WO2018008803A1

WO2018008803A1 - 세스퀴테르펜 유도체의 신규한 용도

Info

Publication number: WO2018008803A1
Application number: PCT/KR2016/011558
Authority: WO
Inventors: 오상택
Original assignee: 국민대학교산학협력단
Priority date: 2016-07-07
Filing date: 2016-10-14
Publication date: 2018-01-11
Also published as: KR101674622B1; JP6667681B2; EP3482750B1; AU2016413709A1; CN109414416A; AU2016413709B2; ES2929708T3; EP3482750A4; EP3482750A1; CN109414416B; JP2019524686A; US20200078338A1; US10918625B2; US20190290617A1

Abstract

본 발명은 세스퀴테르펜 유도체의 신규한 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명의 화학식 1로 표시되는 세스퀴테르펜 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 안구 내 혈관 누수(vascular leakage)에 의한 황반변성 또는 황반부종의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 시판되고 있는 안구 내 질환 관련 치료제들이 유리체강 내로 직접 투여해야하는 불편함과 이에 따른 고통 및 부작용이 있는 것에 반해, 본 발명의 세스퀴테르펜 유도체 화합물은 유리체강 내 투여 이외의 다른 투여경로(경구투여, 복강주사 등)를 통해서도 타겟 조직(눈)에 분포하여, 투여경로에 구애받지 않고 치료효능을 가지므로 효과가 탁월하다.

Description

세스퀴테르펜 유도체의 신규한 용도

본 발명은 세스퀴테르펜 유도체의 신규한 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 화학식 1로 표시되는 세스퀴테르펜 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 안구 내 혈관 누수에 의한 황반변성 또는 황반부종의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

황반부종(macular edema)은 망막 황반의 부기를 말하며, 부종은 망막 혈관으로부터의 액체 누출로 인하여 발생한다. 혈액은 약한 혈관벽에서 누출되어, 색상을 감지하는 신경 말단이며 낮 동안의 시력이 의존하는 망막 원추체가 풍부한 망막 황반의 극소 영역으로 유입된다. 이어서, 이미지가 중심영역의 중앙 또는 중앙 옆 오른쪽에서 희미하게 된다. 시력은 수개월 동안 점진적으로 감소한다. 연령관련 황반변성(Age-related macular degeneration, AMD)은 모두 황반부종과 연관되어 있다. 안구 내에서 혈관누수는 다양한 원인에 의하여 일어난다. 일례로 고혈압 환자에서 지속적인 혈압의 상승은 혈액-망막장벽의 파괴를 유발하며, 혈액-망막장벽의 손상으로 혈관 누출에 의해 망막부종이 발생하게 된다. 망막 황반은 때때로 백내장 치료를 위한 수정체 제거 후의 황반부기(macula tumentia)에 의해 손상된다.

종래 황반부종의 치료로는 레이저 조사에 의한 광응고술, 유리체 수술, 전신 투여, 스테로이드의 유리체강 내 투여 및 서브테논(sub-Tenon) 투여 등을 수행하였다. 레이저 조사에 의한 광응고술은 액체 누출이 일어나는 혈관을 막아서 황반의 부기를 감소시킨다. 그러나, 레이저 조사 시에 극도로 취약한 중심와(fovea)를 피하도록 주의하여야 한다. 중심와가 이 시술에 의해 상처를 받으면 중심시야가 손상될 수 있다. 또한 복수의 레이저 시술이 부기를 제거하기 위해 종종 필요하다. 유리체 수술은 레이저 시술이 비효과적인 경우에 적용하지만, 이 방법은 가끔 수술 후 합병증 문제를 야기하는 높은 조직 침습 가능성과 연관되어 있다. 현재 사용되는 안과 조성물의 유리체강 내 투여는, 스테로이드를 투여했을 때 고안압증, 스테로이드성 녹내장 및 후부 수정체피막하 백내장을 일으킬 수 있다. 또한 스테로이드의 유리체강내 투여는 때때로 수술 후 합병증을 유발한다.

상기 스테로이드뿐만 아니라, 국소적으로 유리체강 내에 직접 투여하는 시판 약물들은 통상 4-6주 마다 반복적인 투여가 필요한 것으로 알려져 있으며, 유리체강 내 직접 투여로 인해 투약의 불편함과 고통 및 부작용을 수반하는 문제점이 있었다.

이에 본 발명자들은 투약의 불편함은 감소시키고 장기투여 가능하며 황반부종 또는 이와 관련된 황반변성에 탁월한 치료효능을 나타내는 약제를 개발하고자 연구하던 중, 화학식 1로 표시되는 화합물이 안구 내 혈관누수(vascular leakage)를 효과적으로 억제하여 황반부종 또는 황반변성 동물모델에서 치료효과를 보임을 확인하였으며, 해당 화합물이 경구투여를 통해서도 안구까지 타겟팅(targeting)됨을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

[선행기술문헌]

(비특허문헌 1) Joo-Hyun Kim et al., "Wnt5a attenuates the pathogenic effects of the Wnt/β-catenin pathway in human retinal pigment epithelial cells via down-regulating β-catenin and Snail", BMB Rep. 2015; 48(9): 525-530

(비특허문헌 2) Bokjumn Ji et al., "Increased Levels of Dickkopf 3 in the Aqueous Humor of Patients With Diabetic Macular Edema", Invest Ophthalmol Vis Sci. April 2016;57;2296-2304

발명의 요약

본 발명의 목적은 안구 내 혈관 누수에 의한 황반변성 또는 황반부종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 안구 내 혈관 누수에 의한 황반변성 또는 황반부종의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 상기 목적들은 하기 설명되는 본 발명에 의하여 모두 달성될 수 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 황반변성 또는 황반부종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다:

화학식 1

화학식 1에서,

점선은 단일결합 또는 이중결합을 나타내며

i) 3번 탄소와 4번 탄소의 결합 및 5번 탄소와 6번 탄소의 결합이 단일결합일 때, R2b는 존재하지 않고 R2a는 CH₂인 구조;

ii) 3번 탄소와 4번 탄소의 결합이 이중결합일 때, 5번 탄소와 6번 탄소의 결합은 단일결합이고, R2b는 존재하지 않고 R2a는 CH₃인 구조; 및

iii) 5번 탄소와 6번 탄소의 결합이 이중결합일 때, 3번 탄소와 4번 탄소의 결합은 단일결합일 때, R2a 및 R2b는 CH₃인 구조로 구성된 군에서 선택되는 하나의 구조이고,

R1은 H 또는 CH₃이며,

R3은 하기 R3a 내지 R3d로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 작용기이고,

상기 R3a는

i) R4 및 R7이 각각 OH 또는 OCH₃이고, R5, R6 및 R8은 H인 구조; 또는

ii) R5가 COOCH₃이고, R7은 H 또는 OH이며, R8은 OH이고, R4 및 R6은 H인 구조이며,

상기 R3b는

R9가 H, NH₂, C1~C8 알콕시기 및 하기 R9a 내지 R9j로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 작용기이고, R10은 H 또는 OH이고,

상기 R3c는

R11 및 R12는 각각 OH 또는 OAc이고, R13은 H인 구조; 또는

R11 및 R12는 각각 OH 또는 OCH₃이며 R13은 CH₃인 구조이며

상기 R3d는 R14가 OCH₃이고, R15 및 R16은 CH₃인 구조.

본 발명은 또한 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 안구 내 혈관 누수 억제용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 황반변성 또는 황반부종의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

도 1은 Wnt-3a CM 처리에 의해 Wnt/β-catenin 경로가 활성화된 HEK293 세포에서, 본 발명의 화합물(제조예 30 화합물 또는 제조예 31 화합물)처리에 따른 β-catenin 발현 억제효과를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.

도 2는 Wnt-3a CM 처리에 의해 Wnt/β-catenin 경로가 활성화된 HEK293 세포에서, 본 발명의 화합물(제조예 32 화합물)처리에 따른 β-catenin 발현 억제효과를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.

도 3은 Wnt-3a CM 처리에 의해 Wnt/β-catenin 경로가 활성화된 인간 망막상피세포에서, 본 발명의 화합물(제조예 33 또는 제조예 34)처리에 따른 β-catenin 발현 억제효과를 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.

도 4는 황반부종 마우스 모델에서, 본 발명의 화합물(제조예 33)의 유리체강내 투여에 따른 혈액누수 억제 효과를 형광안저혈관촬영 및 빛간섭단층촬영 검사로 확인한 결과를 나타낸다(A 및 B는 DMSO를 주사 후에 촬영한 대조군(화합물 무처리군) 사진이고, C 및 D는 실험군(제조예 33)의 주사 후에 촬영한 사진이며, 화살표는 혈관 부위를 표시한 것임).

도 5는 황반부종 마우스 모델에서, 본 발명의 화합물(제조예 33)의 복강주사에 따른 혈액누수 억제 효과를 빛간섭단층촬영 검사로 확인한 결과를 나타낸다(A는 vehicle 투여군, B는 제조예 33 화합물 1mg/kg 투여군)

도 6은 본 발명의 화합물(제조예 33)을 ICR 마우스에 경구투여한 후, 타겟 조직(특히, 눈)에 대한 화합물 분포를 측정한 결과를 나타낸다.

발명의 상세한 설명 및 구체적인 구현예

본 발명에서는 투약의 불편함은 감소시키고 장기투여 가능하며 황반부종 또는 이와 관련된 황반변성에 탁월한 치료효능을 나타내는 약제를 개발하고자 연구하던 중, 화학식 1로 표시되는 화합물이 안구 내, 특히 망막 내의 혈관누수(vascular leakage)를 효과적으로 억제하여 황반부종 또는 황반변성 질환에 치료효과를 보임을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 황반변성 또는 황반부종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

화학식 1

본 발명의 세스퀴테르펜 유도체 화합물은 상기 화학식 1로 표시되며, 상기 화학식 1에서 점선은 단일결합 또는 이중 결합을 나타내며

i) 3번 탄소와 4번 탄소의 결합 및 5번 탄소와 6번 탄소의 결합이 단일결합으로 이루어질 때, R2b는 존재하지 않고 R2a는 CH₂인 구조;

ii) 3번 탄소와 4번 탄소의 결합이 이중결합으로 이루어질 때, 5번 탄소와 6번 탄소의 결합은 단일 결합으로 이루어지며, R2b는 존재하지 않고 R2a는 CH₃ 인 구조; 및

iii) 5번 탄소와 6번 탄소의 결합이 이중결합으로 이루어질 때, 3번 탄소와 4번 탄소의 결합은 단일 결합으로 이루어지며, R2a 및 R2b는 CH₃ 인 구조로 구성된 군에서 선택되는 하나의 구조이고,

R1은 H 또는 CH₃이며,

R3은 하기 R3a 내지 R3d로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 작용기이며,

상기 R3a는

ii) R5가 COOCH₃이고, R7은 H 또는 OH이며, R8은 OH이고, R4 및 R6은 H인 구조이고,

상기 R3b는 R9가 H, NH₂, C1~C8 알콕시기 및 하기 R9a 내지 R9j 로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 작용기이고, R10은 H 또는 OH이며,

상기 R3c는

R11 및 R12는 각각 OH 또는 OAc(아세톡시기, Acetoxy group)이고, R13은 H인 구조; 또는

R11 및 R12는 각각 OH 또는 OCH₃이며 R13은 CH₃인 구조이고

상기 R3d는 R14가 OCH₃이고, R15 및 R16은 CH₃인 구조인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 용어 알콕시기(alkoxy group)는 산소와 결합된 알킬기(O-alkyl group)를 의미하는 것으로, 본 발명에서 메톡시기(C1), 에톡시기(C2), 프로폭시기(C3), 부톡시기(C4), 펜틸옥시기(C5), 헥실옥시기(C6), 헵틸옥시기(C7) 및 옥틸옥시(C8)를 포함하는 C1~C8 알콕시기로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게 본 발명의 상기 알콕시기는 메톡시기 또는 에톡시기일 수 있다.

상기 화학식 1에서

i) 3번 탄소와 4번 탄소의 결합 및 5번 탄소와 6번 탄소의 결합이 단일결합으로 이루어질 때, R2b는 존재하지 않고 R2a는 CH₂인 구조는 하기 <화학식 1-1>로 표시되는 것일 수 있으며;

ii) 3번 탄소와 4번 탄소의 결합이 이중결합으로 이루어질 때, 5번 탄소와 6번 탄소의 결합은 단일 결합으로 이루어지며, R2b는 존재하지 않고 R2a는 CH₃인 구조는 하기 <화학식 1-2>로 표시되는 것일 수 있고;

iii) 5번 탄소와 6번 탄소의 결합이 이중결합으로 이루어질 때, 3번 탄소와 4번 탄소의 결합은 단일 결합으로 이루어지며, R2a 및 R2b는 CH₃인 구조는 하기 <화학식 1-3>으로 표시되는 것 일 수 있다.

화학식 1-1

화학식 1-2

화학식 1-3

본 발명의 화학식 1의 화합물은, 구체적으로 하기 [표 1]에 기재된 구조의 화합물을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

제조예	구조	제조예	구조
1		2
3		4
5		6
7		8
9		10
11		12
13		14
15		16
17		18
19		20
21		22
23		24
25		26
27		28
29		30
31		32
33		34

바람직하게, 본 발명의 상기 세스퀴테르펜 유도체 화합물은 상기 화학식 1에서, 3번 탄소와 4번 탄소의 결합 및 5번 탄소와 6번 탄소의 결합이 단일결합으로 이루어질 때 R2b는 존재하지 않고 R2a는 CH₂인 화학식 1-1의 구조이고, R3은 상기 R3b 내지 R3d로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 작용기인 것일 수 있다.

상기 R3b는, 바람직하게 R9가 에톡시기, 메톡시기 및 상기 R9a로 구성된 군에서 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.

상기 R3c는, 바람직하게 R11은 OH이고 R12는 OCH₃이며 R13은 CH₃인 것일 수 있다.

상기 R3d는, 바람직하게 R14가 OCH₃이고, R15 및 R16은 CH₃인 것일 수 있다.

가장 바람직하게, 본 발명의 상기 화학식 1의 화합물은,

3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-4-히드록시-5-(2-페닐에틸아미노)시클로헥사-3,5-디엔-1,2-디온;

3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-2-히드록시-5-메톡시시클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온;

3-[[(1S,2R,4aR,8aR)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-5-에톡시-2-히드록시시클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온;

18-메톡시-22-메틸-16-[{(5S,8S,9R,10S)-5,8,9-트리메틸-4-메틸렌데카히드로나프탈렌-9-일}메틸]벤조[d]-옥사졸-17-올; 및

18-메톡시-22,22-디메틸-16-[{(5R,8S,9R,10S)-5,8,9-트리메틸-4-메틸렌데카히드로나프탈렌-9-일}메틸]벤조[d]-옥사졸-17(2H)-온;

로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 화합물일 수 있다.

본 발명의 상기 화학식 1의 화합물은 해면(sponge)으로부터 추출될 수 있다. 구체적으로, 로팔로에이데스 속(Rhopaloeides sp.), 스폰지아 속(Spongia sp.), 스메노스폰지아 속(Smenospongia sp.), 히포스폰지아 속(Hippospongia sp.), 닥틸로스폰지아 속(Dactylospongia sp.), 베롱귤라 속(Verongula sp.), 디사이데아 속(Dysidea sp.), Sponge SS-1047, Sponge SS-265 및 Sponge SS-1208로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 해면(Sponge)에 C1-C6의 유기용매를 가하여 추출하는 단계를 포함하는, 안구 내 혈관 누수에 의한 황반 변성 또는 황반 부종의 예방 또는 치료용 화학식 1의 화합물의 수득 방법에 의한 것일 수 있다.

