KR20210025901A - 항산화 활성이 증진된 발효 죽순껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물 - Google Patents

항산화 활성이 증진된 발효 죽순껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항산화 활성이 증진된 발효 죽순껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 발효 죽순껍질 추출물은 천연 유래의 물질로 인체에 안전하고 장기간 사용하여도 부작용이 없으므로, 염증 개선을 위한 식품 및 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

항산화 활성이 증진된 발효 죽순껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물{Composition for anti-inflammation comprising extract of fermented bamboo shoot bark with improved antioxidant activity as effective component}
본 발명은 항산화 활성이 증진된 발효 죽순껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물에 관한 것이다.
염증반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개 물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등 외적 증상이 나타나는 것을 의미한다. 정상인 경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부 물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 질환의 주요 병리현상(과민성질환, 만성 염증)이 되며, 수혈, 약물투여, 장기이식 등 치료과정에서도 장해요인이 된다.
현재까지는 염증 반응의 물리적 불편함을 감소시키는 제약학적 제제를 투여하여 치료하고 있으나 일반적인 항염증성 약제는 광범위한 질병의 치료에 사용되고, 동일한 약제가 종종 상이한 질병의 치료에 이용되는 경우가 있기 때문에 치료작용 및 부작용을 공유하게 된다. 따라서 부작용 때문에 장기적으로 사용하기가 곤란하며, 결과적으로 현재까지의 치료법에 부작용의 심각성이 너무 크기 때문에 새롭거나 개선된 염증 질환 치료제 개발은 필수적이고 시급한 실정이며, 부작용에 대한 우려가 없는 인체에 안전한 항염제의 필요성이 대두되고 있다.
죽순은 대나무의 지하경(땅속 줄기) 마디에서 돋아나는 어린순을 말하는데, 성장한 대나무에서 볼 수 있는 형질을 다 갖추고 있다. 왕대, 솜대, 죽순대 등의 죽순을 식용으로 사용하는데 죽순대의 죽순의 품질이 가장 우수하다고 알려져 있다. 죽순은 단백질과 비타민 B·C, 무기질 등의 성분을 함유하고 있어 고혈압, 동맥 경화 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 다량의 섬유질을 함유하고 있어 변비에도 효과가 있다고 알려져 있다. 「동의보감」에 따르면 죽순은 달고 약간 찬 성질을 가지고 있어 몸속의 체액이 순조롭게 돌아가도록 해주고 원기 회복을 촉진하는 효과가 있으며, 「한국본초도감」에서는 죽순이 혈압을 내리며 햇볕에 의한 피부염, 만성기관지염, 불면증 치료에 효과가 있다고 전하고 있다.
발효는 오랜 역사를 가진 생물학 기술로, 유산균, 곰팡이, 효모 등의 인체에 유익한 미생물의 효소작용을 이용하여 식품 내 천연 고분자 물질을 저분자 물질로 변화시켜 체내 흡수율을 높이고, 다당체, 올리고당, 사포닌, 펩타이드, 피틴산 등의 새로운 발효산물을 얻거나 또는 상호 간의 시너지 작용에 의해 생리활성 및 기능성 효능이 상승되는 것으로 알려져 왔다. 탄수화물과 단백질을 주로 분해하는 미생물 중 하나인 곰팡이 균주는 증식하면서 분비하는 효소에 의해 생성되는 당류, 아미노산류, 유기산류 등의 맛 성분이 품질을 결정하며, 폴리페놀류 등의 유효성분이 증가함으로써 다양한 생리활성 작용을 나타낸다. 이와 같은 특징을 가지는 곰팡이류에는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii), 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 등이 있다. 그 중 아스퍼질러스 카와치는 흑국균의 백색변이주로, 탄수화물과 구연산 및 내산성 당화효소를 생산하여 입국을 제조하기가 용이하고, pH를 산성으로 변화시켜 안전하게 해주는 이점이 있다.
