WO2023106884A1 - 사철쑥 및 죽순 추출물을 포함하는 장질환 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

사철쑥 및 죽순 추출물을 포함하는 장질환 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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김희준
김보혜
이미라
라문진
정상미
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정봉환
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Definitions

  • the present application relates to a composition for preventing or treating intestinal diseases composed of a vacuum extract of wormwood rhizome or/and a vacuum extract of bamboo shoots, and a method for preparing the same.
  • the present application relates to various uses of the composition.
  • Bowel disease refers to any disease that causes inflammation in the digestive organs, such as the small and large intestines. Bowel diseases include inflammatory bowel disease and intestinal fibrosis.
  • Inflammatory bowel diseases include Crohn's disease, ulcerative colitis, intestinal Behcet's disease, intestinal tuberculosis, enteritis, and the like.
  • intestinal fibrosis in the case of intestinal fibrosis, it also appears as a complication of intestinal disease. This is because chronic inflammation progresses during the onset of intestinal disease, and extracellular matrix (ECM) proteins are excessively deposited in the intestinal tissue by myofibroblasts, leading to fibrosis. Occurs.
  • ECM extracellular matrix
  • Medications are broadly classified into three categories.
  • 5-ASA 5-aminosalicylic acid
  • 5-MP 6-Mercaptopurine
  • AZA azathioprine
  • An object of the present application is to provide a composition for preventing or treating inflammatory bowel disease, which is composed of a vacuum extract of Artemisia artemisia or/and a vacuum extract of bamboo shoots.
  • Another object of the present application is to provide a composition for preventing or treating intestinal fibrosis, which is composed of a vacuum extract of rhododendron wormwood and/or a vacuum extract of bamboo shoots.
  • Another object of the present application is to provide a method for preparing the vacuum extract and a composition comprising the same.
  • Another object of the present application is to provide various uses of the composition.
  • the present application contains Artemisia capillaris Thunberg vacuum extract and bamboo shoot vacuum extract (Bamboo shoot) as active ingredients. And it provides a pharmaceutical composition for preventing or treating inflammatory bowel disease, characterized in that it is included in a weight ratio of one selected from 30:70.
  • a vacuum extract of Artemisia capillaris Thunberg and a vacuum extract of bamboo shoots are included as active ingredients.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating fibrosis of the large intestine or small intestine characterized in that it is included in a weight ratio of one selected from 30:70.
  • a vacuum extract of Artemisia capillaris Thunberg and a vacuum extract of bamboo shoots are included as active ingredients.
  • the inflammatory bowel disease provides a composition that is any one or more selected from Crohn's disease, ulcerative colitis, and Behcet's enteritis.
  • the wormwood extract and the bamboo shoot extract provide a composition included in the composition in a weight ratio of 50:50.
  • the wormwood vacuum extract contains chlorogenic acid, scoparone, scopoletin, scopolin, ficusic acid, coumarin, pinene, eucalyptol ( eucalyptol), beta-sitosterol, terpinene, abscisic acid, p-Cymene, bergamoten, gibberellin, borneol ( borneol), Camphor, Caffeic acid, Hyperoside, Isoquercitrin, Isochlorogenic acid A, Isochlorogenic acid B, Isochlorogenic acid C ( It provides a composition containing at least one selected from isochlorogenic acid C), longiverbenone, and eugenol.
  • the bamboo shoot vacuum extract contains coumaric acid, ferulic acid, hyperoside, isochlorogenic acid A, oxalic acid, malic acid, methyl salicylate ( Methyl salicylate) provides a composition containing at least one selected from
  • the composition lowered the increase in the disease activity index; decrease in the degree of increase in the hematocrit index; The degree of increase in the diarrheal index is lowered; lengthening of the large intestine; Decreased destruction of mucosal structures of colon tissue; Ulcer weakened; reduced reactive oxygen species (ROS) production; increased expression of ZO-1; decreased expression of Bcl-xl, BAX or COX2; Decreased expression of autophagy activation marker (LC3 ⁇ ); Decreased expression of pro-inflammatory factors (STAT3, COX2, iNOS); decreased expression of NF- ⁇ B; Decreased expression of apoptosis-related factors (BAX, BCL2L1, Gzmb, Fas, FasL); decreased expression of immune-related factors (C3, CCL19, CCL2, Ccr7, CD38, CD3E, CD4, CD40, CD68, CD8a, ICOS, Ptprc); Decreased expression of inflammation-related factors (CSF1, CXCL11,
  • the mixing is provided by mixing the wormwood vacuum extract and the bamboo shoot vacuum extract in a weight ratio selected from 70:30, 50:50 and 30:70.
  • the method may further include fractionating the vacuum extract of wormwood wormwood and the vacuum extract of bamboo shoots by gas chromatography mass spectrometry.
  • the wormwood vacuum extract or bamboo shoot vacuum extract may be extracted 1 to 5 times for 15 to 30 hours at a temperature of 200 ° C to 300 ° C using a vacuum extraction device.
  • administering a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of inflammatory bowel disease to a subject;
  • a method for preventing or treating inflammatory bowel disease comprising a.
  • administering a pharmaceutical composition for preventing or treating fibrosis of the large intestine or small intestine to a subject;
  • a method for preventing or treating fibrosis of the large intestine or small intestine including a.
  • the site of administration may be at least one selected from muscle, intradermal, subcutaneous, intravenous, abdominal, arterial, heart, mucosal, spinal cord, and bone marrow.
  • the composition may be administered at a dose of 10 mg/kg to 2000 mg/kg at a time.
  • composition for preventing or treating inflammatory bowel disease composed of a vacuum extract of Artemisia wormwood and/or a vacuum extract of bamboo shoots.
  • composition for preventing or treating intestinal fibrosis composed of the vacuum extract of Artemisia wormwood and/or the vacuum extract of bamboo shoots.
  • FIG. 1 is a diagram showing the process of the hot water extraction method and the ethanol extraction method used in the examples of the present application for the selection of a specific plant.
  • Figure 2 is a diagram showing the process of the vacuum extraction method for obtaining the vacuum extract used in the examples of the present application.
  • FIG. 3 is a diagram showing the process of the vacuum extraction method for obtaining the vacuum extract of bamboo shoots used in Examples of the present application.
  • FIG. 4 is a diagram showing candidate index components used in the examples of the present application.
  • FIG. 5 is a view showing the results of analyzing the extract obtained by extracting wormwood for each extraction method.
  • (a) is a hot water extraction method;
  • (b) is an ethanol extraction method;
  • (c) was used; vacuum extraction method.
  • Figure 6 is a view showing the results of analyzing the extract extracted by extracting the heat machine by extraction method.
  • (a) is a hot water extraction method;
  • (b) is an ethanol extraction method;
  • (c) was used; vacuum extraction method.
  • FIG. 7 is a view showing the results of analyzing the extract extracted from the bamboo cylinder by extraction method.
  • (a) is a hot water extraction method;
  • (b) is an ethanol extraction method;
  • (c) was used; vacuum extraction method.
  • FIG. 8 is a view showing the results of analyzing the vacuum extract of bamboo leaves.
  • FIG. 9 is a view showing the results of analyzing the extract obtained by extracting bamboo bamboo shoots by extraction method.
  • (a) is a hot water extraction method;
  • (b) is an ethanol extraction method;
  • (c) was used; vacuum extraction method.
  • FIG. 10 is a result of analyzing the disease activity index by administering the vacuum extract of bamboo shoots and the vacuum extract of wormwood at various ratios.
  • BA refers to a bamboo shoot vacuum extract and a wormwood vacuum extract.
  • Figure 10 (a) is a disease activity index graph; (b) is a numerical representation of (a).
  • FIG. 11 is a result of analyzing the weight change by administering the vacuum extract of bamboo shoots and the vacuum extract of wormwood at various ratios.
  • BA refers to a bamboo shoot vacuum extract and a wormwood vacuum extract.
  • Figure 11 (a) is a weight change graph; (b) is a numerical representation of (a).
  • FIG. 12 is a result of analyzing the bloody stool index by administering the vacuum extract of bamboo shoots and the vacuum extract of wormwood at various ratios.
  • BA refers to a bamboo shoot vacuum extract and a wormwood vacuum extract.
  • Figure 12 (a) is a blood stool index graph; (b) is a numerical representation of (a).
  • FIG. 13 is a result of analyzing the diarrhea index by administering bamboo shoot vacuum extract and wormwood vacuum extract at various ratios.
  • BA refers to a bamboo shoot vacuum extract and a wormwood vacuum extract.
  • Figure 13 (a) is a diarrhea index graph;
  • (b) is a numerical representation of (a).
  • FIG. 14 is a result of analyzing the length of the large intestine by administering vacuum extracts of bamboo shoots and vacuum extracts of wormwood at various ratios.
  • BS is a bamboo shoot vacuum extract
  • AC refers to wormwood vacuum extract.
  • Figure 14 (a) is a photograph of the length of the large intestine; (b) is a graph of (a).
  • FIG. 15 shows HE staining for histological observation of the large intestine of FIG. 14 .
  • Figure 15 (a) is a photograph of the colon stained; (b) is a graph of (a).
  • FIGS. 16A and 16B and 17 are diagrams showing the results of measuring reactive oxygen species (ROS) in human colorectal cancer cell lines, HT-29 and Caco2 cells, respectively.
  • ROS reactive oxygen species
  • FIGS. 18a and 18b and 19 are views showing the results of measuring F-actin in human colon cancer cell lines, HT-29 and Caco2 cells, respectively.
  • (a) of each drawing is a fluorescence microscope analysis photograph;
  • (b) is a graph of (a).
  • FIG. 20a and FIG. 20b is a diagram showing the results of measuring RhoA in human colorectal cancer cell lines.
  • Figure 20 (a) is HT-29 cells; (b) is Caco2 cells;
  • 21 is a diagram showing the results of measuring intestinal health-related factors in a DSS-induced ulcerative colitis mouse model.
  • FIG. 22 is a diagram showing the results of measuring autophagy-related factors in a DSS-induced ulcerative colitis mouse model.
  • FIG. 23 is a diagram showing the results of measuring STAT3, COX2, and iNOS, which are intestinal damage-related factors, in a DSS-induced ulcerative colitis mouse model.
  • FIG. 24 is a graph of the results of FIG. 23 .
  • Figure 25 is a view showing the results of measuring NF- ⁇ B (p-p65/total p65) in human colon cancer cell lines.
  • Figure 25 (a) is HT-29 cells; (b) is Caco2 cells;
  • 26 is a view showing the results of measuring apoptosis-related factors.
  • 27 and 28 are views showing the results of measuring immune-related factors.
  • 29 to 31 are views showing the results of measuring inflammation-related factors.
  • 32 and 33 are views showing the results of measuring tumor-related factors.
  • Figure 34 is a view showing the results of measuring the disease activity index of a group administered with a combination extract (50:50 ratio) of bamboo shoot vacuum extract and wormwood vacuum extract.
  • Figure 34 (a) is 10mg / kg concentration; (b) is 50mg/kg concentration; (c) a concentration of 250 mg/kg; (d) is measured by administration at a concentration of 1250 mg/kg;
  • FIG. 35 is a view showing the results of measuring the weight change of a group administered with a combination extract (50:50 ratio) of bamboo shoot vacuum extract and wormwood vacuum extract.
  • Figure 35 (a) is 10mg / kg concentration; (b) is 50mg/kg concentration; (c) a concentration of 250 mg/kg; (d) is measured by administration at a concentration of 1250 mg/kg;
  • FIGS. 34 and 35 are numerical representations of FIGS. 34 and 35, respectively.
  • Figure 37 is a view showing the results of measuring the diarrhea index of the group administered with a combination extract (50:50 ratio) of bamboo shoot vacuum extract and wormwood vacuum extract.
  • Figure 37 (a) is 10mg / kg concentration; (b) is 50mg/kg concentration; (c) a concentration of 250 mg/kg; (d) is measured by administration at a concentration of 1250 mg/kg;
  • Figure 38 is a view showing the results of measuring the bloody stool index of a group administered with a combination extract (50:50 ratio) of bamboo shoot vacuum extract and wormwood vacuum extract.
  • Figure 38 (a) is 10mg / kg concentration; (b) is 50mg/kg concentration; (c) a concentration of 250 mg/kg; (d) is measured by administration at a concentration of 1250 mg/kg;
  • FIGS. 37 and 38 are numerical representations of FIGS. 37 and 38, respectively.
  • FIG. 40 is a view showing the results of measuring changes in colon length in groups administered with a combination extract (50:50 ratio) of bamboo shoot vacuum extract and wormwood vacuum extract.
  • Figure 40 (a) is a photograph of the length of the large intestine; (b) is a graph of (a); (c) is the measurement of colon length per weight; (d) is the numerical value of (b); (e) is the numerical value of (c);
  • extraction refers to a process of separating a specific component from a plant of interest.
  • the extraction may be further purified, concentrated, and the like, if necessary.
  • the form of the extract may be solid, liquid, and the like. Extraction in the present application may use various known methods, but may mean separating active ingredients from plants by vacuum extraction as a representative example.
  • extract refers to a specific substance obtained using the above extraction process, preferably a vacuum extraction method.
  • the extract may be an extract obtained by extraction treatment, a diluted or concentrated extract of the extract, a dried product obtained by drying the extract, and a crude or purified product thereof.
  • the extract may include a crude extract, a fractional extract, and the like.
  • the wormwood extract refers to a vacuum extract of wormwood
  • the bamboo shoot extract refers to a vacuum extract of bamboo shoots. Therefore, wormwood extract and bamboo shoot extract are used interchangeably with wormwood vacuum extract and bamboo shoot vacuum extract.
  • the term “comprising” means that a substance contains certain components.
  • 'substance A contains material B' and 'substance B is contained in material A' may be interpreted as meaning that material B is included in material A.
  • the terms “comprising” or “comprising” are used interchangeably.
  • the term “combination” used in this application means mixing at least two or more materials or elements using appropriate conditions.
  • the material or element may include a mixture of the same material or element in different states.
  • the state of the material or element includes, but is not limited to, solid, liquid, and the like.
  • the conditions include, but are not limited to, ratio, specific gravity, weight, temperature, and the like.
  • the terms “combination” or “mixing” are used interchangeably.
  • a mixture of an extract of wormwood and an extract of bamboo shoots is referred to as a "combined extract”.
  • the term "Effective” refers to a state in which a substance, element, etc. exhibits a direct or indirect effect or action.
  • the validity should also include numerical values and amounts that affect the experiment.
  • the material or element should also include a mixture of the same material or element in different states.
  • the validity should also include use to interpret the results obtained through physiological experiments, biochemical experiments, etc.
  • the effects or actions of the effect include, but are not limited to, increase, suppression, decrease, increase, and the like.
  • 'substance A is effective for B' means that substance A is effective for B.
  • 'substance A has an effective amount of 1.0% in experiment B' means that material A shows an effect at 1.0% in experiment B.
  • an effective amount is an appropriate amount that will effect a beneficial or desirable clinical or biochemical result.
  • An effective amount can be administered once or more.
  • an effective amount is an amount suitable for temporarily alleviating, ameliorating, stabilizing, reversing, slowing or delaying the progression of a disease state.
  • a composition is said to be "pharmaceutically or physiologically acceptable” if the recipient animal is able to tolerate administration of the composition, or if administration of the composition to the animal is suitable.
  • An agent can be said to be administered in a "therapeutically effective amount” when the amount administered is physiologically important.
  • An agent is physiologically meaningful if the presence of the agent results in a physiologically detectable change in the recipient patient.
  • treatment means alleviating or inhibiting the progression of a disease, disease, symptom, or the like.
  • the treatment includes, but is not limited to, physical treatment, pharmacological treatment, psychological treatment, chemical treatment, and the like.
  • improvement means fixing the existing state, function, effect, form, etc., or adding a specific element or newly transforming it to make it better.
  • Methods for judging the improvement include, but are not limited to, both objective and subjective methods such as experiments and surveys.
  • the term "health functional food” refers to food having useful functionality for the human body by adding substances, elements, etc. to general food.
  • the substances and elements must include those modified or processed chemically, pharmacologically, or pharmacologically.
  • the functionalities include, but are not limited to, physiologically active functions, psychological functions, and the like.
  • the form of the food includes, but is not limited to, a supplement form, a drinking form, a pill form, and the like.
  • the health functional food should include those that temporarily exhibit functional effects.
  • the term "about” refers to a reference amount, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, amount, weight or length of 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, means an amount, level, value, number, frequency, percentage, dimension, size, quantity, weight or length that varies by 6, 5, 4, 3, 2 or 1%.
  • Korean Patent Registration No. 0465113 reports that tricin is isolated from a crude bamboo extract and is effective in inflammatory diseases such as gastritis, colitis, and arthritis caused by an inflammatory reaction by inhibiting NO production.
  • Korean Patent Publication No. 2009-0079608 confirmed the effect of inhibiting the secretion of inflammatory cytokines in the leaf extract.
  • the inflammation inhibitory effect was confirmed in lupus animal models, encephalomyelitis animal models, and arthritis animal models.
  • the present inventors have made great efforts to find a specific part of bamboo or a specific type of mugwort that is excellent in preventing or treating intestinal disorders, and furthermore, studied the remarkable therapeutic effect of the combination of these two specific plants.
  • the present inventors found and used an extraction method for effectively extracting an extract while minimizing the loss of active ingredients from a specific part of bamboo and a specific mugwort.
  • the present application is characterized by the pharmacological effect (function) of using an extract of a specific part of bamboo or an extract of a specific type of mugwort.
  • the extract of a specific part of bamboo and the extract of a specific kind of mugwort may be used alone or in combination, preferably in combination.
  • a specific part of the bamboo used in this application is a bamboo shoot, and a specific kind of mugwort is a wormwood.
  • composition comprising the extract obtained by extracting the bamboo shoots and wormwood by vacuum extraction alone or in combination is provided.
  • the vacuum extraction method used in this application has an advantage in that there is no browning phenomenon due to carbonization of the material and can effectively extract moisture and components of the material.
  • One invention described in this application is characterized by using a vacuum extract extracted from a target plant by a vacuum extraction method.
  • the composition of the present application has an effect of preventing or treating intestinal-related diseases.
  • the bowel-related disease of the present application is inflammatory bowel disease.
  • the bowel-related disease of the present application is intestinal fibrosis.
  • composition of the present application has various intestinal health improvement effects in addition to the effect of preventing or treating such specific intestinal-related diseases.
  • Intestinal health including, for example, regulating autophagy, reducing inflammation, increasing immune activity, inhibiting apoptosis, reducing reactive oxygen species production, inhibiting actin bundle formation, increasing intestinal length, relieving bloody stool symptoms, inhibiting diarrhea, and the like This improvement effect can be shown.
  • composition of the present application uses a specific part extract of bamboo and a specific mugwort extract as main components.
  • the bamboo shoot extract and the mugwort extract selected above are used alone or in combination, preferably in combination.
  • an optimal ratio of the bamboo shoot extract and the wormwood extract for the desired effect is provided.
  • the composition of the present application has an excellent preventive or therapeutic effect on inflammatory bowel disease; And it has a preventive or therapeutic effect on intestinal fibrosis.
  • bamboo shoots and wormwood of this application are used as vacuum extracts of bamboo shoots and wormwood vacuum extracts extracted using a vacuum extraction method.
  • the vacuum extract of bamboo shoots and the vacuum extract of artemisia wormwood of the present application are derived from natural plants and do not have problems such as side effects caused by synthetic compounds.
  • the extract may be extracted by various extraction methods such as hot water extraction, ethanol extraction, steam extraction, and vacuum extraction. At this time, according to the selected extraction method, the composition such as the type and content of the active ingredient of the extract is different.
  • the extract of a specific plant of the present application is, in particular, an extract extracted by a vacuum extraction method (hereinafter referred to as a vacuum extract).
  • the vacuum extraction method is a method that can effectively extract moisture and components of medicinal materials such as animals and plants without using water at all. Specifically, by lowering the internal temperature of the steaming processing unit, which is heated to a high temperature for extraction, by air-cooling means, the water vapor generated from the medicinal material is rapidly transformed into condensed water, and the vacuum action does not cause browning of the medicinal material at high temperature. Extracts a clear and transparent stock solution is to make it possible
  • the hot water extraction method or the ethanol extraction method is a method of extracting a component by putting a plant material to be extracted and a solvent (water, ethanol, etc.) and heating for a long time. Since the ingredients in the material are extracted while boiling the plant material with the solvent, carbonization is bound to occur. Because the carbonization phenomenon occurs, the browning phenomenon in which the extract is black or yellowish is also accompanied. In particular, as the material is heated for a long time in order to extract a lot of components in the material, the carbonization phenomenon is aggravated. In addition, when the material is heated in a solvent, loss of the material inevitably occurs unless the residue containing moisture is extracted. Furthermore, even if the material damaged by moisture is dried, it is difficult to solve the above problem because complete drying is impossible.
  • the vacuum extract of artemisia wormwood and the vacuum extract of bamboo shoots of the present application do not have browning due to carbonization, which occurs when using an extraction method using a solvent, and can effectively contain moisture and components of medicinal materials.
  • the vacuum extract has a higher human body absorption rate than the hot water extract or ethanol extract.
  • the vacuum extract of Artemisia Artemisia has a human body absorption rate that is 1.5 to 100 times higher than that of a hot water extract of Artemisia Artemisia or an ethanol extract of Artemisia Artemisia.
  • the bamboo shoot vacuum extract has a human body absorption rate that is 1.5 to 100 times higher than that of the bamboo shoot hot water extract or the bamboo shoot ethanol extract.
  • This application relates to a vacuum extract of wormwood wormwood or/and a vacuum extract of bamboo shoots.
  • the present application is characterized by using a vacuum extract of Artemisia capillaris Thunberg (hereinafter referred to as AC) among various types of mugwort by a vacuum extraction method.
  • AC Artemisia capillaris Thunberg
  • the solvent-based original extract refers to an extract obtained by a solvent-based extraction method such as a hot water extraction method and an ethanol extraction method.
  • the wormwood extract will be referred to as a wormwood vacuum extract.
  • the inventors of the present application compared the wormwood extract with the extract of the hot spring (see Tables 3 and 4) and confirmed that the content of the components differs depending on the "type of wormwood" even if they belong to the same wormwood, and It was confirmed that the content of the component was different depending on whether it was extracted with.
  • a scoparone component may be derived from the wormwood extract, and the scoparone component may not be derived from the hot weather extract.
  • the hot water extract of Artemisia wormwood may have a high content of chlorogenic acid
  • the ethanol extract of Artemisia Artemisia may have a high content of Scoparone.
  • the vacuum extract of wormwood wormwood of the present application has different types and contents of main active ingredients in the same dose as the original wormwood extract.
  • the vacuum extract of wormwood wormwood of the present application includes longiverbenone, eugenol, and the like, which are not derived from the original wormwood extract.
  • the vacuum extract of wormwood of the present application may include the following components.
  • the vacuum extract of wormwood of the present invention contains camphor, borneol, longiverbenone, eucalyptol, etc. as main active ingredients, and is mostly composed of terpene hydrocarbons has been
  • the wormwood vacuum extract of the present application has a low increase in disease activity index; decrease in the degree of increase in the hematocrit index; The degree of increase in the diarrheal index is lowered; lengthening of the large intestine; Decreased destruction of mucosal structures of colon tissue; Ulcer weakened; ROS generation is reduced; increased expression of ZO-1; decreased expression of Bcl-xl, BAX or COX2; Decreased expression of autophagy activation marker (LC3 ⁇ ); and the like.
  • the vacuum extract of Artemisia wormwood of the present application reduces F-actin formation; Attenuation of RhoA activation;
  • the present application is characterized by using "bamboo shoots (hereinafter referred to as BS)" among various parts of bamboo, such as bark, branches, leaves, cylinders, stems, and bamboo shoots.
  • ingredients such as hyperoside and isochlorogenic acid A are derived from bamboo cylinders, but may not be derived from bamboo shoots.
  • the content of ferulic acid may be lower than when extracted by ethanol extraction.
  • the bamboo shoot vacuum extract of the present application has different types and contents of main active ingredients in the same volume as raw bamboo shoots, bamboo leaves, or bamboo cylinders.
  • the vacuum extract of bamboo shoots contains methyl salicylate, benzofuran, pyrazine, and the like that are not derived from raw bamboo shoots.
  • the bamboo shoot vacuum extract contains methyl salicylate, etc., which is not derived from bamboo leaves.
  • the bamboo shoot vacuum extract of the present application contains the following components.
  • the bamboo shoot vacuum extract of the present invention contains methyl salicylate, benzofuran, propionic acid, beta-panasinsene and the like as main active ingredients.
  • the bamboo shoot vacuum extract of the present application has a low increase in disease activity index; decrease in the degree of increase in the hematocrit index; The degree of increase in the diarrheal index is lowered; lengthening of the large intestine; Decreased destruction of mucosal structures of colon tissue; Ulcer weakened; ROS production is reduced; increased expression of ZO-1; decreased expression of Bcl-xl, BAX or COX2; Decreased expression of autophagy activation markers (LC3 ⁇ , etc.); and the like.
  • bamboo shoot vacuum extract of the present application reduces F-actin formation; Attenuation of RhoA activation;
  • a combined extract in which a vacuum extract of artemisia wormwood and a vacuum extract of bamboo shoots are mixed is provided.
  • the present application may be a combination extract in which the wormwood extract and the bamboo shoot extract are mixed at a weight ratio of 30:70 or 50:50 or 70:30. In a preferred embodiment, it may be a combined extract containing wormwood extract and bamboo shoot extract in a weight ratio of 50:50.
  • the combined extract shows a more excellent effect than each single extract of wormwood and bamboo shoot.
  • the combined extract mixed in a weight ratio of 50:50 has the most excellent effect.
  • the increase in the disease activity index is lowered
  • the degree of increase in the diarrheal index is lowered
  • ROS reactive oxygen species
  • CSF1 CXCL11, IL-15, IL-1b, NF-KB1, Nos2, Ptgs2, Socs1, Socs2, Stat3, Stat4, Stat6, Tnf, TNFRSF18, Nfafc3, Nfatc4, Ly96;
  • the increase in disease activity index was lowered; decrease in the degree of increase in the hematocrit index; The degree of increase in the diarrheal index is lowered; lengthening of the large intestine; effects were confirmed. As a result, it was confirmed that the effect was the most excellent when the weight ratio of the combined extract was 250 mg / kg at 50:50.
  • the vacuum extraction method is a high-vacuum extraction method, which uses a steaming processing device to extract a clear and transparent stock solution without browning of the material at high temperature.
  • the present application uses a special assembly cover of a steaming device to effectively extract moisture and components of medicinal materials such as animals and plants without using water at all.
  • the vacuum extraction method may also be referred to as a pressure extraction method.
  • the vacuum extraction method may include a high vacuum extraction method, a low vacuum extraction method, and the like.
  • the vacuum extraction method may be performed at a temperature of 30 °C to 500 °C.
  • wormwood vacuum extract may be vacuum extracted at a temperature of 80 ° C to 250 ° C.
  • bamboo shoot vacuum extract can be vacuum extracted at a temperature of 80 °C to 250 °C.
  • the vacuum extraction method may be performed by extracting for 2 hours to 300 hours.
  • wormwood vacuum extract can be obtained by extracting for 48 hours to 144 hours.
  • bamboo shoot vacuum extract can be obtained by extracting for 48 hours to 144 hours.
  • the vacuum extraction method may vary the amount of extraction depending on the type of material to be extracted.
  • the amount of extraction when 1 kg of bamboo is extracted by vacuum extraction, the amount of extraction may be about 4000 cc. When 1 kg of wormwood is extracted by vacuum extraction, the extraction amount may be about 2500 cc.
  • any known equipment may be used by those skilled in the art.
  • a herbal vacuum extract extractor manufactured by Chammaek Co., Ltd., Korea
  • Chammaek Co., Ltd., Korea may be used.
  • the vacuum extract is further fractionated by column chromatography, thin layer chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography (GC), etc. It can be separated in the form of fractions through.
  • the method may further include an additional purification method and a concentration method in order to remove impurities or increase the content of the active ingredient.
  • the purification method may be, for example, centrifugation, filtration, sedimentation, ethanol precipitation, water precipitation, chromatography, etc., but is not limited thereto.
  • the concentration method may be, for example, evaporation concentration method, vacuum concentration method, freeze concentration method, membrane separation concentration method, etc., but is not limited thereto.
  • One embodiment of the present application relates to a method for obtaining a vacuum extract of Artemisia wormwood or a method for obtaining a vacuum extract of bamboo shoots.
  • the method for obtaining the wormwood vacuum extract or bamboo shoot vacuum extract For example, the method for obtaining the wormwood vacuum extract or bamboo shoot vacuum extract,
  • Preparing the sandwormwood or bamboo shoots; crushing sandwormwood or bamboo shoots; and precipitating wormwood or bamboo shoots in water may include, but are not limited thereto.
  • the first vacuum extraction box; And the secondary vacuum extraction box; the temperature or / and extraction time of the vacuum extraction device may be different from each other. At this time, the temperature of the vacuum extraction device may be lower than that of the secondary vacuum extraction chamber; the primary vacuum extraction chamber.
  • the first vacuum extraction chamber vacuum extraction may be performed at a temperature of 200 ° C to 250 ° C for 20 hours to 30 hours
  • the second vacuum extraction chamber is at a temperature of 150 ° C to 200 ° C.
  • Vacuum extraction may be performed for 20 to 30 hours.
  • the first vacuum extraction is performed at a temperature of 230° C. for 23 hours
  • the second vacuum extraction may be performed at a temperature of 170° C. for 25 hours.
  • the principle of the vacuum extraction method is to extract by air-cooling method, which circulates and cools the internal temperature of the steaming machine, which is heated to a high temperature for extraction.
  • the water vapor generated by this is rapidly changed into condensed water, and a clear and transparent stock solution can be extracted without browning of the medicinal material at high temperature by vacuum action.
  • the method may optionally further include a process of additionally confirming the extract through analysis of the content of the index component of wormwood or bamboo shoots.
  • This confirmation process may be performed by column chromatography, thin layer chromatography, high performance liquid chromatography (HPLC), gas chromatography (GC), or the like.
  • the marker components of the extract of cedar wormwood are scopolin, caffeic acid, scopoletin, hyperoside, isoquercitrin, isochlorogenic acid B ), isochlorogenic acid A, scoparone, and isochlorogenic acid C.
  • Scoparone was used as the indicator component of wormwood.
  • the indicator components of the bamboo shoot extract are among Coumaric acid, Orientin, Ferulic acid, Methyl salicylate, Vitexin and Tricin. There may be one or more selected. In one embodiment, Scoparone was used as an indicator component of bamboo shoots.
  • the present application is structurally characterized by using i) a rhizome wormwood extract, ii) a bamboo shoot extract, or ii) a combined extract in which a pyrexia artemisia extract and a bamboo shoot extract are mixed. According to these structural characteristics, the extract of the present application has significant pharmacological effects described below.
  • an extract of wormwood, a bamboo shoot extract, or a combination extract thereof is effective in preventing, treating, and/or improving diseases related to intestinal health.
  • diseases related to intestinal health may be inflammatory bowel disease, intestinal fibrosis, and the like.
  • this application provides the following effects and uses thereof:
  • Inflammatory bowel disease can be classified into two diseases: ulcerative colitis and Crohn's disease, which are clinically similar but different from each other in terms of histological findings, endoscopy, and immunology.
  • the inflammatory bowel disease includes Crohn's disease, ulcerative colitis, intestinal Behcet's disease, intestinal tuberculosis, enteritis, and the like.
  • Intestinal fibrosis is a hardening of a part of an organ and occurs as a complication of inflammatory bowel disease. Inflammation in inflammatory bowel disease partially improves and then recurs repeatedly, resulting in scarring, hardening, and further stricture.
  • Fibrosis is a phenomenon in which fibrous connective tissue in an organ is excessively formed, and when inflammation in the intestinal environment becomes severe for a long time, intestinal fibrosis appears.