상기 C1-C6의 유기용매는 C1-C6의 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 펜탄올, 헥산올), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 아세토니트릴(acetonitrile), 디클로로메탄(dichloromethane) 및 석유에테르(petroleum ether)로 구성된 군에서 선택된 것일 수 있다.

바람직하게, 본 발명의 화학식 1의 화합물은 상기 해면동물에 물, C1-C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로서 가하고 추출하여 해면동물 추출물을 제조하는 단계; 및 상기 추출물에 2차 용매를 가하여 분획하고 크로마토그래피를 통해 분리하는 단계를 포함하는 방법에 의하여 수득될 수 있다.

상기 크로마토그래피는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), LH-20 칼럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 이온교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 중압 액체 크로마토그래피 (medium pressure liquid chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography), 실리카겔 진공 액체 크로마토그래피(silica gel vacuum liquid chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등을 포함하여, 당업자에게 공지된 크로마토그래피라면 그 종류가 제한되지 않는다.

해면동물 추출물의 제조에 이용되는 상기 C1-C4 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 해면동물의 추출물을 분획하는 2차 용매로는 C1-C4 알코올, n-헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 클로로포름, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 아세토니트릴 및 이들의 혼합물 등의 용매를 사용할 수 있다.

본 발명의 화학식 1의 화합물은 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 본 발명에서 용어 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 것을 의미한다.

상기 약제학적으로 허용되는 염은 무기산 또는 유기산과의 산부가염이 포함된다. 산부가염으로는 약제학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 푸마산, 포름산, 피로피온산, 옥살산, 트리플루오로아세트산, 메탄술폰산, 벤젠설폰산, 말레인산, 벤조산, 글루콘산, 글리콜산, 숙신산, 4-모폴린에탄술폰산, 캠포술폰산, 4-니트로벤젠술폰산, 히드록시-O-술폰산, 4-톨루엔술폰산, 칼룩투론산, 엠보산, 글루탐산, 아스파트산 등을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, in vitro상에서 본 발명의 화학식 1의 화합물이 β-catenin 발현을 억제하는 것을 확인하여 Wnt/β-catenin 매커니즘의 저해를 통해 혈액 누수(vascular leakage)를 억제함을 밝혔다. 본 발명의 또 다른 실시예에서는, 실제로 in vivo 황반부종 동물모델에 본 발명 화합물의 처리를 통해 혈관 누수를 억제하여 치료효능을 나타냄을 확인하였다. 또한 유리체강 내로 직접 약물을 투여하는 것 이외에도 다른 투여경로(경구투여, 복강주사 등)를 통해서도 타겟 조직(눈)에 분포하여, 투여경로에 구애받지 않고 치료효능을 보임을 확인하였다.

따라서 본 발명의 다른 관점은, 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 안구 내 혈관 누수 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어‘혈관누수(vascular leakage)’란 혈관의 완전성(integrity) 손상에 의한 체액 또는 혈장성분의 누출을 의미하는 것으로, 안구(eye ball)에서의 혈관누수는 다양한 안질환의 주요병태를 구성한다. 본 발명에서 용어 ‘안구 내 혈관누수’는 안구를 구성하는 다양한 조직(맥락막, 망막 등)에서의 혈관누수를 의미하는 것으로, 이에 제한되지 않으나 바람직하게 망막 내 혈관 누수일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 안구 내 혈관누수 질환에 대하여 예방 또는 치료효과가 있으며, 당업계에 안구 내 혈관누수 질환으로서 공지된 것이라면 질환의 종류가 특별히 제한되지 않으나, 예를 들어 망막변성(retianl degeneration), 황반변성(macular degeneration), 망막부종(retinal edema), 황반부종(macular edema)을포함한다. 바람직하게 본 발명의 안구 내 혈관누수 질환은 황반변성 또는 황반부종 일 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기 화학식 1의 세스퀴테르펜 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 단독으로 함유하거나, 또는 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 함유할 수 있다.

약학적으로 허용되는 담체로는 예컨대, 경구 투여용 담체 또는 비경구 투여용 담체를 추가로 포함할 수 있다. 경구 투여용 담체는 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등을 포함할 수 있다. 또한, 비경구 투여용 담체는 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코오스 및 글리콜 등을 포함할 수 있으며, 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현택제 등을 추가로 포함할 수 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

본 발명의 조성물은 인간을 비롯한 포유동물에 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들면, 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 비경구적인 투여방법으로는 이에 한정되지는 않으나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수 내, 경막내, 심장내, 안구 내, 유리체강 내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장내 투여일 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 투여 경로에 따라 경구 투여용 또는 비경구 투여용 제제로 제형화 할 수 있다.

경구 투여용 제제의 경우에 본 발명의 조성물은 분말, 과립, 정제, 환제, 당의정제, 캡슐제, 액제, 겔제, 시럽제, 슬러리제, 현탁액 등으로 당업계에 공지된 방법을 이용하여 제형화될 수 있다. 예를 들어, 경구용 제제는 활성성분을 고체 부형제와 배합한 다음 이를 분쇄하고 적합한 보조제를 첨가한 후 과립 혼합물로 가공함으로써 정제 또는 당의정제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제의 예로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨 및 말티톨 등을 포함하는 당류와 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분 및 감자 전분 등을 포함하는 전분류, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오즈 및 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈 등을 포함하는 셀룰로즈류, 젤라틴, 폴리비닐피롤리돈 등과 같은 충전제가 포함될 수 있다. 또한, 경우에 따라 가교결합 폴리비닐피롤리돈, 한천, 알긴산 또는 나트륨 알기네이트 등을 붕해제로 첨가할 수 있다. 나아가, 본 발명의 약학적 조성물은 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

비경구 투여용 제제의 경우에는 주사제, 점안제, 연고제 크림제, 로션제, 오일제, 겔제, 에어로졸 및 비강 흡입제의 형태로 당업계에 공지된 방법으로 제형화할 수 있다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 15th Edition, 1975. Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042, Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기재되어 있다.

바람직하게 본 발명의 상기 약학적 조성물은 경구제, 주사제, 점안제 및 연고제로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 형태로 제조되는 것일 수 있다.

본 발명의 상기 세스퀴테르펜 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 용량은 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 환자에 대한 유효 투여량이 결정되는 것이므로, 이러한 점을 고려할 때 당 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 상기 세스퀴테르펜 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 안구 내 혈액 누수 질환의 예방 또는 치료제로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

또한 본 발명의 또 다른 관점은, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 황반변성 또는 황반부종의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

상기 본 발명의 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food), 식품 첨가제(food additives) 및 사료 등의 모든 형태를 포함하며, 인간 또는 가축을 비롯한 동물을 취식대상으로 한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당 업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.

예를 들면, 건강식품으로는 본 발명의 상기 세스퀴테르페논 유도체 또는 상기 세스퀴테르페논을 함유하는 해면(sponge) 추출물 자체를 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한 본 발명의 상기 세스퀴테르페논 유도체 또는 상기 세스퀴테르페논을 함유하는 해면(sponge) 추출물을, 황반부종 또는 황반변성의 개선 및 예방효과가 있다고 알려진 공지의 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다.

또한, 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마아말레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 상기 세스퀴테르페논 유도체 또는 상기 세스퀴테르페논을 함유하는 해면(sponge) 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 세스퀴테르페논 유도체 또는 상기 세스퀴테르페논을 함유하는 해면(sponge) 추출물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

<제조예 1> 메틸 3-[[(1R,2S,4aR,8aS)-1,2,4a,5-테트라메틸-2,3,4,7,8,8a-헥사히드로나프탈렌-1-일]메틸]-4,5-디히드록시벤조에이트의 수득

EtOH에서 보존된 Hyrtios sp.(38 g dry weight) 샘플을, MeOH를 이용하여 남김없이 추출하였다. 상기 MeOH 추출물을 in vacuo 상태에서 증발시킨 후, 남은 잔여물(15.6 g)을 물과 CH₂Cl₂ 용매를 이용하여 분획하였다. 유기상(organic phase)은 in vacuo 상태에서 증발되었으며, gum(5.32 g)을 수득하였다. 상기 gum 2.37 g은, 용리제로서 hexane 및 증가하는 농도의 EtOAc 용액을 이용하여 Si gel column으로 flash chromatography를 수행하였다. 이렇게 생성된 분획 중 일부를 hexane/EtOAc (100:0 to 50:50)를 이용하여 Si gel column으로 flash chromatography를 수행하였다. 2개의 UV positive-분획이 생성되었으며, HPLC (UV detection at 210 nm, eluent 90:10 MeOH/H₂O)를 수행하여 추가 정제를 실시하여, 제조예 1의 화합물(3 mg)을 수득하였다.

수득된 제조예 1의 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘methyl 3-[[(1R,2S,4aR,8aS)-1,2,4a,5-tetramethyl-2,3,4,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl]methyl]-4,5-dihydroxybenzoate’ 화합물로 판명되었다.

amorphous solid;

IR(film) 3339, 1680, 1303 cm^-1;

UV (CH₃OH) λmax 221 (17440), 269 (7460), 305 nm (3341, sh);

UV (CH₃OH/NaOH) λmax 210 (18520), 241 (13176), 284 (4310), 322 nm (6950);

¹H NMR (600 MHz) δ 7.49 (1H, d, 1.5), 7.45 (1H, d, 1.5), 5.32 (1H, bs), 3.87 (3H, s), 2.84 (1H, d, 14) and 2.60 (1H, d, 14) AB system, 1.64 (3H, bs), 0.98 (3H, d, 6), 0.95 (3H, s), 0.90 (3H, s);

¹³C-NMR (CDCl₃, 150.87 MHz)데이터는 하기 [표 2] 참조

Carbon	제조예 1 화합물(δ ppm)
C-1	19.7
C-2	25
C-3	124.3
C-4	140
C-5	37.7
C-6	37.8
C-7	29.5
C-8	37.6
C-9	43.9
C-10	44.9
C-11	38.1
C-12	17.3
C-13	18.4
C-14	33
C-15	20.5
C-16	126.2
C-17	149.2
C-18	143.1
C-19	114.6
C-20	121.3
C-21	128.1
C-22	168.2
C-23	52.8

<제조예 2> 3-[[(1S,2R,4aR,8aR)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-2,5-디히드록시시클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온의 수득

sponge Smenospongia sp. 샘플(2 kg)을 MeOH에 침지시키고,CHCl₃/Me0H(l/l mixture)로 추가 추출하였다. 상기 추출물을 감압조건하에서 증발시키고, 이의 수용성 현탁액을 CH₂Cl₂로 추출(extract A)하였다. 상기 extract A(8 g)에 대하여 silica gel (CHCl₃/증가하는 농도의 MeOH)을 이용해 chromatogmphy하였다. 이로부터, 2%- MeOH(in CHCl₃)에서 용출된 fraction 1 및 5%- MeOH(in CHCl₃)에서 용출된 fraction 2가 제조되었다. 상기 fraction 1을 30% AcOEt(in hexane)로 용출시켜, 제조예 2의 화합물(20 mg)을 수득하였다.

수득된 제조예 2의 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘3-[[(1S,2R,4aR,8aR)-1,2,4a-trimethyl-5-methylidene-3,4,6,7,8,8a-hexahydro-2H-naphthalen-1-yl]methyl]-2,5-dihydroxycyclohexa-2,5-diene-1,4-dione’화합물로 판명되었다:

C₂₁H₂₈0₄;

m.p. > 350

SM m/e (%): 191 (40), 154 (12). 135 (44). 121 (65). 109 (56). 107 (87). 95 (100).

UV (EtOH)λmax nm(ε): 214,286.

IR (KBr) υ cm^-l: 3324,2940,1645,1535.

¹H NMR (MeOD, 80 MHz) δ ppm: 5.71(1H, s), 4.76 (2H, br s), 2.40 (2H, br s), 1.01 (3H, s), 0.92 (3H, d, J=7 HZ), 0.78 (3H,s).

¹³C NMR (δ ppm, CD₃OD, 20.115 MHz) 데이터는 하기 [표 3] 참조

<제조예 3> 3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-4-히드록시-5-(3-메틸부틸아미노)시클로헥사-3,5-디엔-1,2-디온의 수득

sponge Smenospongia sp. 의 건조물 44 g을 CH₂Cl₂로 추출한 뒤, MeOH로 추출(Extract B)하였다. 상기 Extract B(4g)을 silica gel column (CHCl₃/ increasing amounts MeOH)으로 chromatography 수행하여, 2%- MeOH(in CHCl₃)에서 용출된 fraction A 및 5%- MeOH(in CHC1₃)에서 용출된 fraction B가 제조되었다. 상기 faction A를 Sephadex LH 20 (MeOH/CHCl₃: 60/40) column으로 정제하는 과정을 거쳐, 제조예 3의 화합물(20 mg) 및 하기 제조예 4의 화합물(5 mg)을 수득하였다.

상기 수득된 제조예 3 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같으며,‘3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-trimethyl-5-methylidene-3,4,6,7,8,8a- hexahydro-2H-naphthalen-1-yl]methyl]-4-hydroxy-5-(3-methylbutylamino)cyclohexa-3,5-diene-1,2-dione’화합물로 판명되었다:

C₂₆H₃₉N0₃;

m.p.: 170-172

SM m/e (%): 413 (4), 3ll (8), 283 (12), 223 (100), 191 (11), 167 (22), 153 (27), 149 (15), 135 (14), 121 (16), 109 (18), 107 (12), 95 (79).

m/e 191.179, calc.191.179 for C_l4 H₂₃; m/e 223.119, calc. 223.120 for C₁₂H₁₇NO₃.

UV(EtOH) λmax nm(ε): 204 (27230). 324 (14070).

IR (KBr) υ cm^-l: 3417,3275,1640,1592.

¹H NMR (CDC1₃ .200 MHz) δ ppm: 8.41 (1H exch., s), 6.41 (1H exch., t). 5.36 (lH, s), 4.43 (br s), 3.20 (2H. dt), 2.48 (d)-2.37 (d) (AB syst.). 2.31 (dt), 2.07 (2 H, m), 1.85 (lH, m), 1.80-1.05 (llH, m). 1.04 (3H. s). 0.95 (9H, 3d overlaped), 0.83 (3H, s), 0.78 (lH, dd).