한편, 한국등록특허 제0465113호에는 '대나무 추출물 또는 이로부터 분리된 트리신을 포함하는 조성물'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2019-0081719호에는 '산채복합 추출물을 함유하는 항염증 활성이 있는 프리바이오틱스를 갖는 프로바이오틱스 조성물 및 이의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 항산화 활성이 증진된 발효 죽순껍질 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 조성물에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 죽순껍질 분말에 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii)를 접종하여 3일간 발효시킨 후 에탄올 추출하여 발효 죽순껍질 추출물을 제조하였고, 제조된 발효 죽순껍질 추출물이 발효되지 않은 죽순껍질 추출물에 비해 총 플라보노이드 함량이 증가되고 DPPH 라디칼 소거 활성 및 SOD 유사 활성이 우수할 뿐만 아니라, 항염증 효과가 현저하게 증가되는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은 항산화 활성이 증진된 발효 죽순껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 항산화 활성이 증진된 발효 죽순껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 발효 죽순껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 발효 죽순껍질 추출물은 천연 유래의 물질로 인체에 안전하고 장기간 사용하여도 부작용이 없으므로, 염증 개선을 위한 식품 및 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 비발효 죽순껍질 추출물(NF) 및 발효 죽순껍질 추출물(F/3) 내의 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과이다.
도 2는 비발효 죽순껍질 추출물(NF) 및 발효 죽순껍질 추출물(F/3)의 DPPH 라디칼 소거 활성(DPPH radical scavenging activity)을 측정한 결과이다. 양성대조군은 BHT(butylated hydroxytoluene, 0.05%)를 처리한 것이다.
도 3은 비발효 죽순껍질 추출물(NF) 및 발효 죽순껍질 추출물(F/3)의 SOD 유사 활성(Superoxide dismutase like activity)을 측정한 결과이다. 양성대조군은 아스코르브산(Ascorbic acid, 0.05%)을 처리한 것이다.
도 4는 비발효 죽순껍질 추출물(NF) 및 발효 죽순껍질 추출물(F/3)의 리폭시게나아제 저해 활성(lipoxygenase inhibition activity)을 측정한 결과이다. 양성대조군은 인도메타신(Indomethacine, 0.05%)을 처리한 것이다.
도 5는 비발효 죽순껍질 추출물(NF) 및 발효 죽순껍질 추출물(F/3)의 NO(nitric oxide) 생성량을 측정한 결과이다. n은 아무것도 처리하지 않은 군이고, C는 염증유도물질인 LPS(Lipopolysaccharide)만을 처리한 군이다.
도 6은 발효 균주에 따른 발효 죽순껍질 추출물의 리폭시게나아제 저해 활성을 측정한 결과이다. 양성대조군은 IDM(인도메타신)을 처리한 것이고, NF는 비발효 죽순껍질 추출물 처리군이며, Ak는 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii); Bs는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis); 및 Lc는 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei)를 각각 접종하여 제조한 발효 죽순껍질 추출물 처리군을 나타낸다.
도 7은 아스퍼질러스 카와치(Ak) 균주를 접종한 후 발효 기간에 따른 발효 죽순껍질 추출물의 리폭시게나아제 저해 활성을 측정한 결과이다. 양성대조군은 IDM(인도메타신)을 처리한 것이고, NF는 비발효 죽순껍질 추출물 처리군; F/1은 1일간; F/2는 2일간; F/3은 3일간; F/5는 5일간; F/7은 7일간; 및 F/9는 9일간 각각 발효시켜 제조한 발효 죽순껍질 추출물 처리군을 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항산화 활성이 증진된 발효 죽순껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에서, 상기 발효 죽순껍질은 죽순껍질 분말에 곰팡이균을 접종하여 발효한 것일 수 있고, 바람직하게는 죽순껍질 분말에 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii)를 접종하고 2~4일 동안, 바람직하게는 3일 동안 발효한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 발효 죽순껍질 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 이용하여 추출한 것일 수 있고, 바람직하게는 에탄올을 추출용매로 이용하여 추출한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 건강기능식품 조성물은, 비발효 죽순껍질 추출물에 비해 총 플라보노이드의 함량이 높고, DPPH 라디칼 소거 활성, SOD 유사 활성, 염증유발 인자인 리폭시게나아제(lipoxygenase) 및 NO(nitric oxide) 생성 억제 활성이 증가된 발효 죽순껍질 추출물을 유효성분으로 포함하고 있어, 염증성 질환에 효과가 있다.
상기 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽, 발포정 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 건강기능식품 조성물은 염증성 질환의 예방 또는 개선하기 위해 섭취할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 발효 죽순껍질 추출물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 발효 죽순껍질 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 발효 죽순껍질 추출물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양의로 첨가된다. 그러나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 안전성 면에서 아무런 문제가 없는 범위의 양으로 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. 상기 음료는 탄산음료, 기능성이온음료, 쥬스(예를 들어, 사과, 배,포도, 알로에, 감귤, 복숭아, 당근, 토마토쥬스 등), 식혜 등을 포함한다.
