마다 OD600에서 세포 농도를 측정하여 성장속도를 측정하였다.
미생물의 성장속도는 시간의 변화에 따른 균체의 농도 변화량을 측정하여 세포의 성장속도를 판단하는 지표로 사용하였다.
이의 결과, 도 2에서와 같이 모든 균주가 접종 후 4시간부터 대수증식기가 시작하여 접종 후 9시간 후에 대수증식기가 종료되는 것으로 나타났다. 이 결과를 바탕으로 황칠추출물을 발효시키기 위하여 첨가되는 스타터(starter)는 대수증식기가 종료되는 시점, 즉 OD600에서 흡광도가 ~ 2.0인 배양액을 사용하여 황칠추출액에 약 2%(v/v)가 되도록 첨가하는 것이 좋을 것이라 판단하였다.
또한 L. brevis 균주가 가장 빠른 성장을 나타냈으며, B. subtilis 균주의 성장이 상대적으로 느리게 나타났다.
1-2-2. 미생물 배양에 따른 pH 변화
미생물, 특히 식물유산균은 일반적으로 배양과정에서 젖산과 CO2를 생성하여 배지를 산성화 및 혐기상태로 유지하게 되며, 장내 이상발효의 개선, 장내 부패세균의 억제, 항암, 항균, 면역증강, 혈중 콜레스테롤 저하능 등에 효능이 있다고 보도되고 있다.
발효 배양액의 pH는 영양분, 성장인자 등의 세포막 이동속도에 영향을 미치며, 외부의 pH가 변하면 영양물질 분자의 이온화 경향이 달라져 물질 흡수 능력에 차이를 보이기 때문에 미생물의 성장과 생산에 중요한 역할을 한다.
이에 미생물 성장에 따른 배양액의 pH 변화를 살펴보았다.
이의 결과, 도 3에서와 같이 상용 MRS 배지의 경우 Lactobacillus 속 균주와 L. mesenteroides는 초기 pH 5.5 ~ 6.0으로 비슷하였고, 발효가 진행될수록 pH가 낮아지는 경향을 보였다. 발효 9시간 이후부터는 pH가 더 이상 감소하지 않았다. B. subtilis는 초기 pH 7로 발효가 진행되어도 pH 7에서 크게 변하지 않고 일정한 경향을 나타내었다.
이 결과를 바탕으로 B. subtilis 보다 Lactobacillus 속 균주가 황칠 발효에 좋을 것으로 판단하였다.
1-3. 유산균의 혼합배양에 따른 MRS 배지의 유산발효
1-3-1. 혼합발효 실험을 위한 유산균 선정
유산발효 시 스타터로 사용되는 유산균을 단독으로 사용하는 것보다 2종류 이상의 균주를 혼합배양함으로써 발효능과 기호성을 높일 수 있을 것으로 기대하여 여러 식물성 유산균들 중에서 MRS 배지 발효능이 우수한 3종류의 유산균, 즉 간균으로서 L. plantarum, L. sakei를, 구균으로서 L. brevis를 선정하여 혼합 스타터를 사용한 후 이에 따른 발효능을 조사하였다.
1-3-2. 유산균의 생육곡선
혼합배양에 사용하기 위하여 선정한 3종류의 식물성 유산균, 즉 L. plantarum, L. brevis, L. sakei 각각의 균주를 2가지씩 혼합하여 혼합균주로 MRS 배지에 접종하여 배양하면서 균의 생육을 경시적으로 검토하였다.
이의 결과, 도 4에서와 같이 사용한 유산균들 중에서 혼합균주들은 접종 후 3시간부터 대수증식기가 시작되어 10시간 후에 종료되었다. 대수증식기가 종료되는 시점에서의 600nm에서의 흡광도는 약 2.10이며, L. plantarum + L. brevis 혼합균주가 L. plantarum + L. sakei 혼합균주보다 높은 흡광도를 나타내었다. 이 결과로부터 향후 황칠 열수추출물을 발효시키기 위하여 첨가하는 스타터로는 L. plantarum + L. brevis 혼합균주를 이용하는 것이 좋을 것이라 판단하였고, 대수증식기가 종료되는 시점 즉, 흡광도가 약 2.10인 배양액을 사용하여 황칠 열수추출물에 약 2%(v/v)가 되도록 첨가하는 것이 좋을 것으로 판단하였다.