  • G-actin globular actin
  • F-actin filamentous actin
  • fibrosis of various organs causes goes through various stages such as migration of inflammatory cells, secretion of cytokines, activation of astrocytes, etc., and excessive actin filaments of cells in the process of tissue fibrosis Formation (F-actin polymerization or reorganization) is described as a major target (Mol Med Rep. 2014 May; 9(5): 1641-1647.). In particular, it is known that fibrosis increases rapidly when actin bundle formation is increased.
  • RhoA signaling pathway is involved in the mechanism of inflammatory bowel disease (Int J Clin Exp Med. 2015 Mar 15;8(3):3089-97.).
  • RhoA activity is known to regulate cytoskeleton rearrangement through filament actin (F-actin) formation and motility (Science. 1998 Jan 23;279(5350):509-14., Cell Adh Migr. 2011 Mar- Apr;5(2):170-80., Cell Motil Cytoskeleton.2005 May;61(1):21-33.).
  • the present application provides a composition comprising the above-described extract as an active ingredient as an embodiment.
  • the content, form, and other components of the specific plant vacuum extract included in the composition of the present application may vary depending on the use of the composition.
  • the composition may be a pharmaceutical composition or a health functional food composition.
  • the wormwood vacuum extract or bamboo shoot vacuum extract alone When included in the composition, it may be included in an amount of 1 wt% to 100 wt% of the total weight of the composition.
  • 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 of the total weight of the composition , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46 , 47, 48, 49, may be included within two numerical ranges selected from among, or a selected numerical value.
  • 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 wt% may be included within two numerical ranges selected or selected.
  • a combination extract of a vacuum extract of wormwood and a vacuum extract of bamboo shoots is included in the composition, it may be included in a weight ratio of 1 to 100: 100 to 1 in the composition:
  • the wormwood extract and bamboo shoot extract may be included in a weight ratio of 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 80:20 or 90:10 in the composition. .
  • the composition of the present application may include a combined extract in which a vacuum extract of artemisia wormwood and a vacuum extract of bamboo shoots are mixed in a weight ratio of 30:70, 50:50, or 70:30.
  • composition may be in liquid form, powder form, semi-solid form, encapsulated form, etc., but is not limited thereto.
  • a suspension which is a kind of liquid form, and then in the form of a powder.
  • it may be prepared in a powder form after preparing in a suspension form for concentrating the active ingredient of the composition or for user convenience or ease of storage.
  • liquid form may have viscosity.
  • compositions may vary depending on the use of the composition. For convenience, it will be divided into the case of a pharmaceutical composition and a health functional food composition.
  • the pharmaceutical composition may further include conventional pharmaceutically acceptable carriers, excipients, diluents, preservatives, and the like, in addition to the above-described active ingredients.
  • the carriers, excipients and diluents are lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginates, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, distilled water, physiological saline, and the like.
  • the preservative may be benzoic acid, sodium benzoate, sorbic acid, paraoxybenzoic acid, chlorobutanol, and the like.
  • fillers when formulating the pharmaceutical composition, fillers, extenders, binders, wetting agents and the like may be further included.
  • the pharmaceutical composition when the pharmaceutical composition is formulated into a solid formulation for oral administration, powders, granules, capsules, and the like may be included.
  • compositions contained in the pharmaceutical composition may vary in content or ratio depending on the target disease.
  • the health functional food composition may further include flavoring agents, preservatives, coloring agents, and the like that are acceptable for conventional health functional foods.
  • the flavoring agent may be taumarin, stevia extract, saccharin, aspartame, and the like.
  • the preservative may be tocopherol, nitrite, citric acid, benzoic acid, sorbic acid, and the like.
  • the colorant may be a food tar colorant, a xanthine colorant, a triphenylmethane colorant, or the like.
  • the health functional food composition may include all conventional ones for the purpose of promoting human health, health use, etc., but is not limited thereto.
  • Health promotion of the human body may include, but is not limited to, physical, biochemical, biological, physiological, immunological, therapeutic, psychological, and all things corresponding to general health promotion.
  • the health functional food composition may include all conventional ones to which useful nutrients, functional ingredients, etc. are added, depending on the above purpose, but are not limited thereto.
  • Types of health functional foods may include any one or more or combinations thereof, such as vitamins, nutrients, candies, snacks, powders, tablets, capsules, and beverages.
  • Health functional foods may include, but are not limited to, all common ones that show the effect of improving health function regardless of the duration of taking, such as intake of food, short-term intake, long-term intake, etc.
  • Health functional food may be consumed together with any one or more or a combination thereof, such as medicines and supplementary medicines, but is not limited thereto.
  • the vacuum extract used in manufacturing the health functional food of the present invention is a natural ingredient, it can help improve health function. Natural ingredients rarely cause side effects even when used for a long time.
  • the health functional food of the present invention When preparing the health functional food of the present invention, it is prepared by essentially including the vacuum extract of the specific plant. However, the ratio, content, etc. of the vacuum extract are not limited.
  • the present application provides a method for treating intestinal-related diseases using the pharmaceutical composition.
  • the intestinal-related disease may be inflammatory bowel disease, intestinal fibrosis, and the like.
  • a method for preventing or treating inflammatory bowel disease For example, a method for preventing or treating inflammatory bowel disease,
  • a pharmaceutical composition comprising a vacuum extract of wormwood, a vacuum extract of bamboo shoots, or a combination extract in which they are combined; includes
  • the target may be mammals, fish, birds, and ungulates.
  • the mammal may be a human, dog, cat, mouse, or rabbit. Preferably it may be a person.
  • administration means introducing the pharmaceutical composition of this application to a subject by any suitable method.
  • the administration may be determined in consideration of the subject's age, weight, general health condition, diet, intake of other drugs, duration of treatment, and the like.
  • the administration may vary depending on the disease, such as the dosage of the pharmaceutical composition, the frequency of administration, and the site of administration. It is preferable to use it appropriately according to the type of the disease, the degree of progression of the disease, and the like.
  • the administration may be oral administration or parenteral administration.
  • the parenteral administration may be injection administration.
  • the injection site may be a muscle, intradermal, subcutaneous, intravenous, abdominal cavity, artery, heart, mucous membrane, spinal cord, bone marrow, etc., but is not limited thereto.
  • the frequency of administration of the composition may be once or several times a day, or may be administered several times over a long period of time. At this time, it may be administered at intervals of a certain period.
  • the administration interval may be 1 day, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, and the like.
  • continuous administration or non-continuous administration may be performed.
  • composition may be administered at a dose of 10 mg/kg to 2000 mg/kg at a time, but is not limited thereto.
  • the composition may be administered at a dose of 100 mg/kg to 1000 mg/kg at a time.
  • the composition may be administered at a dose of 200 mg/kg to 500 mg/kg at a time.
  • the wormwood vacuum extract, bamboo shoot vacuum extract, or a combination extract thereof may be administered at a dose of 10 mg/kg to 1500 mg/kg per dose.
  • the wormwood vacuum extract, bamboo shoot vacuum extract, or a combination extract thereof may be administered at a dose of 250 mg/kg at a time.
  • the pharmaceutical composition of the present application may be used alone for the treatment and prevention of diseases, but may also be used in combination with surgery, biological treatment, chemical treatment, and the like.
  • the composition composed of the vacuum extract of wormwood wormwood or/and the vacuum extract of bamboo shoots of the present application is i) using a specific wormwood extract among various types of wormwood; ii) that extracts from specific parts of various parts of bamboo are used; iii) extracting the extract by vacuum extraction; iv) using a specific mugwort and a specific part of bamboo in combination; v)
  • the combined extract has excellent various effects compared to the use of the vacuum extract of wormwood or the vacuum extract of bamboo shoots alone. This is because a specific mugwort optimal for a specific disease among various mugworts has been used, or a specific part optimal for a specific disease among various parts of bamboo is not used. it made an effort
  • Embodiment 1 Artemisia vacuum extract
  • a vacuum extract of wormwood containing at least Longiverbenone is provided.
  • Embodiment 2 Addition of active ingredient
  • the wormwood vacuum extract contains chlorogenic acid, scoparone, scopoletin, scopolin, ficusic acid, coumarin, pinene, eucalyptol ( eucalyptol), beta-sitosterol, terpinene, abscisic acid, p-Cymene, bergamoten, gibberellin, borneol ( borneol), Camphor, Caffeic acid, Hyperoside, Isoquercitrin, Isochlorogenic acid A, Isochlorogenic acid B, Isochlorogenic acid C ( Isochlorogenic acid C), eugenol (Eugenol) characterized in that it further contains at least one selected from the vacuum extract of Artemisia wormwood.
  • Embodiment 3 bamboo shoot vacuum extract
  • Embodiment 4 Numerical limitations
  • the bamboo shoot vacuum extract is any one selected from coumaric acid, ferulic acid, hyperoside, isochlorogenic acid A, oxalic acid, and malic acid. Bamboo shoot vacuum extract, characterized in that it further comprises one or more.
  • Embodiment 5 Combination
  • This mixed (or combined) vacuum extract is
  • Embodiment 6 Combination Numerical Limitation
  • Artemisia vacuum extract and bamboo shoot vacuum extract are vacuum extracts mixed at a weight ratio of 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 or 90:10. .
  • Embodiment 7 mono-pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the vacuum extract of any one of embodiments 1 to 4.
  • Embodiment 8 Independent - health functional food composition
  • a health functional food composition comprising the vacuum extract of any one of embodiments 1 to 4.
  • Embodiment 9 Combination - Pharmaceutical Composition
  • a pharmaceutical composition comprising the vacuum extract of any one of embodiments 5 to 6.
  • Embodiment 10 Combination - Health functional food composition
  • a health functional food composition comprising the vacuum extract of any one of embodiments 5 to 6.
  • Embodiment 11 Numerical limitation (1)
  • the vacuum extract is 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, a composition characterized in that contained within the range of two values selected from among, or a selected value of 50wt%.
  • Embodiment 12 Effect
  • the composition lowered the increase in the disease activity index; decrease in the degree of increase in the hematocrit index; The degree of increase in the diarrheal index is lowered; lengthening of the large intestine; Decreased destruction of mucosal structures of colon tissue; Ulcer weakened; reduced reactive oxygen species (ROS) production; increased expression of ZO-1; decreased expression of Bcl-xl, BAX or COX2; Decreased expression of autophagy activation marker (LC3 ⁇ ); Decreased expression of pro-inflammatory factors (STAT3, COX2, iNOS); decreased expression of NF- ⁇ B; Decreased expression of apoptosis-related factors (BAX, BCL2L1, Gzmb, Fas, FasL); decreased expression of immune-related factors (C3, CCL19, CCL2, Ccr7, CD38, CD3E, CD4, CD40, CD68, CD8a, ICOS, Ptprc); Decreased expression of inflammation-related factors (CSF1, CXCL11,
  • Embodiment 13 disease limitation (1)
  • Embodiment 14 disease limitation (2)
  • composition of any one of embodiments 7 to 12 is characterized in that it is used for the treatment or prevention of intestinal fibrosis.
  • Embodiment 15 disease limitation (3)
  • composition according to any one of embodiments 7 to 12 is characterized in that it is used for treatment or prevention by controlling autophagy.
  • Embodiment 16 disease limitation (4)
  • Embodiment 17 Alone
  • Method for obtaining a vacuum extract comprising a.
  • Embodiment 18 Combination
  • Method for obtaining a vacuum extract comprising a.
  • Embodiment 19 conditional (1)
  • the first vacuum extraction or / and the second vacuum extraction is characterized in that carried out at a temperature of 200 °C to 300 °C.
  • Embodiment 20 conditional (2)
  • the method characterized in that the temperature of the second vacuum extraction is carried out at a temperature 10 °C to 50 °C lower than the temperature of the first vacuum extraction.
  • Embodiment 21 conditional (1)
  • the first vacuum extraction or / and the second vacuum extraction is characterized in that it is carried out for 15 hours to 30 hours.
  • Embodiment 22 conditional (1)
  • the method characterized in that the execution time of the secondary vacuum extraction is 2 to 10 hours more than the execution time of the primary vacuum extraction.
  • Embodiment 23 conditional (1)
  • the method characterized in that the internal vacuum of the vacuum extraction device is 500 Torr to 1000 Torr.
  • Embodiment 24 yield limited (1)
  • Embodiment 25 yield limited (2)
  • Embodiment 26 Inflammatory Bowel Disease
  • Inflammatory bowel disease treatment or improvement or prevention method comprising a.
  • Embodiment 27 intestinal fibrosis
  • Intestinal fibrosis treatment or improvement or prevention method comprising a.
  • Embodiment 28 diseases associated with autophagy
  • a method for treating or improving or preventing a disease related to autophagy comprising a.
  • Embodiment 29 Cancer
  • Cancer treatment or improvement or prevention method comprising a.
  • Embodiment 30 limited administration mode
  • the site of administration is characterized in that at least one selected from muscle, intradermal, subcutaneous, vein, abdominal cavity, artery, heart, mucous membrane, spinal cord, bone marrow.
  • Embodiment 31 dose limitation
  • the composition is characterized in that it can be administered in a dose of 10mg / kg to 2000mg / kg at a time.
  • Embodiment 32 limited number of times
  • the method characterized in that the number of administrations can be administered once or several times a day.
  • Cell culture reagents such as fetal bovine serum, RPMI 1640 media, and antibiotics were purchased from Gibco BRL (Grand Island, USA), and chloroform, sodium dodesyl sulfate, sodium chloride, Acrylamide, Tris-HCL, LPS, acetic acid, etc. were purchased from SIGMA (St.Louis, USA).
  • the antibodies used in the experiment were Phospho-STAT3 (Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit monoclonal antibody #9145), Stat3 (79D7) Rabbit monoclonal antibody #4904), COX2 (Cox2 (D5H5) XP® Rabbit monoclonal antibody) #12282), p65 (Phospho-NF- ⁇ B p65 (Ser536) Rabbit polyclonal antibody #3031), NF- ⁇ B p65 (D14E12) XP® Rabbit monoclonal antibody #8242) were purchased from Cell Signaling Technology (Danver, USA). .
  • Anti-inducible nitric oxide synthase was purchased from Merck Millipore (Lake Placid, NY, USA), and anti-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) was purchased from Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). All reagents used in the experiment were of analytical grade or higher.
  • the composition of the extraction solvent was extracted under reflux by varying the concentration of ethanol at 0% (hot water) and 100%.
  • the extraction solvent was added in a weight ratio of 20 times that of the raw material, and extracted and filtered at 70 ° C. temperature conditions (hot water extraction at 100 ° C. for 2 hours (hot water extraction 4 hours)) (see FIG. 1).
  • 14 candidates were selected as index components of bamboo or mugwort extract (see FIG. 4). A total of 14 candidate marker components were selected through prior research and reference literature review, and an analysis method capable of simultaneously analyzing bamboo and mugwort was established.
  • the marker components of mugwort extract are scopolin (1), caffeic acid (2), scopoletin (5), and hyperoside (8).
  • Indicator components of bamboo extract are ⁇ -coumaric acid (3), orientin (4), ferulic acid (6), vitexin (7), tricine (Tricin) (14).
  • Example 1 Selection of specific mugwort extract and specific bamboo extract
  • mugwort was selected by comparing sandworm mugwort and heat keeper, and bamboo parts were selected by comparing cylinder, leaf, and bamboo shoot, respectively.
  • Conditions for each extraction method are shown in Table 2 below.
  • scopolin (1) caffeic acid (2), hyperoside (8), isoquercitrin (9), isochlorogenic acid B ) (10), isochlorogenic acid A (11), Scoparone (12), and isochlorogenic acid C (Isochlorogenic acid C) (13) peaks were confirmed, and eight marker components were identified. .
  • hyperoside (8) and scoparone (12) were not detected in the heat generator, so they were judged to be index components specifically appearing in sandwormwood.
  • the content of candidate marker components was high in hot water (ethanol 0%) conditions except for scoparone.
  • scopolin (1) caffeic acid (2), scopoletin (5), isochlorogenic acid B (10), isochlorogenic acid A (Isochlorogenic acid A) (11) and Isochlorogenic acid C (Isochlorogenic acid C) (13) were identified as marker components.
  • scopolin and scopoletin (5) were specifically shown. Only a small amount of scopoletin was detected in the high-vacuum extract.
  • scopolin and scopoletin were specifically shown. In particular, it was confirmed that scopolin was more abundant than wormwood, and it was judged to be an index component that appears specifically in hot weather.
  • the present inventors confirmed that the main active ingredients extracted by the same method are different depending on the specific type of mugwort, and decided to use sandalwood mugwort.
  • Sole material (bamboo) Candidate index component content ( ⁇ g/g) by part
  • Coumaric acid (coumaric acid) ferulic acid (ferulic acid) hyperoxide (Hyperoside) isochlorogenic acid A
  • Isochlorogenic acid A bamboo (cylinder) hot water extract 1.59 ⁇ 0.09 0.47 ⁇ 0.03 - 1.87 ⁇ 0.01 ethanol extract 1.45 ⁇ 0.03 - 0.29 ⁇ 0.01 1.98 ⁇ 0.03 high vacuum extract - - - - bamboo (leaf) high vacuum extract - - - - bamboo (Bamboo shoots) hot water extract 0.87 ⁇ 0.01 0.17 ⁇ 0.00 - - ethanol extract 0.95 ⁇ 0.02 2.64 ⁇ 0.06 - - high vacuum extract - - - - -
  • the content of the four candidate marker components detected was relatively higher in the 100% ethanol condition than in the hot water condition, but it was confirmed in a small amount, so no significant difference was confirmed. In addition, all candidate marker components were not detected in the high-vacuum extract.
  • the present inventors confirmed that the main active ingredients extracted by the same method were different depending on the specific part of bamboo, and decided to use bamboo shoots.
  • the oven temperature of the gas chromatography mass spectrometer was raised from 50 ° C to 300 ° C, the injector temperature was 250 ° C, and helium was used as a carrier gas.
  • the mass selective detector conditions were: capillary direct interface temperature 250 °C ion source temperature 230 °C ionization voltage 70 eV, mass range 50-550 a.m.u. And a scan rate of 2.2 scan/sec was used.
  • each component was identified by comparing with the NIST08 mass spectrum database.
  • the analysis conditions of the gas chromatography mass spectrometer are as follows (Table 6).
  • Table 7 shows the results of gas chromatography mass spectrometry of the vacuum extract of wormwood wormwood.
  • camphor occupies the highest proportion at 31.74% among the volatile organic compound components of the vacuum extract of wormwood, borneol (26.91%), longiverbenone ( 13.99%) and eucalyptol (10.10%) account for a relatively high proportion, and terpene hydrocarbons constitute most of them.
  • the volatile organic compound components of the raw material of wormwood have high peaks such as camphor (34.10%), borneol (16.13%), and eucalyptol (14.94%), the same as the vacuum extract. It was identified as a peak area and longiverbenone was not identified.
  • Camphor is a major organic compound component of wormwood, and has a refreshing feeling similar to mint flavor.
  • Eucalyptol is a major component of eucalyptus essential oil and is a monoterpene alcohol, also known as 1,8-Cineol. .
  • Caryophyllene (1.87%), which was identified only in the raw material, is known as a component that is contained in large amounts in cloves, lemons, grapefruits, and lavenders.
  • terpenoids such as thujone, camphor, borneol, terpinene, and terpineol are the main components. It is consistent with the contents of previous studies.
  • Tables 8 and 9 show the results of gas chromatography mass spectrometry for each of the bamboo cylinders, leaves, and vacuum extracts of bamboo shoots.
  • methyl salicylate occupied the highest proportion at 46.50%.
  • Methyl salicylate is an ester, and generally most esters have an odor and are the main component of fruit flavor. It has been reported that ester compounds having a carbon number of 10 or less form a lot of fruit flavor, and as the molecular weight increases, the scent becomes thick and flowery. Methyl salicylate is a naturally occurring ester in many food species, and is also synthesized and used in food and beverages, and is listed as a synthetic flavoring agent (control number M172) in the Food Additives Code.
  • Example 3 Efficacy evaluation of wormwood vacuum extract alone and bamboo shoot vacuum extract alone
  • DSS dextran sulfate sodium
  • Induction of colitis using sodium dextran sulfate is a model that is easily used because the method is simple and the rate of onset is fast.
  • Sodium dextran sulfate is a chemical that directly damages the epithelial cells that play the role of the barrier of the colon. It penetrates into the lamina basement, induces the activation of immune cells, and induces inflammation.
  • Induction of colitis by dextran sodium sulfate causes destruction of colonic epithelial cells and inflammation caused by intestinal bacteria.
  • Sodium dextran sulfate is a chemical Escherichia coli that has anticoagulant properties and induces epithelial disruption and intestinal inflammation.
  • mice were supplied with C57BL/6N (male, 7 weeks old, 20-22g) from Daehan Biolink (Korea) in a breeding environment at a temperature of 22-25°C and a relative humidity of 50 ⁇ 10%, with a 12-hour light/dark cycle (using fluorescent lights). After acclimatization for 1 week, it was used in the experiment. Feed exclusively for rodents (2918C, Teklad Global 18% Protein Rodent Diet, ENVIGO, Indianapolis, USA) was fed ad libitum during the acclimatization and test period.
  • rodents 2918C, Teklad Global 18% Protein Rodent Diet, ENVIGO, Indianapolis, USA
  • the healthy group was provided with tap water sterilized by high pressure, and in the case of the colitis induction group, DSS (Dextran Sulfate Sodium salt, MW 36,000-50,000 kD, MP Biomedicals, Canada) was dissolved in tap water autoclaved at a concentration of 2.5% for 5 days ( In the case of the 3-day test group, water was supplied freely for 3 days. After 5 days, the experimental animals in all groups were freely supplied with high-pressure sterilized tap water.
  • DSS Dispern Sulfate Sodium salt, MW 36,000-50,000 kD, MP Biomedicals, Canada
  • the vacuum extract was freeze-dried, suspended in phosphate-buffered saline (PBS) to a concentration of 250 mg/kg, and administered orally once a day. At this time, the same amount of PBS was orally administered to the healthy group and the positive control group.
  • PBS phosphate-buffered saline
  • mice corresponding to each group were anesthetized with Terrel solution (isoflurane, Gyeonggi Pharmaceutical, Asan, Korea). After blood was collected, the colon was removed openly to measure the length, and the weight was measured after the spleen was removed. In addition, the colon was used for disease activity score measurement, histological analysis, and Western blot analysis.
  • the large intestine was rolled from the proximal to the distal end and fixed with 4% formalin.
  • the fixed colon tissue was thoroughly washed with running water and then dehydrated with low to high concentration ethanol.
  • After passing through the process of clearing with xylene it was embedded in paraffin, and sections were prepared with a thickness of 4 ⁇ m using a tissue slicer. After attaching it to the slide, paraffin was removed using xylene and ethanol. After staining the nuclei with hematoxylin, they were washed with distilled water and the like, and the cytoplasm was stained with eosin. Thereafter, the slide was mounted and observed at 400X magnification using an optical microscope.
  • the degree of inflammatory cell infiltration, epithelial cell damage, and change in the mucous membrane were classified into 1 to 3 levels, respectively, and evaluated.
  • the inflammatory index is the sum of the inflammatory cell infiltration score and the intestinal mucosal damage score, and the most severe inflammatory index is 6 points.
  • F-actin cytoskeleton and intracellular filamentous actin (F-actin) analysis
  • F-actin was immunostained with fluorescently labeled phalloidin (Invitrogen, Alexa FluorTM 488 Phalloidin) and cell nuclei were immunostained with DAPI.
  • human colorectal cancer cells treated with the test substance were washed three times with PBS and fixed in 4% paraformaldehyde (methanol-free, Thermo Fisher) for 10 minutes. Thereafter, the cells were permeabilized with 0.1% Triton X-100, washed with PBS, and blocked with a blocking solution (1% BSA and 5% goat serum) at 25° C. for 1 hour.
  • a blocking solution 1% BSA and 5% goat serum
  • F-actin Alexa FluorTM
  • ZEISS Fluorescence microscope
  • SPECTRAMAX GEMINI EM fluorescence microplate reader
  • fluorescence wavelengths were set to 485 nm (excitation wavelengths) and 525 nm (emission wavelengths) conditions.
  • RhoA-GTP RhoA Activation Assay colorimetric G-LISA kit (cytoskeleton) and measured by the method suggested by the manufacturer.
  • absorbance was read at 490 nm using an xMarkTM microplate absorbance spectrophotometer (BioRad).
  • the blood collected from the orbit was treated with a combination of CD4-FITC, CD8a-PE, CD19-PerCP, and CD3e-APC antibodies, and reacted at room temperature for 15 minutes.
  • RNA extraction was performed using RNeasy Mini Kit (Qiangen, USA). Subsequently, qRT-PCR (Quantitative Real-Time PCR) was performed to quantitatively express RNA expression using a Taqman Array Mouse Immune Response plate (Cat# 4414079, ABI, USA). 100ng of the synthesized cDNA and 10 ⁇ l of Taqman Fast Advanced master mix (ABI, USA) were added and reacted under PCR conditions. PCR conditions were 40 cycles of 50 seconds at 95 ° C and 20 seconds at 60 ° C.
  • HT-29 Korea Cell Line Bank (KCLB), 30038) and Caco2 (Korea Cell Line Bank (KCLB), 30037.1)
  • KCLB Kirea Cell Line Bank
  • KCLB Caco2
  • Culture of each cell line was cultured by a method known in the art.
  • Human colon cancer cell lines were cultured in an incubator at 37° C. 5% CO 2 using an appropriate medium. Subculture was performed twice a week.
  • Cultured human colorectal cancer cells were used for western blot analysis, detection of NF- ⁇ B phosphorylation, ROS production, F-actin and RhoA activation analysis.
  • Protein analysis using human colorectal cancer cell lines For Western blot analysis of protein expression, proteins were extracted from cell lines treated with test substances using RIPA lysis buffer (Sigma Aldrich Co., St. Louis, USA).
  • Colon tissue was washed with cold PBS and lysed with RIPA buffer, Xpert protease inhibitor cocktail and Xpert phosphatase inhibitor cocktail solution (GenDEPOT, Katy, TX, USA). Then, tissue homogenates were centrifuged at 15,000 x g for 15 minutes at 4°C to extract proteins from the tissue.
  • Proteins extracted from human colon cancer cell lines and colon tissues were quantified using a BCA kit (Thermo scientific, USA), and the same amount of protein (20 ⁇ g) was subjected to electrophoresis on a 10% SDS-polyacrylamide gel. Proteins were transferred from the electrophoresis gel to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK), and after blocking with 5% skim milk for 1 hour at room temperature, each protein expression was analyzed. The following specific antibody to the protein was overnight at 4 ° C.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • ZO-1 (Rabbit polyclonal to ZO1 tight junction protein, 1:1000, ab96587), BCL-xL (Rabbit polyclonal antibody, 1:1000, CST, #2762) BAX (Rabbit polyclonal antibody, 1:1000, CST, #2772 ), COX2 (1:1000, Cell Signaling Technology), LC3 ⁇ (Rabbit polyclonal antibody, 1:1000, Abcam, ab51520), STAT3 (1:1000, Cell Signaling Technology), Stat3 (1:1000, Cell Signaling Technology), Inos (1:1000, Merck Millipore)), GAPDH (1:5000, Santa Cruz Biotechnology).
  • the cultured cells were cultured for 24 hours in a culture medium treated with 2% DSS alone or bamboo combination extract (BA 50:50, 200 ⁇ g/ml) together. Subsequently, NF- ⁇ B activity was measured in the cells using the NF- ⁇ B p65 (Total/Phospho) Human InstantOneTM ELISA Kit (15500797, Invitrogen, USA) by the method provided by the manufacturer. Absorbance was measured at 450 nm calibrated to 650 nm using an xMarkTM microplate absorbance spectrophotometer (BioRad, Hercules, CA, USA).
  • DCF-DA reagent cell-permeant 2',7 '-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA) (dichlorofluores cin diacetate, Sigma, USA) was treated together, incubated for 30 minutes, and then washed. At this time, the DCF-DA reagent was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) and then washed in PBS. It was used after diluting to a final concentration of 100 ⁇ M.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • mice in the DSS induction group and in the control group 250 mg/kg of either the wormwood vacuum extract alone or the bamboo shoot vacuum extract alone were administered, respectively, and the disease activity index, weight change, diarrhea index, and bloody stool index were measured (FIGS. 10 to 13).
  • the disease activity index increased (up to 7.67) according to the DSS treatment period (0 to 5 days).
  • the bamboo shoot vacuum extract alone treatment group indicated as 100:0, 7.00, 8.7% decrease
  • the wormwood vacuum extract alone treatment group indicated as 0:100, 5.20, 32.2% decrease
  • the disease activity index decreased.
  • the bamboo shoot vacuum extract alone treatment group and the wormwood vacuum extract alone treatment group showed a lower increase in disease activity index than the DSS treatment group (FIG. 10).
  • Body weight changes were mostly decreased compared to the control group due to DSS treatment (FIG. 11).
  • a decrease in colon length is a biological marker for colon inflammation in a DSS-induced animal model (World J Gastroenterol. 2017 Sep 7;23(33):6016-6029.).
  • HE staining was performed on the large intestine to confirm the protective effect of the extract on mucosal inflammation.
  • the mouse colon tissue is divided into mucosa, submucosa, and muscularis tissue from the lumen direction.
  • the epithelial barrier formed by a continuous layer of superficial epithelial cells serves to prevent penetration of bacteria and other antigens into the mucosa, and the epithelial layer is critically dependent on oxygen and nutrients delivered by blood flow through the mucosal microvessels.
  • Ulcerative bowel disease is characterized by intractable chronic ulceration and inflammation of the colonic mucosa, and it is reported that epithelial barrier dysfunction, in which bacteria and other antigens penetrate the mucous membrane, is one of the major causes of ulcerative colitis.
  • FIG. 15 Looking at the histological score (FIG. 15), it can be seen that the histological score and inflammatory response were lower than those of the DSS-induced mouse group when the vacuum extract of Artemisia wormwood and the vacuum extract of bamboo shoots were administered.
  • the epithelial cells and crypts seen in the mucosa and submucosa were consistent in shape, barrier collapse and immune cell infiltration ) was also not observed.
  • ROS production levels were analyzed in two DSS-treated human colorectal cancer cell lines (HT-29, Caco2) using a fluorescent DCFA-DA probe (FIGS. 16 and 17).
  • the increase in production of active oxygen by DSS treatment can be observed through a fluorescence microscope, and when the change in production of active oxygen is confirmed using a fluorescence microplate reader, the production of active oxygen is increased by 160 to 200% or more in each cell.
  • ROS production was decreased by BS treatment or AC treatment in DSS-treated HT-29 and Caco2 cells.
  • HT-29 and Caco2 cells treated with bamboo shoot vacuum extract alone were 108.32 ⁇ 13.73% and 105.11 ⁇ 5.66%, respectively. They were ⁇ 7.46% and 108.25 ⁇ 8.50%.
  • DSS-treated cells denoted as DSS
  • CON untreated cells
  • BS or AC-treated cells confirmed that F-actin formation was reduced compared to DSS-treated cells.
  • the active RhoA protein was increased by DSS treatment (over 1200% compared to the normal control group), and the active RhoA protein was increased in the DSS-only treatment group by the treatment of the wormwood extract or bamboo shoot extract. It was confirmed that it was reduced by 21 to 25% compared to (FIG. 20).
  • DSS-treated HT-29 and Caco2 cells were 0.52 ⁇ 0.02 and 0.50 ⁇ 0.04, BS-treated HT-29 and Caco2 cells were 0.41 ⁇ 0.07 and 0.39 ⁇ 0.04, respectively, and AC-treated HT-29 and Caco2 cells were 0.42 ⁇ 0.03 and 0.37 ⁇ 0.004, respectively.
  • ZO-1 tight junction protein
  • Bcl-xl anti-apoptotic protein
  • COX2 inflammatory mediated protein, cyclooxygenase-2
  • ulcerative colitis-related marker proteins in DSS and vacuum extracts of bamboo shoots (BS) and wormwood (AC) were confirmed using human DSS-induced mice and control mice.
  • Bcl-xl and BAX which are apoptosis-related proteins increased by DSS treatment
  • a decrease in the expression was confirmed when the vacuum extract of Artemisia artemisia or the vacuum extract of bamboo shoots was treated.
  • COX2 an immune-inducing protein, according to DSS treatment was similarly reduced to that of the normal control group when the vacuum extract of rhododendron artemisia or the vacuum extract of bamboo shoots was treated.