본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 저해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 발효 죽순껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에서, 상기 염증성 질환은 알레르기, 피부염, 아토피, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 약학 조성물은, 염증유발 인자인 리폭시게나아제(lipoxygenase)의 저해 활성 및 NO(nitric oxide) 생성 억제 활성이 증가된 발효 죽순껍질 추출물을 유효성분으로 포함하고 있어, 염증성 질환에 효과가 있다. 또한, 본 발명에 따른 상기 발효 죽순껍질 추출물은 항산화 효과가 우수하다.
본 발명의 상기 발효 죽순껍질 추출물을 포함하는 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 조합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제제, 외용제, 좌제 및 주사제의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 발효물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이 외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 상기 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중,질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 발효 죽순껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 건강기능식품 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 발효 죽순껍질 추출물은 비발효 죽순껍질 추출물에 비해 총 플라보노이드의 함량이 높고 DPPH 라디칼 소거 활성 및 SOD 유사 활성이 우수하므로, 항산화용 건강기능식품로 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
1. 실험재료
죽순껍질은 (주)오케이바이오랩에서 제공받았으며, 발효 균주는 곰팡이의 일종인 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii) KCCM 32819 균주를 선택하여 사용하였고, YM 액체 배지(Yeast Malt broth, Difco)에서 전배양 시킨 KCCM 32819 균주(1.0×104 내지 1.0×106 CFU/mL)를 죽순껍질 분말에 1:1 중량 비율로 접종한 후 37℃에서 3일간 발효시키고 60℃에서 8시간 동안 열풍 건조시켜 분말화하였다.
2. 발효 죽순껍질의 추출 조건
추출물은 발효 처리되지 않은 죽순껍질 분말 및 발효된 죽순껍질의 건조 분말 100g에 각각 10배의 에탄올을 첨가한 후 37℃에서 3시간씩 3회 환류 추출하였으며 각 추출액을 모아 Adventec 110 mm No.2 여과지(Toyo 2A; Toyo Roshi, 일본)로 여과하여 하기 실시예에 사용하였다. 실험군으로는 비발효 죽순껍질 추출물(NF) 및 발효 죽순껍질 추출물(F/3)로 설정하여 수행하였다.
3. 총 플라보노이드 함량 측정
총 플라보노이드(flavonoid) 함량을 측정하기 위해 0.1%(w/v) 시료 용액 0.25㎖에 정제수 1.25㎖과 5% 아질산나트륨(NaNO2) 용액 5㎖을 가하고, 5분 후 10% 염화알루미늄·6수화물(AlCl3·6H2O) 0.15㎖을 혼합하고, 상기 혼합물을 분광광도계를 이용하여 510nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 총 플라보노이드 함량은 표준 물질로서 (+)-카테킨 하이드레이트(catechin hydrate)을 20~200㎍/㎖ 농도로 시료와 동일한 방법으로 측정하여 작성된 표준곡선으로부터 계산하였다.
4. DPPH 라디칼 소거 활성 측정
에탄올 100㎖에 DPPH(α,α'-diphenyl-β-picrylhydrazyl) 16㎎을 녹이고 증류수 100㎖을 혼합한 후 Whatman 필터지 NO. 2에 여과시켜 DPPH 반응 용액을 제조하였다. 비발효 죽순껍질 추출물 또는 발효 죽순껍질 추출물을 10%(w/v)의 농도로 만들어 1㎖를 취한 후 DPPH 반응 용액 5㎖을 넣어 혼합하고 암소에서 30분간 반응시킨 다음 분광광도계를 이용하여 528nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 활성 비교를 위하여 기존에 항산화제로 많이 사용되고 있는 합성 항산화제 BHT(butylated hydroxytoluene)를 0.05% 농도로 사용하여 시료와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하였다. DPPH를 이용한 항산화 활성은 시료 첨가구와 무첨가구의 흡광도차를 백분율(%)로 표시하였다. DPPH 라디칼 소거능 활성(radical scavenging activity)을 구하는 식은 하기와 같다.