1-3-3. pH 변화
MRS 배지에 L. plantarum, L. brevis, L. sakei 균주를 각각 1%(v/v) 접종하여 L. plantarum + L. brevis 및 L. plantarum + L. sakei 유산균이 1:1로 접종된 혼합 스타터로 사용하여 2균주 혼합발효에 의한 pH 변화를 조사하였다. 2균주의 혼합균주를 사용하여 10시간 발효시켰을 경우 도 6에서와 같이 L. plantarum과 L. brevis가 1:1로 혼합된 스타터가 pH 3.88으로 가장 낮은 값을 나타내었다.
이 결과로부터 향후 황칠 열수추출물을 발효시키기 위하여 첨가하는 스타터로는 L. plantarum과 L. brevis 혼합균주를 이용하는 것이 좋을 것이라 판단하였다.
실시예 2. 황칠나무 발효액 제조 및 평가
2-1. 황칠나무 발효액 제조
2-1-1. 황칠의 전처리
추출원료로 사용할 황칠나무 잎과 줄기를 세척하고, 수분함량 10% 내외로 건조한 후 줄기는 1 ~ 2mm, 잎은 2 ~ 3cm로 파쇄, 절단하여 분쇄물을 얻었다.
2-1-2. 황칠 열수추출액의 제조
분쇄한 황칠나무 잎과 줄기에 10배 중량의 물을 가하여 90 ~ 95℃에서 10시간 환류추출한 후, 여과, 감압농축(60℃ 이하)하여 고형물 함량이 1 또는 2브릭스(Brix)가 되도록 조절한 후, 121℃에서 15분간 살균하였다.
2-1-3. 액체발효 미생물의 전 배양
Bacillus subtilis는 NA 배지에 형성된 단일 colony를 NB 배지에 접종하고 37℃, 120rpm으로 15시간 배양하였으며, Lactobacillus 속 균주들 및 Leuconostoc mesenteroides는 MRS 고체배지에 형성된 단일 colony를 MRS 액체배지에 접종하고 37℃, 120rpm으로 15시간 배양하였다.
2-1-4. 미생물 접종 및 액체 배양
상기 2-1-2에서 수득한 황칠 열수추출액에 상기 2-1-3의 각 균주 배양액을 1%(v/v)로 접종한 후, 37℃, 120rpm에서 12시간 또는 24시간 진탕배양하였다.
2-1-5. 당 첨가 효과 시험
상기 2-1-4와 같은 방법을 사용하되, 상기 2-1-2에서 수득한 1 또는 2브릭스의 황칠 열수추출액에 과당을 0, 1, 3 또는 5%(v/v)로 첨가하여 121℃에서 15분간 살균한 후, 상기 2-1-3에서 15시간 전 배양한 각 균주 배양액을 접종 및 진탕배양하였다.
2-1-6. 효모 첨가 효과 시험
상기 2-1-4와 같은 방법을 사용하되, 상기 2-1-2에서 수득한 1 또는 2브릭스의 황칠 열수추출액에 효모추출물(yeast extract)을 0 ~ 0.5%(w/v)로 첨가하여 121℃에서 15분간 살균한 후, 상기 2-1-3에서 15시간 전 배양한 각 균주 배양액을 접종 및 진탕배양하였다.
2-1-7. 발효액 수득
상기 2-1-4, 2-1-5 및 2-1-6을 통해 발효가 완료된 발효물을 100 ~ 121℃, 15 ~ 20분간 멸균한 다음 여과하여 최종 발효액을 수득하였다.
2-2. 평가
2-2-1. 황칠 열수추출액의 균 증식능
기존에 황칠 추출액은 항균활성이 있는 것으로 알려져 있었기 때문에 발효균주를 선정하기 위하여 황칠 열수추출액에서 6가지 균주의 생육정도를 조사하였다.
고형물 함량이 1브릭스인 황칠 열수추출액에 각 균주의 전배양액을 1%(v/v)로 접종한 후 배양하여 고체배지에서 형성되는 colony 수를 조사하였다. 이때 대조구는 황칠 열수추출액 대신 전배양에 사용한 배지를 사용한 것으로 하였다.
대조구와 비교하여 생육정도를 +(생육 미흡), ++(생육 보통), +++(생육 우수)로 표시하여 표 2에 나타내었다.
| 균주 | 생육정도 |
| Lactobacillus plantarum | ++ |
| L. brevis | +++ |
| L. sakei | +++ |
| L. casei | ++ |
| Leuconostoc mesenteroides | ++ |
| Bacillus subtilis | + |
표 2에서와 같이 Bacillus subtilis는 1브릭스 농도에서 상대적으로 생육이 미흡하였고, 5개 균주는 1브릭스 농도에서 생육이 양호하였다.
