KR20130077911A - 죽순발효 식초를 이용한 기능성 식품 및 그의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 죽순을 미생물 발효시켜서 얻은 식초를 주성분으로 포함하는 기능성 식품 및 그의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 죽순발효식초 추출물을 이용하여 제조된 식품 조성물은 항산화 효능, 항염증 효능을 가지고 있으므로 국내 자생식물을 이용한 기능성 식품으로 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 죽순을 미생물 발효시켜서 얻은 식초를 주성분으로 포함하는 기능성 식품 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
죽순은 담양, 거제, 순창 등에서 주로 생산되며 농가 소득 및 지역경제 활성화에 큰 기여를 했으며 해외 수출 품목으로서 국가 경제에도 상당한 기여를 한 작목이다. 국민 식생활의 편의성과 서구화에 기인한 영양의 불균형, 각종 생활환경 오염으로 인한 자연환경의 파괴로 인하여 급증하는 각종 성인병 예방과 치료에 국민의 관심이 고조되고 있으며, 최근 건강지향적인 식생활문화의 변화로 각종 건강 기능성식품과 기능성식품의 소비량이 증가하고 있으나 이들 제품의 효능에 대한 시비가 자주 거론되고 있다. 이러한 소비자의 다양한 요구에 부응하기 위한 건강 지향적인 기능성을 부여한 부가가치 가공미의 유통이 예견되며 앞으로 식품산업의 한 분야로 자리잡을 전망이기 때문에 다양한 부가가치 상품에 대한 기술개발이 요구되고 있다.
죽순의 생리활성은 이미 여러 연구에 의해 항산화활성, 항고혈압활성 등이 보고된 바 있으나 아직 제품 실용화 연구는 진행되지 않고 있는 실정이다. 현재까지 죽순을 이용한 식품가공은 죽순주, 죽순회, 죽순통조림, 죽순음료 등 단순 가공식품으로만 이용되고 있으며 생명공학 기술을 접목하여 죽순을 이용한 식초와 셀룰로오스 관련 제조에 대해서는 시도된 바 없다.
본 발명자들은 죽순을 대상으로 새로운 기능성 제품을 개발하고자 예의 연구한 결과, 후술하는 바와 같이 죽순을 미생물 발효시켜 얻은 식초가 항산화 효능, 미백 효능 및 항염증 효능 등의 다양한 생리활성을 나타냄을 발견하고 이들이 건강 기능성 식품으로 효율적으로 이용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명은 일면에 있어서 후술하는 방법에 의해 제조된 죽순발효식초를 주요 성분으로 포함하는 기능성 식품 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 죽순 발효식초의 항산화활성, 항균활성, 항염증활성 및 미백 활성 등의 기능성을 식품에 반영한 죽순 발효식초를 성인병 예방과 치료에 도움이 되는 건강 기능성 식품으로 개발하여 건강증진에 기여하고 지역의 특산물로서 개발하여 지역 경제를 활성화시키는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 따라 죽순발효식초 추출물을 이용하여 제조된 식품 조성물은 항산화 효능, 항염증 효능을 가지고 있으므로 국내 자생식물을 이용한 기능성 식품으로 이용될 수 있다.
도 1은 죽순발효 식초의 아질산염 소거능력을 나타내는 그라프도.
도2는 (A) NIH3T3 및 (B) RBL-2H3 세포주에서 세포 생존능에 미치는 죽순발효식초의 효과를 나타내는 그라프도.
도 3은 (A) Raw264.7 및 (B) HeLa 세포중에서 세포 생존능에 미치는 죽순발효식초의 효과를 나타내는 그라프도.
도 4는 (A) SNU-601 및 (B) B16F10 세포주에서 세포 생존능에 미치는 죽순발효식초의 효과를 나타내는 그라프도.
도 5는 버섯 티로시나아제 활성에 미치는 죽순발효 식초의 효능을 나타내는 그라프도.
도 6은 죽순발효 식초의 UV 흡광도를 나타내는 그라프도.
도 7은 200nM α-멜라노사이트 자극 호르몬(α-MSH)에 의해 자극시킨 (A) 티로시나아제 활성 및 (B) B16 멜라노마 세포에서의 멜라닌 함량에 미치는 죽순발효 식초의 영향을 나타낸 그라프도.