¹³C NMR (δ ppm, CDCl₃, 20.115 MHz) 데이터는 하기 [표 3] 참조

Carbon	제조예 2 화합물(δ ppm)	제조예 3 화합물(δ ppm)
1	24.49 t	23.20 t
2	29.48 t	27.98 t
3	38.30 t	36.85 t
4	162.35 s	160.33 s
5	41.61 s	40.41 s
6	33.70 t	32.97 t
7	30.05 t	28.63 t
8	39.20 d	37.% d
9	43.65 s	42.89 s
10	51.46 d	50.01 d
11	102.58 t	102.39 t
12	21.06 q	20.48 q
13	18.88 q	17.80 q
14	17.85 q	17.16 q
15	33.94 t	32.57 t
16	114.45 s	113.53 s
17	188.82 s*	157.06 s
18	179.65 s*	182.77 s
19	101.79 d	91.484 d
20	174.72 s*	150.21 s
21	166.80 s*	177.97 s

* may be reversed

<제조예 4> 3-[[(1S,2R,4aR,8aR)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-4-히드록시-5-(2-메틸프로필아미노)시클로헥사-3,5-디엔-1,2-디온의 수득

상기 제조예 3에서 전술한 바와 동일한 방법으로 제조예 4의 화합물을 수득하였다. 수득된 화합물(제조예 4)의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘3-[[(1S,2R,4aR,8aR)-1,2,4a-trimethyl-5-methylidene-3,4,6,7,8,8a-hexahydro-2H-naphthalen-1-yl]methyl]-4-hydroxy-5-(2-methylpropylamino)cyclohexa-3,5-diene-1,2-dione’화합물로 판명되었다:

C₂₅H₃₇NO₃

SM m/e (%): 399 (5). 209 (100). 191(17), 166 (36). 152 (18), 135 (11). 121(15). 109 (15), 107 (12). 95 (66).

UV (EtOH) λmax nm(ε): 210 (14000). 329 (20150).

IR (KBr) υ cm^-l: 3417,3275, 1640,1592.

¹H NMR (CDC1₃, 200 MHz) δ ppm: 6.53 (1H. s). 5.41 (1H. S), 4.45 (2H br s), 2.95 (2H, dt), 2.48 (lH, d), 2.45 (lH, d, J =13 Hz), 1.O3 (3H, s), 0.97 (9H. 3d overlaped), 0.82 (3H. s). 0.76 (lH, dd).

<제조예 5> 3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-5-아미노-4-히드록시시클로헥사-3,5-디엔-1,2-디온의 제조

Hippospongia sp.의 MeOH 및 DCM 조추출물을 모아서, 각각의 용매로 분획하여 각각 MeOH, DCM, hexane 및 BuOH 분획을 수득하였다. 상기 분획물 중 hexane, DCM 및 MeOH 분획에 대하여 flash column chromatography 및 semi-preparative RP-HPLC를 수행하여, 제조예 5의 화합물을 수득하였다.

수득된 화합물(제조예 5)의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-trimethyl-5-methylidene-3,4,6,7,8,8a-hexahydro-2H-naphthalen-1-yl]methyl]-5-amino-4-hydroxycyclohexa-3,5-diene-1,2-dione’화합물로 판명되었다:

purple solid;

C₂₁H₃₀O₃N ( HRESIMS m/z 344.2295, [M+H]⁺);

UV (MeOH) λmax (log ε) 315 (3.58) nm;

IR (KBr) 3835, 3566, 1624, 1536 cm-1;

¹H-NMR (400 MHz, CD₃OD) δ: 2.17/1.43 (2H, m H-1), 1.39 (2H,m, H-2), 1.50/1.38 (2H, m, H-3), 2.34/2.05 (2H, m, H-6), 1.23/1.82 (2H, m, H-7), 1.23 (1H, m, H-8), 0.82(1H, m, H-10), 4.44 (2H, s, H-11), 1.05 (3H, s, H-12), 0.98 (3H, d, J = 6.4 Hz H-13), 0.84 (3H, s, H-14), 2.47/2.40 (2H, dd, J = 13.7 Hz, H-15), 5.51 (1H, s, H-19).

¹³C-NMR (100 MHz, CD₃OD) δ: 22.8 (t, C-1), 27.5 (t, C-2), 36.4 (t, C-3), 160.1 (s, C-4), 39.9 (s, C-5), 32.5 (t, C-6), 28.3 (t, C-7), 37.6 (d, C-8), 42.1 (s, C-9), 49.7 (d, C-10), 101.1 (t, C-11), 19.4 (q, C-12), 16.9 (q, C-13), 16.2 (q, C-14), 31.6 (t, C-15), 113.7 (s, C-16), 159.4 (s, C-17), 183.2 (s, C-18), 93.6 (d, C-19), 183.2 (s, C-21).

<제조예 6> 2-[[5-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-6-히드록시-3,4-디옥소시클로헥사-1,5-디엔-1-일]아미노]아세틱 에시드의 수득

sponge Dactylospongia elegans를 동결건조하고, 상기 동결건조된 해면(33 g 건조 중량)에 MeOH(3×1 L)를 가하여 추출물을 제조하여, in Vacuo 상태에서 농축하고, reversed-phase C18 vacuum liquid chromatography (0%, 20%, 50%, 70%, 90%, 100% MeOH in H₂O, 및 1:1 CH₂Cl₂/MeOH)를 수행하였다. 각각 20%, 50% 및 70% MeOH 분획을 수득하여, C18 preparative HPLC(4 mL/min, gradient elution from 3:7 H₂O/MeCN/0.1% formic acid to 100% MeCN/0.1% formic acid over 10 min, through a 150 × 10 mm, 5 ㎛ Phenomenex phenyl hexyl column)를 수행하였다. 이로부터 제조예 6 화합물(11.7 mg, 0.035%), 하기 제조예 7 화합물(1.4 mg, 0.004%) 및 제조예 8 화합물(0.8 mg, 0.002%)을 수득하였다.

상기 수득된 제조에 6 화합물은 다음과 같은 물리화학적 성질을 지니며, ‘2-[[5-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-trimethyl-5-methylidene-3,4,6,7,8,8a-hexahydro-2H-naphthalen-1-yl]methyl]-6-hydroxy-3,4-dioxocyclohexa-1,5-dien-1-yl]amino]acetic acid’화합물로 판명되었다:

amorphous, red solid;

[α]_D +94.4 (c 0.018, MeOH);

UV (PDA, CH₃CN/H₂O) λmax 218, 311, 494 nm;

IR (neat) νmax 3598, 2936, 2064, 1657 cm^-1;

¹H (300 MHz) 및 ¹³C (75 MHz) NMR (CD₃OD)데이터는 하기 [표 4] 참조

HRESIMS m/z 424.2104 [M + Na]⁺(calcd for C₂₃H₃₁NO₅Na, 424.2094, Δ 1.0 mmu).

<제조예 7> 3-[[5-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-6-히드록시-3,4-디옥소시클로헥사-1,5-디엔-1-일]아미노]프로파노익 에시드의 수득

상기 제조예 6에서 전술한 바와 동일한 방법으로, 제조예 7의 화합물을 수득하였다. 수득된 화합물(제조예 7)의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘3-[[5-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-trimethyl-5-methylidene-3,4,6,7,8,8a-hexahydro-2H-naphthalen-1-yl]methyl]-6-hydroxy-3,4-dioxocyclohexa-1,5-dien-1-yl]amino]propanoic acid’화합물로 판명되었다:

amorphous, red solid;

[α]_D +13 (c 0.06, MeOH);

UV (PDA, CH₃CN/H₂O) λmax 233, 314, 494 nm;

IR (neat) νmax 3410, 2930, 1686, 1632, 1567 cm^-1;

HRESIMS m/z 438.2264 [M + Na]⁺ (calcd for C₂₄H₃₃NO₅Na, 438.2251, Δ 1.3 mmu):

¹H NMR (CD₃OD, 300 MHz) δ 5.38 (1H, s, H-19), 4.40 (2H, s, H₂-11), 3.45 (2H, t, J = 6.8 Hz, H₂-23), 2.59 (2H, t, J = 6.8 Hz, H₂-24), 2.47 (1H, d, J = 13.6 Hz, H_a-15), 2.38 (1H, d, J = 13.6 Hz, H_b-15), 2.32 (1H, m, H_a-3), 2.16 (1H, m, H_a-1), 2.04 (1H, m, H_b-3), 1.80 (1H, m, H_a-2), 1.48 (1H, m, H_a-6), 1.43 (1H, m, H_b-1), 1.41 (1H, m, H_a-7), 1.36 (1H, m, H_b-6), 1.35 (1H, m, H_b-7), 1.29 (1H, m, H_b-2), 1.21 (1H, m, H-8), 1.04 (3H, s, H₃-12), 0.97 (3H, d, J = 6.4 Hz, H₃-13), 0.83 (3H, s, H₃-14), 0.81 (1H, m, H-10);

¹³C NMR (CD₃OD, 75 MHz) δ 183.4 (C, C-21), 179.6(C, C-18), 176.0 (C, C-25), 162.9 (C, C-4), 161.1 (C, C-17), 152.0 (C, C-20), 115.5 (C, C-16), 103.3 (CH₂, C-11), 92.6 (CH, C-19), 51.1 (CH, C-10), 44.0 (C, C-9), 41.8 (C, C-5), 39.9 (CH₂, C-23), 39.0 (CH, C-8), 38.2 (CH₂, C-6), 34.5 (CH₂, C-24), 34.2 (CH₂, C-3), 33.4 (CH₂, C-15), 30.0 (CH₂, C-2), 29.4 (CH₂, C-7), 24.3 (CH₂, C-1), 21.4 (CH₃, C-12), 18.7 (CH₃, C-13), 18.1 (CH₃, C-14).

<제조예 8> 7-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-1,3-벤조옥사졸-5,6-디올의 수득

상기 제조예 6에서 전술한 바와 동일한 방법으로, 제조예 8의 화합물을 수득하였다. 수득된 화합물(제조예 8)의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘7-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-trimethyl-5-methylidene-3,4,6,7,8,8a-hexahydro-2H-naphthalen-1-yl]methyl]-1,3-benzoxazole-5,6-diol’화합물로 판명되었다:

colorless solid;

[α]_D -6.7 (c 0.075, MeOH);

UV (PDA, CH₃CN/H₂O) λmax 236, 297, 323 (sh) nm;

IR (neat) νmax 3408,2927, 1541 cm^-1;

¹H (300 MHz) 및 13C (75 MHz) NMR (CD₃OD)데이터는 하기 [표 5] 참조

HRESIMS m/z 378.2050 [M + Na]⁺ (calcd for C₂₂H₂₉NO₃Na, 378.2040, Δ 1.0 mmu).

<제조예 9> [7-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-6-아세틸옥시-1,3-벤조옥사졸-5-yl] 아세테이트의 제조

제조예 5에서와 같이 sponge Dactylospongia elegans를 동결건조 하여, 상기 동결건조된 해면(33 g 건조 중량)에 MeOH(3×1 L)를 가하여 추출물을 제조한 후, 그 외에 MeOH에 용해되지 않는 물질(120 mg)을 pyridine(0.5 mL)에 넣은 용액에 (CH₃CO)₂O (0.5 mL)을 처리하고 상온에서 12시간동안 교반(stir)해주었다. 상기 반은 물질들을 in Vacuo 상태에서 농축하고, sequential reversed-phase HPLC 분리(A: H₂O/MeCN + 0.1% formic acid (3:7) to 100% MeCN + 0.1% formic acid over 10 min at 4 mL/min and held for an additional 10 min on a 150 × 10 mm, 5 ㎛ Phenomenex Luna C18 column; B: H₂O/MeOH with 0.1% formic acid (3:7) to 100% MeOH with 0.1% formic acid for 10 min at 4 mL/min and held for an additional 5 min on a 150 × 10 mm, 5㎛ Phenomenex Luna phenyl hexyl column)를 수행하였다. 이와 같은 방법으로 제조예 9의 화합물이 2.3 mg(0.007%) 수득되었으며, 이의 물리화학적 성질은 다음과 같고, ‘[7-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-trimethyl-5-methylidene-3,4,6,7,8,8a-hexahydro-2H-naphthalen-1-yl]methyl]-6-acetyloxy-1,3-benzoxazol-5-yl] acetate’화합물로 판명되었다:

colorless oil;

[α]_D -170 (c 0.003, CHCl₃);

UV (PDA, CH₃CN/H₂O) λmax 233, 278, 284, 300 (sh) nm;

IR (neat) νmax 3488, 2927, 1775, 1630, 1458 cm^-1;

HRESIMS m/z 462.2250 [M + Na]⁺ (calcd for C₂₆H₃₃NO₅Na, 462.2251, Δ 0.1 mmu);

¹H NMR (CDCl₃, 300 MHz) δ 8.07 (1H, s, H-22), 7.54 (1H, s, H-19), 4.42 (1H, d, J = 1.6 Hz, H_a-11), 4.38 (1H, d, J = 1.6 Hz, H_b-11), 2.83 (1H, d, J = 14.2 Hz, H_a-15), 2.76 (1H, d, J = 14.2 Hz, H_b-15), 2.35 (1H, m, H_a-3), 2.34 (s, a-OCOCH₃), 2.30 (s, b-OCOCH₃), 2.08 (1H, m, H_b-3), 1.92 (1H, m, H_a-2), 1.58 (1H, m, H_a-1), 1.49 (1H, m, H_a-6), 1.45 (1H, m, _Hb-1),1.43 (1H, m, H-8), 1.42 (2H, m, H₂-7), 1.28 (1H, m, H_b-6), 1.26 (1H, m, H_b-2), 1.07 (3H, s, H₃-12), 0.97 (3H, d, J = 5.6 Hz, H₃-13), 0.94 (3H, s, H₃-14), 0.92 (1H, m, H-10);

¹³C NMR (CDCl₃, 150 MHz) δ168.1 (C, a-OCOCH₃), 167.9 (C, b-OCOCH₃), 159.1 (C, C-4), 152.7 (CH, C-22), 147.9 (C, C-21), 140.4 (C, C-17), 137.4 (C, C-18), 136.6 (C, C-20), 118.3 (C, C-16), 111.9 (CH, C-19), 102.2 (CH₂, C-11), 50.1 (CH, C-10), 43.0 (C, C-9), 40.3 (C, C-5), 37.6 (CH, C-8), 36.2 (CH₂, C-6), 35.6 (CH₂, C-15), 32.6 (CH₂, C-3), 28.3 (CH₂, C-2), 27.7 (CH₂, C-7), 23.1 (CH₂, C-1), 20.1 (2 × CH₃, -OCOCH₃), 19.9 (CH₃, C-12), 18.1 (CH₃, C-13), 16.8 (CH₃, C-14).

<제조예 10> 3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-테트라메틸-2,3,4,7,8,8a-헥사히드로나프탈렌-1-일]메틸]-2-히드록시-5-메톡시시클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온의 수득

sponge Spongiidae SS-1047(0.30 kg, wet weight)를 'Yohei Takahashi et al., 2010' 문헌에 기재된 바와 같이 수득하고 추출하였다. 간략하게, EtOAc 용해성 물질들(1.2 g)을 silica gel column (n-hexane/EtOAc)으로 분획하여, 극성이 낮은 분획 1 및 분획 2, 분획 3, 극성 분획 4를 제조하였다. 상기 분획 3은 C18 column (MeOH/H₂O) 및 C18 HPLC (Luna 5u Phenyl-Hexyl, 250 × 10 mm; eluent, MeOH/H₂O/CF₃CO₂H, 85:15:0.05; flow rate, 2.5 mL/min; UV detection at 320 nm)으로 분획 및 정제하여, 각각 제조예 10 및 하기 제조예 11에 해당하는 화합물을 수득하였다.