2-2-2. 황칠 열수추출액에 발효 미생물 혼합단계
황칠 발효에 필요한 탄소원(과당) 1%(v/v), 질소원(효모추출물) 0.1%(w/v)를 추가하고 발효 미생물인 상기 6가지 균주를 액체발효 전 배양으로 배양조에서 배양한 후, 본 배양조에 두 종의 미생물 전배양액 1%(v/v)를 각각 접종하여 액체발효가 잘 이루어질수 있도록 고루 잘 교반하였다.
상기 6가지 균주를 단독으로 사용할 수도 있지만, 2종류 이상의 균주를 동시에 사용하여 발효할 경우 균주들 간의 상호작용을 통해 발효능과 기호성을 높일 수 있을 것으로 기대하여 5종류의 젖산균 중 가능한 모든 조합으로 2가지 균주를 혼합하여 스타터로 사용한 후 발효능을 조사하였다.
이의 결과, L. plantarum, L. brevis를 혼합한 스타터가 가장 우수한 발효능을 나타내었다.
2-2-3. 발효조의 내부온도 25 ∼ 45℃에서 유용물질이 생성되도록 발효하는 단계
미생물의 생물반응의 적합한 온도범위는 25 내지 45℃ 정도이며, 발효조의 표준은 살균된 연속교반식 생물반응기를 지칭한다. 생물반응기(bioreactor)는 반응이 끝난 다음 급속멸균 단계가 따른다. 발효기는 온도가 자동으로 조절되는 인큐베이트와 동일한 조건으로 발효미생물인 상기 6가지 미생물이 원활한 발효작업을 할 수 있는 조건을 제공한다. 본 발명에서 실시되는 발효는 발효조 온도와 황칠나무의 상태에 따라서 발효가 12시간에서 24시간 사이에 이루어진다.
2-2-4. 황칠나무 발효물의 제조
발효된 발효산물은 급속멸균장치(Outoclave)를 이용하여 발효미생물을 멸균한다. 발효가 완료된 액상 발효산물은 부유물질과 미생물이 있기 때문에 규조토 여과기를 이용하여 불순물을 거의 여과시켜 투명한 수용성 물질의 상태를 유지하는 것이 좋다.
2-2-5. 황칠의 복합 유산균 발효를 위한 발효공정 최적화
삼각플라스크 배양에서 황칠 열수추출물의 복합 유산균 발효를 위한 발효 공정 최적화를 시도하였다.
L. plantarum과 L. brevis를 사용하였으며, MRS 액체 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 전배양액을 황칠 열수추출액에 각각 1%(v/v)가 되도록 총 2%(v/v)가 되도록 혼합하여 37℃에서 24시간, 48시간, 72시간의 조건으로 발효시켰다. 시간별로 발효액을 여과한 후 4℃ 이하로 보관하면서 실험에 사용하였다.
최적 황칠 원료비를 도출하기 위하여 황칠 열수추출물을 200㎖로 고정시키고 과당의 함량을 달리하여 멸균시킨 배지를 제조한 후 종균 2종을 유산균 전용 배지인 Difco MRS 배지에서 각각 37℃ 15시간 배양한 후 L. plantarum과 L. brevis를 각각 황칠원료의 1%(v/v)로 접종하여 37℃ 120rpm에서 5일간 배양하면서 배양액의 탁도를 흡광도법(A600nm)으로 측정하였다.
이의 결과, 도 7에서와 같이 1일 이내에서는 1 ~ 5%(v/v)까지는 과당 함량이 증가될수록 균체생육도 증가하는 양상이었으나, 1일 이후에서는 오히려 균체 생육속도가 느려지는 양상을 나타내었다.
특히 과당 함량이 1%인 경우 배양 2일 이후 5일까지 거의 최고 흡광도값에 도달하였고, 더 이상의 황칠과 과당 원료가 공급되더라도 균체생육에는 크게 영향을 미치지 못하는 것으로 나타나 최적 원료 첨가비를 황칠 기준 과당 1%(v/v)로 결정하였다.