  • the expression of the autophagy activation marker protein (LC3 ⁇ ) was found when the vacuum extract of rhododendron artemisia (indicated as 0:100) or the vacuum extract of bamboo shoots (indicated as 100:0) was treated in the same manner as in the improvement of intestinal damage. It was confirmed that the expression decreased most similarly to the normal control group.
  • Example 4 Efficacy evaluation of a combination of wormwood extract and bamboo shoot extract as a combined extract
  • a combination of rhododendron wormwood vacuum extract and bamboo shoot vacuum extract (hereinafter referred to as the combined extract) was administered to mice in the DSS induction group and control mice, and the disease activity index, weight change, diarrhea index, and bloody stool index were measured (FIG. 10 to 13 ).
  • the combined extracts were evaluated at ratios of 70:30, 50:50, and 30:70 of bamboo shoot vacuum extract and wormwood vacuum extract, respectively.
  • the disease activity index increased (up to 7.67) according to the DSS treatment period (0 to 5 days).
  • the combination extract by ratio of bamboo shoot vacuum extract and wormwood vacuum extract 70:30 (6.20, 19.2% decrease), 30:70 (5.80, 24.4% decrease), and 50:50 (5.80, 24.4% decrease) are all A decrease in the disease activity index was observed (FIG. 10).
  • the increase in the disease activity index was high according to the period, but in the group treated with the combination extract by ratio of the vacuum extract of bamboo shoots and the vacuum extract of Artemisia wormwood, the increase in the disease activity index was lower than that of the DSS-treated group.
  • the histological score was 5.6 ⁇ 0.54 in the large intestine of DSS-induced mice, and crypt distortion and inflammatory reactions such as mucosal and submucosal infiltrates were observed.
  • tissue staining results of the 50:50 administration group of the vacuum extract of bamboo shoots and the combination of wormwood extracts (marked as 50:50), partial epithelial cells and crypts seen in the mucous membrane and submucosa commonly found in the single administration group and the combined administration group at different ratios Disintegration and infiltration of immune cells in the submucosa were observed.
  • morphological disruption of the mucosal and submucosal regions and reduction of immune cell infiltration were observed compared to the single administration group and the combined administration group at different ratios. In particular, disruption of the epithelial cell layer, goblet cells, and crypt morphology was reduced overall.
  • the histological scores of 30:70, 70:30, and 50:50 vacuum extracts of bamboo shoots and combined extracts of Rhododendron wormwood were 4.8 ⁇ 0.44, 4.4 ⁇ 0.54, and 3.66 ⁇ 1.86, respectively.
  • the destruction of the mucosal structure was reduced and the ulcer was weakened compared to the colon tissue of the DSS-induced mouse.
  • the histological score was the lowest at 50:50 among the combined extract treatment groups of various ratios of bamboo shoot vacuum extract and wormwood vacuum extract, and also, when confirmed by staining the colon tissue, compared to the mixed extract treatment groups at various ratios.
  • the destruction of the colonic mucosal structure was the least, and the most weakened ulcer was observed.
  • ROS production levels were analyzed in two DSS-treated human colorectal cancer cell lines (HT-29, Caco2) using a fluorescent DCFA-DA probe (FIGS. 16 and 17).
  • the increase in production of active oxygen by DSS treatment can be observed through a fluorescence microscope, and when the change in production of active oxygen is confirmed using a fluorescence microplate reader, the production of active oxygen is increased by 160 to 200% or more in each cell. However, when the combined extracts were treated together, a decrease in active oxygen production increased by DSS was observed similar to that of the normal control group (Figs. 16 and 17).
  • bamboo shoot vacuum extract and wormwood vacuum extract are mixed at a ratio of 50:50 can prevent, treat, or improve inflammatory diseases.
  • the present inventors induced excessive actin bundle formation by DSS using human colorectal cancer cell lines HT-29 and Caco2, and evaluated the actin bundle formation by treating the combined extract of a combination of wormwood extract and bamboo shoot extract (FIG. 18, 19).
  • DSS-treated cells denoted as DSS
  • CON untreated cells
  • BS, AC and BS-treated cells confirmed that F-actin formation was reduced compared to DSS-treated cells.
  • BA-treated HT-29 and Caco2 cells not only reduced F-actin formation compared to DSS treatment, but also reduced F-actin formation compared to BS treatment or AC treatment.
  • RhoA-guanosine triphosphate (GTP) levels were measured to elucidate whether F-actin formation regulated by BA treatment was due to RhoA activity.
  • the active RhoA protein was increased by DSS treatment (over 1200% compared to the normal control group), and the active RhoA protein was increased by 21 ⁇ 21% compared to the DSS alone treatment group by treatment with the combination extract It was confirmed that it was reduced by 25% (FIG. 20).
  • DSS-treated HT-29 and Caco2 cells were 0.52 ⁇ 0.02 and 0.50 ⁇ 0.04, BS-treated HT-29 and Caco2 cells were 0.41 ⁇ 0.07 and 0.39 ⁇ 0.04, respectively, and AC-treated HT-29 and Caco2 cells were 0.42 ⁇ 0.03, 0.37 ⁇ 0.004, respectively.
  • BA-treated HT-29 and Caco2 cells were 0.38 ⁇ 0.04 and 0.33 ⁇ 0.01, respectively.
  • ZO-1 tight junction protein
  • Bcl-xl anti-apoptotic protein
  • COX2 inflammatory mediated protein, cyclooxygenase-2
  • marker proteins related to ulcerative colitis was confirmed according to the mixing ratio (200 ⁇ g/ml, 24h) of DSS and the combined extract of bamboo shoots (BS) and wormwood (AC) using human colorectal cancer cell lines.
  • Bcl-xl and BAX which are cell death-related proteins increased by DSS treatment
  • a decrease in expression was confirmed when the combined extract was treated with a combination ratio of 50:50 of bamboo shoot and wormwood, and COX2, an immunity-inducing protein, was also treated with DSS. It was confirmed that the increase in expression according to the complex extract (50:50) decreased most similarly to the normal control group.
  • the combination ratio of bamboo shoot vacuum extract and wormwood vacuum extract of 50:50 is the most effective in improving intestinal damage with respect to the mixing ratio of wormwood and bamboo shoot composite extract.
  • autophagy is an interaction between intestinal microbiota and inflammation in ulcerative colitis (Autophagy. 2020 Jan;16(1):38-51.) and autophagy in an ulcerative colitis model. This increase is known.
  • the large intestines of the group in which 2.5% DSS was administered to mice for 3 days (DSS group) and the combined extract group (BA group) in which vacuum extracts of artemisia artemisia and vacuum extracts of bamboo shoots were mixed at a ratio of 50:50 were extracted and Western blotting were used to detect colitis markers. Expression was confirmed.
  • DSS group The large intestines of the group in which 2.5% DSS was administered to mice for 3 days
  • BA group the combined extract group in which vacuum extracts of artemisia artemisia and vacuum extracts of bamboo shoots were mixed at a ratio of 50:50 were extracted and Western blotting were used to detect colitis markers. Expression was confirmed.
  • 250 mg/kg of the combined extract mixed with the vacuum extract of wormwood and vacuum extract of bamboo shoots at a ratio of 50:50 was orally administered, and the normal control group and the DSS-treated group were administered PBS.
  • FIG. 24 which quantifies the western blot results of FIG. 23 , on day 3, P-STAT3/STAT3 in the DSS group increased by 528.33% and COX2/GAPDH by 184.9% compared to the control group (indicated by CON). In contrast, P-STAT3/STAT3 and COX2/GAPDH in the combination extract administration group (indicated as BA) were decreased compared to the DSS group.
  • P-STAT3/STAT3 in the DSS group increased by 798.43%, COX2/GAPDH by 428.53%, and iNOS/GAPDH by 322.19%, compared to the control group.
  • P-STAT3/STAT3, COX2/GAPDH, and iNOS/GAPDH in the combination extract administration group were decreased compared to the DSS group.
  • a combination extract (50:50 ratio) of bamboo shoot (BS) vacuum extract and wormwood (AC) vacuum extract was cultured for 24 hours in a culture medium treated with 200ug/mL. Afterwards, changes in NF- ⁇ B expression were confirmed (FIG. 25).
  • both HT-29 and Caco2 increased the expression of NF- ⁇ B (p-p65/total p65) in the DSS-treated group (indicated by -) by more than 200% compared to the control group (indicated by CON).
  • the combination extract administration group represented by BA is reduced compared to the DSS group.
  • the large intestines of the group in which 2.5% DSS was administered to mice for 3 days (DSS group) and the group administered with a combination extract mixed with wormwood vacuum extract and bamboo shoot vacuum extract in a ratio of 50:50 (BA group) were extracted and related to apotosis by qRT-PCR. Factors, immune-related factors, inflammation-related factors, and tumor-related factors were identified.
  • Apoptosis-related factors BAX (Apoptosis regulator BAX, also known as bcl-2-like protein 4), Bcl-2-like 1 (BCL2L1), Gzmb (Granzyme B), Fas (Fas receptor), FasL ( As a result of confirming the expression of Fas ligand) (FIG. 26), it was confirmed that the expression was suppressed in the BA group compared to the DSS-induced group.
  • C3 Complement component 3
  • CCL19 Chemokine (C-C motif) ligand 19
  • CCL2 chemokine (C-C motif) ligand 2)
  • Ccr7 C-C chemokine receptor type 7
  • CD38 cluster of differentiation 38
  • CD3E CD3e molecule, epsilon
  • CD4 cluster of differentiation 4
  • CD40 cluster of differentiation 40
  • CD68 cluster of differentiation 68
  • CD8a cluster of differentiation 8a
  • ICOS inducible T cell costimulator
  • Ptprc As a result of confirming the expression of Protein tyrosine phosphatase, receptor type (C) (Figs. 27 to 28), it was confirmed that the expression was suppressed in the BA group compared to the DSS-induced group.
  • CSF1 colony stimulating factor 1
  • CXCL11 C-X-C motif chemokine 11
  • IL-15 Interleukin 15
  • IL-1b Interleukin 1 beta
  • NF-KB1 Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit
  • Nos2 Nitric oxide synthase 2)
  • Ptgs2 Prostaglandin-endoperoxide synthase 2
  • Socs1 Suppressor of cytokine signaling 1
  • Socs2 Sycs2
  • Stat3 Signal transducer and activator of transcription 4
  • Stat6 Signal transducer and activator of transcription 6
  • Tnf Tuor recrosis factor
  • TNFRSF18 Tuor necrosis factor receptor superfamily member 18
  • Nfafc3 Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 3
  • Example 5 Evaluation of various concentrations of combined extracts of the combination of wormwood extract and bamboo shoot extract
  • the optimal ratio of 50:50 of wormwood vacuum extract and bamboo shoot vacuum extract was evaluated for inflammatory bowel disease efficacy at various concentrations.
  • DAI score ⁇ Disease activity index
  • the disease activity index for various concentrations of the combination extract is shown in FIG.
  • the graph of FIG. 34 is digitized in FIG. 36 (a).
  • the control group it started to rise from the second day of administration, and the highest score was observed on the fifth day.
  • the score was 3.38 on the 2nd and 4th days, and 5.63 on the 5th day, lower than the control group from the 3rd day.
  • the score was lower than that of the control group at 1.38 on the 3rd day, but there was no difference on the 4th and 5th days.
  • the 250mg/kg administration group was lower than the control group at 1.08 on the 3rd day, and 3.23 on the 4th day, lower than the control group.
  • the increase increased to 6, but it was lower than that of the control group, which was 6.55.
  • the score was lower than that of the control group, with 0.18 on the second day, 1.13 on the third day, 3.13 on the fourth day, and 6 points on the fifth day.
  • FIG. 36(b) The change in body weight for various concentrations of the combined extract is shown in FIG.
  • the graph of FIG. 35 is digitized in FIG. 36(b).
  • the diarrhea index for various concentrations of the combined extract is shown in 37.
  • the graph of FIG. 37 is digitized in FIG. 39 (a).
  • control group In the control group, it gradually increased until the 4th day, and then increased rapidly on the 5th day. On day 5, the control group scored 2.18 points, whereas 10 mg/kg had the largest difference at 1.13 points. 50mg/kg was 1.75, 250mg/kg was 1.69, and 1250mg/kg was 1.5, lower than the control group.
  • the hematologic index for various concentrations of the combined extract is shown in 38.
  • the graph of FIG. 38 is digitized in FIG. 39(b).
  • the bloody stool index of the combination extract administration group was all lower.
  • 10 m/kg increased to 0.25 on the second day, 0.75 on the third day, 2.5 on the fourth day, and 4 points on the fifth day, lower than the control group.
  • bloody stool was not observed on the second day, and increased to 0.75 on the third day and 3.75 on the fourth and third days, similar to the control group.
  • the length of the large intestine at various concentrations of the combined extract is shown in 40.
  • the disease index (DAI score) on the 5th day of DSS administration was lower in wormwood than in bamboo shoots than in the control group.
  • the 250 and 1250 mg/kg groups showed lower DAI scores than the 10 and 50 mg/kg groups.
  • the bloody stool index showed the lowest score in the 250mg/kg group on the 3rd and 4th day of DSS administration compared to the control group, and then increased on the 5th day.
  • the bamboo shoot vacuum extract alone, the wormwood vacuum extract alone, and the combination extract in which the bamboo shoot vacuum extract and the wormwood vacuum extract were mixed had various effects such as reducing colon inflammation, damage to the mucosal structure of the colon, and protecting against ulcers.
  • the combination extract of bamboo shoot vacuum extract and wormwood vacuum extract was more effective in treating, preventing, or improving DSS-induced colitis than either bamboo shoot vacuum extract alone or wormwood vacuum extract alone.
  • the above examples prove the synergistic effect of the vacuum extract of bamboo shoots and the vacuum extract of wormwood.
  • the combination extract in which bamboo shoot vacuum extract and wormwood vacuum extract were mixed at a ratio of 50:50, showed higher efficacy against colon inflammation and colonic mucosal structure destruction and ulceration in DSS-induced colitis compared to treatment with a single vacuum extract of bamboo shoots or a single vacuum extract of wormwood. support that it can be protected.
  • the treatment with the combined extract mixed at 50:50 of the present invention reduced NF- ⁇ B and STAT3 activities and the expression of COX2 and iNOS in the DSS-induced mouse model (FIG. 23), indicating that the combined extract was effective against DSS-induced colitis. provides evidence indicating an anti-inflammatory effect in
  • RhoA-GTP active form of RhoA
  • RhoA/ROCK-STAT3 signaling pathway is involved in the pathogenesis of colon inflammation and colitis.
  • the above examples show that the combined extract of bamboo shoot vacuum extract and wormwood vacuum extract contributes to reducing colon inflammation by reducing NF- ⁇ B-STAT3 phosphorylation and RhoA/ROCK activity.
  • the combined extract has a therapeutic role in colitis, resulting in weakened destruction of the colonic mucosa and ulcer structure.
  • the present application may provide a composition for preventing or treating intestinal diseases composed of a vacuum extract of rhododendron wormwood or/and a vacuum extract of bamboo shoots, and a method for preparing the same.

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Abstract

본 출원은 사철쑥 추출물 또는/및 죽순 추출물로 구성된 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

사철쑥 및 죽순 추출물을 포함하는 장질환 예방 또는 치료용 조성물
본 출원은 사철쑥 진공추출물 또는/및 죽순 진공추출물로 구성된 장질환 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 출원은 상기 조성물의 다양한 용도에 관한 것이다.
장 질환(bowel disease)은 소장과 대장 등의 소화기관에 염증을 일으키는 모든 질환을 의미한다. 장질환에는 염증성 장질환, 장 섬유화 등이 있다.
염증성 장질환은 크론병(Chron's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 장형 베체트병, 장결핵, 장염 등이 포함된다.
특히 장 섬유화의 경우, 장질환의 합병증으로도 주로 나타나는데 이는 장질환 발병시 만성적 염증이 진행되어 근섬유아세포에 의해 세포외 기질(extracellular matrix, ECM) 단백질이 장조직에 과도하게 침착되면서 섬유화로 진전되어 발생한다.
장질환이 발병하면 주로 복통, 설사, 혈변, 체중 감소, 직장 출혈 등의 증상이 일어난다. 이러한 증상들이 수개월간 나타나며, 이로 인해 염증이 반복되어 악화, 호전, 재발을 반복한다.
현재까지 장질환의 원인은 뚜렷하게 밝혀지지 않았으나, 유전적, 면역학적, 환경적 요인 등 다복합적 요인에 의해 발병하는 것으로 추정하고 있다. 다만, 염증성 매개 인자와 면역세포의 활성화가 중요한 병인일 것으로 추정만 되고 있다.
현재까지 장질환 치료제는 대부분 화합물이다. 약제는 크게 3가지로 분류된다. 첫째로, 프로스타글라딘(prostaglandins)의 생성을 차단하는 5-아미노살리실산(5-aminosalicylic acid, 5-ASA) 계통 약물로, 예를 들어, 설파살라진(sulfasalazine), 메살라진(mesalazine) 등이 있다. 둘째로, 스테로이드이다. 셋째로, 면역력을 조절하는 6-Mercaptopurine(6-MP)과 azathioprine(AZA) 등의 면역 조절제이다. 하지만, 재발과 부작용이 심해, 여전히 완치를 기대할 수 있는 약물은 없는 실정이다.
한편, 천연 추출물은 신약 개발의 새로운 돌파구로 주목받고 있다. 특히, 대한민국과 중국, 일본 등은 천연물을 임상적으로 사용해온 역사가 매우 오래되었으며, 화합물 의약품에 비해 상대적으로 높은 안전성과 적은 부작용의 장점을 가지고 있다.
따라서, 장질환에 대해 효과적인 치료제의 개발이 요구되고 있는 바, 이에 유용한 천연 추출물의 개발이 요구되어진다.
본 출원의 일 과제는, 사철쑥 진공추출물 또는/및 죽순 진공추출물로 구성된 염증성 장질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 출원의 다른 과제는, 사철쑥 진공추출물 또는/및 죽순 진공추출물로 구성된 장 섬유화 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 출원의 다른 과제는, 상기 진공추출물 및 이를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 출원의 또 다른 과제는, 상기 조성물의 다양한 용도를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 출원은 전술한 상기 과제를 해결하기 위하여,
본 출원은 일 구체예로서, 사철쑥(Artemisia capillaris Thunberg) 진공추출물 및 죽순 진공추출물(Bamboo shoot)을 유효성분으로 포함하고, 이 때, 상기 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물은 70:30, 50:50 및 30:70 중 선택되는 하나의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 염증성장질환 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 제공한다.
본 출원의 다른 구체예로서, 사철쑥(Artemisia capillaris Thunberg) 진공추출물 및 죽순 진공추출물(Bamboo shoot)을 유효성분으로 포함하고, 이 때, 상기 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물은 70:30, 50:50 및 30:70 중 선택되는 하나의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는 대장 또는 소장의 섬유화 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물이 제공된다.
본 출원의 다른 구체예로서, 사철쑥(Artemisia capillaris Thunberg) 진공추출물 및 죽순 진공추출물(Bamboo shoot)을 유효성분으로 포함하고, 이 때, 상기 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물은 70:30, 50:50 및 30:70 중 선택되는 하나의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는, 장 건강에 관련된 질환을 개선을 위한 건강기능 식품 조성물이 제공된다.
이 때, 상기 염증성장질환은 크론병, 궤양성 대장염, 베체트장염 중 선택되는 어느 하나 이상인 조성물을 제공한다.
이 때, 상기 사철쑥 추출물 및 죽순 추출물은 50:50의 중량비로 조성물 내에 포함되어 있는 조성물을 제공한다.
상기 사철쑥 진공추출물은 클로로겐산(chlorogenic acid), 스코파론 (scoparone), 스코폴레틴(scopoletin), 스코폴린(scopolin), 피쿠식산(ficusic acid), 쿠마린(coumarin), 피넨(pinene), 유칼립톨(eucalyptol), 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 테르피넨 (Terpinene), 아브시스산 (Abscisic acid), P-사이멘(p-Cymene), 베르가모텐(Bergamotene), 지베렐린 (Gibberellin), 보르네올(borneol), 캠퍼(Camphor), 카페산(Caffeic acid), 하이페로사이드(Hyperoside), 이소케르세틴(Isoquercitrin), 이소클로로겐산 A(Isochlorogenic acid A), 이소클로로겐산 B(Isochlorogenic acid B), 이소클로로겐산 C(Isochlorogenic acid C), 롱기베르베논(longiverbenone), 유제놀(Eugenol) 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하고 있는 조성물을 제공한다.
상기 죽순 진공추출물은 쿠마린산(coumaric acid), 페룰산(Ferulic acid), 하이페로사이드(Hyperoside), 이소클로로겐산 A (Isochlorogenic acid A), 옥살산(oxalic acid), 말산(malic acid), 살리실산메틸(Methyl salicylate) 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하고 있는 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 질병활성지수의 증가도가 낮아짐; 혈변지수의 증가도가 낮아짐; 설사지수의 증가도가 낮아짐; 대장 길이 길어짐; 대장 조직의 점막 구조 파괴가 감소됨; 궤양이 약화됨; 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성이 감소함; ZO-1의 발현 증가; Bcl-xl, BAX 또는 COX2의 발현 감소; 자가소화작용 활성형 마커(LC3β)의 발현 감소; 전염증성 인자(STAT3, COX2, iNOS)발현 감소; NF-κB의 발현 감소; 세포사멸(Apoptosis) 관련인자(BAX, BCL2L1, Gzmb, Fas, FasL)의 발현 감소; 면역 관련 인자(C3, CCL19, CCL2, Ccr7, CD38, CD3E, CD4, CD40, CD68, CD8a, ICOS, Ptprc)의 발현 감소; 염증 관련 인자(CSF1, CXCL11, IL-15, IL-1b, NF-KB1, Nos2, Ptgs2, Socs1, Socs2, Stat3, Stat4, Stat6, Tnf, TNFRSF18, Nfafc3, Nfatc4, Ly96)의 발현 감소; 종양 관련인자(Gusb gene, HMOX1, Lrp2, SKI, Smad3, Smad7, LIF, Agtr2, Edn1, Selp, Vcam1, Icam1)의 발현 감소; 중 선택되는 하나 이상의 효과를 가질 수 있다.
본 출원의 또 다른 구체예로서, 상기 조성물을 제조하는 방법으로,
사철쑥 및 죽순을 준비함;
사철쑥 및 죽순을 각각 진공추출장치로 진공추출하여 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물을 수득함;
상기 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물을 혼합함;
이 때, 상기 혼합은 상기 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물이 70:30, 50:50 및 30:70 중 선택되는 하나의 중량비로 혼합되는 방법이 제공된다.
상기 방법은 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물을 기체 크로마토그래피 질량분석법으로 분획화 하는 것을 더 포함할 수 있다.
상기 사철쑥 진공추출물 또는 죽순 진공추출물은 진공추출장치 조건을 200℃내지 300℃의 온도에서 15시간 내지 30시간 동안 1회 내지 5회 추출할 수 있다.℃
본 출원의 또 다른 구체예로서, 상기 염증성장질환 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 대상에 투여함;
을 포함하는 염증성장질환을 예방 또는 치료하기 위한 방법이 제공된다.
본 출원의 또 다른 구체예로서, 상기 대장 또는 소장의 섬유화 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물을 대상에 투여함;
을 포함하는 대장 또는 소장의 섬유화를 예방 또는 치료하기 위한 방법이 제공된다.
상기 투여의 부위는 근육, 피내, 피하, 정맥, 복강, 동맥, 심장, 점막, 척수, 골수 중 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 투여시 상기 조성물은 1회에 10mg/kg 내지 2000mg/kg의 용량으로 투여할 수 있다.
본 출원에 따르면 다음과 같은 효과가 발생된다.
첫째, 본 출원에 의하면, 사철쑥 진공추출물 또는/및 죽순 진공추출물로 구성된 염증성 장질환 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
둘째, 본 출원에 의하면, 사철쑥 진공추출물 또는/및 죽순 진공추출물로 구성된 장 섬유화 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
셋째, 본 출원에 의하면, 상기 조성물을 제조하는 방법을 제공할 수 있다.
넷째, 본 출원에 의하면, 상기 조성물을 이용한 다양한 용도를 제공할 수 있다.
도 1은 특정 식물의 선정을 위해, 본 출원의 실시예에서 사용한 열수추출법 및 에탄올추출법의 과정을 도시한 도면이다.
도 2는 본 출원의 실시예에서 사용한 사철쑥 진공추출물을 수득하기 위한 진공추출법의 과정을 도시한 도면이다.
도 3은 본 출원의 실시예에서 사용한 죽순 진공추출물을 수득하기 위한 진공추출법의 과정을 도시한 도면이다.
도 4는 본 출원의 실시예에서 사용한 후보 지표성분을 나타내는 도면이다.
도 5는 사철쑥을 추출방법별로 추출한 추출물을 분석한 결과를 나타내는 도면이다. (a)는 열수 추출법; (b)는 에탄올 추출법; (c)는 진공추출법;을 이용하였다.
도 6은 더위지기를 추출방법별로 추출한 추출물을 분석한 결과를 나타내는 도면이다. (a)는 열수 추출법; (b)는 에탄올 추출법; (c)는 진공추출법;을 이용하였다.
도 7은 대나무 원통을 추출방법별로 추출한 추출물을 분석한 결과를 나타내는 도면이다. (a)는 열수 추출법; (b)는 에탄올 추출법; (c)는 진공추출법;을 이용하였다.
도 8은 대나무 잎의 진공추출물을 분석한 결과를 나타내는 도면이다.
도 9는 대나무 죽순을 추출방법별로 추출한 추출물을 분석한 결과를 나타내는 도면이다. (a)는 열수 추출법; (b)는 에탄올 추출법; (c)는 진공추출법;을 이용하였다.
도 10은 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물을 다양한 비율로 투여하여 질병활성지수를 분석한 결과이다. 도면에서 BA는 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물을 지칭한다. 도 10의 (a)는 질병활성지수 그래프; (b)는 (a)를 수치화한 것이다.
도 11은 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물을 다양한 비율로 투여하여 체중변화를 분석한 결과이다. 도면에서 BA는 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물을 지칭한다. 도 11의 (a)는 체중변화 그래프; (b)는 (a)를 수치화한 것이다.
도 12는 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물을 다양한 비율로 투여하여 혈변지수를 분석한 결과이다. 도면에서 BA는 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물을 지칭한다. 도 12의 (a)는 혈변지수 그래프; (b)는 (a)를 수치화한 것이다.
도 13은 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물을 다양한 비율로 투여하여 설사지수를 분석한 결과이다. 도면에서 BA는 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물을 지칭한다. 도 13의 (a)는 설사지수 그래프; (b)는 (a)를 수치화한 것이다.
도 14는 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물을 다양한 비율로 투여하여 대장 길이를 분석한 결과이다. 도면에서 BS는 죽순 진공추출물을; AC는 사철쑥 진공추출물을 지칭한다. 도 14의 (a)는 대장 길이 사진; (b)는 (a)를 그래프화한 것이다.
도 15는 도 14의 대장을 조직학적으로 관찰하기 위해, HE 염색을 한 것이다. 도 15의 (a)는 대장을 염색한 사진; (b)는 (a)를 그래프화한 것이다.
도 16(도 16a 및 도 16b) 및 17(도 17a 및 도 17b)은 인간 대장암 세포주인 HT-29 및 Caco2 세포 각각에서 ROS(reactive oxygen species)를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 각 도면의 (a)는 형광현미경 분석 사진; (b)는 (a)를 그래프화한 것이다.
도 18(도 18a 및 도 18b) 및 19(도 19a 및 도 19b)는 인간 대장암 세포주인 HT-29 및 Caco2 세포 각각에서 F-actin을 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 각 도면의 (a)는 형광현미경 분석 사진; (b)는 (a)를 그래프화한 것이다.
도 20(도 20a 및 도 20b)은 인간 대장암 세포주에서 RhoA를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 20의 (a)는 HT-29세포; (b)는 Caco2세포;이다.
도 21은 DSS 유도 궤양성 대장염 마우스 모델에서 장건강 관련인자를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 22은 DSS 유도 궤양성 대장염 마우스 모델에서 서 자가소화 관련인자를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 23은 DSS 유도 궤양성 대장염 마우스 모델에서 장손상 관련인자인 STAT3, COX2, iNOS를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 24는 도 23의 결과를 그래프화한 것이다.
도 25는 인간 대장암 세포주에서 NF-κB(p-p65/total p65)를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 25의 (a)는 HT-29세포; (b)는 Caco2세포;이다.
도 26은 세포사멸 관련 인자를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 27 및 28은 면역관련 인자를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 29 내지 31은 염증관련 인자를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 32 및 33은 종양관련 인자를 측정한 결과를 나타낸 도면이다.
도 34는 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물의 조합추출물(50:50 비율) 투여군의 질병활성지수를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 34의 (a)는 10mg/kg 농도; (b)는 50mg/kg 농도; (c)는 250mg/kg 농도; (d)는 1250mg/kg농도;로 투여하여 측정한 것이다.
도 35는 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물의 조합추출물(50:50 비율) 투여군의 체중 변화를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 35의 (a)는 10mg/kg 농도; (b)는 50mg/kg 농도; (c)는 250mg/kg 농도; (d)는 1250mg/kg농도;로 투여하여 측정한 것이다.
도 36은 도 34 및 35를 각각 수치화한 것이다.
도 37은 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물의 조합추출물(50:50 비율) 투여군의 설사지수를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 37의 (a)는 10mg/kg 농도; (b)는 50mg/kg 농도; (c)는 250mg/kg 농도; (d)는 1250mg/kg농도;로 투여하여 측정한 것이다.
도 38은 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물의 조합추출물(50:50 비율) 투여군의 혈변지수를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 38의 (a)는 10mg/kg 농도; (b)는 50mg/kg 농도; (c)는 250mg/kg 농도; (d)는 1250mg/kg농도;로 투여하여 측정한 것이다.
도 39는 도 37 및 38을 각각 수치화한 것이다.
도 40은 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물의 조합추출물(50:50 비율) 투여군의 대장길이 변화를 측정한 결과를 나타낸 도면이다. 도 40의 (a)는 대장 길이 사진; (b)는 (a)를 그래프화 한 것; (c)는 무게당 대장길이를 측정한 것; (d)는 (b)를 수치화한 것; (e)는 (c)를 수치화한 것;이다.
달리 정의되지 않는 한, 본 출원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본 출원에 기재된 것과 유사 또는 동일한 방법 및 물질이 본 출원의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 이하에 기재된다. 본 출원에서 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 논문 및 다른 참고문헌은 전체가 참고로 포함된다. 추가로, 물질, 방법 및 실시에는 단지 예시적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
● 용어 정의
본 출원에서 사용되는 용어 "추출"은 목적하는 식물체로부터 특정 성분을 분리해내는 과정을 지칭한다. 상기 추출은 필요에 따라, 추가로 정제, 농축 등을 더 수행할 수 있다. 또한 상기 추출물의 형태는 고체, 액체 등일 수 있다. 본 출원에서 추출은 다양한 공지의 방법을 사용할 수 있으나, 특히 대표적인 예로써 진공추출법으로 식물체로부터 유효성분을 분리해내는 것을 의미할 수 있다.
본 출원에서 사용되는 "추출물"은 상기 추출과정, 바람직한 예로써, 진공추출법을 이용하여 얻어진 특정 물질을 지칭한다. 상기 추출물은 추출처리에 의해 얻어지는 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 이들의 조정제물 또는 정제물일 수 있다. 상기 추출물은 조추출물(Crude extract), 분획추출물 등을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 본 출원에서 사철쑥 추출물은 사철쑥 진공추출물을 의미하고, 죽순 추출물은 죽순 진공추출물을 의미한다. 따라서, 사철쑥 추출물 및 죽순 추출물은 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물과 상호교환 가능하게 사용된다.
본 출원에서 사용되는 용어 "함유"는 물질이 어떤 성분을 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 'A물질은 B물질을 함유한다', 'B물질은 A물질에 함유되어 있다'는 말의 의미는, B물질이 A에 포함되어 있다는 의미로 해석할 수 있다. 용어 "함유" 또는 "포함"은 상호교환 가능하게 사용된다.