도 8은 Raw 264.7 세포에서 산화 질소(NO)의 생산에 미치는 죽순 발효 식초의 억제효과를 나타내는 그라프도.
도 9는 항원-자극시킨 매스트 세포에서 β-헥소스아미니다아제 방출에 미치는 죽순발효 식초의 영향을 나타내는 그라프도.
도2는 (A) NIH3T3 및 (B) RBL-2H3 세포주에서 세포 생존능에 미치는 죽순발효식초의 효과를 나타내는 그라프도.
도 3은 (A) Raw264.7 및 (B) HeLa 세포중에서 세포 생존능에 미치는 죽순발효식초의 효과를 나타내는 그라프도.
도 4는 (A) SNU-601 및 (B) B16F10 세포주에서 세포 생존능에 미치는 죽순발효식초의 효과를 나타내는 그라프도.
도 5는 버섯 티로시나아제 활성에 미치는 죽순발효 식초의 효능을 나타내는 그라프도.
도 6은 죽순발효 식초의 UV 흡광도를 나타내는 그라프도.
도 7은 200nM α-멜라노사이트 자극 호르몬(α-MSH)에 의해 자극시킨 (A) 티로시나아제 활성 및 (B) B16 멜라노마 세포에서의 멜라닌 함량에 미치는 죽순발효 식초의 영향을 나타낸 그라프도.
도 8은 Raw 264.7 세포에서 산화 질소(NO)의 생산에 미치는 죽순 발효 식초의 억제효과를 나타내는 그라프도.
도 9는 항원-자극시킨 매스트 세포에서 β-헥소스아미니다아제 방출에 미치는 죽순발효 식초의 영향을 나타내는 그라프도.
본 발명은 일면에 있어서 죽순을 미생물에 발효시켜서 제조된 죽순발효식초를 주성분으로 포함하는 기능성 식품 조성을 제공한다. 더욱 구체적으로 상기 죽순 발효 식초는
a) 자연 채취한 죽순을 깨끗이 세척한 후, 껍질 등 이물질을 제거하고 세절하는 단계,
b) 상기 죽순을 발효 용기에 각각 넣고 죽순 : 설탕을 70 : 30 비율로 혼합한 후 죽순과 설탕의 혼합량과 동일한 무게의 증류수를 넣어 발효 배지를 준비하는 단계,
c) 상기 발효 배지에 Acetobacter aceti 균주를 접종하여 25∼30℃에서 180일간 발효시키는 단계, 및
d) 초산발효공정에서 얻어진 죽순 발효물을 5,000rpm의 원심분리기에서 10분간 잔류물을 분리한 후 0.45㎛ 멤브레인 필터에 통과시켜 잔류물이 제거된 상태의 죽순발효식초를 얻는 단계
에 의해 얻어진다.
초산 생성 세균은 글루코노백터(Gluconobacter)와 아세토박터(Acetobacter)의 2종류로 나눌 수 있으며, 이들은 당과 알코올을 초산으로 산화시킬 수 있는 능력을 가지고 있는 세균의 집단에 속한다. 두 균의 차이점은 Gluconobacter는 알코올보다 당을 더 선호하며 초산을 재-산화시키는 능력이 없는 반면 Acetobacter는 초산과 젖산을 재 산화 시킬 수 있는데, 여기서 재-산화과정(over-roxidation)이란 에탄올을 이용하여 초산을 생성하고 이어서 초산을 CO2와 H2O로 산화시키는 두 가지 과정을 의미한다.
지금까지 알려진 대표적인 종들로는 Acetobacter acet;, A. pasteurianus, A. liquefaciens, A. xylinum 그리고 A. methanolicus 등이 있으며, Acetobacter 속은 식초 생산을 위해서 산업적으로 매우 중요하기 때문에 새로운 균주의 분리와 함께 초산균의 개량을 위해서 유전자 재조합 기술을 이용한 주요 효소의 클로닝과 spheroplast fusion을 이용한 돌연변이 획득에 대해서도 연구되고 있는 실정이다.