최적 원료 첨가량을 결정하기 위하여 황칠 열수추출물에 과당 함량을 달리 하여 첨가하고, 복합 유산균 접종비를 총 2%(v/v) 범위에서 접종한 후 5일 배양하여 균체 건조중량을 측정한 결과, 과당 2% 이상 총 5%(v/v)를 첨가한 경우까지는 균체생육증가가 거의 유사한 양상이 관찰되었으며 오히려 1% 첨가한 것보다 균체량이 낮아, 과당은 1%로 첨가하기로 결정하였다.
2-2-6. 황칠 발효물의 항산화 실험
황칠 열수추출액(1 ~ 2브릭스), 그리고 황칠 열수추출액과 탄소원 1%(v/v), 질소원 0.1%(w/v)가 추가된 혼합액에 각각 L. plantarum 및 L. brevis 2개 균주 전배양액을 각각 1%(v/v)씩 접종하여 37℃, 12시간 및 24시간 진탕배양한 후 여과, 농축, 동결건조한 시료를 사용하였다.
프리라디칼(Free radical) 소거활성으로 측정하였으며 1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl(DPPH) 라디칼에 대한 전자공여효과에 의해 나타나는 시료의 환원력으로 측정하였다. 농도별 시료 1㎖에 500μM DPPH 용액 1㎖를 첨가해 교반한 후, 37℃ 암소에서 30분간 반응시켰다. 반응용액은 517nm에서 흡광도를 측정하여, 다음과 같은 radical scavenging activity를 계산하고 표 3에 나타내었다.
Free radical scavenging activity (%) = (1-A/B) x 100
A : 시료첨가 흡광도, B : 시료무첨가 흡광도
| 발효기질 |
발효대사체의 농도(㎍/㎖) |
DPPH 소거능(%) |
| L. plantarum + L. brevis | ||
| 황칠 열수추출물 |
0 | 0.20 |
| 50 | 24.02 | |
| 100 | 59.75 | |
| 200 | 68.78 | |
| 400 | 79.11 | |
| 600 | 86.39 | |
| 1000 | 91.25 | |
| 황칠 열수추출물 + 과당 1% + 효모 0.1% |
0 | 0.20 |
| 50 | 26.31 | |
| 100 | 66.39 | |
| 200 | 76.42 | |
| 400 | 87.90 | |
| 600 | 94.94 | |
| 1000 | 100.7 |
황칠 열수추출물, 과당, 효모추출물을 발효기질로 한 발효 대사체가 황칠 열수추출물에 비하여 DPPH 소거활성이 높았다.
2-2-7. 총 플라보노이드 함량 측정
충남대학교 농업과학연구소에 의뢰하여, 황칠 자연발효(50일 발효숙성) 추출물, 황칠 열수추출물, 및 황칠 열수추출물, 과당, 효모 혼합 발효액(L. plantarum + L. brevis로 발효한 발효액)(황칠 발효추출물) 각각에 대해 플라보노이드 함량을 측정하였다.
총 플라보노이드 함량은 Jia(1999)의 방법을 응용하여 측정하였다. 각 시료 0.5㎖를 소듐 나이트라이트 용액 75㎕와 혼합하여 5분간 반응시키고 알루미늄 클로라이드 용액 150㎕를 첨가하여 다시 5분간 반응시킨 후 1M NaOH 0.5㎖와 섞어 510nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 플라보노이드 함량은 카테킨을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 구하였다.
이의 결과, 얻어진 각 시료에서의 총 플라보노이드 함량을 표 4에 나타내었다.
| 시료 | 총 플라보노이드 함량(㎎/㎏) |
| 황칠 열수추출물 | 121.32 |
| 황칠 자연발효(50일 발효숙성)추출물 | 0.44 |
| 황칠 발효추출물 | 35.80 |
2-2-8. 총 폴리페놀 함량 측정
충남대학교 농업과학연구소에 의뢰하여, 황칠 자연발효 추출물, 황칠 열수추출물, 및 황칠 열수추출물, 과당, 효모 혼합 발효액(L. plantarum + L. brevis로 발효한 발효액)(황칠 발효추출물) 각각에 대해 폴리페놀 함량을 측정하였다.