상기 수득된 제조예 10 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-tetramethyl-2,3,4,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl]methyl]-2-hydroxy-5-methoxycyclohexa-2,5-diene-1,4-dione’화합물로 판명되었다:

mp 95-98;

[α]²⁰ ₅₇₉ +64.4° (c0.27 CHCl₃);

IR (film) 3341, 1652, 1645, 1609, 1243 cm^-1;

UV(CH₃OH) λmax 213 (9600), 288 nm (13485);

UV (CH₃OH/NaOH) λmax 210 (12850), 290 (8930), 526 nm (1650);

¹H NMR(600 MHz, CDCl₃, δ, J in Hz) 데이터는 하기 [표 6] 참조

¹³C NMR(150.87 MHz, CDCl₃) 데이터는 하기 [표 6] 참조

HREIMS m/z 358.2151 [M+](12, calcd for C₂₂H₃₀O₄, 358.2144), 191.1803 (15, calcd for C₁₄H₂₃, 191.1800), 168.0423 (41, calcd for C₈H₈O₄, 168.0422), 121.1013 (12, calcd for C₉H₁₃, 121.1017), 107.0859 (30, calcd for C₈H₁₁, 107.0861), 95.0861 (100, calcd for C₇H₁₁, 95.0861).

<제조예 11> 2-히드록시-5-메톡시-3-[[(1R,2S)-1,2,5,5-테트라메틸-2,3,6,7,8,8a-헥사히드로나프탈렌-1-일]메틸]시클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온의 수득

상기 제조예 10에서 전술한 바와 같은 방법으로, 제조예 11의 화합물을 수득하였다. 수득된 화합물(제조예 11)의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘2-hydroxy-5-methoxy-3-[[(1R,2S)-1,2,5,5-tetramethyl-2,3,6,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl]methyl]cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione’화합물로 판명되었다:

pale yellow feathery solid;

m.p. 108.5-109.5;

C₂₂H₃₀0₄ (high resolution FABMS (M+ 358.2146, Δ0.2 mmu, C₂₂H₃₀0₄; MH+ 359.2223, Δ0.1 mmu, C₂₂H₃₁0₄));

^lH NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 0.73 (s, 3H), 0.90 (sh, lH), 0.92 (s, 3H), 0.96 (d, J=7 Hz, 3H), 0.99 (s, 3H), I.12 (ddd, J=13.5,13.5, 4.3 Hz, 1H), 1.33-1.45 (complex mult., 4H), 1.73 (mult, lH), 1.79 (br d, lH), 1.95 (ddd, J=18, 17.5, 4.5 Hz, 1H), 2.08 (br d, J=13 Hz, 1H), 2.45 (d, cJ=13.0 HZ, lH), 2.58 (d, J=13.0 Hz, lH), 3.84 (s, 3H), 5.35 (br s, lH), 5.84 (s, 1H), 7.45 (s, 1H);

¹³C NMR (500 MHz, CDCl3), δ (mult., proton asignments): 16.0 (q, 0.73, C-14), 16.5 (q, 0.92, C-11), 22.7 (t, 1.40, 1.46, C-2), 27.9 (q, 0.96, C-13), 29.7 (q, 0.99, C-12). 30.6 (t, 0.90, 1.79, C-l), 31.5 (t, 1.73, 1.95, C-7), 32.7 (t, 2.45,2.58, C-15), 36.3 (s, C-4), 36.4 (d, 1.36, C-8), 40.9 (s, C-g), 41.2 (t, 1.13, 1.32, C-3), 41.7 (s, 2.08, C-10), 56.8 (q, 3.86, C-22), 102.0 (d, 5.85, C-19),114.8 (d, 5.35, C-6), 118.3 (s, C-16), 146.3 (s, C-5), 152.8 (s, -OH, C-17), 161.5 (s, C-20), 182.0 (s, C-21), 182.4 (s, C-18).

<제조예 12> 3-[[(1R,2S,8aS)-1,2,5,5-테트라메틸-2,3,6,7,8,8a-헥사히드로나프탈렌-1-일]메틸]-4-히드록시-5-(2-페틸에틸아미노)시클로헥사-3,5-디엔-1,2-디온의 수득

상기 제조예 10에서 수득된 분획 1은 C18 column (MeOH/H₂O) 및 C₁₈ HPLC (Wakosil-II 5C18AR, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 250 × 10 mm; eluent, MeCN/H₂O/CF₃CO₂H, 90:10:0.05; flow rate, 2.0 mL/min; UV detection at 300 nm)으로 재분획하여, 각각 제조예 11의 화합물 (2.8 mg, 0.00093% wet weight) 및 하기 제조예 12의 화합물(24.7 mg, 0.0082%)을 수득하였다.

수득된 제조예 12 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘3-[[(1R,2S,8aS)-1,2,5,5-tetramethyl-2,3,6,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl]methyl]-4-hydroxy-5-(2-phenylethylamino)cyclohexa-3,5-diene-1,2-dione’화합물로 판명되었다:

purple-red, amorphous solid;

[α]²³ _D -14 (c 0.2, CHCl₃);

IR (film) νmax 3290, 1730, 1650, 1590, 1510, 1460, 1380, 1360, 1220 cm^-1;

UV (MeOH) λmax 336 (log 4.28), 507 nm (2.84);

¹H NMR (CDCl₃)데이터는 하기 [표 7] 참조;

¹³C NMR (CDCl₃)데이터는 하기 [표 7] 참조;

EIMS m/z (%) 447 (M+, 9), 257 (100), 191 (2), 166 (20), 152 (5), 105 (10), 95 (15); HREIMS m/z 447.2790 [M]+ (calcd for C₂₉H₃₇NO₃, 447.2773).

<제조예 13> 3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-테트라메틸-2,3,4,7,8,8a-헥사히드로나프탈렌-1-일]메틸]-4-히드록시-5-(2-페일에틸아미노)시클로헥사-3,5-디엔-1,2-디온의 수득

상기 제조예 12에서 전술한 바와 같은 방법으로, 제조예 13의 화합물을 수득하였다. 수득된 화합물(제조예 13)의 물리화학적 성질은 다음과 같으며,‘3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-tetramethyl-2,3,4,7,8,8a- hexahydronaphthalen-1-yl]methyl]-4-hydroxy-5-(2-phenylethylamino)cyclohexa-3,5-diene-1,2-dione’화합물로 판명되었다;

purple-red. amorphous solid;

[α]²⁵ _D +180 (c 0.1, CHCl₃);

IR (film) νmax 3270, 1730, 1640, 1590, 1510, 1460, 1380, 1210 cm^-1;

UV (MeOH) λmax 335 (log 4.20), 502 nm (2.74);

¹H NMR (CDCl₃)데이터는 하기 [표 8] 참조;

¹³C NMR (CDCl₃)데이터는 하기 [표 8] 참조;

EIMS m/z (%) 447 (M+, 25), 257 (100), 209 (17), 191 (18), 168 (45), 166 (48), 152 (17), 119 (42), 105 (40);

HREIMS m/z 447.2783 [M]+ (calcd for C₂₉H₃₇NO₃, 447.2773).

<제조예 14> 3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-테트라메틸-2,3,4,7,8,8a-헥사히드로나프탈렌-1-일]메틸]-4-히드록시-5-(2-메틸프로필아미노)시클로헥사-3,5-디엔-1,2-디온의 수득

상기 제조예 10에서 수득된 분획 2로 C18 column (MeOH/H₂O/CF₃CO₂H) 및 C18 HPLC (Luna 5u Phenyl-Hexyl, Phenomenex, 250 × 10 mm; eluent, MeCN/H₂O/CF₃CO₂H, 80:20:0.05; flow rate, 2.0 mL/min; UV detection at 300 nm)를 수행하여, 제조예14의 화합물(0.9 mg, 0.00030%)과 각각 γ분획 및 δ분획을 수득하였다.

상기 수득된 제조예 14의 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-tetramethyl-2,3,4,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl]methyl]-4-hydroxy-5-(2-methylpropylamino)cyclohexa-3,5-diene-1,2-dione’화합물로 판명되었다;

purple-red, amorphous solid;

[α]²³ _D +160 (c 0.1, CHCl₃);

IR (film) νmax 3270, 1730, 1640, 1590, 1510, 1380, 1210 cm^-1;

UV (MeOH) λmax 334 (log 4.29), 509 nm (2.86);

¹H NMR (CDCl₃)데이터는 하기 [표 9] 참조;

¹³C NMR (CDCl₃)데이터는 하기 [표 9] 참조;

EIMS m/z (%) 399 (M+, 8), 209 (100), 191 (3), 166 (11), 152 (9), 107 (9), 95 (22);

HREIMS m/z 399.2790 [M]+ (calcd for C₂₅H₃₇NO₃, 399.2773).

<제조예 15> 3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-테트라메틸-2,3,4,7,8,8a-헥사히드로나프탈렌-1-일]메틸]-4-히드록시-5-[[(2S)-2-메틸부틸]아미노]시클로헥사-3,5-디엔-1,2-디온의 수득

상기 제조예 14에서 수득된 γ분획을 다시 C18 HPLC (Luna 5u C18(2), Phenomenex, 250 × 10 mm; MeOH/H₂O/Et₂NH, 70:30:0.1; flow rate, 2.0 mL/min; UV detection at 300 nm)으로 정제하여, 제조예 15의 화합물(1.4 mg, 0.00047%) 및 제조예 16의 화합물(4.0 mg, 0.0013%)을 수득하였다.

상기 제조예15의 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같았으며, 이에 따라 ‘3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-tetramethyl-2,3,4,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl]methyl]-4-hydroxy-5-[[(2S)-2-methylbutyl]amino]cyclohexa-3,5-diene-1,2-dione’화합물로 판명되었다:

purple-red, amorphous solid;

[α]²¹ _D +136 (c 0.25, CHCl₃);

IR (film) νmax 3270, 1680, 1650, 1590, 1510, 1450, 1380, 1210 cm^-1;

UV (MeOH) λmax 336 (log 4.09), 505 nm (2.67);

¹H NMR (CDCl₃)데이터는 하기 [표 10] 참조;

¹³C NMR (CDCl₃)데이터는 하기 [표 10] 참조;

HREIMS m/z 413.2940 [M]+ (calcd for C₂₆H₃₉NO₃, 413.2930).

<제조예 16> 3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-테트라메틸-2,3,4,7,8,8a-헥사히드로나프탈렌-1-일]메틸]-4-히드록시-5-(3-메틸부틸아미노)시클로헥사-3,5-디엔-1,2-디온의 수득

상기 제조예 15에서 전술한 바와 같이 제조예 16의 화합물을 수득하였으며, 이의 물리화학적 성질은 다음과 같았으며, ‘3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-tetramethyl-2,3,4,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl]methyl]-4-hydroxy-5-(3-methylbutylamino)cyclohexa-3,5-diene-1,2-dione’화합물로 판명되었다:

purple-red, amorphous solid;

[α]²¹ _D +124 (c 0.25, CHCl₃);

IR (film) νmax 3270, 1680, 1640, 1590, 1510, 1380, 1210 cm^-1;

UV (MeOH) λmax 336 (log 4.17), 515 nm (2.55);

¹H NMR (CDCl₃)데이터는 하기 [표 11] 참조;

¹³C NMR (CDCl₃)데이터는 하기 [표 11] 참조;

EIMS m/z (%) 413 (M+, 7), 223 (100), 191 (3), 166 (8), 152 (9), 107 (8), 95 (18);

HREIMS m/z 413.2947 [M]+ (calcd for C₂₆H₃₉NO₃, 413.2930).

<제조예 17> 3-[[(1R,2S,8aS)-1,2,5,5-테트라메틸-2,3,6,7,8,8a-헥사히드로나프탈렌-1-일]메틸]-4-히드록시-5-[[(2S)-2-메틸부틸]아미노]시클로헥사-3,5-디엔-1,2-디온의 수득

상기 제조예 14에서 수득된 δ분획은 C18 HPLC (Luna 5u Phenyl-Hexyl, 250 × 10 mm; MeOH/H₂O/Et₂NH, 65:35:0.1; flow rate, 2.0 mL/min; UV detection at 300 nm)으로 재분획하여, 각각 제조예 17의 화합물(0.7 mg, 0.00023%) 및 하기 제조예18의 화합물(1.6 mg, 0.00053%)을 수득하였다.

상기 수득된 제조예 17 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같으며,‘3-[[(1R,2S,8aS)-1,2,5,5-tetramethyl-2,3,6,7,8,8a-hexahydronaphthalen -1-yl]methyl]-4-hydroxy-5-[[(2S)-2-methylbutyl]amino]cyclohexa-3,5-diene-1,2-dione’화합물로 판명되었다:

purple-red, amorphous solid;

[α]²³ _D -42 (c 0.25, CHCl₃);

IR (film) νmax 3290, 1680, 1650, 1590, 1520, 1460, 1390, 1200 cm^-1;

UV (MeOH) λmax 338 (log 4.06), 511 nm (2.63);

¹H NMR (CDCl₃)데이터는 하기 [표 12] 참조;

¹³C NMR (CDCl₃)데이터는 하기 [표 12] 참조;

EIMS m/z (%) 413 (M+, 15), 223 (100), 191 (10), 168 (15), 166 (14), 152 (16), 119 (18);

HREIMS m/z 413.2916 [M]+ (calcd for C₂₆H₃₉NO₃, 413.2930).

<제조예 18> 3-[[(1R,2S,8aS)-1,2,5,5-테트라메틸-2,3,6,7,8,8a-헥사히드로나프탈렌-1-일]메틸]-4-히드록시-5-(3-메틸부틸아미노)시클로헥사-3,5-디엔-1,2-디온의 수득

상기 제조예 17에서 전술한 바와 같이 제조예 18의 화합물을 수득하였으며, 이의 물리화학적 성질은 다음과 같았으며,‘3-[[(1R,2S,8aS)-1,2,5,5-tetramethyl-2,3,6,7,8,8a-hexahydronaphthalen -1-yl]methyl]-4-hydroxy-5-(3-methylbutylamino)cyclohexa-3,5-diene-1,2-dione’화합물로 판명되었다:

purple-red, amorphous solid;

[α]²¹ _D -38 (c 0.2, CHCl₃);

IR (film) νmax 3270, 1680, 1650, 1590, 1510, 1460, 1380, 1200 cm^-1 ;

UV (MeOH) λmax 338 (log 4.21), 515 nm (2.63);

¹H NMR (CDCl₃)데이터는 하기 [표 13] 참조;

¹³C NMR (CDCl₃)데이터는 하기 [표 13] 참조;

EIMS m/z (%) 413 (M+, 24), 223 (100), 191 (13), 166 (20), 152 (17), 119 (20);

HREIMS m/z 413.2947 [M]+ (calcd for C₂₉H₃₇NO₃, 413.2930).

<제조예 19> 3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-4-히드록시-5-[[(2S)-2-메틸부틸]아미노]시클로헥사-3,5-디엔-1,2-디온의 수득

sponge Spongiidae SS-265를 'Yohei Takahashi et al., 2010' 문헌에 기재된 바와 같이 수득하고 추출하였다. 간략하게, sponge SS-265 (1.4 kg, wet weight) 조각에 MeOH (4.3 및 3.2 L)를 가하여 추출물을 제조하였다. MeOH 추출물(68.4 g)을 CHCl₃ 및 H₂O로 분획하였다. CHCl₃-용해성 물질들(2.3 g)은 silica gel column (n-hexane/EtOAc), C18 column (MeOH/H₂O), silica gel column (n-hexane/acetone), 및 반복적으로 C18 HPLC (Wakosil-II 5C18AR, 250 × 10 mm; eluent, MeCN/H₂O/CF₃CO₂H, 90:10:0.1; flow rate, 2.0 mL/min; UV detection at 300 nm and Luna 5u C18(2), 250 × 10 mm; MeOH/H₂O/Et₂NH, 70:30:0.1; flow rate, 2.0 mL/min; UV detection at 300 nm)를 수행하여, 제조예 19(1.8 mg, 0.00013%)의 화합물을 분리 수득하였다.