본 발명에 따른 죽순발효 식초를 주성분으로 포함하는 기능성 식품 조성물은 화학 합성제가 아닌 천연 발효 물질의 추출물을 포함하고 있으므로 후술하는 실시예 및 시험예의 결과로부터 잘 알 수 있는 바와 같이 피부에 대한 자극성이나 독성이 없어서 안정성이 우수하며, 항산화 효능 등의 탁월한 기능성이 있으므로 이러한 기능성을 요하는 식품의 성분으로 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 조성물은 항산화용 건강 기능성 식품으로 이용될 수 있다. 상기 건강기능성 식품은 일반 건강식품 또는 다이어트나 피로회복, 숙취해소용 등의 다목적 기능을 갖는 기능성 건강 식품으로도 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 기능성 식품 조성물은 당해 분야에서의 통상적인 방법에 따라, 예를 들면 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 액상 또는 음료 형태를 포함하는 제형으로 제공할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물의 섭취량은 그 제제 형태, 투여 방법, 사용 목적 및 이것에 적용되는 개체의 연령, 체중, 증상에 따라서 적절히 설정되고, 일정하지 않지만 일반적으로는 제제 중에 함유되는 유효성분의 양은 성인 1일당, 예컨대 25 mg∼5,000 ㎎/㎏이다. 물론 복용량은, 각종 조건에 의해서 변동하기 때문에, 상기 섭취량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또는 범위를 초과하여 필요한 경우도 있다.
또한, 본 발명의 죽순발효식초가 기능성 식품(건강기능식품 및 일반 식품) 조성물로 제조되는 경우에는 식품에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 감미료, 예를 들면 감초, 비타민 C, 구연산, 니코틴산, 안식향산나트륨, 아스파탐, 사카린, 펙틴, 말리톨, 솔비톨, 자일리톨, 구아검, 탈지분유 및 올리고당으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 성분을 추가하여 기호도나 미감을 증대시킬 수 있다.
이들은 본 발명의 조성물의 전체 중량을 기준으로 약 0.01~20 중량%로 사용하는 것이 적절하다.
음료수는, 예를 들면, 상기 죽순 발효 식초 추출물을 0.01~20 중량%으로 넣고, 감초 0.01~2 중량%, 구연산을 0.01~2 중량%, 사과산 0.01~2 중량%, 타우린 0.1∼2 중량%, 비타민 C 0.01~2 중량%, 비타민 B1 0.01~2 중량%, 바이오틴 0.01~2 중량%, 액상과당 0.01~20 중량% 폴리덱스트로스 0.1~3 중량%, 배농축액 0.1~1 중량%, 벌꿀 0.1~0.5중량%, 젖산칼슘 0.01~1 중량%, 향료 0.1~1 중량%, 색소 0.01~0.05 중량%, 구연산나트륨 0.01~0.5중량%, 스테비텐후레쉬 0.01~0.5 중량%, 니코틴산아미드 0.01~0.5 중량%, 로얄제리추출물 0.01~0.5 중량%, L-멘톨 0.0001~0.5 중량%등을 단독 또는 혼합하여 첨가하여 기능성 음료수로 제조할 수 있다.
또한 본 발명에 의해 죽순 발효 식초를 이용하여 기능성 식품을 개발하게 되면, 벼농사 및 기존 작물의 소득저하로 인한 농가소득 보전을 위한 신 소득 작물의 개발 필요성이 대두되고 있는 농가의 소득 작목으로 자리 매김 될 수 있다.
이와 같은 기능성 식품을 제공함으로써 국내 죽순산업의 경쟁력 확보와 고부가가치 상품개발을 통한 수출산업으로의 기반구축이 가능하고, 죽순식품가공은 향후 성장가능성이 존재하는 분야로 판단되고 있기 때문에 지역특산품화로 지역경제 활성화가 가능하며, 최근 기능성을 강화한 식초에 대한 소비자 선호와 수요가 점차 확대되면서 식초의 고급화, 다양화 전략으로 기능성식초시장 선점이 가능하며, 식습관 및 쇼핑형태는 지역에 따라 폭넓은 다양성을 나타내고 있기 때문에 시장차별화와 시장세분화 전략으로 시장진입 해소하고, 소비추세나 소비성향을 보면 자연 건강식품생산 소비에 따라 성인병 예방이나 치료에 효능이 좋아 국민건강 증진도모가 가능할 뿐만 아니라, 농산물을 이용 부가가치향상 제품 생산으로 지역브랜드화에 기여할 수 있다.