본 출원에서 사용되는 용어 "조합(Combination)"은 최소 두 가지 이 상의 물질이나 요소를 적절한 조건을 이용하여 혼합한 것을 의미한다. 상기 물질이나 요소는 같은 물질이나 요소가 서로 다른 상태로 혼합된 것도 포함할 수 있다. 상기 물질이나 요소의 상태는 고체, 액체 등을 포함하나 이들에 한정하지 않는다. 상기 조건은 비율, 비중, 중량, 온도 등을 포함하며 이들에 한정하지 않는다. 용어 "조합" 또는 "혼합"은 상호교환 가능하게 사용된다. 본 출원에서 사철쑥 추출물과 죽순의 추출물을 혼합한 것을 "조합추출물(combined extract)"로 나타낸다.
본 출원에서 사용되는 용어 "유효(Effective)"는 물질, 요소 등이 직접적 또는 간접적 효과나 작용을 나타내는 상태를 의미한다. 상기 유효는 실험에 영향을 주는 수치, 양 등도 포함하여야 한다. 상기 물질이나 요소는 같은 물질이나 요소가 서로 다른 상태로 혼합된 것도 포함하여야 한다. 상기 유효는 생리학적 실험, 생화학적 실험 등을 통하여 얻어진 결과를 해석하는 데 사용하는 것도 포함하 여야 한다. 또한, 상기 유효의 효과나 작용은 상승, 억제, 감소, 증가 등을 포함하며 이들에 한정하지 않는다. 예를 들어, 'A물질은 B에게 유효하다'는 의미는 A물질은 B에게 효과가 있다는 것을 의미한다. 또한, 예를 들어, 'A물질은 B실험에서 유효량이 1.0% 이다'는 의미는 A물질은 B실험에서 1.0%에서 효과를 나타냄을 의미한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "유효량"은, 이롭거나 바람직한 임상적 또는 생화학적 결과에 영향을 주는 적절한 양이다. 유효량은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있다. 본 발명의 목적을 위하여, 유효량은 질병 상태의 진행을 일시적으로 완화, 개선, 안정화, 되돌림, 속도를 늦춤 또는 지연시키는데 적절한 양이다. 만약, 수혜동물이 조성물의 투여에 견딜 수 있거나, 조성물의 그 동물에의 투여가 적합한 경우라면, 조성물은 "약학적으로 또는 생리학적으로 허용가능함"을 나타낸다. 투여된 양이 생리학적으로 중요한 경우에는 상기 제제는 "치료학적으로 유효량"으로 투여되었다고 말할 수 있다. 상기 제제의 존재가 수혜 환자의 생리학적으로 검출 가능한 변화를 초래한 경우라면 상기 제제는 생리학적으로 의미가 있다.
본 출원에서 사용되는 용어 "치료"는 질환, 질병, 증상 등을 완화시 키거나 그 진행을 억제하는 것을 의미한다. 상기 치료는 물리적 치료, 약물적 치료, 심리적 치료, 화학적 치료 등을 포함하나 이들에 한정하지 않는다.
본 출원에서 사용되는 용어 "개선(Improvement)"은 기존의 상태, 기능, 효과, 형태 등의 부족한 것을 고치거나, 특정 요소를 추가, 새롭게 변형되어 좋게 된 것을 의미한다. 상기 개선을 판단하는 방법은 실험, 설문조사 등 객관적인 방법이나 주관적인 방법 모두를 포함하나 이들에 한정하지 않는다.
본 출원에서 사용되는 용어 "건강기능식품"은 물질, 요소 등을 일반 식품에 첨가하여 인체에 유용한 기능성을 가진 식품을 의미한다. 상기 물질, 요소는 화학적, 약학적, 약리적 등으로 변형 또는 가공된 것도 포함하여야 한다. 또한 상기 기능성은, 생리활성 기능, 심리학적 기능 등을 포함하며 이들에 한정하지 않는다. 상기 식품의 형태는 보조제 형태, 드링킹류 형태, 환 형태 등을 포함하며 이 들에 한정하지 않는다. 상기 건강기능식품은 기능성 효과가 일시적으로 나타나는 것도 포함하여야 한다.
본 출원에서 사용되는 용어 "약"은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.
● 종래 기술
지금까지 염증성 장질환 예방 또는 치료를 위한 조성물을 개발하기 위해 다양한 방법을 시도하고 있다. 염증성 장질환 환자는 과거 동양인에서는 비교적 드문 질환이었으나, 1980년대 이후 급격히 발병률이 증가하기 시작했다. 이후, 매년 증가하여, 2010년 대비 2019년에는 10년 새 약 2배이상 증가하였다.
한국 등록특허 제0465113호에서는 대나무 조추출물에서 트리신(tricin)을 분리하여 NO 생성 저해를 효과를 하여 염증 반응에 의해 발생하는 위염, 대장염, 관절염 등의 염증성 질환에 효과가 있다고 보고하고 있다.
한국 공개특허 제2009-0079608호에서는 애엽 추출물에서 염증성 사이토카인 분비 억제 효과를 확인하였다. 또한, 루푸스 동물모델, 뇌척수염 동물모델, 관절염 동물모델에서 염증 억제 효과를 확인하였다.
이와 같이, 현재까지 보고된 문헌들에서는 i)대나무의 특정 부위 또는 특정 종류의 쑥을 사용하는 것; ii)대나무의 특정 부위 및 특정 쑥을 조합하여 사용하는 것; iii)대나무의 특정 부위 및 특정 쑥을 용매를 사용하지 않고 추출하여 사용하는 것;에 따른 효과에 대하여 보고하고 있지 않다.
본 발명자들은, 장질환 예방 또는 치료에 효과가 탁월한 대나무의 특정 부위 또는 특정 쑥 종류를 찾는데 많은 노력을 기울였고, 나아가, 이러한 두 특정 식물의 조합에 따른 현저한 치료 효과에 대하여 연구하였다. 특히, 본 발명자들은 대나무의 특정 부위 및 특정 쑥으로부터 유효성분의 손실을 최소화하면서 효과적으로 추출물을 추출하기 위한 추출법을 찾았고 이를 이용하였다.
● 본 출원의 기술적 특징
본 출원은 대나무의 특정 부위의 추출물 또는 특정 종류의 쑥 추출물을 이용하는 약학적 효과(기능)를 특징으로 한다. 상기 대나무의 특정 부위 추출물 및 특정 종류의 쑥 추출물을 단독으로 또는 조합하여 이용할 수 있고, 바람직하게는 조합하여 이용할 수 있다.
본 출원에서 사용하는 대나무의 특정 부위는 죽순이고, 특정 종류의 쑥은 사철쑥이다.
특히, 본 발명의 일 구체예에서, 상기 죽순 및 사철쑥을 진공추출법으로 추출한 추출물을 단독으로 또는 조합으로 포함하는 조성물을 제공한다,
본 출원에서 사용하는 진공추출법은 재료의 탄화현상에 의한 갈변현상이 없고, 재료가 가지고 있는 수분 및 성분을 효과적으로 추출할 수 있는 이점이 있다. 본 출원에서 설명하는 일 발명은 대상 식물을 진공추출법으로 추출한 진공추출물을 이용하는 것을 특징으로 한다.
일 구현예에서, 본 출원의 조성물은 장 관련 질환의 예방 또는 치료 효과를 가진다.
일 예에서, 본 출원의 장 관련 질환은 염증성 장질환이다.
다른 예에서, 본 출원의 장 관련 질환은 장 섬유증(fibrosis)이다.
또한, 본 출원의 조성물은 이러한 특정 장 관련 질환의 의 예방 또는 치료 효과 이외에도, 다양한 장 건강 개선 효과를 가진다.
예를 들어, 자가소화작용(autophagy) 조절, 염증 감소, 면역활성 증가, 세포사멸 억제, 활성산소 생성 감소, 액틴다발 형성 억제, 장 길이 증가, 혈변 증상 완화, 설사 억제 등을 포함하는, 장 건강이 개선되는 효과를 나타낼 수 있다.
그러므로, 본 출원은 다음과 같은 기술적 특징으로 보유한다.
첫째, 본 출원의 조성물은 대나무의 특정 부위 추출물과 특정 쑥 추출물을 주요한 구성으로 이용한다.
둘째, 상기에서 선정한 죽순 추출물, 사철쑥 추출물을 단독 또는 조합으로 이용하되, 바람직하게는 조합하여 이용한다. 구체예에서, 목적하는 효과를 위한, 죽순 추출물 및 사철쑥 추출물의 최적 비율을 제공한다. 본 출원의 조성물은 우수한 염증성 장질환 예방 또는 치료 효과; 및 장 섬유화의 예방 또는 치료효과를 가진다.
셋째, 본 출원의 죽순 및 사철쑥은 진공추출법을 이용하여 추출한 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물로 사용한다.
넷째, 본 출원의 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물은 천연 식물 유래로서, 합성 화합물에 따른 부작용과 같은 문제점을 가지고 있지 않다.
이하에서, 상기의 기술적 특징을 지닌 본 출원의 사철쑥 추출물 또는/및 죽순 추출물로 구성된 약학적 조성물 및 이의 용도에 대해서 자세히 설명하도록 한다.
1. 진공 추출물
추출물은 열수추출법, 에탄올추출법, 수증기추출법, 진공추출법 등 다양한 추출법으로 추출될 수 있다. 이 때, 선택된 추출법에 따라 추출물이 가지는 유효성분의 종류 및 함유량 등의 구성이 상이하게 된다.
본 출원의 특정 식물의 추출물은 특히, 진공추출법으로 추출된 추출물이다(이하, 진공추출물로 지칭).
상기 진공추출법은 물을 전혀 사용하지 않으면서도 동식물 등의 약재료가 가지고 있는 수분 및 성분을 효과적으로 추출할 수 있는 방법이다. 구체적으로, 추출을 위해 고온으로 가열하는 증숙가공장치 내부온도를 공랭수단으로 낮추어서 약재에서 발생하는 수증기를 급속하게 응축수로 변질시키며 진공작용으로 고온에서 약재료에 갈변현상이 발생하지 않고 맑고 투명한 원액을 추출할 수 있게 하는 것이다.
이에 반해, 열수추출법이나 에탄올추출법은 추출하고자 하는 식물 재료와 용매(물, 에탄올 등)를 넣고 장시간 가열하여 성분을 추출하는 방법이다. 용매와 함께 식물 재료를 끓이면서 재료 내 성분이 추출되는 것이기 때문에 탄화현상이 발생될 수밖에 없다. 탄화현상이 발생되기 때문에 추출물이 시커멓거나 누런 색을 띠는 갈변현상도 동반된다. 특히, 재료 내 성분을 많이 추출하기 위해 오랜 시간동안 가열할수록 탄화현상이 가중된다. 또한, 재료를 용매에 가열하면 수분을 머금고 있는 잔재물을 추출하지 않는 이상 재료의 손실이 생길 수밖에 없다. 더군다나 수분으로 손상된 재료를 건조한다고 해도 완전한 건조가 불가능하여 상기 문제를 해결하기 어렵다.
본 출원의 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물은 용매를 이용하는 추출법을 이용할 때 발생하는 탄화현상에 의한 갈변현상이 없고, 약재료가 가지고 있는 수분 및 성분을 효과적으로 함유할 수 있다.
또한, 진공추출물은 열수추출물 또는 에탄올추출물 보다 인체 흡수율이 높다.
예를 들어, 사철쑥 진공추출물은 사철쑥 열수추출물 또는 사철쑥 에탄올추출물 보다 인체 흡수율이 1.5배 내지 100배 높다.
다른 예를 들어, 죽순 진공추출물은 죽순 열수추출물 또는 죽순 에탄올추출물 보다 인체 흡수율이 1.5배 내지 100배 높다.
본 출원은 사철쑥 진공추출물 또는/및 죽순 진공추출물에 관한 것이다.
1) 사철쑥 (Artemisia capillaris Thunberg) 진공 추출물
본 출원은 다양한 쑥 종류 중에서 사철쑥(Artemisia capillaris Thunberg, 이하 AC로 지칭.)을 진공추출법으로 추출한 사철쑥 진공추출물을 이용하는 것을 특징으로 한다.
상기 사철쑥 진공추출물은 사철쑥 원물(solvent-based original extract)에서 도출되지 않은 새로운 성분이 추출될 수 있다. 상기 사철쑥 원물(solvent-based original extract)이란 열수 추출법, 에탄올 추출법 등 용매 기반의 추출법에 의해 수득한 추출물을 의미한다. 이하에서 사철쑥 추출물을 사철쑥 진공추출물로 칭하기로 한다.
본 출원의 발명자는 사철쑥 추출물을 더위지기 추출물과 비교하여(표 3, 표 4 참고), 동일한 쑥 속에 속할지라도 "쑥 종류"에 따라서 성분의 함량이 상이함을 확인하였고, 사철쑥을 "어떤 방식"으로 추출하는지에 따라서 성분의 함량이 상이함을 확인하였다. 예를 들어, 사철쑥 추출물은 스코파론(Scoparone) 성분이 도출되고, 더위지기 추출물은 스코파론 성분이 도출되지 않을 수 있다. 다른 예를 들어, 사철쑥 열수추출물은 클로로겐산(chlorogenic acid)의 함량이 높고, 사철쑥 에탄올 추출물은 스코파론의 함량이 높을 수 있다.
이러한 세부분석 결과를 본 명세서 표 7에 도시한다. 본 출원의 사철쑥 진공추출물은 사철쑥 원물과 동일한 용량 내 주요 유효성분의 종류 및 함량이 상이하다. 예를 들어, 본 출원의 사철쑥 진공추출물은 사철쑥 원물에서 도출되지 않은 롱기베르베논(longiverbenone), 유제놀(Eugenol) 등을 포함한다.
본 출원의 사철쑥의 진공 추출물은, 일 구체예에서, 다음과 같은 성분을 포함할 수 있다.
Figure PCTKR2022020027-appb-img-000001
이는 종래 공지된, 용매를 이용하여 추출된 원물이 함유하고 있는 유효성분과 종류 및 함유량이 상이하다.
특히, 본 발명의 사철쑥 진공추출물은 주요 유효성분으로 캠퍼(Camphor), 보르네올(borneol), 롱기베르베논(longiverbenone), 유칼립톨(eucalyptol) 등을 포함하고, 대부분 테르펜 탄화수소(terpene hydrocarbon)류로 구성되어 있다.
일 실시예에서, 본 출원의 상기 사철쑥 진공추출물은 질병활성지수의 증가도가 낮아짐; 혈변지수의 증가도가 낮아짐; 설사지수의 증가도가 낮아짐; 대장 길이 길어짐; 대장 조직의 점막 구조 파괴가 감소됨; 궤양이 약화됨; ROS 생성이 감소함; ZO-1의 발현 증가; Bcl-xl, BAX 또는 COX2의 발현 감소; 자가소화작용 활성형 마커(LC3β)의 발현 감소;등의 효과를 가진다.
또한, 본 출원의 상기 사철쑥 진공추출물은 F-액틴 형성이 감소; RhoA 활성화의 약화;등의 효과도 가진다.
2) 죽순 (bamboo shoot) 진공 추출물
본 출원은 대나무의 다양한 부위, 예를 들어 껍질, 가지, 잎, 원통, 줄기, 죽순 등의 부위 중 "죽순(bamboo shoot, 이하 BS로 지칭.)"을 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 출원의 발명자는 대나무의 여러 부위를 비교하여, 같은 대나무일지라도 "부위"에 따라 성분의 종류 또는/및 함량이 상이함을 확인하였고, 죽순을 "어떤 방식"으로 추출하는지에 따라 성분의 종류 또는/및 함량이 상이함을 확인하였다(표 5 참고). 예를 들어, 대나무 원통에서는 하이페로사이드(Hyperoside), 이소클로로겐산 A(Isochlorogenic acid A)등의 성분이 도출되나, 대나무 죽순에서는 도출되지 않을 수 있다. 또 다른 예를 들어, 대나무 죽순을 열수추출법으로 추출하면 에탄올 추출법으로 추출하였을 때보다 페룰산(Ferulic acid)의 함량이 낮을 수 있다.
이러한 세부분석 결과를 표 8 및 9에 도시한다. 본 출원의 죽순 진공추출물은 죽순 원물 또는 대나무 잎 또는 대나무 원통과 동일한 용량 내 주요 유효성분의 종류 및 함량이 상이하다. 예를 들어, 죽순 진공추출물은 죽순 원물에서 도출되지 않은 살리실산메틸(Methyl salicylate), 벤조퓨란(Benzofuran), 피라진(Pyrazine) 등을 포함한다. 다른 예를 들어, 죽순 진공추출물은 대나무 잎에서 도출되지 않은 살리실산메틸(Methyl salicylate) 등을 포함한다. 본 출원의 죽순 진공 추출물은 다음과 같은 성분을 포함하고 있다.
Figure PCTKR2022020027-appb-img-000002
Figure PCTKR2022020027-appb-img-000003
이는 종래 공지된 용매를 이용하여 추출된 원물이 함유하고 있는 유효성분과 종류 및 함유량이 상이하다.
특히 본 발명의 죽순 진공추출물은 주요 유효성분으로 살리실산메틸(Methyl salicylate), 벤조퓨란(Benzofuran), 프로피온산 (Propionic acid), 베타-파나신센(beta-Panasinsene) 등을 포함한다.
일 실시예에서, 본 출원의 죽순 진공추출물은 질병활성지수의 증가도가 낮아짐; 혈변지수의 증가도가 낮아짐; 설사지수의 증가도가 낮아짐; 대장 길이 길어짐; 대장 조직의 점막 구조 파괴가 감소됨; 궤양이 약화됨; ROS 생성이 감소함; ZO-1의 발현 증가; Bcl-xl, BAX 또는 COX2의 발현 감소; 자가소화작용 활성형 마커(LC3β 등)의 발현 감소;등의 효과를 가진다.
또한, 본 출원의 상기 죽순 진공추출물은 F-액틴 형성이 감소; RhoA 활성화의 약화;등의 효과도 가진다.
3) 사철쑥 진공 추출물 및 죽순 진공 추출물의 조합
특히, 본 출원의 바람직한 일 태양으로, 사철쑥 진공 추출물 및 죽순 진공 추출물이 혼합된 조합추출물(combined extract)이 제공된다.
일 구체예로, 본 출원은 사철쑥 추출물 및 죽순 추출물이 30:70 또는 50:50 또는 70:30의 중량비로 혼합된 조합추출물일 수 있다. 바람직한 구체예로, 사철쑥 추출물 및 죽순 추출물이 50:50의 중량비로 함유된 조합추출물일 수 있다.
상기 조합추출물은 사철쑥 및 죽순의 각 단독추출물과 비교하여, 보다 더 우수한 효과를 나타낸다. 특히, 50:50의 중량비로 혼합된 조합추출물이 가장 뛰어난 효과를 가진다.
본 출원의 사철쑥 추출물, 죽순 추출물, 그리고 사철쑥과 죽순의 조합추출물은 모두 다음의 효과를 가진다. 그리고, 상기 조합추출물은 단독추출물과 비교하여 더 개선된 효과를 가진다:
질병활성지수의 증가도가 낮아짐;
혈변지수의 증가도가 낮아짐;
설사지수의 증가도가 낮아짐;
대장 길이 길어짐;
대장 조직의 점막 구조 파괴가 감소됨;
궤양이 약화됨;
활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성이 감소함;
ZO-1의 발현 증가;
Bcl-xl, BAX 또는 COX2의 발현 감소;
자가소화작용 활성형 마커(LC3β)의 발현 감소;
전염증성 인자(STAT3, COX2, iNOS)발현 감소;
NF-κB의 발현 감소;
세포사멸(Apoptosis) 관련인자(BAX, BCL2L1, Gzmb, Fas, FasL)의 발현 감소;
면역 관련 인자(C3, CCL19, CCL2, Ccr7, CD38, CD3E, CD4, CD40, CD68, CD8a, ICOS, Ptprc)의 발현 감소;
염증 관련 인자(CSF1, CXCL11, IL-15, IL-1b, NF-KB1, Nos2, Ptgs2, Socs1, Socs2, Stat3, Stat4, Stat6, Tnf, TNFRSF18, Nfafc3, Nfatc4, Ly96)의 발현 감소;
종양 관련인자(Gusb gene, HMOX1, Lrp2, SKI, Smad3, Smad7, LIF, Agtr2, Edn1, Selp, Vcam1, Icam1)의 발현 감소.
추가적으로, 조합추출물의 중량비 50:50을 10mg/kg, 50mg/kg, 250mg/kg 또는 1250mg/kg로 질병활성지수의 증가도가 낮아짐; 혈변지수의 증가도가 낮아짐; 설사지수의 증가도가 낮아짐; 대장길이 길어짐; 등의 효과를 확인했다. 이의 결과 조합추출물의 중량비 50:50으로 250mg/kg일 때 상기 효과가 가장 뛰어남을 확인하였다.
하기에서 본 출원의 상기 진공추출물을 수득하기 위한 추출방법에 대해 자세히 설명하도록 한다.
4) 추출방법
진공추출법은 고진공방식의 추출법으로, 증숙가공장치를 사용하여 고온에서 재료의 갈변현상이 발생하지 않고, 맑고 투명한 원액을 추출하는 방법이다. 특히, 본 출원은 증숙장치의 특수한 어셈블리 덮개를 사용하여 물을 전혀 사용하지 않으면서도 동식물 등의 약재료가 가지고 있는 수분 및 성분을 효과적으로 추출한다. 진공추출법은 가압추출법으로 불릴 수도 있다.
상기 진공추출법은 고진공추출법, 저진공추출법 등을 포함할 수 있다.
상기 진공추출법은 30℃ 내지 500℃의 온도에서 수행될 수 있다.
예를 들어, 사철쑥 진공추출물은 80℃ 내지 250℃의 온도에서 진공추출 할 수 있다. 죽순 진공추출물은 80℃ 내지 250℃의 온도에서 진공추출 할 수 있다.
상기 진공추출법은 2시간 내지 300시간 동안 추출하는 방법으로 수행할 수 있다.
예를 들어, 사철쑥 진공추출물은 48시간 내지 144시간 동안 추출하여 수득할 수 있다. 죽순 진공추출물은 48시간 내지 144시간 동안 추출하여 수득할 수 있다.
진공추출법은 추출하고자 하는 재료의 종류에 따라 추출되는 양을 다르게 할 수 있다.
예를 들어, 대나무 1kg을 진공추출법으로 추출시, 추출량이 약 4000cc일 수 있다. 사철쑥 1kg을 진공추출법으로 추출시, 추출량이 약 2500cc일 수 있다.
이 때, 상기 진공추출법에 사용되는 진공추출장치로, 당업자가 임의의 공지된 장비를 사용할 수 있다. 일 예를 들어, 본초진공원액추출기(제조사: (주)참맥, 한국)를 사용할 수 있다.
상기 진공추출물은, 컬럼 크로마토그래피(Column chromatography), 박층 크로마토그래피(Thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피 (High Performance Liquid chromatography, HPLC), 기체 크로마토그래피(gas chromatography, GC) 등으로 추가의 분획과정을 통해 분획물의 형태로 분리할 수 있다.
또한, 상기 방법은 불순물을 제거하거나 유효성분의 함량을 더 높이기 위해, 추가적인 정제법 및 농축법을 더 포함하여 수행할 수 있다.
상기 정제법은 예를 들어, 원심분리법, 여과법, 침강법, 에탄올 침전법, 물 침전법, 크로마토그래피법(Chromathgraphy) 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 농축법은 예를 들어, 증발농축법, 감압농축법, 동결농축법, 막분리농축법 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
본 출원의 일 구현예는, 사철쑥 진공추출물을 수득하는 방법 또는 죽순 진공추출물을 수득하는 방법에 관한 것이다.
예를 들어, 상기 사철쑥 진공추출물 또는 죽순 진공추출물을 수득하는 방법은,
사철쑥 또는 죽순을 준비함;
진공추출장치로 1차 진공추출함;
상기 1차 진공추출한 추출물을 2차 진공추출함;
를 포함할 수 있다.
상기 사철쑥 또는 죽순을 준비함;은 사철쑥 또는 죽순을 분쇄함; 및 사철쑥 또는 죽순을 물에 침전시킴(예를 들어, 물에 24시간 침전);을 포함할 수 있으나 이에 제한하지 않는다.
상기 1차 진공추출함; 및 2차 진공추출함;의 진공추출장치 온도 또는/및 추출시간은 서로 상이할 수 있다. 이 때, 상기 2차 진공추출함;은 1차 진공추출함;에 비해 진공추출장치의 온도가 낮을 수 있다.
예를 들어, 상기 1차 진공추출함;은 200℃내지 250℃의 온도에서 20시간 내지 30시간 동안 진공추출이 수행될 수 있고, 상기 2차 진공추출함;은 150℃내지 200℃의 온도에서 20시간 내지 30시간 동안 진공추출이 수행될 수 있다. 바람직하게는, 1차 진공추출은 230℃의 온도에서 23시간 동안 수행되고, 2차 진공추출은 170℃의 온도에서 25시간 동안 수행될 수 있다.
이는 진공추출법의 원리가 추출을 위해 고온으로 가열하는 증숙가공장치의 내부온도를 순환하여 냉각시키는 공랭방식으로 추출하는 것이기 때문이다. 이로 인해 발생하는 수증기를 급속하게 응축수로 변화시켜 진공작용으로 고온에서 약재료에 갈변현상이 발생하지 않고 맑고 투명한 원액을 추출할 수 있는 것이다.
한편, 상기 방법은 사철쑥이나 죽순의 지표성분의 함량 분석을 통해 추가적으로 추출물을 확인하는 과정을 선택적으로 더 포함할 수 있다.
이러한 확인과정은 컬럼 크로마토그래피(Column chromatography), 박층 크로마토그래피(Thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피 (High Performance Liquid chromatography, HPLC), 가스 크로마토그래피(gas chromatography, GC) 등으로 수행될 수 있다.
예를 들어, 사철쑥 추출물의 지표성분은 스코폴린(scopolin), 카페산(Caffeic acid), 스코폴레틴(scopoletin), 하이페로사이드(Hyperoside), 이소케르세틴(Isoquercitrin), 이소클로로겐산 B(Isochlorogenic acid B), 이소클로로겐산 A(Isochlorogenic acid A) 및 스코파론 (scoparone), 이소클로로겐산 C(Isochlorogenic acid C) 중 선택되는 하나 이상일 수 있다. 일 실시예에서, 사철쑥의 지표성분은 스코파론을 사용하였다.
다른 예를 들어, 죽순 추출물의 지표성분은 쿠마린산 (Coumaric acid), 오리엔틴(Orientin), 페룰산(Ferulic acid), 살리실산메틸(Methyl salicylate), 비텍신(Vitexin) 및 트라이신(Tricin) 중 선택되는 하나 이상일 수 있다. 일 실시예에서, 죽순의 지표성분으로 스코파론을 사용하였다.
이러한 지표성분의 확인을 통해, 특정 종의 쑥을 이용하는 것 및 특정 부위의 대나무를 이용하는 것에 따라, 추출물의 주요 유효성분의 종류 및 함량이 상이함을 확인할 수 있다.
본 출원은 구성적으로, i) 사철쑥 추출물, ii) 죽순 추출물, 또는 ii) 사철쑥 추출물 및 죽순 추출물이 혼합된 조합추출물을 이용하는 것을 특징으로 한다. 이러한 구성적 특징에 따라, 본 출원의 추출물은 이하 설명하는 현저한 약학적 효과를 가진다.
2. 본 출원 추출물의 효과 및 용도
본 출원은 사철쑥 추출물, 죽순 추출물, 또는 이들의 조합추출물은 장 건강에 관련된 질환의 예방, 치료 및/또는 개선에 효과를 가진다. 예를 들어, 장 건강에 관련된 질환은 염증성 장질환, 장 섬유화 등일 수 있다.
일 구체예로, 본 출원은 다음의 효과 및 이에 의한 용도를 제공한다:
(i) 염증성 장 질환 또는 예방; 또는
(ii) 장 섬유화 억제
[염증성 장질환]
염증성 장질환은 임상적으로 유사하면서 조직학적 소견과 내시경 및 면역학적 측면에서 서로 다른 궤양성 대장염(ulcerative colitis) 및 크론병(Crohh's disease)의 두 가지 질환으로 분류될 수 있다.
상기 염증성 장질환은 크론병(Chron's disease), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 장형 베체트병, 장결핵, 장염 등을 포함한다.
본 출원의 일 실시예로, 궤양성 대장염 동물 모델 또는 인간 대장암 세포주에 사철쑥 진공추출물; 또는 죽순 진공추출물; 또는 사철쑥 추출물 및 죽순 추출물이 혼합된 조합추출물;을 처리하여 염증성 장질환의 예방 또는 치료 효과들을 확인하였다.
염증성 장질환의 병리학적 및 임상적 특징은 장관 점막의 염증이며, 이는 비효율적인 상피 장벽 기능, 환경 요인, 유전적 감수성 또는 장내 미생물군에 대한 손상된 면역 반응에 의해 악화될 수 있는 것으로 알려져 있다.
장 면역계의 지속적이거나 부적절한 활성화는 만성 점막염 염증의 병리생리에서 중요한 역할을 하며, 특히 호중구, 대식세포, 림프구 및 비만세포의 침윤에 의해 결국 점막 파괴 및 궤양을 초래한다. 또한, 대장 염증은 결장 점막 파괴 및 궤양을 동반하여 염증성 단핵구 및 대식세포의 침윤 및 유판(lamina propria)의 비후를 초래하는 것으로 알려져 있다(Clin Microbiol Rev. 2002 Jan;15(1):79-94., Sci Rep. 2017 Apr 6;7:46252.). 그리고, 염증성 장질환으로 인해 혈변, 설사 등이 증가, 대장 길이가 감소되는 것으로 알려져 있다.
본 출원의 일 실시예로, 궤양성 대장염 동물 모델 또는 인간 대장암 세포주에 사철쑥 진공추출물; 또는 죽순 진공추출물; 또는 사철쑥 추출물 및 죽순 추출물이 혼합된 조합추출물;을 처리하여 면역세포의 침윤의 약간의 감소; 대장 조직의 점막 구조 파괴가 감소됨; 궤양이 약화됨; 질병활성지수의 증가도가 낮아짐; 혈변지수의 증가도가 낮아짐; 설사지수의 증가도가 낮아짐; 대장 길이 길어짐;을 확인하였다.
한편, 궤양성 대장염 환자 및 유도모델에서 활성산소 생성증가 및 관련 신호전달기전의 활성화가 알려져 있다(Mucosal Immunol. 2018 Jul;11(4):1011-1023, Gut. 2010 Sep;59(9):1192-9.). 특히, 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)의 과잉 생산은 염증성 질환의 진행 및 발병에 관여한다고 알려져 있다(Antioxid Redox Signal. 2014 Mar 1;20(7)).
본 출원의 일 실시예로, 궤양성 대장염 동물 모델 또는 인간 대장암 세포주에 사철쑥 진공추출물; 또는 죽순 진공추출물; 또는 사철쑥 추출물 및 죽순 추출물이 혼합된 조합추출물;을 처리하여 ROS 생성이 감소함;을 확인하였다.
궤양성 대장염 환자 및 유도모델의 장 조직에서 염증매개인자의 발현이 증가되며 과도한 염증반응으로 인해 장조직의 붕괴가 진행되는 것으로 알려져 있다. 더불어, 궤양성 대장염 환자 및 동물모델에서 장 내 장벽(intestinal epithelial barrier)의 유지에 있어 자가소화작용이 중요한 조절자로서 작용한다고 보고되고 있다(Autophagy. 2021 Apr 27;1-18.). 자가소화작용은 궤양성대장염에서 장내 미생물총(microbiota) 및 염증반응(inflammation)에서의 상호작용 (Autophagy. 2020 Jan;16(1):38-51.)과 궤양성 대장염 모델에서 자가소화작용이 증가됨이 알려져 있다.