상기 수득된 제조예 19 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-trimethyl-5-methylidene-3,4,6,7,8,8a-hexahydro-2H-naphthalen-1-yl]methyl]-4-hydroxy-5-[[(2S)-2-methylbutyl]amino]cyclohexa-3,5-diene-1,2-dione’화합물인 것으로 판명되었다:

purple-red, amorphous solid;

[α]²² _D +33 (c 0.2, CHCl3);

IR (film) νmax 3280, 1640, 1590, 1510, 1380, 1200 cm^-1

UV (MeOH) λmax 501 (log 2.88), 327 (4.17), 243 (3.86), 208 nm (4.25);

¹H NMR (CDCl₃)데이터는 하기 [표 14] 참조;

¹³C NMR (CDCl₃)데이터는 하기 [표 14] 참조;

EIMS m/z (%) 413 (M+, 15), 223 (100), 191 (3), 166 (10), 152 (10), 95 (10);

HREIMS m/z 413.2934 [M]+ (calcd for C₂₆H₃₉NO₃, 413.2930).

<제조예 20> 2-[[5-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-테트라메틸-2,3,4,7,8,8a-헥사히드로나프탈렌-1-일]메틸]-6-히드록시-3,4-디옥소시클로헥사-1,5-디엔-1-일]아미노]에탄술포닉 에시드의 수득

sponge Spongiidae SS-1208를 'Yohei Takahashi et al., 2010' 문헌에 기재된 바와 같이 수득하고 추출하였다. 간략하게, sponge SS-1208(0.4 kg, wet weight)에 MeOH (3 × 0.8 L) 및 MeOH/toluene (3:1) (1 × 0.8 L)용액을 가하여 추출물을 제조하였다. 상기 혼합추출물(15.9 g)을 CHCl₃ 및 H₂O (3 × 500 mL)로 분획하였다. CHCl₃-용해성 분획(2.7 g)을 silica gel column (n-hexane/EtOAc 및 CHCl₃/MeOH), C18 column (MeOH/H₂O/CF₃CO₂H), 및 반복적으로 C18 HPLC (Luna 5u Phenyl-Hexyl, 250 × 10 mm; eluent, MeCN/H₂O/CF₃CO₂H, 70:30:0.1; flow rate, 2.0 mL/min; UV detection at 300 nm and Wakosil-II 5C18AR, 250 × 10 mm; eluent, MeCN/H₂O/CF₃CO₂H, 75:25:0.1; flow rate, 2.0 mL/min; UV detection at 300 nm)로 분리하는 과정을 통해, 제조예 20의 화합물(0.8 mg, 0.00020%)을 수득하였다.

상기 수득된 제조예 20 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘2-[[5-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-tetramethyl-2,3,4,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl]methyl]-6-hydroxy-3,4-dioxocyclohexa-1,5-dien-1-yl]amino]ethanesulfonic acid’화합물인 것으로 판명되었다:

purple-red, amorphous solid;

[α]²² _D +38 (c 0.2, MeOH);

IR (KBr) νmax 3450, 1640, 1600, 1530, 1380, 1210 cm^-1;

UV (MeOH) λmax 237 (log 2.8), 345 (4.00), 513 nm (2.47);

¹H NMR (DMSO-d₆)데이터는 하기 [표 15] 참조;

¹³C NMR (DMSO-d₆)데이터는 하기 [표 15] 참조;

ESIMS (neg) m/z 450 [M - H]^-;

HRESIMS (neg) m/z 450.1955 [M - H]^-(calcd for C₂₃H₃₂NO₆S, 450.1950).

<제조예 21> 메틸 3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-4-히드록시벤조에이트의 수득

sponge Dactylospongia elegans를 동결시키고, 동결시킨 해면(2.6 kg, wet weight)을 조각낸 후 MeOH에 침지시키고 overnight하여 추출물을 제조하였다. MeOH 추출물을 hexane, 90% methanol, n-BuOH, 및 H₂O phases로 용매 분획하였다. 상기 90% methanol 분획을 감압조건 하에서 증발시켜, 12 g의 90% MeOH 추출물을 수득하였다. 상기 90% MeOH 추출물 2g을 SiO₂ column (hexane-AcOEt-acetone-MeOH)으로 분리하여, 각각 Fr. A (0.42 g), Fr. B (0.73 g), Fr. C (0.83 g)의 3개 분획을 수득하였다. 상기 분획들 중 Fr. A 및 Fr.B를 ODS column (MeOH-H₂O) 또는 HPLC (Cosmosil 5SL, hexane-AcOEt= 7 : 1)로 분리하여, 각각 제조예 21의 화합물(20 mg, 1%) 및 제조예 22의 화합물(17 mg, 0.85%)을 수득하였다.

상기 수득된 제조예 21 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘methyl 3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-trimethyl-5-methylidene- 3,4,6,7,8,8a-hexahydro-2H-naphthalen-1-yl]methyl]-4-hydroxybenzoate’화합물로 판명되었다:

white solid;

[α]²⁷ _D +17.3 (c 0.12, CHCl₃).

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.77 (1H, s), 7.77-7.74 (1H, m), 6.77 (1H, d, J = 8.0 Hz), 6.01 (1H, s), 4.41 (1H, s), 4.36 (1H, s), 3.87 (3H, s), 2.68 (1H, d, J = 14.3 Hz), 2.64 (1H, d, J = 14.3 Hz), 2.33 (1H, td, J = 13.7, 5.2 Hz), 2.08 (2H, d, J = 13.7 Hz), 1.93-1.89 (1H, m), 1.61-1.56 (1H, m), 1.47 (1H, dt, J = 12.2, 3.2 Hz), 1.41-1.38 (3H, m), 1.31-1.27 (1H, m), 1.22-1.19 (1H, m), 1.06 (3H, s), 1.02 (3H, d, J = 6.9 Hz), 0.96 (1H, dd, J = 12.0, 1.7 Hz), 0.88 (3H, s);

¹³C NMR (125 MHz, CDCl₃) δ: 167.6, 160.0, 159.2, 135.0, 129.3, 125.2, 121.6, 115.3, 102.8, 52.0, 48.0, 42.0, 40.2, 37.0, 36.5, 36.3, 33.0, 27.8, 27.7, 23.2, 20.5, 17.62, 17.59;

IR (KBr): 3341, 1686, 1601, 1426, 1287 cm^-1;

MS (ESI-TOF) m/z: 379 [M+Na]⁺;

HRMS (ESI-TOF) m/z: 379.2249 (Calcd for C₂₃H₃₂O₃Na; Found: 379.2266).

<제조예 22> 메틸 3-[[(1S,2R,4aR,8aR)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-4,5-디히드록시벤조에이트의 수득

상기 제조예 21에서 전술한 바와 같은 방법으로 제조예 22의 화합물을 수득하였으며, 이의 물리화학적 성질은 다음과 같고, ‘methyl 3-[[(1S,2R,4aR,8aR)-1,2,4a-trimethyl-5-methylidene-3,4,6,7,8,8a-hexahydro-2H-naphthalen-1-yl]methyl]-4,5-dihydroxybenzoate’화합물로 판명되었다:

white solid;

[α]²⁶ _D +10.4 (c 0.19, CHCl₃);

¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ: 7.49 (1H, d, J = 2.0 Hz), 7.40 (1H, d, J = 2.0 Hz), 5.90 (2H, S), 4.41 (1H, s), 4.37 (1H, s), 3.87 (3H, s), 2.68 (1H, d, J = 14.3 Hz), 2.65 (1H, d, J = 14.3 Hz), 2.34 (1H, td, J = 13.7, 5.0 Hz), 2.09 (2H, d, J = 14.3 Hz), 1.93-1.91 (1H, m), 1.60-1.55 (1H, m), 1.47 (1H, dt, J = 11.6, 2.7 Hz), 1.43-1.35 (3H, m), 1.33-1.19 (2H, m), 1.06 (3H, s), 1.03(3H, d, J = 6.3 Hz), 0.96 (1H, d, J = 11.5 Hz), 0.88 (3H, s);

¹³C NMR(125 MHz, CDCl₃) δ: 167.7, 160.1, 148.7, 142.3, 127.4, 125.2,

120.3, 114.0, 102.8, 52.1, 48.0, 42.1, 40.2, 37.0, 36.5, 36.3, 33.0,

27.9, 27.7, 23.2, 20.6, 17.64, 17.59;

IR (KBr): 3341, 1686, 1601, 1426, 1287 cm^-1;

MS (ESI-TOF) m/z: 395 [M+Na]⁺

HRMS(ESI-TOF) m/z: 395.2198 (Calcd for C₂₃H₃₂O₄Na; Found: 395.2214).

<제조예 23> (-)-(1R,4aS,8aS)-1β,2β,4β,-트리메틸-1α[(2',5'-디메톡시페닐)메틸]-5-엑소-메틸렌-(3H)-1, 4,4a,5,6,7,8,8aα-옥타히드로나프탈렌의 제조

7.5 mL의 benzene에 무수(anhydrous) 95% potassium tert.-butoxide (217 mg, 1.93 mmol)을 넣은 교반 현탁액을 제조하고, 여기에 657 mg(0.62 mmol)의 methyltriphenylphosphonium bromide를 첨가하였다. 이렇게 생성된 밝은 노란색의 용액에 30분간 열을 가고, 환류(reflux)하였다. 3 mL의 benzene에 212 mg(0.62 mmol)의 ketone (-)-(1R,4aS,8aS)-1β,2β,4aβ-Trimethyl-1α[(2',5'-dimethoyphenyl)methyl]-1,2,3,4,4a,5,6,7,8,8aα-decahydronaphthalen-5-one이 녹아있는 용액에 대하여 열을 가한 일리드(ylide) 용액을 점적(dropwise) 방식으로 첨가하였다. 22시간 동안 추가적인 열처리를 한 후에, 반응 혼합물을 식히고 10 mL의 ether 및 3 mL의 H2O를 순차적으로 넣어주어 빠르게 교반하며 희석하였다. 층 분리가 되었고, 유기상(organic phase)을 2 mL의 H₂O 및 3 mL의 saturated brine으로 세척하였으며, 건조(MgSO4)하였다. 감압조건 하에서 농축한 결과 거의 무색의 오일(oil)이 수득되었으며, 이를 silica gel column (10×2.5 cm)을 이용한 chromatography로 분리하였고, 5% EtOAc(in hexane)으로 용리하여 제조예 23의 화합물(180 mg, 85%)을 수득하였다

상기 수득된 제조예 23 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘(-)-(1R,4aS,8aS)-1β,2β,4β,-Trimethyl-1α[(2',5'-dimetho xyphenyl)methyl]-5-exo-methylene-(3H)-1, 4,4a,5,6,7,8,8aα-octahydronaphthalene’화합물로 판명되었다:

[α]²⁵ _D -40.4° (c 0.5, CH2Cl₂);

mp 77-78;

silica gel TLC Rf 0.70 (15% EtOAc in hexanes);

¹H NMR (CDCl₃) δ 0.86 (s, 3H), 1.01 (d, 3H, J=5.5 Hz), 1.07 (s, 3H), 1.15-1.65 (m, 7H), 1.70-1.95 (m, 2H), 2.05-2.15 (m, 2H), 2.20-2.45 (m,1H), 2.64 (AB q, 2H, J=14 Hz), 3.72 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 4.33-4.47 (m, 2H), 6.65-6.77 (m, 3H).

Anal Calcd for C₂₃H₃₄O₂ : C, 80.65; H, 10.00. Found: C, 80.82; H, 10.04.

<제조예 24> 2-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-테트라메틸-2,3,4,7,8,8a-헥사히드로나프탈렌-1-일]메틸]벤젠-1,4-디올의 디메틸 에테르 제조

11 mL의 EtOH 용액에 제조예 23의 화합물(108.5 mg, 0.317 mmol) 및 rhodium trichloride hydrate(16.7 mg, 0.06 mmol, 20 mol%)를 첨가하여 제조된 혼합물에 열을 가하여 환류(reflux)하였다. 20시간의 열처리 후, 반응 혼합물을 식히고 5 mL의 H₂O 첨가하여 냉각(quench)하였다. 수상(aqueous phase)은 3번 CH₂Cl₂ 10 mL portion으로 추가 추출되었고, 추출물을 한데 모아 건조(MgSO₄) 및 농축하여 희미하게 색깔을 띄는 오일(oil)을 수득하였다. 잔여물(residue)을 silica gel(10% EtOAc in hexanes) plug로 정제하고, 농축하여 맑은 무색의 오일을 수득하였다. 그 후 고압조건에서 천천히 굳히는 과정을 통하여 제조예 24의 화합물을 수득하였다. 수득된 제조예 24 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같으며,‘Dimethyl Ether of 2-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-tetramethyl-2,3,4,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl]methyl]benzene-1,4-diol’화합물인 것으로 판명되었다:

[α]²⁵ _D +8.88° (c 0.18, CH₂Cl₂);

mp 63-68,

silica gel TLC Rf 0.71 (15% EtOAc in hexanes), 0.37 (5% EtOAc in hexanes);

¹H NMR (CDCl₃) δ 0.75-1.15 (m, 4H), 0.87 (s, 3H), 1.01 (s, 3H), 1.24-1.65 (m, 9H), 2.0-2.15 (br m, 3H), 2.70 (br s, 2H), 3.72 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 5.15 (br s, 1H), 6.65-6.85 (m, 3H);

mass spectrum (chemical ionization, negative ion), m/z 341 (M-1)^-.

<제조예 25> 2-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-테트라메틸-2,3,4,7,8,8a-헥사히드로나프탈렌-1-일]메틸]시클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온의 수득

3.5 mL의 THF에 상기 제조예 24의 화합물(70.0 mg, 0.204 mmol)을 넣은 교반 용액에 448 mg(0.82 mmol)의 ceric ammonium nitrate 용액(in 3.5 mL of H₂O)을 점적(dropwise) 방식으로 처리하였다. 15분 후, 반응 혼합물을 3 mL saturated brine 및 10 mL ethyl ether로 연속하여 희석하였다. 층 분리가 되었고, 수상(aqueous phase) 분획은 3번 CH₂Cl₂ 10mL portion으로 추가 추출과정을 거쳤다. 이렇게 추출한 용액을 한데 모아 건조(Na₂SO₄) 및 농축하고, silica gel column (15×2 cm)을 사용한 chromatography를 통해 정제하여 주황색의 오일(oil)을 수득하였다. 5% EtOAc(in hexane)로 용리하여 제조예 25(25 mg, 40%)의 화합물을 수득하였다. 수득된 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘2-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-tetramethyl-2,3,4,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl]methyl]cyclohexa-2,5-diene-1,4-dione’화합물로 판명되었다:

[α]²⁵ _D +21° (c 0.02, CH2Cl₂);

silica gel TLC Rf 0.55 (15% EtOAc in hexanes); λmax (CH₃OH) 292 nm;

¹H NMR (CDCl₃) δ 0.80-2.15 (m, 5H), 0.85 (s, 3H), 0.93 (d, 3H, J=6.5 Hz), 1.00 (s, 3H), 1.53 (br s, 1H), 2.45-2.67 (AB q, 2H, J=13.5 Hz), 5.14 (br s, 1H), 6.51 (br s, 1H), 6.71 (m, 2H);

mass spectrum (chemical ionization) m/z 312 (M+1)+ ; mass spectrum (electron impact), m/z 311.199 (C₂₁H₂₇O₂ requires 311.201).