<실시예>
이하, 본 발명은 다음의 대표적인 실시예에 의하여 더욱 구체적으로 설명되나, 본 발명이 이들 실시예에 의해 어떤 식으로든 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 죽순 발효 식초의 제조
전남 담양군에서 채취한 죽순을 깨끗이 세척한 후, 껍질 등 이물질을 제거하고 세절하였다. 이 중 1 Kg을 취하여 20 L 발효 용기에 각각 넣고 죽순 : 설탕을 70 : 30 비율로 혼합한 후 죽순과 설탕의 혼합량과 동일한 무게의 증류수를 넣고, 배양한 KCTC 12290 초산균 배양액 100mL을 앞서 제조한 죽순 배지에 각각 넣고, 27℃에서 180일간 발효시켰다.
초산발효공정에서 얻어진 죽순 발효물을 5,000rpm의 원심분리기에서 10분간 잔류물을 분리한 후 0.45㎛ 멤브레인 필터에 통과시켜 잔류물이 제거된 상태의 죽순발효식초 650ml을 얻었다. 상기 죽순발효 식초액에 덱스트로스를 부형제로 첨가하여 이를 동결건조하고(이하, 시료 D라고 함), 죽순발효식초액에 폴리덱스트로오스(수용성 식이섬유)를 부형제로 첨가하여 동결건조하여(이하, 시료 P라고 함) 이를 후속 절차에 사용하였다. D+P는 두개의 시료를 동량 혼합한 시료를 의미한다.
실시예 2: 죽순 발효 식초를 이용한 동결건조분말 제품의 제조
죽순 발효 식초의 기호성 및 휴대성을 제공하기 위하여 실시예 1에서 얻은 죽순발효 식초 100ml을 동결건조한 후 분쇄기(FM-681C, HANIL, Korea)로 마쇄하여 100 메쉬 체를 통과한 분말을 취하고 식품용 첨가제를 첨가하여 식이섬유 분말 제품을 제조하였다.
실시예 3: 죽순 발효 식초를 이용한 음료의 제조
실시예 1에서 얻은 죽순발효식초 5중량%, 액상과당 12중량%, 폴리덱스트로스 1중량%, 배농축액 0.73중량%, 벌꿀 0.5중량%, 구연산 0.1중량%, 젖산칼슘 0.02중량%, 비타민 C 0.04중량%, 수박향료 0.2중량%, 색소 0.05중량%, 구연산나트륨 0.1중량%, 스테비텐후레쉬 0.02중량%, 니코틴산아미드 0.01중량%, 로얄제리추출물 0.01중량%, L-멘톨 0.0005중량% 및 잔여량의 정제수를 첨가하여 죽순발효식초를 함유하는 음료조성물을 제조하였다.
시험예 1: 항산화 효과
1) DPPH(1,1-diphenol-2-picrylhydrazyl) radical 제거 효능 검색
유리 라디칼인 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DDPH)는 자주색을 띄며 515nm에서 최대 흡광도를 보이므로 유리 라디칼 제거 작용을 가지고 있는 물질과 반응 시 노란색이 되면서 흡광도 값이 낮아지는 것을 이용하여 항산화 효과를 측정하였다. DPPH(1-diphenyl-2-picrylhydroazyl)를 이용한 유리 라디칼 소거 반응으로 식초 추출물의 항산화 능력을 측정 하였다. 실시예 1에서 제조한 시료를 각 농도별로 조제한 용액에 1.5 x 10-4 M의 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)을 일정량 가하였다. 10초간 진탕한 후 37℃에서 30분간 방치한 후 마이크로플레이트 판독기를 이용하여 515 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조약물은 L-아스코르브산과 BHA (butylated hydroxy anisole)를 사용 하였다. 항산화효과는 시료를 첨가하지 않은 대조군의 흡광도와 비교하여 그래프로 나타내었다. 그 결과를 표 1에 나타내었다.
| 식초 | DPPH 라디칼 소거능 (IC50, mg/ml) |
| D | 0.808±0.39 |
| P | 0.807±0.24 |
| D+P | 0.811±0.16 |
위 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 D+P가 상대적으로 높은 라디칼 제거 능력을 나타냈다.