DPPH 라디칼 소거능 활성(%)=[1-(시료 흡광도528nm)/대조구 흡광도528nm]×100
5. SOD(superoxide dismutase) 유사 활성
96-웰 플레이트에 비발효 죽순껍질 추출물 또는 발효 죽순껍질 추출물 1%(w/v)의 시료용액을 10㎕씩 각각 분주하고 pH 8.5로 보정한 Tris-HCl 완충용액(50mM Tris, 10mM EDTA, pH 8.5) 150㎕와 7.2mM 피로갈롤 25㎕를 첨가한 후 30분간 25℃ 상온에서 반응시켰다. 반응시킨 후 1N HCl를 50㎕ 넣어 반응을 멈춘 뒤, 분광광도계를 이용하여 420nm에서 흡광도를 측정하고, 하기의 식을 이용하여 SOD 유사 활성을 계산하였다. 양성대조군으로는 아스코르브산(0.05%)을 사용하였다.
SOD 유사 활성(%)=(1-시료의 흡광도/대조구의 흡광도)×100
6. 리폭시게나아제(lipoxygenase) 억제 활성
비발효 죽순껍질 추출물 또는 발효 죽순껍질 추출물 1%(w/v)의 시료용액 100㎕와 200mM 보레이트 완충액(borate buffer, pH 9.0) 1㎖을 넣은 후 기질인 리놀렌산(linoleic acid, 0.6 mM/㎖ in ethanol) 2㎖을 넣고 혼합한 후 234nm에서 보정값을 측정한 다음, 리폭시게나아제 5,000~10,000 unit/㎖ 100㎕를 넣고 상온에서 10분간 반응시킨 후 234nm에서 흡광도를 측정하였으며, 양성대조군은 인도메타신(indomethacin, Sigma)을 0.05%(w/v)로 에탄올에 녹여서 사용하였다.
리폭시게나아제 억제활성(%)={1-(b'-b)/(a'-a)}×100
b: 효소 무첨가 시료’
b : 효소 첨가 시료군
a: 효소 무첨가 blank 군
a': 효소 첨가 blank 군
7. NO(Nitric oxide) 생성 저해능 측정
Raw 264.7 대식세포는 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 페니실린 및 10 mM HEPES(N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N'-2-ethanesulfonic acid)가 함유된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 습한 조건으로 37℃의 온도와 5% CO2가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 전면상태(confluent status)를 70%로 유지해주었고, 48시간 내에 한번씩 계대배양하였으며, 계대배양 3회 이상에서 실험에 사용하였다. 염증유도물질인 LPS(Lipopolysaccharide) 처리로 인해 Raw 264.7 대식세포로부터 생성된 NO(nitric oxide)의 양은 세포 배양액 중에 존재하는 NO2 -의 형태로서 그리스(griess) 시약을 이용하여 측정하였다. 24-웰 플레이트에 웰 당 2×105의 세포수가 되도록 분주하고 24시간 배양하였다. 이후, 각 웰에 500㎍/㎖의 비발효 죽순껍질 추출물 또는 발효 죽순껍질 추출물을 1시간 동안 처리하고 그 후 1㎍/㎖의 LPS를 처리하고 24시간 배양하였다. 배양 후 배양액의 상등액을 얻고, 9-웰 플레이트에 상등액과 그리스 시약(0.08g/2㎖의 증류수) 50㎕를 혼합하여 넣고, 20분 동안 반응시킨 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
8. 통계처리
상기 실험으로부터 얻어진 결과는 one-way ANOVA 검정에 의한 평균치와 표준편차(mean± SE)로 표시하였고, 각 실험 군 간의 유의성 검증은 Duncan's multiple range test로 나타내었다.
실시예 1. 발효 죽순껍질 추출물의 총 플라보노이드 함량 분석
비발효 죽순껍질 추출물과 발효 죽순껍질 추출물의 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과, 도 1에 개시한 바와 같이 총 플라보노이드 함량은 NF군에서 18.75mg/100g인 반면, F/3군에서 25.05mg/100g인 것으로, 비발효 죽순껍질 추출물에 비해 발효 죽순껍질 추출물에서 총 플라보노이드 함량이 증가하였고 NF군 및 F/3군 간에 통계적으로 유의한 차이가 있는 것을 확인하였다.
실시예 2. 발효 죽순껍질 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성 분석
비발효 죽순껍질 추출물 및 발효 죽순껍질 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성을 측정하였고, 양성대조군에는 시중에서 판매하고 있는 합성 항산화제인 BHT 0.05%를 처리하였다. 그 결과, DPPH 라디칼 소거 활성이 비발효 죽순껍질 추출물 처리군(NF)에서 30%인 반면, 발효 죽순껍질 추출물 처리군(F/3)에서 60%로 DPPH 라디칼 소거활성이 2배 증가하였다(도 2).