<제조예 26> 2-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-테트라메틸-2,3,4,7,8,8a-헥사히드로나프탈렌-1-일]메틸]벤젠-1,4-디올의 수득

상기 제조예 25의 화합물 25 mg(0.08 mmol)을 2 mL의 ethyl ether에 용해하고, 이러한 용액을 세게 교반하며 Na₂S₂O₄용액(56 mg Na₂S₂O₄ in 2 mL of H₂O, 0.32 mol)을 점적(dropwise)방식으로 넣어주었다. 45분 후에, 반응 혼합물은 2 mL의 saturated brine과 10 mL의 ethyl ether로 희석하였다. 층 분리가 되었고, 수상(aqueous phase) 분획은 3번 ethyl ether 10 mL portion으로 추가 추출과정을 거쳤다. 이렇게 추출한 ether 용액을 한데 모아 건조(Na₂SO₄) 및 농축하고, silica gel column (18×1 cm)을 이용한 chromatography로 정제하여, 유성 잔류물(oily residue)을 수득하였다. 15% EtOAc(in hexane) 용액으로 용리하여, 맑은 무색의 오일을 수득하였으며, 이를 진공상태에서 굳혀, 제조예 26의 화합물(23 mg, 92%)을 수득하였다. 수득된 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘2-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-tetramethyl-2,3,4,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl]methyl]benzene-1,4-diol’화합물로 로 판명되었다

(+)-1: [α]²⁵ _D +22.0° (c 1.35, CDCl₃);

(-)-1: [α]²⁵ _D -19.5° (c 1.0, CKCl₃);

mp 125-127 .;

silica gel TLC R_f 0.10 (15% EtOAc in hexanes); λmax (DMSO) 305 nm;

¹H NMR (CDCl₃) δ 0.86 (s, 3H), 0.99 (d, 3H, J=8 Hz), 1.02 (s, 3H), 1.51 (br s, 3H), 1.2-1.65 (m, 7H), 1.9-2.15 (m, 3H), 2.54-2.70 (AB q, 2H, J=14 HZ), 4.38 (br s, 1H), 4.41 (br s, 1H), 5.14 (br s, 1H) and 6.59 (m, 3H); mass spectrum (chemical ionization), m/z 315 (M+1)⁺,

mass spectrum (electron impact), m/z 314.225 (M)⁺ (C₂₁H₃₀O₂ requires 314.225).

<제조예 27> 2-[[5-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-테트라메틸-2,3,4,7,8,8a-헥사히드로나프탈렌-1-일]메틸]-6-히드록시-3,4-디옥소시클로헥사-1,5-디엔-1-일]아미노]아세틱 에시드의 제조

EtOH(1 mL)용액에 제조예 10의 화합물(3.0 mg, 8.4 μmol)과 giycine (0.8 mg, 10 μmol)을 넣고, NaHC0₃(11 mg, 130 umol)의 존재 하에서 24시간 상온에서 저어주었다. 여과 및 증발과정을 거쳐 제조된 잔여물(residue)에 Cl8 reversed-phase HPLC (YMC-Pack AM-323, 1.0 x 25 cm; flow rate 2.5 mL/min; UV detection at 300 nm; eluent CH₃CN/H20/CF₃CO₂H, 85: 15:O.l)을 수행하여, 제조예 27의 화합물(1.6 mg, 47%)을 수득하였다.

상기 수득된 제조예 27 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘2-[[5-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-tetramethyl-2,3,4,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl]methyl]-6-hydroxy-3,4-dioxocyclohexa-1,5-dien-1-yl]amino]acetic acid’ 화합물로 판명되었다;

mp. 156 - 158;

[α]²⁰ _D -71.7°(C 1.0, MeOH);

IR (KBr) Vmax 3300, 1720, 1640, 1580, 1370, 1200 cm^-l;

UV(MeOH) λmax 317 (ε 11800) 및 488 nm (860);

ELMS m/z (%) 401 (M+, 1). 385(l), 357(4). 343(3), 211(20), 191(25) 및 95(100);

FABMS (positive) m/z 404 (M+2H+H)⁺; HRFABMS m/z 404.2461 (M+2H+H)⁺, calcd for C₂₃H₃₄N0₅, 404.2437;

¹H NMR (CD₃OD)데이터는 하기 [표 16] 참조;

¹³C NMR (CD₃OD)데이터는 하기 [표 16] 참조.

<제조예 28> (2S)-2-[[5-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-테트라메틸-2,3,4,7,8,8a-헥사히드로나프탈렌-1-일]메틸]-6-히드록시-3,4-디옥소시클로헥사-1,5-디엔-1-일]아미노]-3-히드록시프로파노익 에시드의 제조

EtOH(1 mL)용액에 제조예 10의 화합물(3.0 mg, 8.4 μmol) 및 L-serine (1.3 mg, 10 pmol)을 넣고, NaHC0₃(27 mg, 34 Mmol)의 존재 하에서 24시간 40에서 저어주었다. 여과 및 증발과정을 거쳐 제조된 잔여물(residue)에 Cl8 reversed-phase HPLC (YMC-Pack AM-323, 1.0 x 25 cm; flow rate 2.5 mL/min; UV detection at 300 nm; eluent CH₃CN/H₂0/CF₃CO₂H, 85: 15:O.l)을 수행하여, 제조예 28의 화합물(1.7 mg, 46%)을 수득하였다.

상기 수득된 제조예 28 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘(2S)-2-[[5-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-tetramethyl-2,3,4,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl]methyl]-6-hydroxy-3,4-dioxocyclohexa-1,5-dien-1-yl]amino]-3-hydroxypropanoic acid’ 화합물로 판명되었다:

mp. 198-200;

[α]¹⁷ _D-71°(c0.73, EtOH);

IR (K Br) Vmax 3400, 1670, 1630, 1590, 1540, 1380, 1200 cm^-1;

UV (MeOH) λmax 321 (ε12100) 및 498 nm (920);

FABMS (negative, diethanolamine matrix) m/z 432 (M+2H-H)^-;

HRFABMS m/z 432.2381 (M+2H-H)^-, calcd for C₂₄H₃₄N0₆ 432.2386;

¹H NMR (DMSO-d₆)데이터는 하기 [표 17] 참조;

¹³C NMR (DMSO-d₆)데이터는 하기 [표 17] 참조.

<제조예 29> (2S)-2-[[5-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-테트라메틸-2,3,4,7,8,8a-헥사히드로나프탈렌-1-일]메틸]-6-히드록시-3,4-디옥소시클로헥사-1,5-디엔-1-일]아미노]-3-히드록시부타노익 에시드의 제조

EtOH(1 mL)용액에 제조예 10의 화합물(3.0 mg, 8.4μmol) 및 L-threonine (1.3 mg, 13 umol), 을 넣고, NaHC03(11 mg, 130 umol)의 존재 하에서 24시간 40에서 저어주었다. 여과 및 증발과정을 거쳐 제조된 잔여물(residue)에 Cl8 reversed-phase HPLC (YMC-Pack AM-323, 1.0 × 25 cm; flow rate 2.5 mL/min; UV detection at 300 nm; eluent CH₃CN/H₂0/CF₃CO₂H, 85: 15:O.l)을 수행하여, 제조예 29의 화합물(1.3 mg, 35%)을 수득하였다.

상기 수득된 제조예 29 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘(2S)-2-[[5-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a,5-tetramethyl-2,3,4,7,8,8a-hexahydronaphthalen-1-yl]methyl]-6-hydroxy-3,4-dioxocyclohexa-1,5-dien-1-yl]amino]-3-hydroxybutanoic acid’화합물로 판명되었다:

mp. 188-191;

[α]¹⁷ _D -183° (c 1.0, EtOH);

IR (K Br) Vmax 3400, 1670, 1630, 1590, 1540, 1380, 1200 cm^-1;

UV (MeOH) λmax 317 (ε 12600) 및 490nm(1000);

FABMS (negative, diethanolamine matrix) m/z 446 (M+2HH)^-;

HRFABMS m/z 446.2524 (M+2H-H)^-, calcd for C₂₅H₃₆N0₆, 446.2906;

¹H NMR (DMSO-d₆)데이터는 하기 [표 18] 참조;

¹³C NMR (DMSO-d₆)데이터는 하기 [표 18] 참조.

<제조예 30> 18-메톡시-22,22-디메틸-16-[{(5R,8S,9R,10S)-5,8,9-트리메틸-4-메틸렌데카히드로나프탈렌-9-일}메틸]벤조[d]-옥사졸-17(2H)-온의 수득

Smenospongia aurea 및 Smenospongia cerebriformis를 균질화(homogenize)하고, Verongula rigida 와 함께 에탄올 용액에 넣어, 일주일동안 인큐베이션(incubation)하였다. 상기 세가지 해면의 혼합물에 대한 에탄올 추출물을 건조시킨 것(3.6 kg)을 silica gel VLC (36 kg, 14 (H) × 17.5 (D) cm) 수행하고, 단계적인 농도의 hexanes (100%), hexanes-acetone (80:20, 60:40, 50:50, 40:60, 20:80), acetone (100%), acetone-MeOH (80:20, 60:40, 50:50), MeOH (100%), MeOH-H₂O (50:50), 및 H₂O(100%)으로 용출시켜, 13개의 분획(Fr. 1~13)을 수득하였다. 분획 10(39.3 g)은 hexanes-acetone 혼합용액(95:5, 90:10, 85:15, 80:20), MeOH (100%), 및 MeOH-H₂O(50:50)로 silica gel VLC (12 (H) × 17.5 (D) cm)를 이용하여 9개의 분획(Fr. 10-1 ~ 10-9)으로 추가 분획하였다. 분획 10-7(3.7 g)을 MeOH-H₂O(85:15)의 등용매(isocratic condition) 조건에서 C18 MPLC (15.5 × 4 cm) 수행하여, 6개의 소분획 (Fr. 10-7-1 ~ 10-7-6)을 제조하였다. 분획 10-7-3(115.8 mg)을 MeOH-H₂O(83:17)로 C18 HPLC (250 × 21.20 mm, 10μm) chromatography를 수행하고 3개의 분획(Fr. 10-7-3-1 ~ 10-7-3-3)을 제조하였다. 분획 10-7-3-2 (12.4 mg)은 MeOH-H₂O(75:25)로 C18 HPLC (250 × 4.60 mm and 150 × 4.60 mm, 5 ㎛, connected in line)를 수행하여, 제조예 30의 화합물 및 이의 epimer 혼합물을 수득하였다.

상기 수득된 물질의 물리화학적 성질은 다음과 같았으며, ‘18-methoxy-22,22-dimethyl-16-[{(5R,8S,9R,10S)-5,8,9-trimethyl-4-methylenedecahydronaphthalen-9-yl}methyl]benzo[d]-oxazol-17(2H)-one’화합물로 판명되었다:

yellow, amorphous solid;

[α]²⁵ _D +21 (c0.1, MeOH);

UV (MeOH) λmax 297 nm;

^lH NMR (150 MHz, CDCl₃) 데이터는 하기 [표 19] 참조;

¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃)데이터는 하기 [표 19] 참조.

HRFABMS m/z 398.2696 [M + H]⁺ (calcd for C₂₅H₃₆NO₃, 398.2695), 420.2509 [M + Na]⁺ (calcd for C₂₅H₃₅NO₃Na, 420.2515).

<제조예 31> 18-메톡시-22-메틸-16-[{(5S,8S,9R,10S)-5,8,9-트리메틸-4-메틸렌데카히드로나프탈렌-9-일}메틸]벤조[d]-옥사졸-17-올의 수득

상기 제조예 30의 과정 중, 분획10-7-3-3(9.7 mg)은 MeOH-H₂O(78:22)로 C18 HPLC (250×4.60 mm 및 150×4.60 mm, 5 ㎛, connected in line)을 수행하고, 120분 동안의 MeOH-H₂O 농도 변화 조건(80:20 → 100:0)에서 C18 HPLC (250 × 4.60 mm, 5 ㎛)를 수행하여, 제조예 31의 화합물(1.8 mg)을 수득하였다.

상기 수득된 화합물(제조예 31)의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘18-methoxy-22-methyl-16-[{(5S,8S,9R,10S)-5,8,9-trimethyl-4-methylenedecahydronaphthalen-9-yl}methyl]benzo[d]-oxazol-17-ol’ 화합물로 판명되었다

white, amorphous solid;

[α]²⁵ _D -29 (c 0.1, MeOH);

UV (MeOH) λmax 295 nm;

^lH NMR (150 MHz, CDCl₃) 데이터는 하기 [표 20] 참조;

¹³C NMR (150 MHz, CDCl₃)데이터는 하기 [표 20] 참조.

HRFABMS m/z 384.2540 [M + H]⁺ (calcd for C₂₄H₃₄NO₃, 384.2539),

406.2357[M + Na]⁺ (calcd for C₂₄H₃₃NO₃Na, 406.2358).

<제조예 32> 3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-4-히드록시-5-(2-페닐에틸아미노)시클로헥사-3,5-디엔-1,2-디온의 수득

상기 제조예 30에서 전술한바와 같은 방법으로 Fr.10-7-1 내지 10-7-6의 소분획을 제조한 후, Fr.10-7-4(53 mg)에 대해 MeOH-H₂O(87:13) 등용매 조건에서 C₁₈HPLC(25 X 2.1 cm,10 ㎛)를 반복적으로 수행하여, 제조예 32의 화합물(t_R = 113 min)을 수득하였다.

수득된 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-trimethyl-5-methylidene-3,4,6,7,8,8a-hexahydro-2H-naphthalen-1-yl]methyl]-4-hydroxy-5-(2-phenylethylamino)cyclohexa-3,5-diene-1,2-dione’화합물로 판명되었다;

C₂₉H₃₇NO₃

mp. : 168-170.

SM m/e(%): 447 (7)s 257 (64). 191 (ll), 166 (59). 152 (25). 135 (16), 121 (23). 109 (23). 107 (20). 95 (100).

m/e 166.0495. Calc. 166.0504 for C₈H₈N0₃; m/e 191.1795. calc. 191.1799 for C₁₄H₂₃; m/e 257.104, calc. 257.105 for C₁₅H₁₅NO₃.

IR (KBr) υcm^-l: 3265,1600,1395.

¹H NMR(CDCl₃, 250 MHz) δ ppm: 6.47 (1H exch., s), 5.41 (lH, s), 4.45 (2H, br s). 3.43 (2H, q), 2.87 (2H, t), 2.52-2.51 (dd, AB syst., J= 14 및 2 Hz), 1.05 (3H, s), 0.98 (3H, d, J = 7.5 Hz), 0.84 (3H, s), 0.79 (1H. dd, J = 11.2 및 2 Hz);

¹³C NMR (ppm; CDCl₃)데이터는 하기 [표 21] 참조.