(2) 아질산염 소거능
아질산염 소거능은 Kato 등의 방법에 따라 일정 농도의 실시예 1의 추출물 시료 1 mL에 1 mM NaNO2 용액 1 mL를 가하고, 이 용액에 0.1 N HCl을 가하여 pH 1.2로 조정하였다. 여기에 증류수를 가하여 부피를 10 mL로 정용한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 다음 반응액을 1 mL씩 취하여 2% 아세트산, 5 mL, Griess 시약(A:B＝1:1, A: 30% 아세트산 중의 1% 설파닐릭산, B: 30%아세트산 중의 1% 나프틸라민)을 0.4 mL를 가하여 잘 혼합한 후 실온에서 15분간 방치시킨 후 분광광도계를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존하는 아질산량을 산출하였다. 대조구는 Griess 시약 대신 증류수 0.4 mL를 첨가한 후, 동일한 방법으로 측정하여 시료용액의 첨가구와 시료 무첨가구 사이의 흡광도 차이를 백분율(%)로 나타내었다.
NSA (%)＝[1－{(A－C)/B}] x 100
[A: NaNO2 용액에 시료와 Griess를 첨가한 흡광도, B: NaNO2 용액에 Griess를 첨가한 흡광도, C: NaNO2 용액에 시료와 증류수를 첨가한 흡광도]
대조구는 Griess시약 대신 증류수를 0.4 mL를 가하여 측정하였다. 죽순 발효 식초의 아질산염 소거능의 결과는 도 1에 나타낸 바와 같다. 도 1은 죽순발효 식초의 아질산염 소거능력을 나타내는 그라프도이다. 마찬가지로 D+P에서 가장 높은 아질산염 소거능을 나타냈다.
시험예 2: 동물세포주의 배양
SH-SY5Y (신경모세포종 세포), NIH-3T3 (쥐섬유아세포), HeLa (자궁경부암세포종), SNU601 (위암세포), CT26 (대장암 세포), BV (뇌소교세포), B16F10 (피부암세포), Raw264.7 (대식세포), RBL-2H3 (비만세포), AGS (위암세포), HaCat (피부각질세포) 등의 동물세포주는 한국세포주은행으로부터 분양받아 공지된 DMEM, MEM, RPMI1640, DMEM/F12 등의 배지를 이용하여 각각의 배양조건에 맞추어 37℃, 5% CO2, 습도 95%에서 배양하며, 72시간을 주기로 배지를 교체한다. 70 ~ 80% 정도 자랐을 때, Trypsin/EDTA를 이용하여 계대하여 실험에 이용하였다. 상기 세포주에 추출물을 일정한 dose-dependent와 time-dependent 방식으로 처리하였다. 이를 후속의 시험에 사용하였다.
시험예 3: 최소억제농도(MIC)에 의한 항균효과의 측정
MIC 평가는 96 웰 플레이트를 이용한 브로쓰 희석 시험을 일부 변형하여 수행하였다. 각각의 균주를 활성화 시킨 후, ELISA reader를 이용하여 595 nm에서 흡광도가 0.08~0.1 (McFarland standard 0.5)이 되게 하여 균수를 3 x 107 cfu/well/0.2 ml이 되도록 배양 배지를 분주하였다. 시료는 각각 최종 농도 100, 10, 1, 0.1, 0.01 μM이 되도록 하였다. 인큐베이터에서 24시간 배양한 후 595 nm에서 흡광도를 측정하여 최소 억제농도(MIC)를 결정하고 그 결과를 표 2에 나타내었다.