페놀성 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로서 다양한 구조와 분자량을 갖는다. 이들은 페놀 히드록실기(OH)를 갖기 때문에 단백질 및 기타 거대분자들과 쉽게 결합하여, 항산화, 항암 등의 다양한 생리활성을 나타낼 수 있다. 총 폴리페놀 함량은 시료 0.5㎖에 2N 폴린(folin) 시약 0.5㎖을 가하고 3분간 정치한 후 10% Na2CO3 0.5㎖를 가하여 1시간 반응 후 700nm에서 흡광도를 측정하였고, 비타민 C를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 총 폴리페놀의 함량을 구하였다. 이의 결과, 얻어진 각 시료에서의 총 페놀 함량을 표 5에 나타내었다.
| 시료 | 총 폴리페놀 함량(㎎/㎏) |
| 황칠열수 추출물 | 562.44 |
| 황칠 자연발효(50일 발효숙성) 추출물 | 640.35 |
| 황칠 발효추출물 | 508.39 |
상기 표 4와 5의 결과는 황칠을 발효시킬 경우 총 플라보노이드와 총 폴리페놀 함량이 감소함을 보여준다. 그럼에도 불구하고 표 3과 같이 황칠을 발효시킬 경우 높은 라디컬 소거능을 나타내고 있는데, 이는 황칠이 함유하고 있는 여러 가지 생리활성 물질들이 복합미생물 발효로 인하여 항산화 효과를 나타내는 새로운 생리활성 물질로 변화한 것으로 사료된다.
2-2-9. 성분 분석
충남대학교 농업과학연구소에 의뢰하여, 제조한 황칠 열수추출물과 황칠 미생물 발효추출물(L. plantarum + L. brevis로 발효한 발효액)(황칠 발효추출물)의 성분 분석을 실시하였다. 조단백질, 조지방, 조회분, 당류를 분석 성분으로 하였다.
| 시료 | 조단백질(%) | 조지방(%) | 조회분(%) | 당류(%) |
| 황칠열수 추출물 | 0.29 | 0.02 | 0.05 | 불검출 |
| 황칠 발효추출물 | 0.35 | 0.03 | 0.17 | 0.44 |
이의 결과, 표 6에서와 같이 황칠 미생물 발효추출물은 황칠 열수추출물에 비해 모든 성분함량에서 유사하거나 좋은 것으로 나타났다. 이는 본 발명의 황칠 발효 방법이 미생물에 의한 황칠의 유용성분 증가 효과를 나타낸다는 것을 보여준다.
2-2-10. 황칠 추출물의 아미노산 성분 분석
황칠 열수추출물과 황칠 미생물 발효추출물(L. plantarum + L. brevis로 발효한 발효액)(황칠 발효추출물)의 아미노산 성분 함량을 분석하였다. 아미노산 성분을 공인분석기관인 충남대학교 농업과학연구소에 의뢰하여 분석하였으며, 아미노산 분석은 아미노산 자동분석기(L-8800 Amino acid auto analyzer, Hitachi, Japan)로 분석하였다. 공시계통의 각 아미노산 함량은 표준용액(Amino acid calibration mixture, Ajinomoto-Takara Co., Japan)을 비교하여 계산하였다.
이의 결과는 표 7과 같다.
| Amino acids | 황칠 열수추출물 (mg/kg) |
황칠 발효추출물 (mg/kg) |
| Phosphoserine | 0 | 0 |
| Taurine | 0 | 0 |
| Phospho ethanol amine | 0 | 0 |
| Urea | 0 | 0 |
| Aspartic acid | 0 | 10.17 |
| Threonine | 0 | 12.47 |
| Serine | 0 | 12.20 |
| Glutamic acid | 0 | 33.68 |
| Sarcosine | 0 | 0 |
| α-amino adipic acid | 0 | 0 |
| Hyroxy proline | 0 | 0 |
| Proline | 0 | 9.22 |
| Glycine | 0 | 17.72 |
| Alanine | 0 | 33.63 |
| Citrulline | 0 | 3.72 |
| α-amino-n-butylic acid | 0 | 0 |
| Valine | 0 | 26.85 |
| Cystine | 0 | 0 |
| Methionine | 0 | 2.45 |
| Cystathionine | 0 | 0.97 |
| Isoleucine | 0 | 19.20 |
| Leucine | 0 | 31.42 |
| Tyrosine | 0 | 1.81 |
| Phenylalanine | 0 | 8.47 |
| β-Alanine | 0 | 0 |
| β-Amino isobutyric acid | 0 | 0 |
| γ-Amino-n-butyric acid | 0 | 0.82 |
| Ethanol amine | 0 | 0 |
| Tryptophan | 0 | 0 |
| Ammonia | 0 | 3.20 |
| Hydroxylysine | 0 | 0 |
| Ornithine | 0 | 13.33 |
| Lysine | 0 | 15.28 |
| 1-Methylhistidine | 0 | 0 |
| Histidine | 0 | 3.53 |
| 3-Methylhistidine | 0 | 0 |
| Anserine | 0 | 0 |
| Carnosine | 0 | 0 |
| Arginine | 0 | 0 |
표 7에서와 같이, 본 발명에 따른 황칠 발효추출물은 종래 황칠 열수추출물보다 아미노산 함량이 수배 내지 수십 배 증가된 것을 알 수 있다. 황칠 발효추출물의 각 아미노산 함량이 황칠 열수추출물에 비하여 크게 증가하였음을 보여준다.