<제조예 33> 3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-2-히드록시-5-메톡시시클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온의 수득

Smenospongia aurea , Smenospongia cerebriformis 및 Verongula rigida의 세 종류의 해면동물을 혼합한 후, 여기에 에탄올(98%)을 가하여 에탄올 추출물을 제조하였다. 상기 에탄올 추출물을 헥산, 아세톤, 메탄올, 물 등의 용매를 이용하여 실리카겔 칼럼으로 분리하여 총 13분획을 얻었고, 그 중 4, 5, 6 및 10분획을 농축한 후 이동상(메탄올:물 = 1:1~3:1)을 사용하여, C18 RP 충진제를 사용한 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 순수한 화합물(제조예 33 화합물)을 얻었다. 화합물의 확인은 HPLC(Agilent Technologies 1260 infinity) 장치를 이용하였고 검출기는 자외부 흡광광도계(203 nm), 칼럼으로는 Bluespher AB2(150×2 ㎜)를 사용하였다. 이동상으로 물-메탄올(78:22), 유속 1㎖/min, 온도 40℃ 조건에서 진행하였으며 114분에서 해당 화합물의 피크가 검출되었다.

수득된 화합물의 물리화학적 성질은 다음과 같으며, ‘3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-trimethyl-5-methylidene-3,4,6,7,8,8a-hexahydro-2H-naphthalen-1-yl]methyl]-2-hydroxy-5-methoxycyclohexa-2,5-diene-1,4-dione’화합물로 판명되었다:

Yellow Solid;

C₂₂H₃₀O₄

분자량: 358.47;

m.p.: 72.5;

IT-TOF/MS : m/z 381.1972[M+Na]⁺

¹H-NMR (CDCl₃, 600 MHz) : 2.08, 1.42 (each 1H, m, H₂-1), 1.84, 1.16(each 1H, m, H₂-2), 2.29, 2.05 (each 1H, ddd, J = 13.7, 8.6, 5.4, H₂-3), 1.49,1.32 (each 1H, m, H₂-6), 1.37 (2H, m, H₂-7), 1.14 (1H, m, H-8), 0.74 (1H, d, J= 12.0, H-10), 4.43, 4.41 (each 1H, s, H₂-11), 1.02 (3H, s, H₃-12), 0.96 (3H,d, J = 6.4, H₃-13), 0.82 (3H, s, H₃-14), 2.51, 2.45 (each 1H, d, J = 13.7, H₂-15), 5.83 (1H, s, H-19), 3.84 (3H, s, H₃-22) ;

¹³C-NMR (CDCl₃, 150 MHz) : 23.34 (C-1), 28.11 (C-2), 33.13 (C-3), 160.69 (C-4), 40.63 (C-5), 36.82 (C-6), 28.80 (C-7), 38.25 (C-8), 43.50 (C-9), 50.30 (C-10), 102.66 (C-11), 20.73 (C-12), 18.01 (C-13), 17.52 (C-14),32.52 (C-15), 117.49 (C-16), 153.49 (C-17), 182.51 (C-18), 102.17 (C-19), 161.90 (C-20), 182.20 (C-21), 57.01 (C-22).

<제조예 34> 3-[[(1S,2R,4aR,8aR)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-5-에톡시-2-히드록시시클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온의 제조

라운드 플라스크에 제조예 33의 화합물 400 ㎎을 20 ㎖의 에탄올로 용해하였다. 용해된 반응 혼액에 10.5 ㎖의 1M 수산화칼륨(KOH) 용액을 넣고 70에서 한 시간 교반하였다. 교반된 반응 혼액에 1M 염산 용액을 넣고 감압 농축 후 분별 깔때기에 옮겨 에틸아세테이트 및 증류수에 녹여 분액하였으며, 에틸아세테이트 층을 모아 황산마그네슘으로 탈수 후 여과하여 감압농축하여 농축액을 얻었다. 순수한 반응산물을 얻기 위해 상기 농축액을 이동상(n-헥산 : 에틸아세테이트 = 10:1)을 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 분리하여 최종 화합물(제조예 34)을 얻었다.

상기 최종 화합물(제조예 34)의 물리화학적 성질은 하기와 같으며.‘3-[[(1S,2R,4aR,8aR)-1,2,4a-trimethyl-5-methylidene-3,4,6,7,8,8a- hexahydro-2H-naphthalen-1-yl]methyl]-5-ethoxy-2-hydroxycyclohexa-2,5-diene-1,4-dione’화합물로 판명되었다;

Yellow Semi-solid ;

C₂₃H₃₂O₄ ;

분자량 : 372.5 ;

IT-TOF/MS : m/z 395.2146[M+Na]⁺;

¹H-NMR (CDCl₃, 600 MHz) : 7.47 (1H, s), 5.83 (1H, s), 4.46, 4.44 (each 1H, s), 4.06 (2H, q, J = 7.2 Hz), 2.50 (2H, dd, J = 12, 6.0 Hz), 2.33 (1H, dt, J = 12, 6.0 Hz), 2.17-1.66 (4H, m), 1.49 (3H, t, J = 7.2 Hz), 1.46-1.09 (7H, m), 1.04 (3H, m), 0.98 (3H, d, J = 6 Hz), 0.84 (3H, s) ;

¹³C-NMR (CDCl₃, 150 MHz) : 182.68, 182.26, 161.19, 160.75, 153.35, 117.45, 102.63, 102.40, 66.10, 50.35, 43.45, 40.63, 38.29, 36.82, 33.14, 32.63, 28.79, 28.12, 23.32, 20.73, 18.46, 18.05, 13.97.

<실시예 1> Wnt/β-catenin 경로의 억제활성 평가

제조된 화합물 들 중 구조적으로 대표성을 띠는 몇 가지 화합물에 대하여 Wnt/β-catenin을 억제하는지 여부를 확인하였다.

<1-1> 제조예 30 및 31 화합물의 Wnt/β-catenin 경로의 억제활성

HEK293 (human embryonic kidney cell) 및 Wnt3a-분비 L 세포는 ATCC(American Type 은 ATCC(American Type Culture Collection, USA)에서 구입하였으며, 10% FBS(fetal bovine serum), 120 ㎍/㎖ 페니실린 및 200 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에서 배양하였다.

Wnt3a-CM(Wnt3a-conditioned medium)은 Wnt3a-분비 L 세포를 10%[v/v] FBS(fetal bovine serum)가 포함된 DMEM에서 4일간 배양한 후, 상기 배양된 DMEM 배지를 수거하여 0.22 ㎛ 필터로 멸균하여 준비하였다. 이 후, 세포에 새 DMEM(10%[v/v] FBS 포함) 배지를 첨가하여 3일간 추가 배양 하고 같은 방법으로 배지를 수거한 것을, 상기에서 수득한 Wnt3a-CM과 합쳐주었다.

상기 Wnt3a-CM과, 각각 제조예 30의 화합물 또는 제조예 31의 화합물을 농도별(각각 10, 20 및 40 μM)로 15시간동안 HEK293세포에 처리하고, 상기 세포에서 세포질 단백질을 추출한 후, Wnt/β-카테닌 경로의 CRT(β-catenin response transcription)를 조절하는 세포 내 β-카테닌 양을 β-카테닌 항체(BD Transduction Laboratories, USA) 및 ECL 시스템(Santa Cruze Biotechnology)를 이용한 웨스턴 블롯으로 확인하였으며, 이를 도 1에 나타내었다.

웨스턴블롯 결과 도 1에서 보는 바와 같이, Wnt3a-CM이 처리된 세포에서 세포질 내 β-카테닌 발현이 증가하였으나, 본 발명의 제조예 30 화합물 또는 제조예 31 화합물의 처리를 통하여 β-카테닌 수준이 감소한 것을 확인하였다.

<1-2> 제조예 32 화합물의 Wnt/β-catenin 경로의 억제활성

상기 실시예 <1-1> 과 같은 방법으로 제조예 32 화합물의 Wnt/β-catenin 경로 억제활성을 평가하였다. 간략하게, 상기 Wnt3a-CM과, 제조예 32의 화합물을 농도별(각각 10 또는 20μM)로 15시간동안 HEK293세포에 처리하고, 상기 세포에서 세포질 단백질을 추출한 후, Wnt/β-카테닌 경로의 CRT(β-catenin response transcription)를 조절하는 세포 내 β-카테닌 양을 β-카테닌 항체(BD Transduction Laboratories, USA) 및 ECL 시스템(Santa Cruze Biotechnology)을 이용한 웨스턴 블롯으로 확인하였으며, 이를 도 2에 나타내었다.

웨스턴블롯 결과 도 2에서 보는 바와 같이, Wnt3a-CM이 처리된 세포에서 세포질 내 β-카테닌 발현이 증가하였으나, 본 발명의 제조예 32 화합물의 처리를 통하여 β-카테닌 수준이 감소한 것을 확인하였다.

<1-3> 제조예 33 및 34 화합물의 Wnt/β-catenin 경로의 억제활성

ARPE-19세포(인간 망막상피세포)와 Wnt3a-분비 L 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, USA)에서 구입하였으며, 10% FBS, 120 ㎍/㎖ 페니실린 및 200 ㎍/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에서 배양하였다. Wnt3a-CM(Wnt3a-conditioned medium)은 Wnt3a-분비 L 세포를 10%[v/v] FBS(fetal bovine serum)가 포함된 DMEM에서 4일간 배양한 후, 상기 배양된 DMEM 배지를 수거하여 0.22 ㎛ 필터로 멸균하여 준비하였다. 이 후, 세포에 새 DMEM(10%[v/v] FBS 포함)을 첨가하여 3일간 추가 배양 후, 다시 한번 Wnt3a-CM을 수득하였다.

상기 Wnt3a-CM과, 각각 제조예 33의 화합물 또는 제조예 34의 화합물(각각 3 및 6μM)이 24시간 처리된 ARPE-19 세포에서 세포질 단백질을 추출한 후, Wnt/β-카테닌 경로의 CRT(β-catenin response transcription)를 조절하는 세포 내 β-카테닌 양을 β-카테닌항체(BD Transduction Laboratories, USA) 및 ECL 시스템(Santa Cruze Biotechnology)를 이용한 웨스턴 블롯으로 확인하였으며, 이를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보는 바와 같이, Wnt3a-CM이 처리된 세포에서 세포질 내 β-카테닌 발현이 증가하였으나, 본 발명의 제조예 33 화합물 또는 제조예 34 화합물의 처리를 통하여 β-카테닌 발현이 감소하여 상기 화합물이 인간망막상피세포에서 Wnt/β-카테닌 경로를 억제함을 확인하였다. 한편, 상기 제조예 33의 화합물을 분리해내기 위해 사용한 해면(sponge) 에탄올 추출물에서는 이러한 작용이 확인되지 않았다(데이터 미도시).

<실시예 2> 안구 내 혈관 누수 억제 활성 평가

<2-1> 유리체강 내 투여

상기 실시예 1에서 좋은 활성을 보였던 제조예 33의 화합물을 대상으로, 황반부종을 유발한 마우스 모델에서 황반변성 또는 황반부종의 원인이 되는 혈관누수에 대한 억제 작용이 있는지 여부를 확인하였다. 레이저를 조사하여 10주령 C57BL/6 마우스에 황반부종을 유발하였다. 케타민(ketamine, 70 mg/kg)과 자일라진(xylazine, 30 ㎎/kg)으로 마취하고, 1% 트로피카마이드(tropicamide)로 동공을 산대시켰다. 히드록시프로필 메틸셀룰로스(hydroxypropyl methycellulose)를 눈에 점안하고, 커버글라스(microscope cover glass)를 콘택트 렌즈(contact lens)로 사용하였다. 이후, 시신경유두 둘레의 혈관 사이사이 공간에 5개의 레이저 번(laser burns)을 만들었다(Zeiss 1149-630, laser power 180 mW, duration 0.1s, spot size 50 ㎛). 이 상태에서 형광안저혈관촬영(fluorescein angiography, FA) 및 빛 간섭단층촬영(optical coherence tomography, OCT)으로 혈관의 크기 및 투과성을 확인하였다. 레이저 조사 후 24시간 째에, 마우스 유리체강 내로, 대조군에는 DMSO(dimethyl sulfoxide) 0.5 ㎕를, 실험군에는 DMSO에 용해한 제조예 33 화합물 100 ng/0.5 ㎕를 주사하고 1주일 후 다시 형광안저혈관촬영 및 빛간섭단층촬영 검사를 수행하였고, 대조군과 화합물 처리군의 사진을 대조 촬영하여 도 4에 개시하였다.

도 4에서 보는 바와 같이 형광 안저 혈관 촬영과 빛 간섭 단층활영 검사 결과, 대조군(도 4의 A 및 B)과 비교하여 실험군(도 4의 C 및 D)의 황반변성 또는 황반부종의 원인이 되는 혈관누수가 명확히 감소한 것을 확인하였다.

<2-2> 복강투여

C57BL/6 마우스에 황반부종을 유발하고 제조예33의 화합물을 복강투여 한 후, 막막 내 혈관 누수 여부를 확인하였다.

간략하게, 8~12 주령 C57BL/6 마우스를 Zoletil (40 mg/kg)과 xylazine (5 mg/kg) 복강으로 마취하고, 1% tropicamide로 동공을 산대시켰다. Hydroxypropyl methycellulose를 눈에 점안하고, microscope cover glass를 contact lens로 사용하였다. 시신경유두 둘레의 망막혈관 사이사이 공간에 3~5개의 laser burns을 만들었다(Zeiss 1149-630, laser power 200 mW, duration 0.05 s, spot size 50μm).

레이저 조사 후, 대조군(도 5의 A)에는 Vehicle로서 증류수를 10 ml/kg, 실험군(도 5의 B)에는 제조예 33의 화합물을 1 mg/kg 용량(증류수에 녹임)으로 7일 동안 매일 복강 투여하였다. 6일 째 되는 날, 10% sodium fluorecein을 복강주입하여 빛간섭단층촬영을 수행하였다.

그 결과 도 5에서 보는 바와 같이, 본 발명의 화합물은 복강주사 시에도 황반변성 또는 황반부종의 원인이 되는 혈관누수를 억제한 것을 확인하였다.

<실시예 3> 경구투여 후 in vivo PK(Pharmacokinetics)

Samtako Co. (Osan, Korea)로부터 수컷 ICR 마우스(8 weeks, 30-35 g)를 구입하였다. 구입한 실험동물은 1주일동안 다음과 같은 조건에서 안정화(acclimatize)되었다: 온도 23 ± 2℃, 상대습도 55 ± 10%, 조도(illumination intensity) 150-300 lux, 환기빈도 15-20 times/h 및 조명 주기(illumination cycle) 12h (07:00-19:00). 모든 동물실험은 Animal Care and Use Committee of Kyungpook National University (Study No. 2016-0043)의 승인을 받았다.

약물을 투여하기 전 12h 동안 마우스들을 단식시켰다. 임의(ad libitum)로 먹이와 물을 공급하였다. 제조예33의 화합물을 DW:PEG400=60:40 (v/v)용액에 용해한 후 10 mg/kg dose를 경구 위관 영양법(oral gavage)으로 투여하였다.

상기 경구투여 0. 5h 및 2 h 후에, 복대동맥(abodominal artery)으로부터 혈액 샘플을 채취하였다. 상기 혈액샘플을 13,000 rpm에서 5분동안 원심분리한 후, 혈장 샘플 50 mL을 수득하였고, 분석에 사용 전까지 -80℃로 보관하였다. 눈(eye)샘플을 마우스로부터 수직하고, 9-fold saline을 이용하여 균질화하여, 10%의 세포분쇄액(homogenate)을 수득하였다. 분취액(aliquot) 50 mL을 수득하여 분석에 사용 전까지 -80℃로 보관하였다.