본 출원의 일 실시예로, 궤양성 대장염 동물 모델 또는 인간 대장암 세포주에 사철쑥 진공추출물; 또는 죽순 진공추출물; 또는 사철쑥 추출물 및 죽순 추출물이 혼합된 조합추출물;을 처리하여 ZO-1의 발현 증가; Bcl-xl, BAX 또는 COX2의 발현 감소; 자가소화작용 활성형 마커(LC3β)의 발현 감소; 전염증성 인자(STAT3, COX2, iNOS)발현 감소; NF-κB의 발현 감소; 세포사멸(Apoptosis) 관련인자(BAX, BCL2L1, Gzmb, Fas, FasL)의 발현 감소; 면역 관련 인자(C3, CCL19, CCL2, Ccr7, CD38, CD3E, CD4, CD40, CD68, CD8a, ICOS, Ptprc)의 발현 감소; 염증 관련 인자(CSF1, CXCL11, IL-15, IL-1b, NF-KB1, Nos2, Ptgs2, Socs1, Socs2, Stat3, Stat4, Stat6, Tnf, TNFRSF18, Nfafc3, Nfatc4, Ly96)의 발현 감소; 또는 종양 관련인자(Gusb gene, HMOX1, Lrp2, SKI, Smad3, Smad7, LIF, Agtr2, Edn1, Selp, Vcam1, Icam1)의 발현 감소;를 확인하였다.
즉, 본 출원의 상기 진공추출물로 염증성 장질환의 예방 또는 치료효과를 다양한 관련 인자들의 발현 변화로 확인하였다.
[장 섬유화]
장 섬유화는 장기 일부가 굳는 현상으로 염증성 장질환의 합병증으로 발생한다. 염증성 장질환의 염증이 일부 호전되다가 재발되기를 반복하여 상처가 생기면서 딱딱 해지고 나아가 협착까지 일어나는 것이다.
섬유화는 장기 내 섬유질 결합조직(connective tissue)이 과도하게 형성되는 현상으로서, 장 내 환경에서 염증이 장기간 심해지면 장 섬유화로 나타나게 된다.
세포 내에서는 두 형태의 액틴[globular actin (G-actin)과 filamentous actin (F-actin)]이 존재하며, 이들의 homeostatic balance를 이루며 세포 형태(골격) 및 세포 활성을 조절함이 잘 알려져 있다.
특히 다양한 원인에 의해 발생하는 여러 장기(간, 폐, 장)의 섬유화는 염증세포의 이동, 사이토카인 분비, 성상세포의 활성화 등의 여러 단계를 거치게 되며, 조직 섬유화 과정에서의 세포의 과도한 액틴필라멘트형성 (F-actin polymerization or reorganization)이 주요한 타겟으로 설명된다 (Mol Med Rep. 2014 May; 9(5): 1641-1647.). 특히, 액틴다발형성이 증가되면 섬유화가 급격하게 증가한다고 알려져 있다.
본 출원의 일 실시예로, 궤양성 대장염 동물 모델 또는 인간 대장암 세포주에 사철쑥 진공추출물; 또는 죽순 진공추출물; 또는 사철쑥 추출물 및 죽순 추출물이 혼합된 조합추출물;을 처리하여 F-액틴 형성이 감소함;을 확인하였다.
그리고 RhoA 신호 전달 경로는 염증성 장질환의 메커니즘에 관여한다(Int J Clin Exp Med. 2015 Mar 15;8(3):3089-97.). 특히, RhoA 활성은 필라멘트 액틴(F-actin) 형성 및 운동성을 통해 세포골격 재배열을 조절한다고 알려져 있다(Science. 1998 Jan 23;279(5350):509-14., Cell Adh Migr. 2011 Mar-Apr;5(2):170-80., Cell Motil Cytoskeleton. 2005 May;61(1):21-33.).
본 출원의 일 실시예로, 궤양성 대장염 동물 모델 또는 인간 대장암 세포주에 사철쑥 진공추출물; 또는 죽순 진공추출물; 또는 사철쑥 추출물 및 죽순 추출물이 혼합된 조합추출물;을 처리하여 RhoA 활성화의 약화;를 확인하였다.
1) 조성물
본 출원은 일 구현예로서 상기 설명한 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.
본 출원의 조성물에 포함되는 특정 식물 진공추출물의 함량, 형태, 기타 구성 등은 조성물의 용도에 따라 상이할 수 있다. 상기 조성물은 약학적 조성물 또는 건강기능식품 조성물 일 수 있다.
1-1. 유효 성분의 함량
[단독 추출물인 경우]
사철쑥 진공추출물 또는 죽순 진공추출물 단독으로 상기 조성물에 포함될 때, 상기 조성물 전체 중량의 1wt% 내지 100wt%로 포함될 수 있다.
예를 들어, 상기 조성물 전체 중량의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50wt% 중 선택되는 두 수치 범위 이내 또는 선택되는 수치로 포함될 수 있다.
바람직하게, 상기 조성물 전체 중량의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 wt%중 선택되는 두 수치 범위 이내 또는 선택되는 수치로 포함될 수 있다.
[조합 추출물인 경우]
사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물이 혼합된 조합추출물이 상기 조성물 내 포함될 경우, 조성물 내 1~100 : 100~1 의 중량비로 포함될 수 있다:
예를 들어, 상기 사철쑥 추출물 및 죽순 추출물은 조성물 내 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 80:20 또는 90:10의 중량비로 포함될 수 있다.
일 구체예로, 본 출원의 조성물은 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물이 30:70 또는 50:50 또는 70:30의 중량비로 혼합된 조합추출물을 포함할 수 있다.
1-2. 조성물의 형태
상기 조성물은 액상 형태, 파우더 형태, 반고체 형태, 캡슐화 형태 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
이는 사용 목적에 따라 액상 형태의 일종인 현탁액 형태로 먼저 제조한 후 파우더 형태로 만들 수 있다.
예를 들어, 조성물의 유효성분 농축을 위해 또는 사용자의 편리성 또는 보관의 용이성을 위해 현탁액 형태로 제조한 뒤에 파우더 형태로 제조할 수 있다.
또한, 상기 액상 형태는 점도(viscosity)를 가지고 있을 수 있다.
1-3. 조성물의 기타 구성
상기 조성물의 기타 구성은 조성물의 용도에 따라 상이해질 수 있다. 이에 대해 편의상 약학적 조성물 및 건강기능 식품 조성물일 경우로 나누어 설명하도록 하겠다.
[약학적 조성물]
약학적 조성물은 상기 설명한 유효성분 이외에, 통상적인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제, 보존제 등을 더 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 담체, 부형제 및 희석제는 락토오즈(lactose), 덱스트로즈, 수크로스(sucrose), 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 증류수, 생리식염수 등일 수 있다.
예를 들어, 상기 보존제는 벤조산, 벤조산 나트륨, 소르빈산, 파라옥시벤조산, 클로로부탄올 등일 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물을 제제화할 경우 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제 등을 더 포함할 수 있다.
예를 들어, 약학적 조성물을 경구 투여를 위한 고형제제로 제제화할 경우, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함될 수 있다.
상기 약학적 조성물이 함유하는 기타 성분들은, 표적하는 질환에 따라 함량이나 비율 등이 달라질 수 있다.
[건강기능 식품 조성물]
건강기능 식품 조성물은 상기 설명한 유효성분 이외에, 통상적인 건강기능 식품에 허용가능한 향미제, 방부제, 착색제 등을 더 포함할 수 있다.
예를 들어, 상기 향미제는 타우마린, 스테비아 추출물, 사카린, 아스파르탐 등일 수 있다.
예를 들어, 상기 방부제는 토코페롤, 아질산염, 구연산, 벤조산, 소르브산 등일 수 있다.
예를 들어, 상기 착색제는 식용타르 색소, 크산트계 색소, 트라이페닐메테인계 색소 등일 수 있다.
건강기능 식품 조성물은 인체의 건강증진, 보건용도 등의 목적을 가진 통상적인 모든 것들을 포함할 수 있으며, 이들에 한정하지는 않는다.
인체의 건강증진은 물리적, 생화학적, 생물학적, 생리학적, 면역학 적, 치료학적, 심리학적 등 통상적인 건강증진에 해당하는 모든 것들을 포함할 수 있으며, 이들에 한정하지는 않는다.
건강기능 식품 조성물은, 상기 목적에 따라, 유용한 영양소, 기능적 성분 등을 첨가한 통상적인 모든 것들을 포함할 수 있으며, 이들에 한정하지는 않는다.
건강기능 식품의 종류는 비타민, 영양제, 캔디류, 스낵류, 분말류, 정제류, 캡슐류, 음료류 등 어느 하나 이상 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다.
건강기능 식품은, 식품의 섭취 시, 단기적 복용, 장기적 복용 등 복용 기간에 관계없이 건강기능 증진의 효과가 나타나는 통상적인 모든 것들을 포함할 수 있으며, 이들에 한정하지는 않는다.
건강기능 식품은 의약품, 보조의약품 등 어느 하나 이상 또는 그들의 조합과 함께 섭취할 수 있으나, 이들에 한정하지는 않는다.
일반적인 건강기능 식품은 대부분 화학성분의 작용으로 인하여, 건 강기능성 효과가 반감, 저해, 억제 등의 부정적 효과가 나타날 수 있다.
그러나, 본 발명의 상기 건강기능 식품 제조시 사용되는 진공추출물은 천연 성분이기 때문에, 건강기능 개선에 도움을 줄 수 있다. 천연 성분은 장기간 복용시에도 부작용의 초래가 거의 없다.
본 발명의 상기 건강기능 식품 제조시, 상기 특정 식물의 진공추출물을 필수적으로 포함하여 제조된다. 그러나 상기 진공추출물의 비율, 함량 등은 제한하지 않는다.
2) 치료방법
본 출원은 다른 구현예로서 상기 약학적 조성물을 이용한 장 관련 질환의 치료방법을 제공한다. 이 때, 상기 장 관련 질환은 염증성 장질환, 장섬유화 등일 수 있다.
일 예로, 염증성 장질환 예방 또는 치료를 위한 방법은,
사철쑥 진공추출물 또는 죽순 진공추출물 또는 이들이 조합된 조합추출물을 포함하는 약학적 조성물을 대상에 투여함; 을 포함한다.
다른 예로, 장섬유화 예방 또는 치료를 위한 방법은,
사철쑥 진공추출물 또는 죽순 진공추출물 또는 이들이 조합된 조합추출물을 포함하는 약학적 조성물을 대상에 투여함;을 포함한다.
상기 대상은 포유류, 어류, 조류, 유제류일 수 있다.
예를 들어, 상기 포유류는 사람, 개, 고양이, 마우스, 토끼 등일 수 있다. 바람직하게는 사람일 수 있다.
본 출원에서 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 대상에 본 출원의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미한다.
상기 투여는 대상의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 식이, 다른 약의 섭취 여부, 치료 기간 등을 고려하여 결정될 수 있다.
상기 투여는 상기 질환에 따라 약학적 조성물의 투여량, 투여횟수, 투여부위 등이 달라질 수 있다. 이는 상기 질환의 종류, 질환의 진행 정도 등에 따라 적절하게 사용하는 것이 바람직하다.
상기 투여는 경구 투여 또는 비경구 투여일 수 있다.
상기 비경구 투여는 주사 투여일 수 있다.
상기 주사 투여시 부위는 근육, 피내, 피하, 정맥, 복강, 동맥, 심장, 점막, 척수, 골수 등일 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
상기 조성물의 투여횟수는, 하루에 1회 또는 수회 투여할 수도 있고, 장기간에 걸쳐 수회 투여할 수도 있다. 이 때, 일정 기간 간격을 두고 투여할 수도 있다.
이 때, 상기 투여간격은 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일 등일 수 있다. 이 때, 연속투여 또는 비연속투여 할 수 있다.
상기 조성물은 1회에 10mg/kg 내지 2000mg/kg의 용량으로 투여될 수 있으나, 이에 제한하지 않는다.
예를 들어, 상기 조성물은 1회에 100mg/kg 내지 1000mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 다른 예를 들어, 상기 조성물은 1회에 200mg/kg 내지 500mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다.
일 구체예로, 사철쑥 진공추출물 또는 죽순 진공추출물 또는 이들의 조합추출물은 1회 당 10mg/kg 내지 1500mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다. 바람직하게는, 사철쑥 진공추출물 또는 죽순 진공추출물 또는 이들의 조합추출물은 1회에 250mg/kg의 용량으로 투여될 수 있다.
본 출원의 약학적 조성물은 질환의 치료, 예방 등을 위해 단독으로 사용할 수 있으나, 수술, 생물학적 치료, 화학적 치료 등과 병행하여 사용할 수도 있다.
상기에서 서술한 바와 같이, 본 출원의 사철쑥 진공추출물 또는/및 죽순 진공추출물로 구성된 조성물은 i) 다양한 쑥 종류 중 특정 쑥의 추출물을 이용한다는 점; ii) 대나무의 다양한 부위 중 특정 부위의 추출물을 이용한다는 점; iii) 상기 추출물을 진공추출법으로 추출한다는 점; iv) 특정 쑥 및 대나무의 특정 부위를 조합하여 이용한다는 점; v) 상기 조합추출물이 사철쑥 진공추출물 단독 또는 죽순 진공추출물 단독사용시 보다 다양한 효과가 뛰어나다는 점;에 기술적 의의가 있다. 이는 종래 다양한 쑥들 중에서 특정 질환에 최적인 특정 쑥을 이용하거나, 또는 대나무의 다양한 부위 중 특정 질환에 최적인 특정 부위를 이용하지 않는다는 점에서, 특정 질환에 최적의 효과를 발휘하고자는 목적으로 각고의 노력을 한 것이다. 또한, 나아가 특정 쑥 단독 또는 대나무 특정 부위 단독으로의 추출물을 조합하였을 때도 예상치 못한 효과를 발휘한다는 점에서 염증성 장질환, 장 섬유화뿐만 아니라 다양한 질환에도 효과가 있을 것으로 예상한다.
[발명의 가능한 구현예]
이하 본 출원에서 제공하는 일 구현예들을 예시로서 나열한다. 본 단락에서 제공하는 이하의 실시예들은 단지 발명의 일 예시에 해당될 뿐이다.
따라서, 본 출원에서 제공하는 발명을 하기 구현예로 제한하여 해석할 수 없다. 구현예 번호와 함께 기재된 간략한 설명 또한, 각 실시예 간 구분의 편의를 위한 것일 뿐 본 출원에서 개시하는 발명에 대한 제한으로 해석될 수 없다.
● 진공추출물
구현예 1: 사철쑥 진공추출물
적어도 롱기버베논(Longiverbenone)을 포함하는 사철쑥 진공추출물.
구현예 2: 유효성분 추가
구현예 1에 있어서,
상기 사철쑥 진공추출물은 클로로겐산(chlorogenic acid), 스코파론 (scoparone), 스코폴레틴(scopoletin), 스코폴린(scopolin), 피쿠식산(ficusic acid), 쿠마린(coumarin), 피넨(pinene), 유칼립톨(eucalyptol), 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 테르피넨 (Terpinene), 아브시스산 (Abscisic acid), P-사이멘(p-Cymene), 베르가모텐(Bergamotene), 지베렐린 (Gibberellin), 보르네올(borneol), 캠퍼(Camphor), 카페산(Caffeic acid), 하이페로사이드(Hyperoside), 이소케르세틴(Isoquercitrin), 이소클로로겐산 A(Isochlorogenic acid A), 이소클로로겐산 B(Isochlorogenic acid B), 이소클로로겐산 C(Isochlorogenic acid C), 유제놀(Eugenol) 중 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 사철쑥 진공추출물.
구현예 3: 죽순 진공추출물
적어도 살리실산메틸(Methyl salicylate)을 포함하는 죽순 진공추출물.
구현예 4: 수치한정
구현예 3에 있어서,
상기 죽순 진공추출물은 쿠마린산(coumaric acid), 페룰산(Ferulic acid), 하이페로사이드(Hyperoside), 이소클로로겐산 A (Isochlorogenic acid A), 옥살산(oxalic acid), 말산(malic acid) 중 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 죽순 진공추출물.
구현예 5: 조합
구현예 1 내지 2 중 어느 하나의 사철쑥 진공추출물; 및
구현예 3 내지 4 중 어느 하나의 죽순 진공추출물;
이 혼합(또는 조합)된 진공추출물.
구현예 6: 조합 수치한정
구현예 5에 있어서,
사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물은 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 또는 90:10의 중량비로 혼합된 진공추출물.
● 조성물
구현예 7: 단독 - 약학적 조성물
구현예 1 내지 4 중 어느 하나의 진공추출물을 포함하는 약학적 조성물.
구현예 8: 단독 - 건강기능식품 조성물
구현예 1 내지 4 중 어느 하나의 진공추출물을 포함하는 건강기능식품 조성물.
구현예 9: 조합 - 약학적 조성물
구현예 5 내지 6 중 어느 하나의 진공추출물을 포함하는 약학적 조성물.
구현예 10: 조합 - 건강기능식품 조성물
구현예 5 내지 6 중 어느 하나의 진공추출물을 포함하는 건강기능식품 조성물.
구현예 11: 수치한정(1)
구현예 7 내지 10에 있어서,
상기 진공추출물은 조성물 전체 중량의 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50wt% 중 선택되는 두 수치 범위 이내 또는 선택되는 수치로 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 12: 효과
구현예 7 내지 11에 있어서,
상기 조성물은 질병활성지수의 증가도가 낮아짐; 혈변지수의 증가도가 낮아짐; 설사지수의 증가도가 낮아짐; 대장 길이 길어짐; 대장 조직의 점막 구조 파괴가 감소됨; 궤양이 약화됨; 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성이 감소함; ZO-1의 발현 증가; Bcl-xl, BAX 또는 COX2의 발현 감소; 자가소화작용 활성형 마커(LC3β)의 발현 감소; 전염증성 인자(STAT3, COX2, iNOS)발현 감소; NF-κB의 발현 감소; 세포사멸(Apoptosis) 관련인자(BAX, BCL2L1, Gzmb, Fas, FasL)의 발현 감소; 면역 관련 인자(C3, CCL19, CCL2, Ccr7, CD38, CD3E, CD4, CD40, CD68, CD8a, ICOS, Ptprc)의 발현 감소; 염증 관련 인자(CSF1, CXCL11, IL-15, IL-1b, NF-KB1, Nos2, Ptgs2, Socs1, Socs2, Stat3, Stat4, Stat6, Tnf, TNFRSF18, Nfafc3, Nfatc4, Ly96)의 발현 감소; 종양 관련인자(Gusb gene, HMOX1, Lrp2, SKI, Smad3, Smad7, LIF, Agtr2, Edn1, Selp, Vcam1, Icam1)의 발현 감소; 중 선택되는 하나 이상의 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 13: 질환 한정(1)
구현예 7 내지 12 중 어느 하나의 조성물은 염증성 장질환의 치료 또는 예방을 위한 용도인 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 14: 질환 한정(2)
구현예 7 내지 12 중 어느 하나의 조성물은 장 섬유화의 치료 또는 예방을 위한 용도인 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 15: 질환 한정(3)
구현예 7 내지 12 중 어느 하나의 조성물은 오토파지 조절에 의한 치료 또는 예방을 위한 용도인 것을 특징으로 하는 조성물.
구현예 16: 질환 한정(4)
구현예 7 내지 12 중 어느 하나의 조성물은 암치료 또는 예방을 위한 용도인 것을 특징으로 하는 조성물.
● 추출방법
구현예 17: 단독
사철쑥 또는 죽순을 각각 준비함;
진공추출장치로 사철쑥 또는 죽순을 각각 1차 진공추출함;
상기 1차 진공추출한 사철쑥 추출물 및 죽순 추출물 각각을 2차 진공추출함;
을 포함하는 진공추출물을 수득하는 방법.
구현예 18: 조합
사철쑥 또는 죽순을 각각 준비함;
사철쑥 및 죽순을 혼합하여 혼합물을 준비함;
진공추출장치로 상기 혼합물을 1차 진공추출함;
상기 1차 진공추출한 혼합물을 2차 진공추출함;
을 포함하는 진공추출물을 수득하는 방법.
구현예 19: 조건한정(1)
구현예 17 또는 18에 있어서,
상기 1차 진공추출 또는/및 2차 진공추출은 200℃ 내지 300℃의 온도로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 20: 조건한정(2)
구현예 17 또는 18에 있어서,
상기 2차 진공추출의 온도는 상기 1차 진공추출의 온도보다 10℃ 내지 50℃ 낮은 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 21: 조건한정(1)
구현예 17 또는 18에 있어서,
상기 1차 진공추출 또는/및 2차 진공추출은 15시간 내지 30시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 22: 조건한정(1)
구현예 17 또는 18에 있어서,
상기 2차 진공추출의 수행시간은 상기 1차 진공추출의 수행시간보다 2시간 내지 10시간 많이 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 23: 조건한정(1)
구현예 17 또는 18에 있어서,
상기 진공추출장치의 내부 진공은 500Torr 내지 1000Torr인 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 24: 수율한정(1)
구현예 17에 있어서,
사철쑥 또는 죽순의 진공추출 수율은 30% 내지 50%인 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 25: 수율한정(2)
구현예 18에 있어서,
사철쑥 및 죽순 혼합물의 진공추출 수율은 30% 내지 50%인 것을 특징으로 하는 방법.
● 치료방법
구현예 26: 염증성 장질환
구현예 7 또는 9를 대상에 투여함;
을 포함하는 염증성 장질환 치료 또는 개선 또는 예방 방법.
구현예 27: 장 섬유화
구현예 7 또는 9를 대상에 투여함;
을 포함하는 장 섬유화치료 또는 개선 또는 예방 방법.
구현예 28: 오토파지와 관련된 질환
구현예 7 또는 9를 대상에 투여함;
을 포함하는 오토파지와 관련된 질환 치료 또는 개선 또는 예방 방법.
구현예 29: 암
구현예 7 또는 9를 대상에 투여함;
을 포함하는 암치료 또는 개선 또는 예방 방법.
구현예 30: 투여방식 한정
구현예 26 내지 29에 있어서,
상기 투여의 부위는 근육, 피내, 피하, 정맥, 복강, 동맥, 심장, 점막, 척수, 골수 중 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 31: 용량 한정
구현예 26 내지 29에 있어서,
상기 투여시 상기 조성물은 1회에 10mg/kg 내지 2000mg/kg의 용량으로 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
구현예 32: 횟수 한정
구현예 26 내지 29에 있어서,
상기 투여의 횟수는 하루에 1회 또는 수회 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
이하, 실시예를 통하여 본 출원을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 출원을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 출원의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 출원이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 자명할 것이다.
재료
대나무(한국산), 사철쑥(한국산), 더위지기(한국산)
Fetal bovine serum, RPMI 1640 media, 항생제 등의 세포 배양용 시약들은 Gibco BRL (Grand Island, USA)사에서 구입하였으며, 클로로포름(chloroform), 도데실 황산 나트륨(sodium dodesyl sulfate), 염화나트륨(sodium chloride), 아크릴아마이드(acrylamide), Tris-HCL, LPS, 아세트산(acetic acid) 등은 SIGMA (St.Louis, USA)사에서 구입하였다.
실험에 사용된 항체인 Phospho-STAT3(Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit monoclonal antibody #9145), Stat3 (79D7) Rabbit monoclonal antibody #4904), COX2(Cox2 (D5H5) XP® Rabbit monoclonal antibody #12282), p65(Phospho-NF-κB p65 (Ser536) Rabbit polyclonal antibody #3031), NF-κB p65 (D14E12) XP® Rabbit monoclonal antibody #8242)는 Cell Signaling Technology (Danver, USA)사에서 구입하였다. iNOS(Anti-inducible nitric oxide synthase)는 Merck Millipore (Lake Placid, NY, USA), GAPDH(Anti-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)는 Santa Cruz Biotechnology (CA, USA)에서 구입하였다. 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급 이상을 사용하였다.
추출방법
(1) 진공추출법
사철쑥잎 5kg, 대나무 죽순 5kg을 각각 분쇄하였다. 이후, 24시간 동안 물에 침전시킨 후 본초진공원액추출기(㈜ 참맥))를 사용하여 추출하였다.
추출조건은 도 2 및 도 3에 명시한 대로 수행하였다.
최종적으로, 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물을 각각 8000cc 수득하였다. 진공추출물의 수율은 각각 35%였다.
(2) 열수 추출법, 에탄올 추출법
사철쑥, 더위지기, 대나무 부위별 각각을 중량대비 20배의 양으로 추출하였다. 환류추출기(DH.WEB01008(WiseBath))를 이용하여 추출하였고, 추출한 추출액을 여과지(No.1 Whatman international, UK)로 여과하였다. 최종 여과액은 저온냉장고에서 냉장 보관하여 사용하였다.
추출용매의 조성은 에탄올 농도를 0%(열수), 100%로 달리하여 환류추출 하였다. 추출용매는 원료 대비 20배의 중량비를 첨가하였고, 70℃온도조건별(열수추출 100℃에서 2시간(열수추출 4시간) 동안 추출, 여과하였다 (도 1 참조).
분석방법
(1) 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC, High Performance Liquid Chromatography)
1) 표준용액 조제
각각의 표준물질 적정량을 정밀히 칭량하여 10mL 부피 플라스크에 취한 후 메탄올에 녹여 조제한다. 상기용액을 표준원액(Stock solution)으로 하며 적절히 메탄올로 희석하여 표준용액으로 사용한다.
2) 시험용액 조제
단독소재 5 g을 조건별 용매 100 mL을 넣고 환류추출방법으로 추출한다 (열수 4시간, EtOH 100% 2시간). 추출액을 여과지로 1차 여과한 후 여과액을 멤브레인 필터(0.45 μm)에 통과시킨 후 그 중 10μL를 고성능 액체 크로마토그래피 분석시의 검액으로 사용한다.
3) 지표성분
대나무 또는 쑥 추출물의 지표성분으로 14종의 후보를 선정하였다(도 4 참고). 후보 지표성분은 선행연구 및 참고문헌 조사를 통하여 총 14종 후보물질을 선정하여 대나무와 쑥을 동시에 분석할 수 있는 분석법을 확립하였다.
14종의 후보 지표성분 중 쑥 추출물의 지표성분은 스코폴린(scopolin)(1), 카페산(Caffeic acid)(2), 스코폴레틴(scopoletin)(5), 하이페로사이드(Hyperoside)(8), 이소케르세틴(Isoquercitrin)(9), 이소클로로겐산 B(Isochlorogenic acid B)(10), 이소클로로겐산 A (Isochlorogenic acid A)(11), 스코파론 (scoparone)(12), 이소클로로겐산 C(Isochlorogenic acid C)(13)이고; 대나무 추출물의 지표성분은 ρ-쿠마린산(ρ-coumaric acid)(3), 오리엔틴(Orientin)(4), 페룰산(Ferulic acid)(6), 비텍신(Vitexin)(7), 트리신(Tricin)(14) 이다.
상기 14종의 후보 지표성분의 화학 구조식은 다음과 같다.
Figure PCTKR2022020027-appb-img-000004
4) 고성능 액체 크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC) 분석조건
고성능 액체 크로마토그래피 분석은 Shimadzu LC-20A 시스템을 사용하였고, 분석조건은 다음과 같다(표 1).
디텍터
(Detector) 		UV (330 nm)
컬럼(Column) COSMOSIL C18 (4.6 x 250 mm, 5 μm)
이동상
(Mobile phase) 		시간 (min) 0.1% FA*　in DW**(%) 0.1% FA in AcN***(%)
0 90 10
30 80 20
50 80 20
51 60 40
55 60 40
56 90 10
70 STOP
유량(Flow rate) 1 mL/min
온도(Temperature) 35 ℃
*폼산(formic acid) **증류수(distiled water) *** 아세토니트릴(acetonitrile)
실시예 1: 특정 쑥 추출물 및 특정 대나무 추출물 선정
추출방법별로 쑥은 사철쑥과 더위지기를 비교, 대나무 부위는 원통, 잎, 죽순을 각각 비교하여 선정하였다. 추출방법별로 조건은 하기 표 2과 같다.
구분 추출조건
추출소재 추출용매 추출온도 추출시간
열수
추출액		 대나무(원통) 열수 90℃ 4H
대나무(죽순)
사철쑥
더위지기
EtOH 100%
추출액		 대나무(원통) 주정
100%		 70℃ 2H
대나무(죽순)
사철쑥
더위지기
고진공
추출액		 대나무(원통) 　- 1차 설정:250℃, 20hr
2차 설정:210℃, 24hr
내부진공:750 Torr 이상(고진공상태)

(도 2 및 3참고)
(1) 쑥 종류별로 상이한 주요 유효성분 도출 확인
사철쑥 추출물과 더위지기 추출물 각각을 추출방법별(열수추출법, 에탄올추출법, 진공추출법)로 후보지표 9종을 분석하였다.
도 5 및 6의 분석결과를 수치화하면 표 3과 같다.
소재 추출
조건별 		후보 지표성분 함량 (μg/g)
스코폴린(scopolin) 카페산(Caffeic acid) 스코폴레틴 (Scopoletin) 하이페로사이드 (Hyperoside) 이소케르세틴 (Isoquercitrin) 이소클로로겐산 B
(Isochlorogenic 　acid B)		 이소클로로겐산 A (Isochlorogenic 　acid A) 스코파론 (Scoparone) 이소클로로겐산 C (Isochlorogenic 　acid C)
사
철
쑥 		열수 * 3.93±0.07 - 71.05±1.90 14.42±0.33 114.89±1.59 61.86±1.18 57.36±0.45 79.36±2.52
에탄올(EtOH) * 0.52±0.02 1.70±0.05 49.03±1.17 10.26±0.26 14.72±0.64 28.83±0.62 138.19±3.46 18.26±0.36
고진공 - - - - - - - 0.64±0.01 -
더
위
지
기 		열수 * 58.36±0.46 30.12±0.36 - - 44.29±0.99 34.34±3.94 - 19.96±0.64
에탄올(EtOH) * 2.04±0.20 32.94±1.78 - - 13.28±0.76 131.79±7.24 - 34.09±1.84
고진공 * - 1.17±0.01 - - - - - -
사철쑥 조건별 추출액에서는 스코폴린(scopolin) (1), 카페산(caffeic acid) (2), 하이페로사이드(Hyperoside)(8), 이소케르세틴(isoquercitrin)(9), 이소클로로겐산 B(Isochlorogenic acid B) (10), 이소클로로겐산 A (Isochlorogenic acid A) (11), 스코파론(Scoparone) (12), 이소클로로겐산 C (Isochlorogenic acid C) (13)의 피크가 확인되어 8종의 지표성분이 확인되었다.
특히 하이페로사이드(Hyperoside)(8), Scoparone (12)은 더위지기에서는 검출되지 않아 사철쑥에서 특이적으로 나타나는 지표성분으로 판단되었다.
분석결과를 바탕으로 후보 지표성분 함량은 scoparone을 제외한 성분은 열수(ethanol 0%) 조건에서 높게 나타났다. 또한 고진공추출액에서는 scoparone만 미량 검출되었다.
더위지기 조건별 추출액에서는 스코폴린(scopolin) (1), 카페산(caffeic acid)(2), 스코폴레틴(scopoletin) (5), 이소클로로겐산 B(Isochlorogenic acid B) (10), 이소클로로겐산 A(Isochlorogenic acid A) (11), 이소클로로겐산 C (Isochlorogenic acid C) (13)의 지표성분을 확인하였다.
더위지기에서는 스코폴린(scopolin), 스코폴레틴(scopoletin) (5)이 특이적으로 나타났다. 고진공추출액에서는 스코폴레틴만 미량 검출되었다.
사철쑥과 더위지기의 주요 유효성분 중, 스코폴린(scopolin)과 클로로겐산 (chlorogenic acid)의 머무름시간(retention time)이 겹쳐서 분리도를 개선하고 주요 유효성분인 scopoletin, 스코파론(scoparone) 물질을 선정하여 총 4종(스코폴린(scopolin), 클로로겐산 (Chlorogenic acid), 스코폴레틴 (Scopoletin), 스코파론(scoparone))의 동시분석법을 추가적으로 확립하였다.
사철쑥 추출물과 더위지기 추출물을 여과한 후 10uL를 주입하여 고성능 액체 크로마토그래피 분석을 실시하였다. 확립된 고성능 액체 크로마토그래피 조건으로 사철쑥 추출물 및 더위지기 추출물 각각의 유효성분 4종의 함량을 분석한 결과는 다음과 같았다 (표 4).