시험예
4: 세포 독성 분석-
MTT
에세이
각 세포주를 1 x 105 cell/㎖씩 96 웰 플레이트에 0.1 ㎖씩 분주하여 하룻밤 배양하고, 각 추출물을 농도별로 처리한 후 24시간 동안 반응 시켰다. 처리 후, MTT 용액(최종 농도: 500㎍/㎖)을 배지로 희석하여 각 웰에 넣어 준 후 37℃,에서 4시간 동안 반응시켜 formazan을 형성시킨다. 형성된 formazn은 0.1 ㎖ DMSO를 이용하여 녹여준 후 마이클로플레이트 판독기를 이용하여 540nm에서 흡광도를 측정한다. 실시예 1의 죽순발효식초 추출물들의 세포 독성을 알아보기 위하여 동물 세포주를 이용하여 MTT 에세이를 수행하였다. 각 세포주들을 96웰에서 배양한 후 추출물울 0, 10, 50, 100, 200, 300, 500 μg/ml농도로 희석하여 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 24시간 동안 처리한 후 세포 생존율 변화를 관찰하였다. 그 결과를 도 2내지 4에 나타내었다. 도2는 (A) NIH3T3 및 (B) RBL-2H3 세포주에서 세포 생존능에 미치는 죽순발효식초의 효과를 나타내는 그라프도이다. 세포들을 5% CO2 배양기에서 37℃에서 24시간 동안 식초(최종 농도: 10, 30, 50, 70, 100, 300, 500 μg/ml)로 인큐베이션시켰다. 생존 세포의 양은 MTT를 이용하여 측정하였다. 도 3은 (A) Raw264.7 및 (B) HeLa 세포 중에서 세포 생존능에 미치는 죽순발효식초의 효과를 나타내는 그라프도이다. 세포들을 5% CO2 배양기에서 37℃에서 24시간 동안 식초(최종 농도: 10, 30, 50, 70, 100, 300, 500 μg/ml)로 인큐베이션시켰다. 생존 세포의 양은 MTT를 이용하여 측정하였다. 도 4는 (A) SNU-601 및 (B) B16F10 세포주에서 세포 생존능에 미치는 죽순발효식초의 효과를 나타내는 그라프도이다. 세포들을 5% CO2 배양기에서 37℃에서 24시간 동안 식초(최종 농도: 10, 30, 50, 70, 100, 300, 500 μg/ml)로 인큐베이션시켰다. 생존 세포의 양은 MTT를 이용하여 측정하였다. 모든 추출물에서 30μg/ml까지는 세포 생존율에서 큰 변화를 나타내지는 않았다. 모든 세포주에서 100μg/ml 이상의 농도에서는 농도가 증가할수록 세포 생존율이 급격하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
시험예 5: 미백효과
(1) 버섯 티로시나아제 저해 활성
Tyrosinase 저해활성은 DOPA oxidase의 방법을 변형하여 측정하였다. 37℃ 수조에서 온도를 미리 조정한 67mM sodium phosphate buffer (pH 6.8) 80 ㎕, 25 mM L-DOPA 40 ㎕ 및 추출시료 용액 40 ㎕의 혼합용액에 버섯 티로시나아제 (125 unit/ml)용액 40 ㎕를 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켜 반응액 중에 생성된 DOPA chrome을 ELISA reader를 이용하여 492 nm에서 흡광도를 측정하였다. 티로시나아제 저해활성은 시료용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율로 나타내었다.
저해활성(%)=(1-시료첨가군 흡광도/무첨가구 흡광도) x 100
(2) 멜라닌 함량 측정
6 웰 플레이트에서 시료처리 48시간 후 플레이트를 PBS로 씻고 트립신화(trypsinization)하였다. 세포를 코닝 튜브(corning tube)에 모은 후 PBS 용액으로 씻고 10% DMSO를 포함하는 1N NaOH용액 200ul에 녹인 다음 80℃ 에서 1시간 동안 반응시킨 후 96 웰 플레이트로 옮겨 405nm에서 마이크로플레이트 판독기로 흡광도를 측정하였다. 흡광도로 다음 식에 의해 멜라닌 저해율을 측정하였다.