0.5 ng/mL의 propranolol이 함유된 acetonitrile 용액 200 μL에 상기 분취액(aliquot)의 50 μL 혈장을 첨가하였다(internal standard). 10분동안 vortex mixing하고 13,000 rpm으로 10분동안 원심분리한 후, 상층액(supernatant)을 새 tube에 옮기고 nitrogen gas 하에서 증발시켰다. 잔여물(residue)를 150 μL의 이동상에 넣고, 5 μL의 분취액(aliquot)을 LC-MS/MS system에 직접적으로 주사하여 분석하였다.

타겟 영역에서 본 발명의 화합물의 조직 분포를 조사하기 위하여, 10 mg/kg농도로 경구 투여후 혈장 및 눈(eye)에서의 화합물 농도를 측정하였다. 샘플링 시점인 0.5 h 및 2 h는 각각 peak plasma concentration과 distribution phase을 기초로하여 선택되었다. [도 6]에서 보는 바와 같이, 본 발명의 화합물(특히, 제조예 33의 화합물)은 타겟 조직에 높은 투과성을 나타내었고, 경구투여를 통해서도 눈(eye)에 높은 수준으로 타겟팅 되는 것을 확인하였다. 이러한 결과를 통해, 본 발명의 제조예 33의 화합물은 유리체강 내로 직접 약물을 투여하는 것 이외에도, 다른 투여경로(경구투여, 복강주사, 정맥주사 등)를 통해서도 치료적 효능을 보일 수 있음을 확인하였다. 즉, 시판되고 있는 안구 내 질환 관련 치료제들이 유리체강 내로 직접 투여해야하는 불편함과 이에 따른 고통 및 부작용이 있는 것에 반해, 본 발명의 화합물은 경구투여 가능한 것으로 확인되었다.

<실시예 4> 화합물 안전성 평가

<4-1> 급성 독성 평가

제조예 33의 화합물을 단기간에 과량을 섭취하였을 때, 급성적(24시간 이내)으로 동물체내에 미치는 독성을 조사하고, 치사율을 결정하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 일반적인 마우스인 ICR 마우스 계통 20마리를 대조군과 실험군에 각각 10마리씩 배정하였다. 대조군에는 PEG-400:트윈-80:에탄올(8:1:1, v:v:v) 만을 투여하고, 실험군은 제조예 33의 화합물을 상기 PEG-400:트윈-80:에탄올(8:1:1, v:v:v)에 녹여 각각 경구투여하였다. 투여 24시간 후에 각각의 치사율을 조사한 결과, 대조군과 2g/㎏/day 농도의 제조예 33 화합물을 투여한 실험군에서 마우스가 모두 생존하는 것으로 확인되었다.

<4-2> 조직 독성 평가

장기 독성 실험은 제조예 33의 화합물을 각 농도로 8주 동안 C57BL/6J 마우스(각 군당 10마리)에 투여하여 실험하였다. 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 제조예 33의 화합물을 투여한 실험군과 PEG-400:트윈-80:에탄올(8:1:1, v:v:v)만을 투여한 대조군의 동물들로부터 8주 후 혈액을 채취하여 GPT(glutamate-pyruvate transferase) 및 BUN(blood urea nitrogen)의 혈액 내 농도를 Select E(Vital Scientific NV, Netherland) 기기를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 간독성과 관계있는 것으로 알려진 GPT와 신장 독성과 관계있는 것으로 알려진 BUN의 경우, 대조군과 비교하여 실험군은 별다른 차이를 보이지 않았다. 또한, 각 동물로부터 간과 신장을 절취하여 통상적인 조직 절편 제작과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였으며 모든 조직에 서 특이한 이상이 관찰되지 않았다.

<제제예> 약학적 제제의 제조

<제제예 1> 정제의 제조

본 발명의 화합물 200 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

<제제예 2> 주사액의 제조

본 발명의 화합물 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르브산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 세스퀴테르펜 유도체의 신규한 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명의 화학식 1로 표시되는 세스퀴테르펜 유도체 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 안구 내 혈관 누수에 의한 황반변성 또는 황반부종의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 화학식 1의 화합물은 안구 내, 특히 망막 내의 혈관 누수(leakage)를 억제하여, 황반부종 및 황반변성 등의 안구 내 혈관누수에 의한 질환에 대하여 치료 효과가 있다. 뿐만 아니라 시판되고 있는 안구 내 질환 관련 치료제들이 유리체강 내로 직접 투여해야 하는 불편함과 이에 따른 고통 및 부작용이 있는 것에 반해, 본 발명의 화합물은 유리체강 내 투여 이외의 다른 투여경로(경구투여, 복강주사 등)를 통해서도 타겟 조직(눈)에 분포하여, 투여경로에 구애받지 않고 치료효능을 가지므로 산업상 이용가능성이 높다.

본 발명의 화학식 1의 화합물은 안구 내, 특히 망막 내의 혈관 누수(leakage)를 억제하여, 황반부종 및 황반변성 등의 안구 내 혈관누수에 의한 질환에 대하여 치료 효과가 있다. 뿐만 아니라 시판되고 있는 안구 내 질환 관련 치료제들이 유리체강 내로 직접 투여해야하는 불편함과 이에 따른 고통 및 부작용이 있는 것에 반해, 본 발명의 화합물은 유리체강 내 투여 이외의 다른 투여경로(경구투여, 복강주사 등)를 통해서도 타겟 조직(눈)에 분포하여, 투여경로에 구애받지 않고 치료효능을 가지므로 효과가 탁월하다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 황반변성 또는 황반부종의 예방 또는 치료용 약학적 조성물:

화학식 1

화학식 1에서,

점선은 단일결합 또는 이중결합을 나타내며

i) 3번 탄소와 4번 탄소의 결합 및 5번 탄소와 6번 탄소의 결합이 단일결합일 때, R2b는 존재하지 않고 R2a는 CH₂인 구조;

ii) 3번 탄소와 4번 탄소의 결합이 이중결합일 때, 5번 탄소와 6번 탄소의 결합은 단일결합이고, R2b는 존재하지 않고 R2a는 CH₃인 구조; 및

iii) 5번 탄소와 6번 탄소의 결합이 이중결합일 때, 3번 탄소와 4번 탄소의 결합은 단일결합일 때, R2a 및 R2b는 CH₃인 구조로 구성된 군에서 선택되는 하나의 구조이고,

R1은 H 또는 CH₃이며,

R3은 하기 R3a 내지 R3d로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 작용기이고,

상기 R3a는

i) R4 및 R7이 각각 OH 또는 OCH₃이고, R5, R6 및 R8은 H인 구조; 또는

ii) R5가 COOCH₃이고, R7은 H 또는 OH이며, R8은 OH이고, R4 및 R6은 H인 구조이며,

상기 R3b는

R9가 H, NH₂, C1~C8 알콕시기 및 하기 R9a 내지 R9j로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 작용기이고, R10은 H 또는 OH이고,

상기 R3c는

R11 및 R12는 각각 OH 또는 OAc이고, R13은 H인 구조; 또는

R11 및 R12는 각각 OH 또는 OCH₃이며 R13은 CH₃인 구조이며

상기 R3d는 R14가 OCH₃이고, R15 및 R16은 CH₃인 구조.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은

3번 탄소와 4번 탄소의 결합 및 5번 탄소와 6번 탄소의 결합이 단일결합일 때, R2b는 존재하지 않고 R2a는 CH₂인 구조이고,

R3은 상기 R3b 내지 R3d로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 작용기인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제2항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물에서 상기 R3b 내지 R3d로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 작용기는,

R3b는 R9가 에톡시기, 메톡시기 및 R9a로 구성된 군에서 선택된 어느 하나;

R3c는 R11은 OH이고 R12는 OCH₃이며 R13은 CH₃; 또는

R3d는 R14가 OCH₃이고, R15 및 R16은 CH₃;인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제3항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은,

3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-4-히드록시-5-(2-페닐에틸아미노)시클로헥사-3,5-디엔-1,2-디온;

3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-2-히드록시-5-메톡시시클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온;

3-[[(1S,2R,4aR,8aR)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-5-에톡시-2-히드록시시클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온;

18-메톡시-22-메틸-16-[{(5S,8S,9R,10S)-5,8,9-트리메틸-4-메틸렌데카히드로나프탈렌-9-일}메틸]벤조[d]-옥사졸-17-올; 및

18-메톡시-22,22-디메틸-16-[{(5R,8S,9R,10S)-5,8,9-트리메틸-4-메틸렌데카히드로나프탈렌-9-일}메틸]벤조[d]-옥사졸-17(2H)-온;

로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 경구제, 주사제, 점안제 및 연고제로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 형태로 제조되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 안구 내 혈관 누수 억제용 약학적 조성물.

화학식 1

화학식 1에서,

점선은 단일결합 또는 이중결합을 나타내며

i) 3번 탄소와 4번 탄소의 결합 및 5번 탄소와 6번 탄소의 결합이 단일결합일 때, R2b는 존재하지 않고 R2a는 CH₂인 구조;

ii) 3번 탄소와 4번 탄소의 결합이 이중결합일 때, 5번 탄소와 6번 탄소의 결합은 단일결합이고, R2b는 존재하지 않고 R2a는 CH₃인 구조; 및

iii) 5번 탄소와 6번 탄소의 결합이 이중결합일 때, 3번 탄소와 4번 탄소의 결합은 단일결합일 때, R2a 및 R2b는 CH₃인 구조로 구성된 군에서 선택되는 하나의 구조이고,

R1은 H 또는 CH₃이며,

R3은 하기 R3a 내지 R3d로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 작용기이고,

상기 R3a는

i) R4 및 R7이 각각 OH 또는 OCH₃이고, R5, R6 및 R8은 H인 구조; 또는

ii) R5가 COOCH₃이고, R7은 H 또는 OH이며, R8은 OH이고, R4 및 R6은 H인 구조이며,

상기 R3b는

R9가 H, NH₂, C1~C8 알콕시기 및 하기 R9a 내지 R9j로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 작용기이고, R10은 H 또는 OH이고,

상기 R3c는

R11 및 R12는 각각 OH 또는 OAc이고, R13은 H인 구조; 또는

R11 및 R12는 각각 OH 또는 OCH₃이며 R13은 CH₃인 구조이며

상기 R3d는 R14가 OCH₃이고, R15 및 R16은 CH₃인 구조.
제6항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은

3번 탄소와 4번 탄소의 결합 및 5번 탄소와 6번 탄소의 결합이 단일결합일 때, R2b는 존재하지 않고 R2a는 CH₂인 구조이고,

R3은 상기 R3b 내지 R3d로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 작용기인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제7항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물에서 상기 R3b 내지 R3d로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 작용기는,

R3b는 R9가 에톡시기, 메톡시기 및 R9a로 구성된 군에서 선택된 어느 하나;

R3c는 R11은 OH이고 R12는 OCH₃이며 R13은 CH₃; 또는

R3d는 R14가 OCH₃이고, R15 및 R16은 CH₃;인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제8항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은,

3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-4-히드록시-5-(2-페닐에틸아미노)시클로헥사-3,5-디엔-1,2-디온;

3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-2-히드록시-5-메톡시시클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온;

3-[[(1S,2R,4aR,8aR)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-5-에톡시-2-히드록시시클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온;

18-메톡시-22-메틸-16-[{(5S,8S,9R,10S)-5,8,9-트리메틸-4-메틸렌데카히드로나프탈렌-9-일}메틸]벤조[d]-옥사졸-17-올; 및

18-메톡시-22,22-디메틸-16-[{(5R,8S,9R,10S)-5,8,9-트리메틸-4-메틸렌데카히드로나프탈렌-9-일}메틸]벤조[d]-옥사졸-17(2H)-온;

로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 황반변성 또는 황반부종의 예방 또는 개선용 식품 조성물.

화학식 1

화학식 1에서,

점선은 단일결합 또는 이중결합을 나타내며

i) 3번 탄소와 4번 탄소의 결합 및 5번 탄소와 6번 탄소의 결합이 단일결합일 때, R2b는 존재하지 않고 R2a는 CH₂인 구조;

ii) 3번 탄소와 4번 탄소의 결합이 이중결합일 때, 5번 탄소와 6번 탄소의 결합은 단일결합이고, R2b는 존재하지 않고 R2a는 CH₃인 구조; 및

iii) 5번 탄소와 6번 탄소의 결합이 이중결합일 때, 3번 탄소와 4번 탄소의 결합은 단일결합일 때, R2a 및 R2b는 CH₃인 구조로 구성된 군에서 선택되는 하나의 구조이고,

R1은 H 또는 CH₃이며,

R3은 하기 R3a 내지 R3d로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 작용기이고,

상기 R3a는

i) R4 및 R7이 각각 OH 또는 OCH₃이고, R5, R6 및 R8은 H인 구조; 또는

ii) R5가 COOCH₃이고, R7은 H 또는 OH이며, R8은 OH이고, R4 및 R6은 H인 구조이며,

상기 R3b는

R9가 H, NH₂, C1~C8 알콕시기 및 하기 R9a 내지 R9j로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 작용기이고, R10은 H 또는 OH이고,

상기 R3c는

R11 및 R12는 각각 OH 또는 OAc이고, R13은 H인 구조; 또는

R11 및 R12는 각각 OH 또는 OCH₃이며 R13은 CH₃인 구조이며

상기 R3d는 R14가 OCH₃이고, R15 및 R16은 CH₃인 구조.
제10항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은

3번 탄소와 4번 탄소의 결합 및 5번 탄소와 6번 탄소의 결합이 단일결합일 때, R2b는 존재하지 않고 R2a는 CH₂인 구조이고,

R3은 상기 R3b 내지 R3d로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 작용기인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
제11항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물에서 상기 R3b 내지 R3d로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 작용기는,

R3b는 R9가 에톡시기, 메톡시기 및 R9a로 구성된 군에서 선택된 어느 하나;

R3c는 R11은 OH이고 R12는 OCH₃이며 R13은 CH₃; 또는

R3d는 R14가 OCH₃이고, R15 및 R16은 CH₃;인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.
제12항에 있어서, 상기 화학식 1의 화합물은,

3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-4-히드록시-5-(2-페닐에틸아미노)시클로헥사-3,5-디엔-1,2-디온;

3-[[(1R,2S,4aS,8aS)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-2-히드록시-5-메톡시시클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온;

3-[[(1S,2R,4aR,8aR)-1,2,4a-트리메틸-5-메틸리덴-3,4,6,7,8,8a-헥사히드로-2H-나프탈렌-1-일]메틸]-5-에톡시-2-히드록시시클로헥사-2,5-디엔-1,4-디온;

18-메톡시-22-메틸-16-[{(5S,8S,9R,10S)-5,8,9-트리메틸-4-메틸렌데카히드로나프탈렌-9-일}메틸]벤조[d]-옥사졸-17-올; 및

18-메톡시-22,22-디메틸-16-[{(5R,8S,9R,10S)-5,8,9-트리메틸-4-메틸렌데카히드로나프탈렌-9-일}메틸]벤조[d]-옥사졸-17(2H)-온;

로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는 식품 조성물.