소재 추출
조건별 		유효성분 함량 (μg/g)
스코폴린(scopolin) 클로로겐산(chlorogenic acid) 스코폴레틴 (Scopoletin) 스코파론(scoparone)
사철쑥 열수 4.62±0.09 154.19±2.18 2.02±0.10 39.67±0.67
에탄올
(EtOH) 		- 19.13±0.41 1.25±0.01 137.69±2.62
고진공 - - - 0.36±0.03
더위지기 열수 91.47±0.19 126.45±0.46 28.37±0.29 -
에탄올
(EtOH) 		45.98±0.87 67.74±1.45 30.17±0.58 -
고진공 - - 0.78±0.02 -
사철쑥의 경우, 특이적으로 클로로겐산(chlorogenic acid)와 스코파론(scoparone)이 함량이 높게 나타나고 더위지기에서는 검출되지 않아 사철쑥에서 특이적으로 나타나는 지표성분으로 판단되었다.
더위지기에서는 스코폴린(scopolin), 스코폴레틴(scopoletin)이 특이적으로 나타났다. 특히, 스코폴린(scopolin)이 사철쑥에 비하여 다량함에 되어 있음을 확인하여 더위지기에 특이적으로 나타나는 지표성분으로 판단되었다.
이처럼 본 발명자들은 쑥의 특정 종류에 따라 동일한 방법에 의하더라도 추출되는 주요 유효성분이 상이함을 확인하고, 사철쑥을 이용하는 것으로 결정하였다.
(2) 대나무 부위 별로 상이한 주요 유효성분 도출 확인
대나무 원통 추출물, 대나무 잎 추출물, 대나무 죽순 추출물 각각을 추출방법별(열수추출법, 에탄올추출법, 진공추출법)로 후보지표 4종을 분석하였다.
도 7 내지 9의 분석결과를 수치화하면 표 5와 같다.
단독소재(대나무) 후보 지표성분 함량 (μg/g)
부위별 추출조건별 쿠마린산
(coumaric acid)		 페룰산
(Ferulic acid)		 하이페로사이드
(Hyperoside)		 이소클로로겐산 A
(Isochlorogenic
acid A)
대나무
(원통) 		열수추출액 1.59±0.09 0.47±0.03 - 1.87±0.01
에탄올추출액 1.45±0.03 - 0.29±0.01 1.98±0.03
고진공추출액 - - - -
대나무(잎) 고진공추출액 - - - -
대나무
(죽순) 		열수추출액 0.87±0.01 0.17±0.00 - -
에탄올추출액 0.95±0.02 2.64±0.06 - -
고진공추출액 - - - -
대나무 조건별 추출물에서는 쿠마린산(coumaric acid)(2), 페룰산(ferulic acid)(6), 하이페로사이드(hyperoside) (8), 이소클로로겐산 A(Isochlorogenic acid A) (11)의 피크가 확인되었다.
추출조건별 고성능 액체 크로마토그래피 분석결과를 바탕으로 검출된 4종의 후보 지표성분 함량은 에탄올 100% 조건에서 열수조건에 비해 상대적으로 함량이 높으나, 미량으로 확인되어 큰 차이가 확인되지 않았다. 또한 고진공추출액에서는 후보 지표성분이 모두 불검출되었다.
이처럼 본 발명자들은 대나무의 특정 부위에 따라 동일한 방법에 의하더라도 추출되는 주요 유효성분이 상이함을 확인하고, 죽순을 이용하는 것으로 결정하였다.
실시예 2: 사철쑥 추출물 및 죽순 추출물의 성분 분석
사철쑥 추출물 및 죽순 추출물 및 각각의 원물의 휘발성 유기화합물 분석을 위한 적절한 기체 크로마토그래피 질량 분석(Gas Chromatography Mass Spectrometry, GC/MS)을 위한 컬럼(column)을 선택하기 위해 HP-5MS 및 DB-5MS 컬럼을 사용하여 기체 크로마토그래피에 나타난 분리도를 비교하였으며, 적절한 분석시간 및 최적 분리를 위해 기체 크로마토그래피 질량 분석의 여러 조건을 변경하여 최적 분석조건을 정립하였다.
휘발성 유기화합물은 시료 4ml을 80℃에서 평형 후 고체상 미세추출 (SPME, solid phase microextraction) 방법으로 향을 포집 하여 HP-5MS 컬럼(30m x 0.25mm x 0.25 ㎛ film thickness, Agilnet)이 장착된 7890A GC/5975 질량 선택 검출기(mass selective detector, MSD)를 이용하여 분석하였다.
기체 크로마토그래피 질량 분석기의 오븐 온도는 50℃에서 300℃까지 상승시켰고, 인젝터(injector) 온도는 250℃였으며 캐리어 가스(carrier gas)로 헬륨을 사용하였음. 질량 선택 검출기 조건은 캐피러리 다이렉트 인터페이스 온도(capillary direct interface temperature) 250℃ 이온 소스 온도(ion source temperature) 230℃ 이온화 전압(ionization voltage) 70eV, 질량 범위(mass range) 50-550 a.m.u. 그리고 스캔 레이트(scan rate) 2.2 scan/sec를 이용하였다.
기체 크로마토그래피 질량 분석기로 각 피크(peak)의 총 이온 크로마토그램(total ion chromatogram, TIC)를 얻은 후 NIST08 질량 스펙트럼 데이터베이스와 비교하여 각각의 성분을 동정하였다. 기체 크로마토그래피 질량 분석기의 분석 조건은 다음과 같다(표 6).
기체 크로마토그래피 질량 분석기의 분석 조건은 다음과 같다(표 6).
기체 크로마토그래피 질량 분석 시스템
(GC system) 		Agilent 7890A
디텍터(Detector) 5975 MSD
인젝터(Injector) 250℃
Split mode Split ratio (5 : 1)
컬럼(Column) HP-5MS (30m x 0.25 mm, 0.25um film thickness)
오븐온도(Oven temp.) 50℃(hold 5 min) → 5℃/min → 200℃(hold 5 min) →
10℃/min → 300℃(hold 5 min)
캐리어가스(Carrier gas) He, 1.0ml/min
이온화 전압(Ionization voltage) 70eV
주입량(Injection volume) 1 μl
(1) 사철쑥 진공추출물의 기체 크로마토그래피 질량 분석
사철쑥 진공추출물의 기체 크로마토그래피 질량 분석 결과는 표 7과 같다.
No. RT(min) 휘발성 유기화합물(Volatile compound) Area %
진공추출액 원물
1 5.701 Camphene - 1.98
2 8.756 Benzene, 1-methyl-2-(1-methylethyl)- - 1.97
3 8.951 Eucalyptol (=1,8-Cineol) 10.10 14.94
5 11.651 Thujone 1.51 2.34
7 12.893 Camphor 31.74 34.10
8 13.042 Bicyclo[2.2.1]heptan-2-one, 1,7,7-trimethyl-, (1S)- - 9.30
9 13.38 Isoborneol - 0.63
10 13.568 Bicyclo[2.2.1]heptan-3-one, 6,6-dimethyl-2-methylene- - 0.68
11 13.648 Borneol 26.91 16.13
12 13.877 Bicyclo[3.1.1]heptan-3-one, 2,6,6-trimethyl-, (1.alpha.,2.alpha.,5.alpha.)- - 2.79
13 14.043 3-Cyclohexen-1-ol, 4-methyl-1-(1-methylethyl)- 2.94
15 15.056 2-Cyclohexen-1-ol, 3-methyl-6-(1-methylethyl)-, cis- - 1.03
16 17.328 Bornyl acetate - 2.01
17 19.347 Eugenol 2.25 -
18 19.748 Copaene - 0.65
19 20.149 1H-Cyclopenta[1,3]cyclopropa[1,2]benzene - 1.87
20 20.87 Caryophyllene - 1.87
21 21.327 2H-1-Benzopyran-2-one 7.23 7.73
23 24.766 1H-Cycloprop[e]azulen-7-ol, decahydro-1,1,7-trimethyl-4-methylene-, [1ar-(1a.alpha.,4a.alpha.,7.beta.,7a.beta.,7b.alpha.)]- 3.32 -
25 26.391 Longiverbenone 13.99 -
total 100 100
단독소재에서 검출된 성분조성을 살펴보면, 사철쑥 진공추출액의 휘발성 유기화합물 성분 중 캠퍼(camphor)가 31.74%로 가장 높은 비중을 차지하고 있으며, 보르네올(borneol)(26.91%), 롱기베르베논(longiverbenone)(13.99%), 유칼립톨(eucalyptol)(10.10%) 가 상대적으로 높은 비중을 차지하고 있으며, 테르펜 탄화수소(terpene hydrocarbon)류가 대부분을 구성하고 있다.
또한, 사철쑥의 원물의 휘발성 유기화합물성분은 진공추출액과 동일하게 캠퍼(camphor)(34.10%), 보르네올(borneol)(16.13%), 유칼립톨(eucalyptol)(14.94%) 등의 성분들이 높은 피크 면적(peak area)으로 확인되었고 롱기베르베논(longiverbenone)는 확인되지 않았다.
캠퍼(camphor)는 사철쑥의 주요 유기화합물성분으로 민트향과 비슷한 청량감을 가지며, 유칼립톨(Eucalyptol)은 유칼립투스의 에센셜 오일의 주요 성분으로 모노테르펜 알코올(monoterpene alcohol)로 1,8-Cineol로도 알려져 있다.
원물에서만 확인된 카리오필렌(Caryophyllene)(1.87%)는 주로 정향, 레몬, 자몽 및 라벤더 등에 다량 함유된 성분으로 알려져 있다. 다음과 같은 구조동정 결과는 투욘(thujone), 캠퍼(camphor), 보르네올(borneol), 테르피넨(terpinene), 테르피네올(terpineol)등의 테르페노이드(terpenoid)류가 주요성분이라는 보고된 선행연구 내용과 일치한다.
(2) 대나무 원통, 잎, 죽순의 기체 크로마토그래피 질량 분석
대나무 원통, 잎, 죽순 진공추출물 각각의 기체 크로마토그래피 질량 분석 결과는 표 8 및 표 9과 같다.
No. RT(min) 휘발성 유기화합물(Volatile compound) Area %
진공추출액
(원통) 		원물
1 9.105 Benzene, 1-methyl-4-(1-methylethyl)- 3.65 6.44
2 13.763 Bicyclo[2.2.1]heptan-2-ol, 1,7,7-trimethyl-, (1S-endo)- 2.96 -
3 14.684 Methyl salicylate 29.15 -
4 15.588 Benzofuran, 2,3-dihydro- 4.73 -
5 16.933 Benzaldehyde, 4-propyl- 7.66 -
6 18.214 Pyrazine, 3,5-dimethyl-2-propyl- 1.38 -
7 19.37 Eugenol 1.20 -
8 21.928 1H-Cycloprop[e]azulene, decahydro-1,1,7-trimethyl-4-methylene-, [1aR-(1a.alpha.,4a.beta.,7.alpha.,7a.beta.,7b.alpha.)]- 2.58 26.28
9 22.323 Naphthalene, decahydro-4a-methyl-1-methylene-7-(1-methylethylidene)-, (4aR-trans)- 1.54 -
10 22.42 2H-Pyrrol-2-one, 1,5-dihydro-1-methyl- 0.71 -
11 22.958 Naphthalene, 1,2,4a,5,6,8a-hexahydro-4,7-dimethyl-1-(1-methylethyl)-, (1.alpha.,4a.alpha.,8a.alpha.)- 1.79 9.04
12 23.13 Cycloheptasiloxane, tetradecamethyl- ND 8.01
13 23.273 1,6-Cyclodecadiene, 1-methyl-5-methylene-8-(1-methylethyl)-, [s-(E,E)]- 14.16 3.48
14 25.876 Megastigmatrienone 2.50 -
15 25.287 Pentanoic acid, 2,2,4-trimethyl-3-carboxyisopropyl, isobutyl ester 1.66 -
16 26.025 1H-Cyclopropa[a]naphthalene, 1a,2,3,3a,4,5,6,7b-octahydro-1,1,3a,7-tetramethyl-, [1aR-(1a.alpha.,3a.alpha.,7b.alpha.)]- 19.20 -
17 26.517 .beta.-Panasinsene 5.13 -
18 26.529 1H-Cycloprop[e]azulene, decahydro-1,1,7-trimethyl-4-methylene-, [1aR-(1a.alpha.,4a.alpha.,7.alpha.,7a.beta.,7b.alpha.)]- - -
19 27.547 Heneicosane - 8.99
20 33.624 Heneicosane - 5.25
21 35.483 Heneicosane - 8.34
22 35.764 Phytol - ND
23 37.709 Heptadecane - 8.36
24 40.599 Octacosane - 6.75
25 42.727 Heneicosane - 5.83
26 44.227 Pentacosane - 3.22
No. RT(min) 휘발성 유기화합물(Volatile compound) Area %
진공추출액
(잎) 		진공추출액
(죽순)
1 14.135 3-Cyclohexen-1-ol, 4-methyl-1-(1-methylethyl)- - 3.45
2 14.684 Methyl salicylate - 46.50
3 15.588 Benzofuran, 2,3-dihydro- 3.50 4.33
4 18.163 2-Methoxy-4-vinylphenol 13.35 3.75
5 18.214 Pyrazine, 3,5-dimethyl-2-propyl- ND 3.24
6 20.675 Benzene, 2-(1,3-butadienyl)-1,3,5-trimethyl- 1.75 -
7 21.156 3-Buten-2-one, 4-(2,6,6-trimethyl-2-cyclohexen-1-yl)-, (E)- 3.24 -
8 22.615 3-Buten-2-one, 4-(2,6,6-trimethyl-1-cyclohexen-1-yl)-, (E)- 8.44 -
9 23.336 Phenol, 2,4-bis(1,1-dimethylethyl)- 3.60 -
10 23.582 2(4H)-Benzofuranone, 5,6,7,7a-tetrahydro-4,4,7a-trimethyl- 3.52 -
11 24.131 Cyclohexanemethanol, 4-ethenyl-.alpha.,.alpha.,4-trimethyl-3-(1-methylethenyl)-, [1R-(1.alpha.,3.alpha.,4.beta.)]- - 10.85
12 24.823 Megastigmatrienone 5.94 -
13 25.287 Propanoic acid, 2-methyl-, 1-(1,1-dimethylethyl)-2-methyl-1,3-propanediyl ester ND 2.15
14 25.876 Megastigmatrienone 4.78 -
15 26.025 1H-Cyclopropa[a]naphthalene, 1a,2,3,3a,4,5,6,7b-octahydro-1,1,3a,7-tetramethyl-, [1aR-(1a.alpha.,3a.alpha.,7b.alpha.)]- - 3.58
16 26.403 1H-Indene, 1-ethylideneoctahydro-7a-methyl-, (1Z,3a.alpha.,7a.beta.)- - 12.89
17 26.517 .beta.-Panasinsene - 9.25
18 27.633 Cyclopropa[d]naphthalen-2(4aH)-one, 1,1a,5,6,7,8-hexahydro-4a,8,8-trimethyl-, [1aR-(1a.alpha.,4a.beta.,8aS*)]- 0.84 -
19 30.614 2-Pentadecanone, 6,10,14-trimethyl- 6.28 -
20 31.341 3,7,11,15-Tetramethyl-2-hexadecen-1-ol 14.96 -
21 32.107 17-Norkaur-15-ene, 13-methyl-, (8.beta.,13.beta.)- 2.40 -
22 32.64 1-Hexadecen-3-ol, 3,5,11,15-tetramethyl- 4.27 -
23 33.012 n-Hexadecanoic acid 1.52 -
24 33.549 Hexadecanoic acid, ethyl ester 1.16 -
25 35.483 Heneicosane 2.24 -
26 35.764 Phytol 7.91 -
27 40.599 Octacosane 2.02 -
28 44.227 Pentacosane 2.93 -
29 46.43 Heptacosane 3.73 -
30 48.14 Heptadecane, 9-octyl- 1.63 -
죽순 진공추출액에서 검출된 성분조성을 보면, 휘발성 성분 중 Methyl salicylate가 46.50%로 가장 높은 비중을 차지하고 있다.
살리실산메틸(Methyl salicylate)는 에스터(Ester)류로 일반적으로 대부분의 에스터류는 냄새를 가지고 있으며 과일향기의 주성분이다. 탄소수가 10이하인 에스터 화합물은 많은 과실향을 이루며 분자량이 커지면서 향기가 농후해지고 꽃향을 이룬다고 보고된 바 있다. 살리실산메틸(methyl salicylate)는 많은 식품 종에서 자연적으로 생산되는 에스터류이고 또한, 합성되어 식품 및 음료에서 사용되고 있으며 식품첨가물공전에 합성향료(관리번호 M172)로 등재되어 있다.
실시예 3: 사철쑥 진공추출물 단독 및 죽순 진공추출물 단독 각각의 효능 평가
실시예 1 및 실시예 2로부터 사철쑥 진공추출물과 죽순 진공추출물을 선정하여 하기의 실험을 수행하였다.
1) 동물모델 제작
본 출원의 추출출이 염증성장질환에 효과가 있는지 확인하기 위하여, 염증성 장질환 동물모델인 덱스트란황산나트륨(DSS, Dextran Sulfate Sodium) 유도 마우스를 이용하여 검증하였다.
덱스트란황산나트륨을 이용하는 대장염 유도는 방법이 간단하고 발병 속도도 빠르기 때문에 쉽게 사용되는 모델이다. 덱스트란황산나트륨은 대장의 방어벽 역할을 수행하는 상피세포를 직접적으로 손상시키는 화학약품이며, 덱스트란황산나트륨에 의해 대장의 상피세포가 파괴되면 장내에 있는 많은 세균들과 세균들이 만드는 물질들이 라미나 프로프리아(Lamina propria)로 침투하게 되어 면역세포들의 활성을 유도하고 염증을 유발한다. 덱스트란황산나트륨에 의한 대장염(Colitis) 유도는 대장 상피세포의 파괴와 이로 인한 장내세균에 의한 염증이 원인이 된다.
덱스트란황산나트륨은 항응고(anticoagulant) 특성을 가지고 있으며, 상피 파괴 및 장 염증(intestinal inflammation)을 유발하는 화학적 대장균이다.
실험동물은 대한바이오링크(Korea)로부터 C57BL/6N(수컷, 7주령, 20~22g)을 공급받아 온도 22~25℃ 상대습도 50±10%, 12시간 명암 사이클(형광등 조명 사용) 사육 환경에서 1주일간 순화한 후 실험에 사용하였다. 설치류 전용사료(2918C, Teklad Global 18% Protein Rodent Diet, ENVIGO, Indianapolis, USA)를 순화 및 시험기간동안 자유 급여하였다. 건강군은 고압으로 멸균한 수돗물을 제공하였고, 대장염유도군의 경우에는 DSS(Dextran Sulfate Sodium salt, MW 36,000~50,000kD, MP Biomedicals, Canada)를 2.5% 농도로 고압 멸균한 수돗물에 녹여 5일간(3일 시험군의 경우 3일간 제공) 자유 급수하였다. 5일 이후에는 모든 군의 실험동물에게 고압 멸균 수돗물로 교체하여 자유 급수하였다.
2) 동물모델에 진공추출물 투여
진공추출물을 동결건조하여 250mg/kg의 농도가 되도록 인산완충생리식염수(phosphate-buffered saline, PBS)에 현탁하여 1일 1회 경구로 투여하였다. 이때, 건강군과 양성대조군에는 PBS 동량을 경구로 투여하였다. 3일, 6일, 9일, 12일을 엔드 포인트(End point)로 하여 각 군에 해당하는 마우스를 Terrel 용액(isoflurane, 경보제약, 아산, 한국)으로 마취시켰다. 채혈한 후 개복하여 대장을 적출하여 길이를 측정하고, 비장 적출 후 무게를 측정하였다. 또한, 대장을 이용하여 질병활성 점수 측정, 조직학적 분석 및 웨스턴 블랏 분석 등에 사용하였다.
3) 질병활성 지수 (Disease activity index, DAI) 측정
2.5% DSS 용액 섭취 2일째부터 매일 오전 체중, 설사, 혈변 유무를 측정하였다. DAI은 아래 표를 기준으로 측정하였다(표 10).
스코어(SCORE) 체중감량(Weight Loss) 대변 일관성
(Stool consistency) 		출혈
(Bleeding)
0 None 정상(Normal) 정상(Normal)
1 0-10% - -
2 10-15% 느슨한 변(Loose stools) 헤마토크리트(Hemoclut) +
3 15-20% - -
4 > 20% 설사(Diarrhea) 심한 출혈(Gross Bleeding)
4) 채혈 및 장기적출
실험 종료일에, 흡입마취제로 심마취하여 하대정맥에서 채혈한 후 방혈하여 안락사시켰다. 대장은 맹장에서 직장까지 적출하여 대장길이를 측정하였다.
5) 조직학적 분석 - 헤마톡실린과 에오신(H&E, Hematoxylin and Eosin) 염색
대장의 조직학적 분석을 위해, 대장의 근위부(proximal)에서 말단부(distal end)까지 돌돌 말아서, 4% 포르말린으로 고정하였다. 고정한 대장 조직을 흐르는 물에 충분히 수세한 후 저농도에서 고농도의 에탄올로 탈수시켰다. 자일렌으로 투명화 과정을 거친 후 파라핀으로 포매하고 조직 절편기를 이용하여 4 μm 두께로 절편을 제작하였다. 이를 슬라이드에 부착한 후 자일렌과 에탄올을 이용하여 파라핀을 제거하였다. 헤마톡실린으로 핵염색을 한 후 증류수 등을 이용하여 수세 하였으며, 에오신을 이용하여 세포질을 염색하였다. 이후 슬라이드를 봉입 (mounting) 하여 광학현미경을 이용하여 400X 배율에서 관찰하였다.
본 연구에서 스코어링은 다음과 같이 수행하였다.
염증세포 침윤정도와 상피 세포손상 및 점막에서의 변화정도를 각각 1~3 단계로 구별하여 평가하였다.
염증세포 침윤의 경우, 침윤이 정상 범위 안에 있을 때 0점, 점막층에 국한되어 나타날 경우 1점, 점막층과 점막밑층까지 관찰될 경우 2점, 근육층까지 침윤이 확인될 경우 3점을 부여하였다.
장 점막의 형태학적 손상에 있어서 정상의 경우 0점, 국소성의 점막층 손상 즉 erosion (침식)이 있을 때 1점, 국소다발성의 침식과 함께 국소성의 궤양소견이 관찰되면 2점, 심한 궤양과 그와 관련된 육아조직의 형성이 폭넓게 관찰되었을 때 3점을 부여하였다.
염증 지수는 염증세포 침윤점수와 장점막 손상점수를 합한 것으로 가장 심한 염증지수는 6점이 된다.
대장조직의 조직병리학적 평가기준은 다음과 같다 (표 11).
Inflammatory cell infiltrate Score 1 Intestinal architecutre Score 2
Severity Extent Epithelial changes Mucosal architecture
Mild Mucosa 1 Focal erosions 1
Moderate Mucosa and submucosa 2 Erosions ± Focal ulcerations 2
Marked Transmural 3 Extended ulcerations±granulation tissue ± pseudopolyps 3
Sum of scores 1 and 2 0-6
6) F-액틴(F-actin) 염색
세포골격 및 세포 내 필라멘트 액틴(fliamentous actin, F-actin) 분석을 위해서 형광이 표지된 팔로이딘(phalloidin)(Invitrogen, Alexa Fluor™ 488 Phalloidin)으로 F-actin을, DAPI 로 세포핵을 면역염색 하였다.
먼저 시험 물질이 처리된 인간 대장암 세포를 PBS로 3회 세척하고 4% 파라포름알데히드(methanol-free, Thermo Fisher)에서 10분 동안 고정하였다. 이후 0.1% Triton X-100으로 투과화(permeabilized) 시킨 후 PBS로 세척하고 블로킹 솔루션(1% BSA 및 5% goat serum)으로 25℃에서 1시간 동안 블로킹하였다.
그런 다음 PBS로 10분씩 3회 세척하고, 블로킹한 세포의 F-actin 시각화를 위해 Alexa Fluor 488-conjugated phalloidin(Invitrogen, CA, USA)을 25℃에서 30분간 배양하였다. 핵염색은 DAPI를 1:5000으로 2분간 염색하였다.
F-actin (Alexa Fluor™ 이후 형광현미경(ZEISS, Axio Observer.D1)을 이용하여 염색된 F-actin을 관찰하였고, F-actin의 변화를 측정하기 하기 위하여 형광측정 마이크로플레이트리더(Molecular Devices, SPECTRAMAX GEMINI EM)를 이용하여 확인하였다. 형광의 파장은 485 nm (excitation wavelengths) 및 525 nm (emission wavelengths) 조건으로 하였다.
7) RhoA 활성 변화 확인
활성형의 RhoA (RhoA-GTP)를 측정하기 위하여 시험 물질이 처리된 세포를 용해하고 상청액을 분리 및 정량 후, 세포 내에 존재하는 RhoA-GTP를 RhoA Activation Assay colorimetric G-LISA kit (cytoskeleton)를 이용하여 제조사에서 제시한 방법을 통해 측정하였다. 활성형 RhoA의 정량적 검출을 위해 xMark™ 마이크로플레이트 흡광도 분광광도계(BioRad)를 사용하여 490nm에서 흡광도를 판독하였다.
8) 형광 활성 세포 분류(FACS, Fluorescence-activated cell sorting)
안와에서 채혈한 혈액에 CD4-FITC, CD8a-PE, CD19-PerCP, CD3e-APC 항체를 조합하여 처리한 후 15분간 상온에서 반응시킨다. 1 X Lysing solution(BD)을 첨가하여 10분간 상온에서 반응시켜 Red blood cell을 용해시킨다. 2% FBS가 함유된 PBS(Gibco)를 첨가한 lysing solution의 두배의 양을 넣고 인버팅(inverting)한 후 2000rpm에서 3분간 원심분리한다. 상층액을 버리고 2% FBS 함유 PBS를 5ml 넣고 세포를 재부유시킨 후 2000rpm에서 3분간 원심분리한다. 상층액을 버리고 stain solution(BD)을 500ml 첨가 후 세포를 재부유하여 유세포분석기(Accuri C6, BD)를 이용하여 분석한다.
9) qRT-PCR (Quantitative Real-time PCR)
2.5% DSS를 3일간 투여한 후 대장을 적출하여 RNA를 추출하였다. RNA를 정량 후 cDNA 합성 키트(SuperscriptIII, Invitrogen)를 이용하여 cDNA합성 후 정량하여 Taqman Array Mouse Immune Response [96well] plate를 이용하여 분석하였다.
RNA 추출은 RNeasy Mini Kit(Qiangen, USA)를 이용하여 추출하였다. 이후, RNA 발현을 정량적으로 표현하기 위해 Taqman Array Mouse Immune Response plate(Cat#4414079, ABI, USA)를 이용하여 qRT-PCR(Quantitative Real-Time PCR)을 수행하였다. 합성된 cDNA 100ng, Taqman Fast Advanced master mix 10 μl(ABI, USA)를 넣고 PCR 조건으로 반응시켰다. PCR 조건은 95℃에서 50초, 60℃에서 20초를 40 cycle로 하였다.
10) 인간 대장암세포주 배양
인간 대장암 세포주 2종인 HT-29(한국세포주은행(KCLB), 30038), Caco2(한국세포주은행(KCLB), 30037.1)을 사용하였다. 각 세포주의 배양은 당업계에 알려진 방법으로 배양하였다. 인간 대장암 세포주를 적정 배지를 이용하여 37℃ 5% CO2 항온기에서 배양하였다. 계대 배양은 1주일에 2회 시행하였다. 배양한 인간 대장암 세포는 웨스턴 블랏 분석, NF-κB 인산화 검출, ROS 생성, F-actin 및 RhoA 활성화 분석에 사용되었다.
11) 웨스턴 블랏(western blot)
인간 대장암 세포주를 이용한 단백질 분석: 단백질 발현을 분석하기 위한 Western blot은 RIPA lysis buffer (Sigma Aldrich Co., St. Louis, USA)를 이용하여 시험 물질이 처리된 세포주에서 단백질을 추출하였다.
대장 조직을 이용한 단백질 분석: 대장 조직을 차가운 PBS로 세척하고, RIPA 버퍼, Xpert protease inhibitor cocktail 및 Xpert phosphatase inhibitor cocktail solution (GenDEPOT, Katy, TX, USA)으로 용해했다. 이후 조직 균질물(Tissue homogenates)을 4°C에서 15분 동안 15,000 x g에서 원심분리 하여 조직에서 단백질을 추출하였다.
인간 대장암 세포주 및 대장 조직에서 각각 추출한 단백질은 BCA kit (Thermo scientific, USA)를 이용하여 정량하였고, 동량의 단백질(20μg)을 10% SDS-polyacrylamide gel에서 전기영동을 실시하였다. 전기영동한 gel에서 polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (Amersham Pharmacia Biotech Inc., Buckinghamshire, UK)으로 단백질을 이동시켰고 5% skim milk로 상온에서 1시간 blocking 한 후, 각각의 단백질의 발현을 분석하기 위해 각각의 단백질에 하기의 특이적인 항체를 4℃에서 overnight 하였다.
ZO-1(Rabbit polyclonal to ZO1 tight junction protein, 1:1000, ab96587), BCL-xL(Rabbit polyclonal antibody, 1:1000, CST, #2762) BAX(Rabbit polyclonal antibody, 1:1000, CST, #2772), COX2(1:1000, Cell Signaling Technology), LC3β(Rabbit polyclonal antibody, 1:1000, Abcam, ab51520), STAT3(1:1000, Cell Signaling Technology), Stat3 (1:1000, Cell Signaling Technology), Inos(1:1000, Merck Millipore)), GAPDH(1:5000, Santa Cruz Biotechnology).
이후, 1ХTBST로 10분씩 3회 세척한 후, 하기의 2차 항체:
goat anti-mouse IgG 또는 goat anti-rabbit IgG(1:5000, Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, USA)
를 상온에서 1시간 동안 반응시키고 1ХTBST로 10분씩 3회 세척하였다. EzWestLumi plus enhanced chemiluminescence (ECL) solution (atto, Tokyo, Japan)으로 처리하고 ChemiDoc XRS+ System (BioRad, Hercules, CA, USA)을 사용하여 단백질 밴드를 관찰하였다. 또한, 단백질 밴드를 정량하기 위하여 ImageJ 1.53q (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) 프로그램을 이용하였으며 통계학적 유의성 검증을 위해 GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA) 프로그램을 사용하였다.
12) 효소면역측정(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)
인간 대장암 세포주 HT-29(한국세포주은행(KCLB), 30038), Caco2(한국세포주은행(KCLB), 30037.1)를 활용하여 DSS 처리에 따른 염증반응 증가에서 죽순(BS) 고진공추출물과 사철쑥(AC) 고진공추출물의 복합소재의 염증반응 개선 효능을 검증하기 위하여 염증반응 매개 전사인자인 NF-κB의 활성 변화를 확인하였다. 2종의 세포주를 각각 24-웰 배양 플레이트에 3 Х 105/well씩 세포를 씨딩한 후, 24시간 동안 배양하였다. 배양한 세포에 2% DSS 단독 혹은 대나무조합추출물(BA 50:50, 200μg/ml)을 같이 처리한 배양액에서 24시간 배양하였다. 이후에 세포를 NF-κB p65 (Total/Phospho) Human InstantOne쪠 ELISA Kit (15500797, Invitrogen, USA)을 사용하여 제조사가 제공하는 방법을 통해 NF-κB 활성을 측정하였다. 흡광도는 xMark™ 마이크로플레이트 흡광도 분광 광도계(BioRad, Hercules, CA, USA)를 사용하여 650 nm로 보정하여 450 nm에서 측정하였다.