멜라닌 저해율(%)=[(C-S)/C]*100[C: 10% 메탄올 첨가시 흡광도 값, S: 시료 첨가시 흡광도 값]
(3) 세포내 티로시나아제 활성 저해 측정
6웰 플레이트에 시료 처리 48시간 후 PBS로 씻고 트립신화(trypsinization)하여 세포를 코닝 튜브에 모은 후 PBS 용액으로 씻고 용해 완충액을 100ul 첨가한다. 용해 완충액(lysis buffer)은 0.1M 인산염 완충액(pH 6.8)에 0.1% Triton-X를 첨가하여 만든다. 세포와 용해 완충액을 섞은 후 4℃, 1시간동안 초음파처리(sonication)하여 세포를 파쇄한다. 그 후 4℃, 15,000 rpm 에서 10분동안 원심분리하여 상층액만을 취한다. 상층액 50 ㎕와 0.1M 인산염 완충액 100 ㎕를 혼합하여 37℃에서 10분 분간 방치한 후 0.15% L-DOPA 50㎕를 첨가하여 37'C에서 20분 반응한 뒤 475nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도로 다음식에 의해 저해율을 구하였다.
티로시나아제 저해율(%)=[(C-S)/C]*100[C: 10% 메탄올 첨가시 흡광도 값, S: 시료 첨가시 흡광도 값]
본 시험예의 결과를 도 5 내지 7에 나타내었다. 도 5는 버섯 티로시나아제 활성에 미치는 죽순발효 식초의 효능을 나타내는 그라프도이다. 도 6은 죽순발효 식초의 UV 흡광도를 나타내는 그라프도이다. 도 7은 200nM α-멜라노사이트 자극 호르몬(α-MSH)에 의해 자극시킨 (A) 티로시나아제 활성 및 (B) B16 멜라노마 세포에서의 멜라닌 함량에 미치는 죽순발효 식초의 영향을 나타낸 그라프도이다. 세포들은 5% CO2 인큐베이터에서 37℃에서 72시간 동안 아르부틴 및 죽순발효식초로 인큐베이션시켰다.
100μg/ml 이하에서는 모든 추출물이 티로시나아제 억제효과가 미미하였지만 농도가 증가할수록 점차 억제 효과 역시 증가하였다(도 5참조). 모든 추출물들은 아르부틴과 비교하였을 때 UVA/B/C 모두에 대해 흡수도가 미미하였다(도 6 참조). 버섯 티로시나아제 억제 효과는 죽순발효 식초에서 효과가 나타났으며 추출물 모두에서 티로시나아제를 직접적으로 억제하는 것을 확인 할 수 있었다. MSH에 의한 티로시나아제 활성과 멜라닌 생성에서 죽순발효 식초가 높은 효과를 나타냈으며 대조군으로 사용한 아르부틴과 비교하였을 때, 티로시나아제 활성과 멜라닌 생성 억제에서 유사하거나 높은 효과를 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
시험예 6: 항염증 및 항알레르기 효과
(1) NO 생성량 측정
NO의 농도는 Griess 시약을 이용하여 배양액 내의 nitrite 농도를 측정한다. 세포를 DMEM 배지를 이용하여 1.5 x 105cells로 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 5% CO2 항온기에서 18시간 전 배양 한 후 추출물을 전처리 후 LPS를 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액을 분리하고 원심 분리하여 얻은 상층액 100㎕을 Griess reagent 100㎕를 더해준 후 상온에서 10분간 반응시킨다. 반응 시킨 후 ELISA reader로 540 nm에서 흡광도를 측정하여 표준물질로 사용한 sodium nitrite의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액 내의 NO를 정량한다.
그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8은 Raw 264.7 세포에서 산화 질소(NO)의 생산에 미치는 죽순 발효 식초의 억제효과를 나타내는 그라프도이다. 세포들은 식초 추출물의 존재 또는 부재하에서 LPS (1μg/ml)로 24 시간 동안 처리하였다. 데이터는 3회 독립적인 실험의 평균±SD로 나타내었다. 농도가 증가할수록 NO의 분비 억제 효과가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
(2) ELISA
배양액 내의 IL-1β, TNF-α 활성도를 측정하기 위해 ELISA kit를 사용하여 측정한다. 추출물을 전처리하고 1시간 후 LPS를 처리하여 24시간 배양한다. 24시간 후 세포 배양액을 원심분리하여 얻은 상층액을 시료로 사용하였으며 각 kit의 매뉴얼에 따라 IL-1β, TNF-α의 활성을 측정한다.