실시예 3. 발효 죽순껍질 추출물의 SOD 유사 활성 분석
비발효 죽순껍질 추출물 및 발효 죽순껍질 추출물의 SOD(superoxide dismutase) 유사 활성을 측정하였고, 양성대조군에는 아스코르브산(Ascorbic acid) 0.05%를 처리하였다. 그 결과, SOD 유사 활성이 비발효 죽순껍질 추출물 처리군(NF)에서 5%로 매우 낮은 반면, 발효 죽순껍질 추출물 처리군(F/3)에서 42%로 SOD 유사 활성이 현저하게 증가하였다(도 3).
실시예 4. 발효 죽순껍질 추출물의 리폭시게나아제 저해 활성 분석
리폭시게나아제(lipoxygenase)는 정상적인 세포에서는 발현이 미비하지만, 염증이 유발되면 류코트리엔(leukotrienes) 물질의 증가로 인해 활성을 나타낸다. 양성대조군에는 시중에서 판매하고 있는 인도메타신(indomethacin) 0.05%를 처리하였다.
비발효 죽순껍질 추출물 및 발효 죽순껍질 추출물의 리폭시게나아제 저해 활성을 측정한 결과, 리폭시게나아제 저해 활성이 NF군에서 62%인 반면, F/3군에서 88%인 것으로, 비발효 죽순껍질 추출물에 비해 발효 죽순껍질 추출물에서 리폭시게나아제 저해 활성이 증가하였고 NF군 및 F/3군 간에 통계적으로 유의한 차이가 있는 것을 확인하였다(도 4).
실시예 5. 발효 죽순껍질 추출물의 NO 생성 억제 활성 분석
NO(Nitric oxide)는 정상적인 방어작용 뿐만 아니라 만성 및 악성염증질환에서 독성을 가지며 전염증성 매개자로서 잘 알려져 있다.
비발효 죽순껍질 추출물 및 발효 죽순껍질 추출물의 NO 생성 억제 활성을 측정한 결과, NO 생성량이 NF군에서 23%인 반면, F/3군에서 20%인 것으로, 비발효 죽순껍질 추출물에 비해 발효 죽순껍질 추출물에서 NO 생성량이 감소하였고 NF군 및 F/3군 간에 통계적으로 유의한 차이가 있는 것을 확인하였다(도 5).
실시예 6. 발효 균주 및 기간에 따른 리폭시게나아제 저해 활성 분석
상기 동일한 방법으로 발효 균주(Aspergillus kawachii, Bacillus subtilis 및 Lactobacillus casei)별로 발효 죽순껍질 추출물을 각각 제조하여 리폭시게나아제 저해 활성을 측정하였다. 그 결과, NF군에 비해 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii, Ak), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis, Bs) 및 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei, Lc)를 각각 접종하여 제조한 발효 죽순껍질 추출물 처리군에서 리폭시게나아제 저해 활성이 증가하였고, 특히 아스퍼질러스 카와치를 접종하여 제조한 발효 죽순껍질 추출물 처리군(Ak)에서 리폭시게나아제 저해활성(83%)이 현저하게 증가하였으며, Ak군과 Bs 및 Lc군 간에 통계적으로 유의한 차이가 있는 것을 확인하였다(도 6).
또한, 아스퍼질러스 카와치를 접종하여 발효 기간(1, 3, 5, 7 및 9일)별로 발효 죽순껍질 추출물을 제조하여 리폭시게나아제 저해 활성을 측정한 결과, 발효 기간 중 3일째에서 리폭시게나아제 저해 활성이 가장 우수한 것을 확인하였다(도 7).

Claims (7)

  1. 항산화 활성이 증진된 발효 죽순껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 발효 죽순껍질은 죽순껍질 분말에 아스퍼질러스 카와치(Aspergillus kawachii)를 접종하여 2~4일 동안 발효한 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  4. 항산화 활성이 증진된 발효 죽순껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 염증성 질환은 알레르기, 피부염, 아토피, 결막염, 치
    주염, 비염, 중이염, 인후염, 편도염, 폐렴, 위궤양, 위염, 크론병, 대장염, 통풍, 강직성 척추염, 류마티스 열, 루푸스, 섬유근통(fibromyalgia), 건선관절염, 골관절염, 류마티스 관절염, 견관절주위염, 건염, 건초염, 건주위염, 근육염, 간염, 방
    광염, 신장염, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 다발성 경화증, 및 급성 및 만성 염증 질환으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 발효 죽순껍질 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화용 건강기능식품 조성물.
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