13) 활성산소(reactive oxygen species, ROS) 측정
인간 대장암 세포주 HT-29(한국세포주은행(KCLB), 30038), Caco2(한국세포주은행(KCLB), 30037.1)를 활용하여 DSS 처리에 따른 염증반응 증가에서 죽순(BS) 고진공추출물과 사철쑥(AC) 고진공추출물의 복합소재의 활성산소생성 억제 효능을 검증하기 위하여 세포 내 활성산소의 변화를 확인함. 먼저 2종의 세포주를 2% DSS 단독 혹은 조합추출물(BA 50:50, 200μg/ml)을 같이 처리한 배양액에서 24시간 배양한 후, 세포에 100μM DCF-DA 시약(cell-permeant 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCFDA) (dichlorofluores cin diacetate, Sigma, USA)을 같이 처리한 후 30분간 배양한 후 세척하였다. 이 때, DCF-DA 시약은 디메틸 설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)에 용해시키고 PBS로 최종 농도 100μM로 희석하여 사용하였다. 세포 내 DCFH-DA의 축적으로 인한 활성산소 생성 변화 확인은 형광 현미경(100x, Axio Observer.D1, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 관찰하였다. 이를 정량화 하기 위하여 형광 측정 마이크로플레이트 리더(SPECTRAMAX GEMINI EM, Molecular Devices, USA)를 활용하였고, 형광의 파장은 485 nm (excitation wavelengths) 및 525 nm (emission wavelengths) 조건으로 하였다.
(1) 염증성 장질환 효능 평가
(1)-1. 질병활성지수, 체중변화, 설사지수, 혈변지수 측정
DSS 유도군 마우스 및 대조군 마우스에 사철쑥 진공추출물 단독, 죽순 진공추출물 단독 각각을 250mg/kg 투여하여 질병활성지수, 체중변화, 설사지수, 혈변지수를 측정하였다 (도 10 내지 13).
질병활성지수 확인 시, DSS 처리기간(0~5일)에 따라 질병활성지수가 증가하였다(최대 7.67). 이에 반해, 죽순 진공추출물 단독처리군(100:0로 표시, 7.00, 8.7% 감소) 및 사철쑥 진공추출물 단독처리군(0:100으로 표시, 5.20, 32.2% 감소)에서는 질병활성지수의 감소 양상이 관찰되었다. DSS 처리군에서는 질병활성지수가 기간에 따라 증가도가 높았으나, 죽순 진공추출물 단독처리군 사철쑥 진공추출물 단독처리군에서는 DSS 처리군에 비해 질병활성지수의 증가도가 낮았다(도 10).
체중변화는 DSS 처리로 인해 대부분 대조군에 비해 감소하였다 (도 11).
혈변지수 확인 시, DSS 처리기간에 따른 혈변지수(최대 4.00)의 증가가 관찰되었다. 이에 반해, 죽순 진공추출물 단독처리군(100:0로 표시, 3.60) 및 사철쑥 진공추출물 단독처리군(0:100으로 표시, 3.20)에서는 혈변지수의 감소 양상이 관찰되었다. DSS 처리군에서는 혈변지수가 기간에 따라 증가도가 높았으나, 죽순 진공추출물 단독처리군 또는 사철쑥 진공추출물 단독처리군에서는 DSS 처리군에 비해 혈변지수의 증가도가 낮았다.
설사지수 확인 시, DSS 처리기간에 따른 설사지수(최대 3.33)의 증가가 관찰되었다. 이에 반해, 죽순 진공추출물 단독처리군(100:0로 표시, 2.00) 및 사철쑥 진공추출물 단독처리군(0:100으로 표시, 1.40)에서는 설사지수의 감소 양상이 관찰되었다. DSS 처리군에서는 설사지수가 기간에 따라 증가도가 높았으나, 죽순 진공추출물 단독처리군 또는 사철쑥 진공추출물 단독처리군에서는 DSS 처리군에 비해 설사지수의 증가도가 낮았다(도 13).
(1)-2. 대장길이 개선 효과
대장 길이의 감소는 DSS 유도 동물 모델에서 대장 염증에 대한 생물학적 마커이다(World J Gastroenterol. 2017 Sep 7;23(33):6016-6029.).
그래서 DSS 유도 마우스에서 대장 길이를 측정함으로써, DSS 유발 대장염 모델에서 추출물의 투여가 결장 감소를 예방하는지 여부를 확인하였다.
맹장부터 대장까지의 길이를 측정한 결과, DSS 유도 마우스의 경우, 대조군에 비해 길이가 감소하는 경향을 보였다. 사철쑥 진공추출물, 죽순 진공추출물 투여군 모두에서 DSS 유도 마우스보다 길이가 길어지는 경향이 관찰되었다(도 14). 즉, 사철쑥 진공추출물, 죽순 진공추출물 투여시 대장길이 개선(즉, 길어짐)의 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
DSS 처리기간별 대장길이에 변화를 측정한 결과, DSS 유도 마우스의 경우, 대조군에 비해 길이가 21.76% (7.72±0.36cm → 6.04±0.27cm) 감소하였다. 이에 반해, 죽순 진공추출물 단독처리군(100:0로 표시, 6.74±0.90cm, 12.7% 감소) 및 사철쑥 진공추출물 단독처리군(0:100으로 표시, 6.04±0.27cm, 21.8% 감소)에서는 DSS 유도 마우스보다 길이가 길어지는 경향이 관찰되었다 (도 14).
또한, 점막 염증에서 추출물의 보호 효과를 확인하기 위해 대장을 HE 염색을 하였다.
마우스 대장 조직은 루멘(lumen) 방향에서부터 점막(mucosa), 점막하층(Submucosa), 점막근(Muscularis) 조직으로 구분되어진다. 표면 상피 세포의 연속 층에 의해 형성된 상피 장벽은 박테리아 및 다른 항원이 점막으로 침투하는 것을 방지하는 역할을 하고, 상피층은 점막 미세 혈관을 통한 혈류에 의해 전달되는 산소 및 영양소에 결정적으로 의존한다.
궤양성 장질환은 난치성 만성 궤양과 결장 점막의 염증이 특징이며, 박테리아 및 기타 항원이 점막으로 침투하는 상피 장벽 기능 장애가 궤양성 장질환의 주요 요인 중 하나인 것으로 보고된다.
따라서, DSS 유도에 따른 마우스 대장조직의 궤양성 대장염증은 혈관 손상 및 감소된 혈루로 조직 저산소증 및 상피 세포의 손상이 원인이 될 것으로 추청된다. 또한 내피 손상, 내피 장벽 기능 장애 및 대장 혈관투과성(Vascular Permeability, VP) 증가에 따른 대장 상피 장벽 기능손실이 보여진다.
조직학적 스코어로 보면 (도 15), 사철쑥 진공추출물, 죽순 진공추출물을 투여시 DSS 유도 마우스군 보다 조직학적 스코어 및 염증 반응이 낮은 것을 확인할 수 있다.
대조군(CON으로 표시)의 조직 염색 결과를 보면, 점막 및 점막하층에서 보여지는 상피세포(Epithelial cell) 및 크립트(crypt)의 형태가 일정하며, 장벽(barrier)의 붕괴 및 면역세포의 침투(infiltration) 또한 관찰되지 않았다.
DSS군(DSS로 표시)의 조직 염색 결과를 보면, 전체적으로 술잔 세포(goblet cell) 손실 및 크립트 형태가 붕괴되었고, 상피세포층(Epithelial cell layer)의 소실이 관찰되었다. 또한, 점막 부위에 부분적인 과형성(hyperplasia)이 관찰되었으며, 점막층과 점막하층 사이의 장벽이 크게 벌어지며, 점막-점막하 장벽에서 궤양(ulcer)이 관찰되었다. 그리고 점막의 형태가 일정치 못한 부분이 관찰되고, 붕괴된 위치에서 면역세포의 침윤이 관찰되었다. 더불어, 점막 및 점막하 침윤과 같은 크립트 왜곡(crypt distortion) 및 염증 반응이 관찰되었다. DSS 유도 마우스의 대장에서 조직학적 스코어는 5.6±0.54였다.
사철쑥 진공 추출물 단독처리군(0:100으로 표시)의 조직 염색 결과를 보면, 점막 및 점막하에서 보여지는 상피세포 및 크립트의 부분적 붕괴가 관찰되며 점막하에서 면역세포의 침윤이 관찰되었다. 또한, 조직 내 보여지는 점막 및 점막하 부분의 형태적 붕괴 및 면역세포의 침윤의 약간의 감소되는 경향이 보였다. 사철쑥 진공 추출물 단독처리군의 대장에서 조직학적 스코어는 4.1 ±1.34였다.
죽순 진공추출물 단독처리군(100:0로 표시)의 조직 염색 결과를 보면, 점막 및 점막하에서 보이는 상피세포 및 크립트의 부분적 붕괴와 점막하 조직에 면역세포의 침윤이 관찰되었다. 죽순 진공추출물 단독처리군의 대장에서 조직학적 스코어는 4.8±0.44였다.
비교하자면, 사철쑥 진공 추출물 또는 죽순 진공추출물은 DSS 유도 마우스의 대장 조직에 비해 점막 구조 파괴가 감소되고, 궤양이 약화된 것을 확인하였다.
상기 결과들을 통해, 죽순 진공추출물 단독처리 또는 사철쑥 진공추출물 단독처리시 염증성 장질환 개선효과가 있음을 알 수 있었다.
(1)-3. 활성산소 억제능 평가
형광 DCFA-DA 프로브를 사용하여 DSS 처리된 인간 대장암 세포주 2종 (HT-29, Caco2)에서 ROS 생성 수준을 분석하였다(도 16 및 17).
DSS 처리에 의한 활성산소 생성증가를 형광현미경을 통해 관찰할 수 있으며, 이를 형광 마이크로 플레이트리더를 사용하여 활성산소생성변화 확인 시, 각 세포에서 160~200% 이상 활성산소생성이 증가되었다.
하지만 죽순 진공추출물 단독처리(BS로 표시) 또는 사철쑥 진공추출물 단독처리(AC로 표시) 하였을 때는 DSS만 처리했을 때보다 ROS 생성이 감소된 것을 확인하였다(도 16b 및 도 17b).
이를 수치화 하였더니, DSS만 처리한 HT-29 및 Caco2 세포에서 각각 207.79±36.41%, 176.99±26.43%였고, BS는 HT-29 및 Caco2 세포에서 각각 145.10±6.53%, 146.73±16.74%였고, AC는 HT-29 및 Caco2 세포에서 각각 139.92±8.38%, 141.65±17.61%였다
즉, DSS 처리된 HT-29 및 Caco2 세포에서 BS 처리 또는 AC 처리로 인해 ROS 생성이 감소함을 확인하였다.
(2) 장 섬유화 효능 평가
(2)-1. 액틴섬유화 측정
인간 대장암 세포주인 HT-29, Caco2를 이용하여 DSS에 의한 세포의 과도한 액틴다발 형성을 유도하고 사철쑥 추출물 또는 죽순 추출물을 처리하여 액틴다발형성을 평가하였다(도 18, 19).
조합추출물 처리에 의해 액틴다발형성이 감소함을 확인할 수 있었다. 이를 통해 조합추출물이 염증성 장질환 및 장섬유화에 대한 보호효과가 있음을 시사한다.
관찰한 세포들을 마이크로플레이트 분광형광계를 사용하여 측정하였다. 측정결과, DSS 처리된 HT-29 및 Caco2 세포 모두 F-액틴 형성이 상당히 증가하였다. 죽순 진공추출물 단독처리(BS로 표시)된 HT-29 및 Caco2 세포는 각각 108.32±13.73 %, 105.11±5.66%였고, 사철쑥 진공추출물 단독처리(AC로 표시)된 HT-29 및 Caco2 세포는 각각 106.18±7.46%, 108.25±8.50%였다.
구체적으로, F-액틴 형성은 처리되지 않은 세포(CON으로 표시)에 비해 DSS 처리된 세포(DSS로 표시)에서 강하게 관찰되는 반면, BS 또는 AC 처리된 세포(DSS+BS, DSS+AC로 표시)는 DSS 처리된 세포에 비해 F-액틴 형성이 감소됨을 확인하였다.
이를 통해, BS 또는 AC 처리된 HT-29 및 Caco2 세포 모두 DSS 처리에 비해 F-액틴 형성이 감소되었음을 확인하였다.
(2)-2. 액틴다발 형성인자 RhoA 단백질 분석
인간 대장암세포주인 HT-29와 Caco2에서 DSS 처리에 의해 활성형의 RhoA 단백질이 증가하였고 (정상대조군 대비 1200% 이상), 사철쑥 추출물 또는 죽순 추출물 처리에 의해 활성형의 RhoA 단백질이 DSS 단독 처리군에 비해 21~25% 감소됨을 확인하였다(도 20).
구체적으로, DSS 처리된 HT-29 및 Caco2 세포는 각각 0.52±0.02, 0.50±0.04였고, BS 처리된 HT-29 및 Caco2 세포는 각각 0.41±0.07였고, 0.39±0.04였고, AC 처리된 HT-29 및 Caco2 세포는 각각 0.42±0.03, 0.37± 0.004였다.
BS 또는 AC 처리는 DSS-처리된 세포 보다 RhoA 활성화를 더 약화시켰다. 이러한 결과는 BS 또는 AC 처리가 DSS 유발 대장염에서 RhoA 활성을 조절함으로써 F-액틴 형성에 관여함을 시사한다.
(3) 다양한 인자 평가
● 장건강 관련 인자
DSS 유도군 마우스 및 대조군 마우스에 죽순(BS) 진공추출물과 사철쑥(AC) 진공추출물의 장건강 관련 인자의 발현변화를 확인하였다(도 21).
특히 궤양성 대장염의 마커단백질로서 ZO-1(tight junction protein), Bcl-xl(anti-apoptotic protein), COX2(inflammatory mediated protein, cyclooxygenase-2) 등이 알려져 있으며 위 단백들의 발현 변화를 통해 장 건강 개선효과를 확인할 수 있다.
이에 인간 DSS 유도군 마우스 및 대조군 마우스를 활용하여 DSS 및 죽순(BS)과 사철쑥(AC) 각각의 진공추출물의 궤양성 대장염 관련 마커 단백질의 발현을 확인하였다.
결과확인시, 대장암세포에서 DSS 처리에 의해 40% 이상 ZO-1의 발현이 감소하였으나, 사철쑥 진공추출물(0:100으로 표시) 또는 죽순 진공추출물(100:0으로 표시)을 처리하였을 때, 정상대조군과 유사하게 발현이 회복됨을 확인하였다.
더욱이 DSS 처리에 의해 증가된 세포 사멸 관련단백인 Bcl-xl 및 BAX의 발현변화에서 사철쑥 진공추출물 또는 죽순 진공추출물을 처리하였을 때, 발현의 감소가 확인되었다. 또한, 면역유도단백질인 COX2 또한 DSS 처리에 따른 발현의 증가가 사철쑥 진공추출물 또는 죽순 진공추출물을 처리하였을 때, 정상대조군에 유사하게 감소하는 효과를 확인할 수 있었다.
해당 결과를 통해, 사철쑥 진공추출물 또는 죽순 진공추출물이 장 손상 개선에 효과가 있음을 알 수 있다.
● 자가소화작용 관련 인자
DSS 유도군 마우스 및 대조군 마우스를 활용하여 죽순(BS) 진공추출물과 사철쑥(AC) 진공추출물의 조합추출물(50:50 비율) 200ug/mL을 처리한 배양액에서 24시간 배양한 후, 자가소화작용 관련 인자의 발현변화를 확인하였다(도 22).
이에 DSS처리에 의한 자가소화작용증가에서 죽순(BS)과 사철쑥(AC) 각각의 추출물에서의 효능을 확인하고자 하였다.
결과확인시, 앞서 장손상 개선변화와 마찬가지로 사철쑥 진공추출물(0:100으로 표시) 또는 죽순 진공추출물(100:0으로 표시)을 처리하였을 때, 자가소화작용 활성형 마커 단백질(LC3β)의 발현이 정상 대조군과 가장 유사하게 발현이 감소함을 확인할 수 있었다.
해당 결과를 통해, 사철쑥 진공추출물 또는 죽순 진공추출물이 자가소화 작용 조절 효과가 있는 것을 확인하였다.
실시예 4: 사철쑥 추출물 및 죽순 추출물 조합의 조합추출물로의 효능 평가
(1) 염증성 장질환 효능 평가
(1)-1. 질병활성지수, 체중변화, 설사지수, 혈변지수 측정
DSS 유도군 마우스 및 대조군 마우스에 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물 조합(이하, 조합추출물로 지칭)을 250mg/kg 투여하여 질병활성지수, 체중변화, 설사지수, 혈변지수를 측정하였다 (도 10 내지 13).
조합추출물은 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물의 비율이 70:30, 50:50, 30:70 각각에 대해 평가하였다.
질병활성지수 확인 시, DSS 처리기간(0~5일)에 따라 질병활성지수가 증가하였다(최대 7.67). 이에 반해, 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물의 비율별 조합추출물에서는, 70:30(6.20, 19.2% 감소), 30:70(5.80, 24.4% 감소), 50:50(5.80, 24.4% 감소) 모두 질병활성지수의 감소 양상이 관찰되었다(도 10). DSS 처리군에서는 질병활성지수가 기간에 따라 증가도가 높았으나, 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물의 비율별 조합추출물 처리군에서는 DSS 처리군에 비해 질병활성지수의 증가도가 낮았다.
체중변화는 DSS 처리 및 진공추출물 비율별 처리 개체 모두 변화가 나타나지 않았다(도 11).
혈변지수 확인 시, DSS 처리기간에 따른 혈변지수(4일째 3.33)의 증가가 관찰되었다. 이에 반해, 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물의 비율별 조합추출물에서는, 70:30(2.00, 39.9%감소), 30:70(2.40, 27.9% 감소), 50:50(1.2, 63.9%감소) 모두 혈변지수의 감소 양상이 관찰되었다(도 12). DSS 처리군에서는 혈변지수가 기간에 따라 증가도가 높았으나, 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물의 비율별 조합추출물 처리군에서는 DSS 처리군에 비해 질병활성지수의 증가도가 낮았다.
설사지수 확인 시, DSS 처리기간에 따른 설사지수(3일째 1.00)의 증가가 관찰되었다. 이에 반해, 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물의 비율별 조합추출물에서는, 70:30(0.80, 20% 감소), 30:70(0.60, 40% 감소), 50:50(0.40, 60% 감소) 모두 설사지수의 감소 양상이 관찰되었다(도 13). DSS 처리군에서는 설사지수가 기간에 따라 증가도가 높았으나, 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물의 비율별 조합추출물 처리군에서는 DSS 처리군에 비해 질병활성지수의 증가도가 낮았다.
(1)-2. 대장길이 개선 효과
맹장부터 대장까지의 길이를 측정한 결과, DSS 유도 마우스의 경우, 대조군에 비해 길이가 감소하는 경향을 보였다. 조합추출물 비율 모두에서 DSS 유도 마우스보다 길이가 길어지는 경향이 관찰되었다(도 14). 다만, 조합추출물 비율 70:30, 30:70 보다 50:50에서 대장길이 개선의 효과가 가장 뛰어남을 확인할 수 있다.
DSS 처리기간별 대장길이에 변화를 측정한 결과, DSS 유도 마우스의 경우, 대조군에 비해 길이가 21.76% (7.72±0.36cm → 6.04±0.27cm) 감소하였다. 이에 반해, 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물의 비율별 조합추출물에서는, 70:30(6.94±0.51cm, 10.1% 감소), 30:70(7.28±0.58cm, 5.7% 감소), 50:50(7.64±0.64cm, 1.04% 감소) 모두 DSS 유도 마우스보다 길이가 길어지는 경향이 관찰되었다 (도 14). 특히, 조합추출물 비율 70:30(10.1% 감소), 30:70(5.7% 감소) 보다 50:50(1.04% 감소)에서 대장길이 개선의 효과가 가장 뛰어남을 확인할 수 있다.
이러한 데이터는 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물의 혼합처리 30:70 또는 50:50이 DSS 유발 대장염을 완화할 수 있음을 시사한다.
이를 HE 염색을 하여, 조직학적 스코어로 보면 (도 15), 조합추출물(70:30, 50:50, 30:70으로 표시)을 투여시 DSS 유도 마우스군 보다 조직학적 스코어 및 염증 반응이 낮은 것을 확인할 수 있다.
구체적으로, DSS 유도 마우스의 대장에서 조직학적 스코어는 5.6±0.54였으며, 점막 및 점막하 침윤과 같은 움 왜곡(crypt distortion) 및 염증 반응이 관찰되었다.
죽순 진공추출물 및 사철쑥 조합추출물 30:70 투여군(30:70으로 표시)의 조직 염색 결과를 보면, 점막 및 점막하에서 보이는 상피세포 및 크립트의 부분적 붕괴가 관찰되며 점막하 부분의 면역세포의 침윤이 관찰되었고, 조직 내 보이는 점막 및 점막하 부분의 형태적 붕괴 및 면역세포의 침윤의 약간의 감소되는 양상이 관찰되었다.
죽순 진공추출물 및 사철쑥 조합추출물 50:50 투여군(50:50으로 표시)의 조직 염색 결과를 보면, 단독투여군 및 다른 비율로의 복합투여군에서 공통적으로 발견되는 점막 및 점막하에서 보이는 상피세포 및 크립트의 부분적 붕괴와 점막하 부분의 면역세포의 침윤이 관찰되었다. 하지만, 단독투여군 및 다른 비율로의 복합투여군과 비교하여 점막 및 점막하 부분의 형태적 붕괴 및 면역세포의 침윤 감소가 보여졌다. 특히, 상피세포층 및 술잔세포, 크립트 형태의 붕괴가 전체적으로 감소되었다.
죽순 진공추출물 및 사철쑥 조합추출물 70:30 투여군(70:30으로 표시)의 조직 염색 결과를 보면, 점막 및 점막하에서 보이는 상피세포 및 크립트의 부분적 붕괴와 점막하 조직에 면역세포의 침윤이 관찰되었다.
DSS군(DSS로 표시)의 조직 염색 결과를 보면, 전체적으로 술잔 세포(goblet cell) 손실 및 크립트 형태가 붕괴되었고, 상피세포층(Epithelial cell layer)의 소실이 관찰되었다.
이에 비해, 죽순 진공추출물 및 사철쑥 조합추출물 30:70, 70:30, 50:50의 조직학적 스코어는 각각 4.8±0.44, 4.4±0.54, 3.66±1.86였다. 또한 조직을 염색하여 확인한 결과, DSS 유도 마우스의 대장 조직에 비해 점막 구조 파괴가 감소되고, 궤양이 약화된 것을 확인하였다.
죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물의 다양한 비율의 조합추출물 처리군의 중 50:50에서 조직학적 스코어가 가장 낮았으며, 또한, 대장 조직을 염색하여 확인하였을 때도, 다양한 비율의 혼합추출물 처리군들에 비해 결장 점막 구조 파괴가 가장 적었고, 궤양이 가장 많이 약화된 것을 관찰할 수 있었다.
실시예 3의 사철쑥 진공추출물 단독, 죽순 진공추출물 단독에 비해, 조합추출물을 이용했을 때, 혈변, 설사, 대장길이 개선 효과 등이 뛰어남을 확인할 수 있었다.
즉, 실시예 3 및 4를 통해, 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물의 조합추출물 처리시 사철쑥 진공추출물 단독처리 또는 죽순 진공추출물 단독처리에 비해 염증성 장질환 개선효과가 뛰어남을 알 수 있었다.
나아가, 조합추출물의 다양한 비율 중에서도 30:70, 70:30에 비해 50:50의 비율에서 가장 뛰어난 효과가 있는 것으로 판단된 바, 이하에서는 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물 조합의 비율이 50:50인 조합추출물을 이용하여 실험하였다.
(1)-3. 활성산소 억제능 평가
ROS 과잉 생산은 염증성 질환의 진행 및 발병에 관여한다고 알려져 있다(Antioxid Redox Signal. 2014 Mar 1;20(7)). 한편, 대나무와 사철쑥 추출물은 항산화 활성을 가지고 있다고 알려져 있다(J Food Sci. 2019 Jun;84(6):1609-1620., J Asian Nat Prod Res. 2015;17(3):248-55., Biomed Pharmacother. 2018 Mar;99:681-687.).
그래서 형광 DCFA-DA 프로브를 사용하여 DSS 처리된 인간 대장암 세포주 2종 (HT-29, Caco2)에서 ROS 생성 수준을 분석하였다(도 16 및 17).
DSS 처리에 의한 활성산소 생성증가를 형광현미경을 통해 관찰할 수 있으며, 이를 형광 마이크로 플레이트리더를 사용하여 활성산소생성변화 확인 시, 각 세포에서 160~200% 이상 활성산소생성이 증가되었다. 하지만 조합추출물을 같이 처리 시, DSS에 의해 증가된 활성산소생성이 정상 대조군과 유사하게 감소가 관찰되었다(도 16, 17).
DSS 처리된 HT-29 및 Caco2 세포가 현저하게 증가된 ROS 생성을 나타냄을 관찰했다. 이에 반해, 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물 조합의 비율이 50:50인 조합추출물(BA로 표시)을 처리한 HT-29 및 Caco2 세포는 ROS 생성이 약화되었다(도 16a 및 도 17a).
추가적으로, 죽순 진공추출물 단독처리(BS로 표시) 또는 사철쑥 진공추출물 단독처리(AC로 표시) 하였을 때는 DSS만 처리했을 때보다 ROS 생성이 감소된 것을 확인하였다(도 16b 및 도 17b).
이를 수치화 하였더니, DSS만 처리한 HT-29 및 Caco2 세포에서 각각 207.79±36.41%, 176.99±26.43%였고, BS는 HT-29 및 Caco2 세포에서 각각 145.10±6.53%, 146.73±16.74%였고, AC는 HT-29 및 Caco2 세포에서 각각 139.92±8.38%, 141.65±17.61%였다. 또한, BA는 HT-29 및 Caco2 세포에서 각각 111.32±26.52 %, 118.56±12.76 %였다.
즉, DSS 처리된 HT-29 및 Caco2 세포에서 BA 처리가 BS 처리 또는 AC 처리에 비해 감소함을 확인하였다.
이를 통해, 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물이 50:50 비율로 혼합된 조합추출물 처리시 사철쑥 진공추출물 단독처리 또는 죽순 진공추출물 단독처리에 비해 활성산소 억제효과가 뛰어남을 확인할 수 있었다.
다시 말해, 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물이 50:50 비율로 혼합된 조합추출물은 염증성 질환을 예방 또는 치료 또는 개선할 수 있음을 시사한다.
(2) 장 섬유화 효능 평가
(2)-1. 액틴섬유화 측정
본 발명자는 인간 대장암 세포주인 HT-29, Caco2를 이용하여 DSS에 의한 세포의 과도한 액틴다발 형성을 유도하고 사철쑥 추출물 및 죽순 추출물 조합의 조합추출물을 처리하여 액틴다발형성을 평가하였다(도 18, 19).
조합추출물 처리에 의해 액틴다발형성이 감소함을 확인할 수 있었다. 이를 통해 조합추출물이 염증성 장질환 및 장섬유화에 대한 보호효과가 있음을 시사한다.
관찰한 세포들을 마이크로플레이트 분광형광계를 사용하여 측정하였다. 측정결과, DSS 처리된 HT-29 및 Caco2 세포 모두 F-액틴 형성이 상당히 증가하였고, BS 처리된 HT-29 및 Caco2 세포는 각각 108.32±13.73 %, 105.11±5.66%였고, AC 처리된 HT-29 및 Caco2 세포는 각각 106.18±7.46%, 108.25±8.50%였고. BA 처리된 HT-29 및 Caco2 세포는 각각 89.64±3.21%, 93.15±6.61%였다.
구체적으로, F-액틴 형성은 처리되지 않은 세포(CON으로 표시)에 비해 DSS 처리된 세포(DSS로 표시)에서 강하게 관찰되는 반면, BS, AC 및 BS 처리 처리된 세포(DSS+BS, DSS+AC, DSS+BS로 표시)는 DSS 처리된 세포에 비해 F-액틴 형성이 감소됨을 확인하였다.
이를 통해, BA 처리된 HT-29 및 Caco2 세포 모두 DSS 처리에 비해 F-액틴 형성이 감소되었을 뿐만 아니라, BS 처리 또는 AC 처리에 비해서도 F-액틴 형성이 감소되었음을 확인하였다.
(2)-2. 액틴다발 형성인자 RhoA 단백질 분석
앞선 결과를 통하여 비정상적으로 증가된 액틴다발형성은 염증성 장질환에 중요한 마커이며, 앞선 결과에서 죽순, 사철쑥의 조합추출물이 증가된 액틴다발형성의 감소를 확인하였기에, RhoA 매개 신호전달기전에서 RhoA 단백질의 활성을 확인하고자 하였다.
즉, BA 처리에 의해 조절되는 F-액틴 형성이 RhoA 활성 때문인지를 밝히기 위해 RhoA-구아노신 삼인산(GTP) 수준을 측정하였다.
인간 대장암세포주인 HT-29와 Caco2에서 DSS 처리에 의해 활성형의 RhoA 단백질이 증가하였고 (정상대조군 대비 1200% 이상), 조합추출물 처리에 의해 활성형의 RhoA 단백질이 DSS 단독 처리군에 비해 21~25% 감소됨을 확인하였다(도 20).
구체적으로, DSS 처리된 HT-29 및 Caco2 세포는 각각 0.52±0.02, 0.50±0.04였고, BS 처리된 HT-29 및 Caco2 세포는 각각 0.41±0.07였고, 0.39±0.04였고, AC 처리된 HT-29 및 Caco2 세포는 각각 0.42±0.03, 0.37± 0.004였고. BA 처리된 HT-29 및 Caco2 세포는 각각 0.38±0.04, 0.33±0.01였다.
BA 처리는 DSS-처리된 BS 및 AC보다 RhoA 활성화를 더 약화시켰다. 이러한 결과는 BA 처리가 DSS 유발 대장염에서 RhoA 활성을 조절함으로써 F-액틴 형성에 관여함을 시사한다.
위 결과를 통해 염증성 장질환에서 RhoA-ROCK-LIMK-cofilin의 신호기전이 매우 밀접하게 관련됨을 알 수 있으며, 죽순, 사철쑥 조합추출물이 과도하게 증가된 RhoA 매개 신호전달기전 활성을 저해하여 염증성 장질환에 의한 장손상을 개선하는 효과를 확인할 수 있었다.
(3) 다양한 인자 평가
● 장건강 관련 인자
인간 대장암 세포주 2종(HT-29, Caco2)을 활용하여 죽순(BS) 진공추출물과 사철쑥(AC) 진공추출물의 조합추출물(50:50 비율)의 장건강 관련 인자의 발현변화를 확인하였다(도 21).
이전 연구에 따르면 궤양성 대장염 환자 및 유도모델의 장 조직에서 염증매개인자의 발현이 증가되며 과도한 염증반응으로 인해 장조직의 붕괴가 진행되는 것으로 알려져 있다.
특히 궤양성 대장염의 마커단백질로서 ZO-1(tight junction protein), Bcl-xl(anti-apoptotic protein), COX2(inflammatory mediated protein, cyclooxygenase-2) 등이 알려져 있으며 위 단백들의 발현 변화를 통해 장 건강 개선효과를 확인할 수 있다.
이에 인간 대장암 세포주를 활용하여 DSS 및 죽순(BS)과 사철쑥(AC)의 조합추출물의 배합비율별에 따른(200μg/ml, 24h) 궤양성 대장염 관련 마커 단백질의 발현을 확인하였다.
결과확인시, 대장암세포에서 DSS 처리에 의해 40% 이상 ZO-1의 발현이 감소하였으나, 조합추출물(BS:AC, 50:50)을 같이 처리하였을 때, 정상대조군과 유사하게 발현회복됨을 확인할 수 있다.
더욱이 DSS 처리에 의해 증가된 세포 사멸 관련단백인 Bcl-xl 및 BAX의 발현변화에서 죽순과 사철쑥 50:50 배합비율의 조합추출물 처리시, 발현의 감소가 확인되었으며, 면역유도단백질인 COX2 또한 DSS 처리에 따른 발현의 증가가 복 합추출물(50:50)에서 정상대조군에 가장 유사하게 감소하는 효과를 확인할 수 있었다.
해당 결과를 통해, 사철쑥 및 죽순 복합 추출물의 배합 비율에 대한 장 손상 개선 효과에 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물 배합비율 50:50에서 가장 효과가 높음을 알 수 있다.