(3) β-hexosaminidase 분비량 측정
24-well plates에 RBL-2H3 세포를 10% FBS와 DMEM 배지에 현탁시킨 후 24-well plate에 2 x 105 cells/㎖ 세포와 dinitropheny-ImmunoglobulinE (DNPIgE) (0.5㎍/㎖)를 분주한 뒤 37℃, 5% CO2 배양기에서 12시간 배양하였다. 각 세포들을 Siraganian buffer (119 mM NaCl, 5mM KCl, 5.6mM glucose, 0.4mM MgCl2, 25mM PIPES, 1 mM CaCl2, 0.1% BSA, pH 7.2)로 2회 세척한 다음 37℃, 5 % CO2 배양기에서 10분간 반응시킨 후 FBS와 DMEM 배지에 시료를 농도별로 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 30분 동안 반응시켰다. 이후 dinitropheny-Human Serum Albumin (DNPHSA) (2㎍/㎖)을 가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 2시간 반응 시키고 얼음에서 냉각시키고 반응을 종결시켰다. 상층액 40㎕를 96 well plate에 옮기고 substrate buffer (4-p-nitrophenyl-N-acetyl-β-D-glucosaminide 2mM, sodium citrate, 0.05M, pH 4.5) 40㎕를 넣고 37℃에서 1시간 동안 배양시 킨 다음 각 well 당 stop solution 200㎕를 첨가하여 반응을 종결시키고 microplate reader (EL 808 series, BioTek, Vermont, USA)를 이용하여 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9는 항원-자극시킨 매스트 세포에서 β-헥소스아미니다아제 방출에 미치는 죽순발효 식초의 영향을 나타내는 그라프도이다. 세포들은 배지 중의 DNP-특이성 IgE로 밤새 배양시켰다. 배지는 죽순발효 식초의 정해진 농도를 함유하는 시라가닌 완충액으로 교체하고 이어서 DNP??HSA로 자극시키고 β-헥소스아미니다아제의 방출을 측정하였다. 죽순발효식초는 농도가 증가할수록 분비 억제 효과가 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
Claims (2)
- 죽순을 미생물에 발효시켜서 제조된 죽순발효식초를 주성분으로 포함하고,
상기 죽순발효식초는
a) 자연 채취한 죽순을 깨끗이 세척한 후, 껍질 등 이물질을 제거하고 세절하는 단계,
b) 상기 죽순을 발효 용기에 각각 넣고 죽순 : 설탕을 70 : 30 비율로 혼합한 후 죽순과 설탕의 혼합량과 동일한 무게의 증류수를 넣어 발효 배지를 준비하는 단계,
c) 상기 발효 배지에 Acetobacter aceti 균주를 접종하여 25∼30℃에서 150~200 일간 발효시키는 단계, 및
d) 초산발효공정에서 얻어진 죽순 발효물을 원심분리기에서 10분간 잔류물을 분리한 후 0.45㎛ 멤브레인 필터에 통과시켜 잔류물이 제거된 상태의 죽순발효식초를 얻는 단계
에 의해 얻어지는 것을 특징으로 하는 기능성 식품 조성물. - 제1항에 있어서, 상기 식품 조성물은 음료 또는 분말형인 것인 기능성 식품 조성물.
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| KR1020110145574A KR20130077911A (ko) | 2011-12-29 | 2011-12-29 | 죽순발효 식초를 이용한 기능성 식품 및 그의 제조방법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103549604A (zh) * | 2013-10-31 | 2014-02-05 | 弋阳县艺林农业开发有限公司 | 一种雷竹笋汁复合饮料及其制备方法 |
| CN104099230A (zh) * | 2014-06-19 | 2014-10-15 | 湖南省林业科学院 | 一种黄甜竹笋醋及其制备方法 |
| KR20210025901A (ko) * | 2019-08-28 | 2021-03-10 | 옥민 | 항산화 활성이 증진된 발효 죽순껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물 |
| CN114847494A (zh) * | 2022-04-20 | 2022-08-05 | 湖南农业大学 | 一种提取芦苇笋中膳食纤维的方法 |
-
2011
- 2011-12-29 KR KR1020110145574A patent/KR20130077911A/ko not_active Application Discontinuation
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