2-2-11. 유기산 및 유리당 함량
공인분석기관인 충남대학교 농업과학연구소에 의뢰하여, 황칠 열수추출물과 황칠 발효추출물(L. plantarum + L. brevis로 발효한 발효액)의 유기산 함량 및 유리당 함량을 분석하였다.
이의 결과, 표 8에서와 같이 유기산의 경우 젖산(lactic acid), 호박산(succinic acid), 사과산(malic acid), 옥살산(oxalic acid), 구연산(citric acid)이 검출되었으며, 발효가 진행되면서 호박산(succinic acid), 과산(malic acid) 및 구연산(citric acid) 함량은 증가하는 경향을 보였다. 특히 황칠 발효추출물에는 젖산(actic acid) 함량이 크게 증가함을 알 수 있다. 유기산은 황칠 발효액의 산미와 지미를 형성할 뿐만 아니라 기능성이 있는 것으로 보고된 바 있다.
또한 표 9에서와 같이 유리당의 경우 글루코스(glucose) 및 과당(fructose)이 검출되었으며, 과당(fructose)은 황칠 열수추출물 0.28%에서, 황칠 자연발효 후 0.52%와 황칠 미생물발효 후 1.11%로 나타나 발효 전보다 증가하는 것으로 나타났다.
| 단위(mg/kg) | 젖산 | 호박산 | 사과산 | 옥살산 | 구연산 |
| 황칠열수 추출물 | 31.17 | 불검출 | 8.75 | 불검출 | 3.68 |
| 황칠 발효추출물 | 2,573.11 | 4.41 | 27.37 | 불검출 | 6.62 |
| 단위(%) | 글루코스 | 슈크로스 | 락토오스 | 말토오스 | 프락토오스 |
| 황칠열수 추출물 | 0.14 | 불검출 | 불검출 | 불검출 | 0.28 |
| 황칠 자연발효 | 0.23 | 불검출 | 불검출 | 불검출 | 0.52 |
| 황칠 발효추출물 | 불검출 | 불검출 | 불검출 | 불검출 | 1.11 |
실시예 3. 황칠 발효음료 제조
황칠 발효액을 이용하여 질감 및 생리활성을 증가시키는 방법과 이를 이용한 황칠 발효음료를 제조함으로써 산업적으로 이용가능성을 확인하였다.
상기 실시예 2의 황칠 발효액에 감로차 착즙액을 첨가하여 황칠 발효음료를 제조하였다. 통상의 건강 음료 제조방법에 따라 황칠 발효액 99%(v/v) 및 감로차 착즙액 1%(v/v)를 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 담고, 밀봉 멸균하였다.
상기 황칠 발효액과 감로차 추출물의 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 사용용도 등 지역적 기호도에 따라서 그 배합비를 임으로 변형 실시할 수 있을 것이다.
Claims (5)
- 황칠나무(Dendropanax morbifera)의 수피, 잎, 가지 및 줄기로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 재료를 50 내지 100℃로 5 내지 20시간 동안 열수추출하고 농축하여 수득한 고형분 함량이 1 내지 2브릭스(Brix)인 열수추출물에 과당 0.5 내지 1.5%(v/v) 및 효모추출물 0.05 내지 0.2%(w/v)를 첨가하고, 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 접종하고 발효시키되,
상기 접종은 상기 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)를 MRS 액체배지에서 35 내지 39℃, 100 내지 140rpm으로 4 내지 20시간 진탕배양하여 수득한 전배양액을 상기 열수추출물에 1 내지 4%(v/v)로 첨가하여 이루어지며,
상기 발효는 35 내지 39℃, 100 내지 140rpm으로 12 내지 24시간 진탕배양하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 황칠나무 발효물 제조방법. - 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1항의 제조방법으로 제조된 황칠나무 발효물을 여과한 여과액을 포함하는 황칠나무 발효음료.
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| AMND | Amendment | ||
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