● 자가소화작용 관련 인자
DSS 유도군 마우스 및 대조군 마우스를 활용하여 죽순(BS) 진공추출물과 사철쑥(AC) 진공추출물의 조합추출물(50:50 비율) 200ug/mL을 처리한 배양액에서 24시간 배양한 후, 자가소화작용 관련 인자의 발현변화를 확인하였다(도 22).
더욱이 최근 연구에 따르면 궤양성 대장염 환자 및 동물모델에서 장 내 장벽(intestinal epithelial barrier)의 유지에 있어 자가소화작용이 중요한 조절자로서 작용한다고 보고되고 있다(Autophagy. 2021 Apr 27;1-18.).
또한 자가소화작용은 궤양성대장염에서 장내 미생물총(microbiota) 및 염증반응(inflammation)에서의 상호작용 (Autophagy. 2020 Jan;16(1):38-51.)과 궤양성 대장염 모델에서 자가소화작용이 증가됨이 알려져 있다.
이에 DSS처리에 의한 자가소화작용증가에서 죽순, 사철쑥 배합비율에 따른 조합추출물의 효능을 확인하고자 하였다.
결과확인시, 앞서 장손상 개선변화와 마찬가지로 동량의 배합비율의 조합추출물에서 자가소화작용 활성형 마커 단백질(LC3β)의 발현이 정상 대조군과 가장 유사하게 발현이 감소함을 확인할 수 있었다.
해당 결과를 통해, 사철쑥 및 죽순 복합 추출물의 배합 비율에 대한 자가소화 작용 조절 효과에 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물 배합비율 50:50에서 가장 효과가 높음을 알 수 있다.
● 전염증성 인자
마우스에 2.5% DSS를 3일간 투여한 군(DSS군), 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물을 50:50의 비율로 혼합한 조합추출물 투여군(BA군)의 대장을 적출하여 웨스턴 블랏으로 대장염 마커의 발현을 확인하였다. 이 때, 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물을 50:50의 비율로 혼합한 조합추출물을 250mg/kg로 경구투여 하였고, 정상 대조군과 DSS 처리군은 PBS를 투여하였다.
대장염 마커로 전염증성 인자인 STAT3, COX2, iNOS 등의 발현을 확인하였다.
도 23의 웨스턴 블랏 결과를 수치화한 도 24를 보면 3일차에 DSS군의 P-STAT3/STAT3은 528.33%, COX2/GAPDH는 184.9%로 대조군(CON으로 표시)에 비해 증가하였다. 이에 반해, 조합추출물 투여군(BA로 표시)의 P-STAT3/STAT3 및 COX2/GAPDH는 DSS군에 비해 감소하였다.
또한, 6일차에는 DSS군의 P-STAT3/STAT3은 798.43%, COX2/GAPDH는 428.53%, iNOS/GAPDH는 322.19%로 대조군에 비해 증가하였다. 이에 반해, 조합추출물 투여군(BA로 표시)의 P-STAT3/STAT3, COX2/GAPDH, iNOS/GAPDH는 DSS군에 비해 감소하였다.
또한 염증반응 매개 전사인자인 NF-κB의 활성 변화를 확인하였다.
인간 대장암 세포주 2종(HT-29, Caco2)을 활용하여 죽순(BS) 진공추출물과 사철쑥(AC) 진공추출물의 조합추출물(50:50 비율) 200ug/mL을 처리한 배양액에서 24시간 배양한 후, NF-κB 발현변화를 확인하였다(도 25).
도 25를 보면 HT-29 및 Caco2 모두 DSS 투여군 (-로 표시)의 NF-κB(p-p65/total p65)의 발현이 대조군(CON으로 표시)에 비해 200% 이상 증가하였다. 이에 반해, 조합추출물 투여군(BA로 표시)에서는 DSS군에 비해 감소하는 것을 확인할 수 있다.
이와 같이, 도 23 내지 25를 통해, DSS 유도 모델에 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물의 50:50 비율의 조합추출물 투여로 인해 STAT3, COX2, iNOS, NF-κB 등의 인자들의 발현이 감소함을 확인하였고, 이는 조합추출물이 DSS 유도 궤양성 대장염을 감소 또는 예방 또는 치료할 수 있다는 것을 시사한다.
● 세포사멸(Apoptosis) 관련 인자
마우스에 2.5% DSS를 3일간 투여한 군(DSS군), 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물을 50:50의 비율로 혼합한 조합추출물 투여군(BA군)의 대장을 적출하여 qRT-PCR로 Apotosis 관련인자, 면역 관련인자, 염증 관련인자, 종양 관련인자 등을 확인하였다.
세포사멸(Apoptosis) 관련인자인 BAX (Apoptosis regulator BAX, also known as bcl-2-like protein 4), Bcl-2-like 1 (BCL2L1), Gzmb (Granzyme B), Fas (Fas receptor), FasL (Fas ligand)의 발현을 확인한 결과 (도 26), DSS 유도군에 비해 BA군에서 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다.
● 면역 관련 인자
면역 관련인자인 C3 (Complement component 3), CCL19 (Chemokine (C-C motif) ligand 19), CCL2 (chemokine (C-C motif) ligand 2), Ccr7 (C-C chemokine receptor type 7), CD38 (cluster of differentiation 38), CD3E (CD3e molecule, epsilon), CD4 (cluster of differentiation 4), CD40 (Cluster of differentiation 40), CD68 (Cluster of Differentiation 68) , CD8a (Cluster of Differentiation 8a), ICOS (Inducible T Cell Costimulator), Ptprc (Protein tyrosine phosphatase, receptor type, C) 의 발현을 확인한 결과 (도 27 내지 28), DSS 유도군에 비해 BA군에서 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다.
● 염증 관련 인자
염증 관련인자인 CSF1 (colony stimulating factor 1), CXCL11 (C-X-C motif chemokine 11), IL-15 (Interleukin 15), IL-1b (Interleukin 1 beta), NF-KB1 (Nuclear factor NF-kappa-B p105 subunit), Nos2 (Nitric oxide synthase 2), Ptgs2 (Prostaglandin-endoperoxide synthase 2), Socs1(Suppressor of cytokine signaling 1), Socs2(Suppressor of cytokine signaling 2), Stat3(Signal transducer and activator of transcription 3), Stat4(Signal transducer and activator of transcription 4), Stat6(Signal transducer and activator of transcription 6), Tnf(Tumor recrosis factor), TNFRSF18(Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18), Nfafc3(Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 3), Nfatc4(Nuclear factor of activated T-cells, cytoplasmic 4), Ly96(Lymphocyte antigen 96) 의 발현을 확인한 결과(도 29 내지 31), DSS 유도군에 비해 BA군에서 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다.
● 종양 관련 인자
종양 관련인자인 Gusb gene (Beta-glucuronidase), HMOX1 (heme oxygenase 1 gene), Lrp2 (Low density lipoprotein receptor-related protein 2), SKI(SKI Proto-Oncogene), Smad3 (Mothers against decapentaplegic homolog3), Smad7(Mothers against decapentaplegic homolog7), LIF(Leukemia inhibitory factor), Agtr2 (Angiotensin II receptor type 2), Edn1 (Endothelin 1), Selp(P-selectin), Vcam1(Vascular cell adhesion protein 1), Icam1(Intercellular adhesion molecule 1)의 발현을 확인한 결과(도 32 내지 33), DSS 유도군에 비해 BA군에서 발현이 억제됨을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 사철쑥 추출물 및 죽순 추출물 조합의 조합추출물의 다양한 농도별로 평가
사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물의 최적비율인 50:50을 다양한 농도별로 염증성 장질환 효능을 평가하였다.
이를 위해, DSS 유도군에 다음과 같이 투여하여 평가하였다(표 12).
실험군 급수 투여물질 농도
(mg/kg) 		동물수
Normal(NC) Tap water vehicle -
DSS 2.5%DSS vehicle -
B:A=50:50 BS:AC=50:50 10
B:A=50:50 BS:AC=50:50 50
B:A=50:50 BS:AC=50:50 250
B:A=50:50 BS:AC=50:50 1250
(1) 염증성 장질환 효능 평가
(1)-1. 질병활성지수, 체중변화, 설사지수, 혈변지수 측정
● 질병활성지수 (DAI score)
조합추출물의 다양한 농도별 질병활성지수는 도 34에 도시되어 있다. 도 34의 그래프를 도 36(a)에 수치화 하였다.
대조군의 경우 투여 이틀째부터 상승하기 시작해서 5일째 되는 날 가장 높은 점수가 관찰되었다. 조합추출물을 10mg/kg으로 투여한 경우에는 3일째부터 대조군보다 낮은 2, 4일째에는 3.38, 5일째에는 5.63점으로 대조군보다 낮았다. 50mg/kg 투여군의 경우 3일째에 1.38점으로 대조군보다 낮았지만 4일째, 5일째에는 차이가 없었다. 250mg/kg 투여군은 3일째에 1.08로 대조군보다 낮았고, 4일째에도 3.23으로 대조군보다 낮았다. 5일째에 상승폭이 더 커져 6으로 올라갔지만 6.55인 대조군보다는 낮았다. 초고농도인 1250mg/kg 투여군의 경우에도 대조군보다 낮은 점수를 보여, 이틀째에는 0.18, 3일째 1.13, 4일째 3.13, 5일째 6점으로 관찰되었다.
● 체중변화
조합추출물의 다양한 농도별 체중변화는 도 35에 도시되어 있다. 도 35의 그래프를 도 36(b)에 수치화 하였다.
복합물의 전 농도에서 4일째까지는 건강군, 대조군과 비교하여 몸무게 차이가 근소하였다. 5일째에는 건강군은 증가하였지만 DSS 투여군은 모두 감소하였다. 대조군은 DSS 투여 시작일에 비해 몸무게가 99.19%로 약간 감소하였고, 10mg/kg은 100.23%으로 약간 높았다. 반면에 50mg/kg은 97.87%로 대조군보다 조금 더 감소하였고, 250mg/kg은 100.17%로 대조군보다 높았다. 초고농도인 1250mg/kg은 98.89%로 대조군보다 근소하게 낮았다.
● 설사지수
조합추출물의 다양한 농도별 설사지수는 37에 도시되어 있다. 도 37의 그래프를 도 39(a)에 수치화 하였다.
대조군은 4일째까지 조금씩 증가하다가 5일째 급격히 증가하였다. 5일째에 대조군은 2.18점인 반면, 10mg/kg은 1.13으로 가장 차이가 컸다. 50mg/kg은 1.75, 250mg/kg은 1.69, 1250mg/kg은 1.5로 대조군보다 낮게 관찰되었다.
● 혈변지수
조합추출물의 다양한 농도별 혈변지수는 38에 도시되어 있다. 도 38의 그래프를 도 39(b)에 수치화 하였다.
대조군에 비해 조합추출물 투여군의 혈변 지수는 모두 낮았다. 5일째에는 거의 모든 개체에서 육안으로 혈이 관찰 가능한 혈변이 관찰되었다. 이틀째부터 혈변이 관찰되기 시작하여 3일에서 4일로 넘어가는 과정에서 혈변지수가 급격하게 상승하였다. 10m/kg은 이틀째 0.25, 3일째 0.75, 4일째 2.5, 5일째 4점으로 대조군보다는 낮게 증가하였다. 50mg/kg은 이틀째에는 혈변이 관찰되지 않았고, 3일째에는 0.75, 4일째 3, 5일째 3.75로 대조군과 유사하게 증가하였다. 250mg/kg은 이틀째에 0.15점이 관찰되었고, 3일째에는 0.62, 4일째에는 2.31로 대조군보다 낮았다. 1250mg/kg군은 3일째까지는 큰 차이가 없었지만, 2.25점이 관찰된 4일째에는 대조군(3.27)보다 낮게 관찰되었다.
(1)-2. 대장길이 개선 효과
조합추출물의 다양한 농도별 대장길이는 40에 도시되어 있다.
맹장부터 대장까지의 길이를 측정한 결과, DSS 유도 대장염 마우스의 경우, 건강군에 비해 길이가 감소하는 경향을 보였다. 특히 대조군의 경우 건강군(7.45cm)에 비해 6.48cm로 유의하게 감소하였다. 조합추출물 투여군은 250mg/kg을 투여하였을 때, 6.82cm로 대조군보다 길게 측정되었으나 통계적 유의성은 없었다. 반면, 10mg/kg은 6.3cm, 50mg/kg은 6.11cm, 초고농도인 1250mg/kg군 역시 6.2cm로 큰 차이를 보이지 않았다.
DAI, 설사지수, 혈변지수, 대장길이 평가 전반적 요약
죽순과 사철쑥의 단독 추출물을 이용하여 장기능 손상 개선 여부를 확인한 실험에서 죽순에 비해 사철쑥이 DSS투여 5일째의 질병질환지수 (DAI score)가 대조군보다 낮게 나타났다.
죽순(B)과 사철쑥(A)을 70:30, 50:50, 30:70 비율로 혼합한 실험에서 B:A=50:50가 질병질환지수, 설사지수, 혈변지수에서 모든 낮은 수치를 나타내었다.
조합추출물을 10, 50, 250, 1250mg/kg으로 매일 투여하여 5일간 질병질환지수를 확인한 결과, 10, 50mg/kg군에 비해 250, 1250mg/kg군이 DAI 점수가 낮게 나타났다.
혈변지수는 DSS투여 3~4일에 250mg/kg군에서 대조군에 비해 가장 낮은 점수를 보이다가 5일째에 증가하였다.
대장의 길이는 DSS로 대장염을 유발한 군이 건강군에 비해 유의하게 줄어든 것을 확인하였다. 대조군과 조합추출물(50:50) 투여군의 대장길이는 그룹간 유의적 차이를 보이지 않았으나, 250mg/kg군이 대장염 유발군 중에서는 6.82cm로 가장 길게 나타났다.
● 실시예 결론
지금까지 서술한 실시예들은 DSS로 유발된 대장염에서 죽순 진공추출물 단독, 사철쑥 진공추출물 단독, 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물이 혼합된 조합추출물의 치료 효과를 입증했다.
상기 죽순 진공추출물 단독, 사철쑥 진공추출물 단독, 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물이 혼합된 조합추출물은 대장 염증, 대장 점막 구조 파괴 감소, 궤양으로부터 보호하는 등 다양한 효과가 있었다.
특히, 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물이 혼합된 조합추출물이 죽순 진공추출물 단독 또는 사철쑥 진공추출물 단독에 비해 DSS로 유발된 대장염에서 치료 또는 예방 또는 개선 효과가 더 뛰어났다.
더군다나 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물이 혼합된 조합추출물을 다양한 비율(30:70, 50:50, 70:30)로 혼합하여 비교하였을 때, 50:50으로 혼합되었을 때 다른 비율(30:70, 70:30)에 비해 효과가 뛰어났다.
상기 실시예들은 죽순 진공추출물과 사철쑥 진공추출물의 시너지 효과를 입증한 것이다. 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물이 50:50으로 혼합된 조합추출물은 죽순 단일 진공추출물 또는 사철쑥 단일 진공추출물 처리에 비해 DSS로 유발된 대장염에서 결장 염증 및 결장 점막 구조 파괴 및 궤양에 대해 더 높은 효능으로 보호할 수 있음을 뒷받침한다.
이러한 결과는 염증성 장질환의 증상을 완화하고 치료 또는 예방 또는 개선에 효과적이라는 점, 천연 재료이기 때문에 화학물질 등에 비해 독성이 상대적으로 약한 점의 다양한 이점이 있습니다.
구체적으로, 본원 발명의 상기 50:50으로 혼합된 조합추출물 처리는 DSS 유도 마우스 모델에서 NF-κB 및 STAT3 활동과 COX2 및 iNOS의 발현을 감소시켰으며(도 23), 이는 조합추출물이 DSS 유발 대장염에서 항염증 효과를 나타내는 증거를 제공한다.
또한, DSS 처리된 대장암 세포주에 50:50으로 혼합된 조합추출물을 처리하였을 때, 죽순 단독 진공추출물 또는 사철쑥 단독 진공추출물 보다 RhoA-GTP(RhoA의 활성 형태) 수준을 유의하게 감소시켰음을 입증했다(도 20).
이러한 결과들은 RhoA/ROCK-STAT3 신호 전달 경로가 대장 염증 및 대장염의 발병에 관여함을 시사한다.
또한 DSS 처리가 RhoA-GTP 수준을 증가시키고 HT-29 및 Caco-2 세포에서 F-액틴 중합을 유도한다는 것을 확인했다. 이에 반해, 50:50으로 혼합된 조합추출물을 처리하면 F-액틴 중합이 감소되었다(도 18 및 19).
이러한 결과들은 50:50으로 혼합된 조합추출물 처리가 DSS-처리된 세포에서 RhoA/ROCK 활성을 억제함으로써 변경된 F-액틴 형성을 약화시킨다는 것을 보여준다.
그리고 DSS 처리된 세포는 ROS 생성이 증가하였고, 이에 반해, 50:50으로 혼합된 조합추출물을 처리한 세포는 ROS 과잉 생성을 약화시켰다(도 16 및 17).
이러한 결과는 50:50으로 혼합된 조합추출물 처리가 ROS 생성의 불균형과 결장 염증에서 관찰되는 병리학적 변화의 진행과 관련될 수 있는 과도한 산화 스트레스를 약화시킨다는 것을 시사한다.
종합하면, 상기 실시예들은 죽순 진공추출물 및 사철쑥 진공추출물이 혼합된 조합추출물이 NF-κB-STAT3 인산화 및 RhoA/ROCK 활성을 감소시켜 결장 염증을 감소시키는 데 기여한다는 것을 보여줍니다. 다시 말해, 상기 조합추출물은 결장염에서 치료적 역할을 하여 결장 점막 및 궤양 구조의 약화된 파괴를 초래하는 것입니다.
본 출원은 사철쑥 진공추출물 또는/및 죽순 진공추출물로 구성된 장질환 예방 또는 치료용 조성물 및 이를 제조하는 방법을 제공할 수 있다.

Claims (33)

  1. 사철쑥(Artemisia capillaris Thunberg) 진공추출물 및 죽순 진공추출물(Bamboo shoot)을 유효성분으로 포함하고,
    이 때, 상기 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물은 70:30, 50:50 및 30:70 중 선택되는 하나의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는,
    염증성장질환 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 사철쑥 추출물 및 죽순 추출물은 50:50의 중량비로 조성물 내에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 사철쑥 진공추출물은 클로로겐산(chlorogenic acid), 스코파론 (scoparone), 스코폴레틴(scopoletin), 스코폴린(scopolin), 피쿠식산(ficusic acid), 쿠마린(coumarin), 피넨(pinene), 유칼립톨(eucalyptol), 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 테르피넨 (Terpinene), 아브시스산 (Abscisic acid), P-사이멘(p-Cymene), 베르가모텐(Bergamotene), 지베렐린 (Gibberellin), 보르네올(borneol), 캠퍼(Camphor), 카페산(Caffeic acid), 하이페로사이드(Hyperoside), 이소케르세틴(Isoquercitrin), 이소클로로겐산 A(Isochlorogenic acid A), 이소클로로겐산 B(Isochlorogenic acid B), 이소클로로겐산 C(Isochlorogenic acid C), 롱기베르베논(longiverbenone), 유제놀(Eugenol) 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 죽순 진공추출물은 쿠마린산(coumaric acid), 페룰산(Ferulic acid), 하이페로사이드(Hyperoside), 이소클로로겐산 A (Isochlorogenic acid A), 옥살산(oxalic acid), 말산(malic acid), 살리실산메틸(Methyl salicylate) 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 염증성장질환은 크론병, 궤양성 대장염, 베체트장염 중 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제, 보존제 중 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제 1항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 질병활성지수의 증가도가 낮아짐; 혈변지수의 증가도가 낮아짐; 설사지수의 증가도가 낮아짐; 대장 길이 길어짐; 대장 조직의 점막 구조 파괴가 감소됨; 궤양이 약화됨; 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성이 감소함; ZO-1의 발현 증가; Bcl-xl, BAX 또는 COX2의 발현 감소; 자가소화작용 활성형 마커(LC3β)의 발현 감소; 전염증성 인자(STAT3, COX2, iNOS)발현 감소; NF-κB의 발현 감소; 세포사멸(Apoptosis) 관련인자(BAX, BCL2L1, Gzmb, Fas, FasL)의 발현 감소; 면역 관련 인자(C3, CCL19, CCL2, Ccr7, CD38, CD3E, CD4, CD40, CD68, CD8a, ICOS, Ptprc)의 발현 감소; 염증 관련 인자(CSF1, CXCL11, IL-15, IL-1b, NF-KB1, Nos2, Ptgs2, Socs1, Socs2, Stat3, Stat4, Stat6, Tnf, TNFRSF18, Nfafc3, Nfatc4, Ly96)의 발현 감소; 종양 관련인자(Gusb gene, HMOX1, Lrp2, SKI, Smad3, Smad7, LIF, Agtr2, Edn1, Selp, Vcam1, Icam1)의 발현 감소; 중 선택되는 하나 이상의 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 사철쑥(Artemisia capillaris Thunberg) 진공추출물 및 죽순 진공추출물(Bamboo shoot)을 유효성분으로 포함하고,
    이 때, 상기 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물은 70:30, 50:50 및 30:70 중 선택되는 하나의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는,
    대장 또는 소장의 섬유화 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 사철쑥 추출물 및 죽순 추출물은 50:50의 중량비로 조성물 내에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 사철쑥 진공추출물은 클로로겐산(chlorogenic acid), 스코파론 (scoparone), 스코폴레틴(scopoletin), 스코폴린(scopolin), 피쿠식산(ficusic acid), 쿠마린(coumarin), 피넨(pinene), 유칼립톨(eucalyptol), 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 테르피넨 (Terpinene), 아브시스산 (Abscisic acid), P-사이멘(p-Cymene), 베르가모텐(Bergamotene), 지베렐린 (Gibberellin), 보르네올(borneol), 캠퍼(Camphor), 카페산(Caffeic acid), 하이페로사이드(Hyperoside), 이소케르세틴(Isoquercitrin), 이소클로로겐산 A(Isochlorogenic acid A), 이소클로로겐산 B(Isochlorogenic acid B), 이소클로로겐산 C(Isochlorogenic acid C), 롱기베르베논(longiverbenone), 유제놀(Eugenol) 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 제 8항에 있어서,
    상기 죽순 진공추출물은 쿠마린산(coumaric acid), 페룰산(Ferulic acid), 하이페로사이드(Hyperoside), 이소클로로겐산 A (Isochlorogenic acid A), 옥살산(oxalic acid), 말산(malic acid), 살리실산메틸(Methyl salicylate) 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  12. 제 8항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 희석제, 보존제 중 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 제 8항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 질병활성지수의 증가도가 낮아짐; 혈변지수의 증가도가 낮아짐; 설사지수의 증가도가 낮아짐; 대장 길이 길어짐; 대장 조직의 점막 구조 파괴가 감소됨; 궤양이 약화됨; 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성이 감소함; ZO-1의 발현 증가; Bcl-xl, BAX 또는 COX2의 발현 감소; 자가소화작용 활성형 마커(LC3β)의 발현 감소; 전염증성 인자(STAT3, COX2, iNOS)발현 감소; NF-κB의 발현 감소; Apoptosis 관련인자(BAX, BCL2L1, Gzmb, Fas, FasL)의 발현 감소; 면역 관련 인자(C3, CCL19, CCL2, Ccr7, CD38, CD3E, CD4, CD40, CD68, CD8a, ICOS, Ptprc)의 발현 감소; 염증 관련 인자(CSF1, CXCL11, IL-15, IL-1b, NF-KB1, Nos2, Ptgs2, Socs1, Socs2, Stat3, Stat4, Stat6, Tnf, TNFRSF18, Nfafc3, Nfatc4, Ly96)의 발현 감소; 종양 관련인자(Gusb gene, HMOX1, Lrp2, SKI, Smad3, Smad7, LIF, Agtr2, Edn1, Selp, Vcam1, Icam1)의 발현 감소; 중 선택되는 하나 이상의 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. 사철쑥(Artemisia capillaris Thunberg) 진공추출물 및 죽순 진공추출물(Bamboo shoot)을 유효성분으로 포함하고,
    이 때, 상기 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물은 70:30, 50:50 및 30:70 중 선택되는 하나의 중량비로 포함되는 것을 특징으로 하는,
    장 건강에 관련된 질환을 개선을 위한 건강기능 식품 조성물.
  15. 제 14항에 있어서,
    상기 건강기능 식품 조성물은 건강기능 식품에 허용가능한 향미제, 방부제, 착색제 중 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 건강기능 식품 조성물.
  16. 제 14항에 있어서,
    상기 사철쑥 추출물 및 죽순 추출물은 50:50의 중량비로 조성물 내에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 건강기능 식품 조성물.
  17. 제 14항에 있어서,
    상기 사철쑥 진공추출물은 클로로겐산(chlorogenic acid), 스코파론 (scoparone), 스코폴레틴(scopoletin), 스코폴린(scopolin), 피쿠식산(ficusic acid), 쿠마린(coumarin), 피넨(pinene), 유칼립톨(eucalyptol), 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 테르피넨 (Terpinene), 아브시스산 (Abscisic acid), P-사이멘(p-Cymene), 베르가모텐(Bergamotene), 지베렐린 (Gibberellin), 보르네올(borneol), 캠퍼(Camphor), 카페산(Caffeic acid), 하이페로사이드(Hyperoside), 이소케르세틴(Isoquercitrin), 이소클로로겐산 A(Isochlorogenic acid A), 이소클로로겐산 B(Isochlorogenic acid B), 이소클로로겐산 C(Isochlorogenic acid C), 롱기베르베논(longiverbenone), 유제놀(Eugenol) 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하고,
    상기 죽순 진공추출물은 쿠마린산(coumaric acid), 페룰산(Ferulic acid), 하이페로사이드(Hyperoside), 이소클로로겐산 A (Isochlorogenic acid A), 옥살산(oxalic acid), 말산(malic acid), 살리실산메틸(Methyl salicylate) 중 선택되는 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능 식품 조성물.
  18. 제 14항에 있어서,
    상기 건강기능 식품 조성물은 질병활성지수의 증가도가 낮아짐; 혈변지수의 증가도가 낮아짐; 설사지수의 증가도가 낮아짐; 대장 길이 길어짐; 대장 조직의 점막 구조 파괴가 감소됨; 궤양이 약화됨; 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성이 감소함; ZO-1의 발현 증가; Bcl-xl, BAX 또는 COX2의 발현 감소; 자가소화작용 활성형 마커(LC3β)의 발현 감소; 전염증성 인자(STAT3, COX2, iNOS)발현 감소; NF-κB의 발현 감소; 세포사멸(Apoptosis) 관련인자(BAX, BCL2L1, Gzmb, Fas, FasL)의 발현 감소; 면역 관련 인자(C3, CCL19, CCL2, Ccr7, CD38, CD3E, CD4, CD40, CD68, CD8a, ICOS, Ptprc)의 발현 감소; 염증 관련 인자(CSF1, CXCL11, IL-15, IL-1b, NF-KB1, Nos2, Ptgs2, Socs1, Socs2, Stat3, Stat4, Stat6, Tnf, TNFRSF18, Nfafc3, Nfatc4, Ly96)의 발현 감소; 종양 관련인자(Gusb gene, HMOX1, Lrp2, SKI, Smad3, Smad7, LIF, Agtr2, Edn1, Selp, Vcam1, Icam1)의 발현 감소; 중 선택되는 하나 이상의 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 건강기능 식품 조성물.
  19. 제 1항, 제 8항 및 제 14항 중 어느 한 항의 조성물을 제조하는 방법으로,
    사철쑥 및 죽순을 준비함;
    사철쑥 및 죽순을 각각 진공추출장치로 진공추출하여 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물을 수득함;
    상기 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물을 혼합함;
    이 때, 상기 혼합은 상기 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물이 70:30, 50:50 및 30:70 중 선택되는 하나의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 방법은 사철쑥 진공추출물 및 죽순 진공추출물을 기체 크로마토그래피 질량분석법으로 분획화 하는 것을 더 포함할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 19항에 있어서,
    상기 사철쑥 진공추출물 또는 죽순 진공추출물은 진공추출장치 조건을 200℃ 내지 300℃의 온도에서 15시간 내지 30시간 동안 1회 내지 5회 추출하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 1항의 조성물을 대상에 투여함;
    을 포함하는 염증성장질환을 예방 또는 치료하기 위한 방법.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 대상은 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 22항에 있어서,
    상기 투여의 부위는 근육, 피내, 피하, 정맥, 복강, 동맥, 심장, 점막, 척수, 골수 중 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 22항에 있어서,
    상기 투여시 상기 조성물은 1회에 10mg/kg 내지 2000mg/kg의 용량으로 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 22항에 있어서,
    상기 투여의 횟수는 하루에 1회 또는 수회 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 22항에 있어서,
    상기 투여는 질병활성지수의 증가도가 낮아짐; 혈변지수의 증가도가 낮아짐; 설사지수의 증가도가 낮아짐; 대장 길이 길어짐; 대장 조직의 점막 구조 파괴가 감소됨; 궤양이 약화됨; 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성이 감소함; ZO-1의 발현 증가; Bcl-xl, BAX 또는 COX2의 발현 감소; 자가소화작용 활성형 마커(LC3β)의 발현 감소; 전염증성 인자(STAT3, COX2, iNOS)발현 감소; NF-κB의 발현 감소; Apoptosis 관련인자(BAX, BCL2L1, Gzmb, Fas, FasL)의 발현 감소; 면역 관련 인자(C3, CCL19, CCL2, Ccr7, CD38, CD3E, CD4, CD40, CD68, CD8a, ICOS, Ptprc)의 발현 감소; 염증 관련 인자(CSF1, CXCL11, IL-15, IL-1b, NF-KB1, Nos2, Ptgs2, Socs1, Socs2, Stat3, Stat4, Stat6, Tnf, TNFRSF18, Nfafc3, Nfatc4, Ly96)의 발현 감소; 종양 관련인자(Gusb gene, HMOX1, Lrp2, SKI, Smad3, Smad7, LIF, Agtr2, Edn1, Selp, Vcam1, Icam1)의 발현 감소; 중 선택되는 하나 이상의 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 8항의 조성물을 대상에 투여함;
    을 포함하는 대장 또는 소장의 섬유화를 예방 또는 치료하기 위한 방법.
  29. 제 28항에 있어서,
    상기 대상은 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 28항에 있어서,
    상기 투여의 부위는 근육, 피내, 피하, 정맥, 복강, 동맥, 심장, 점막, 척수, 골수 중 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제 29항에 있어서,
    상기 투여시 상기 조성물은 1회에 10mg/kg 내지 2000mg/kg의 용량으로 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 29항에 있어서,
    상기 투여의 횟수는 하루에 1회 또는 수회 투여할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 29항에 있어서,
    상기 투여는 질병활성지수의 증가도가 낮아짐; 혈변지수의 증가도가 낮아짐; 설사지수의 증가도가 낮아짐; 대장 길이 길어짐; 대장 조직의 점막 구조 파괴가 감소됨; 궤양이 약화됨; 활성산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성이 감소함; ZO-1의 발현 증가; Bcl-xl, BAX 또는 COX2의 발현 감소; 자가소화작용 활성형 마커(LC3β)의 발현 감소; 전염증성 인자(STAT3, COX2, iNOS)발현 감소; NF-κB의 발현 감소; 세포사멸(Apoptosis) 관련인자(BAX, BCL2L1, Gzmb, Fas, FasL)의 발현 감소; 면역 관련 인자(C3, CCL19, CCL2, Ccr7, CD38, CD3E, CD4, CD40, CD68, CD8a, ICOS, Ptprc)의 발현 감소; 염증 관련 인자(CSF1, CXCL11, IL-15, IL-1b, NF-KB1, Nos2, Ptgs2, Socs1, Socs2, Stat3, Stat4, Stat6, Tnf, TNFRSF18, Nfafc3, Nfatc4, Ly96)의 발현 감소; 종양 관련인자(Gusb gene, HMOX1, Lrp2, SKI, Smad3, Smad7, LIF, Agtr2, Edn1, Selp, Vcam1, Icam1)의 발현 감소; 중 선택되는 하나 이상의 효과를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
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