WO2014027832A1 - 대장염 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

대장염 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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한명주
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    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]

Definitions

  • the present invention relates to a novel use of hair extract, and more particularly, to a composition for preventing or treating colitis comprising a hair extract, a fraction thereof or a compound separated therefrom.
  • the present invention relates to the use of preventing or treating colitis of the complex extract consisting of hair extract and other herbal extracts.
  • Colitis is an inflammation of the large intestine that is caused by a variety of causes. Tenesmus, bloating, lower abdominal pain and diarrhea are the main symptoms, and mucus, pus or blood mixes in feces. In some cases. Colitis can be largely divided into infectious colitis and non-infectious colitis depending on the cause, and can be divided into acute colitis and chronic colitis according to the onset period. Acute colitis includes amebaidism, bacterial dysentery, and pseudomembranous enteritis caused by Salmonella or antibiotics. Chronic colitis includes ulcerative colitis, Crohn's disease, tuberculosis, syphilis, and X-rays.
  • Colitis also includes irritable bowel syndrome (IBS) as well as Inflammatory bowel disease (IBD). Ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease (CD), the representative diseases of Inflammatory bowel disease (IBD), have yet to be identified, and abdominal pain, severe chronic diarrhea and bloodiness It can cause diarrhea, it is hard to cure, and it is characterized by repeated improvement and deterioration. Ulcerative colitis is a disease in which mucous membranes or ulcers form continuously on the mucous membrane of the colon. Bloody stools, mucosal stools, diarrhea and abdominal pain occur, and in severe cases, systemic symptoms such as fever, weight loss, and anemia appear. . Ulcerative colitis can also occur anywhere in the gastrointestinal tract.
  • Crohn's disease is a condition in which lesions such as ulcers are discontinuously occurring in any part of the digestive tract from the mouth to the anus. In addition to abdominal pain, diarrhea and bloody stools, in severe cases, fever, bleeding, weight loss, general malaise, and anemia Back symptoms appear. Ulcerative colitis and Crohn's disease differ in lesions and symptoms of inflammation, but because of similarities in many aspects, the distinction between the two diseases is often unclear.
  • salazosulpapyridine which is frequently used as an aminosalicylic acid preparation, has been reported to have side effects such as nausea, vomiting, anorexia, rash, headache, liver injury, white blood cell reduction, abnormal red blood cells, proteinuria, and diarrhea.
  • corticosteroids are generally used for oral administration of prednisolone, enemas, suppositories, and intravenous injections, but side effects such as femoral head necrosis due to gastric ulcer and long-term use are strong.
  • these drugs cannot be used continuously.
  • IBS Irritable bowel syndrome
  • Anemarrhena asphodeloides Bunge is a perennial herb of monocotyledonous genus Liliumaceae, and it is used as a medicinal herb or dried roots.
  • Herbal rhizome in oriental medicine is used as an antipyretic and is known to be effective for chronic bronchitis or diabetes.
  • Korean Patent Publication No. 10-0856335 discloses the prevention and treatment of respiratory diseases of compounds isolated from hair
  • Korean Patent Publication No. 10-0923953 describes the choline nervous system of hair extract. Damage improvement effect is disclosed
  • Korean Patent Publication No. 10-1075742 discloses a lipid metabolic disease prevention and treatment effect of the compound isolated from the hair.
  • the Galla Rhois is a worm family made by the Schlechtendalia chinensis Bell, a parasitic aphid on the leaves of Rhus javanica L .. In oriental medicine, the worms are removed and used as medicine. Convergence effect, antimicrobial action, antimicrobial action, hepatoprotective action, and antioxidant action have been reported as pharmacological action of the gall bladder, and Korean Patent Publication No. 10-0588470 discloses a cancer cell metastasis inhibiting effect of the gall bladder extract. , Republic of Korea Patent Publication No. 10-1078002 discloses the obesity prevention and treatment effect of the gall bladder extract.
  • Codonopsis lanceolata is a perennial vine plant belonging to the campanula, wild throughout Korea.
  • the enlarged roots of Deodeok are widely used for medicinal purposes, and are known to have medicinal effects such as expectorants.
  • Co Coptis
  • Co Coptis
  • Coptis is an evergreen perennial herb of the dicotyledonous plant of the genus Asteraceae
  • specific examples include Coptis teeta, Coptis japonica, Coptis chinensis, Coptis deltoidea, and Coptis omeiensis .
  • the root stem is taken and dried in the sun as a medicinal herb.Berberine, Copticin, Tooine, Palmintine, etc. are known as active ingredients. It has been reported to have anti-inflammatory, antipyretic, bile secretion and blood pressure lowering effects.
  • 10-2001-0085669 discloses a pharmaceutical composition for the prevention and treatment of drug addiction comprising the extract of the sulfur as an active ingredient
  • Republic of Korea Patent Publication No. 10- 2009-0029022 discloses a composition for the prevention and treatment of skin diseases caused by UV light as an active ingredient, the composition for treating pancreatic cancer comprising the extract of Cheonhwangyeon Korean Patent Publication No. 10-2013-0022733 The Republic of Korea Patent Publication No.
  • compositions for the prevention and treatment of respiratory diseases containing the extract of rhubarb as an active ingredient, in addition to the composition for periodontal disease, including the rhubarb extract, Composition for preventing and treating diabetic complications comprising, nerve cell protection and regeneration including the extract There is a hydrous product, etc. is disclosed.
  • the present invention has been derived under the conventional technical background, and an object of the present invention is to provide a use relating to the prevention or treatment of colitis such as hair extract.
  • Another object of the present invention is to provide a use for the prevention or treatment of colitis of the complex extract, including the hair extract, such as the gall bladder extract and deodeok extract.
  • Another object of the present invention is to provide a use for the prevention or treatment of colitis of the complex extract, including the extract of the hair and extracts such as yellow lotus.
  • the present inventors conducted a study to develop an extract having a prophylactic or therapeutic activity against colitis, targeting a large number of natural products that are safer than synthetic chemicals. As a result, the inventors have found that extracts, fractions thereof, or compounds isolated therefrom have excellent colitis prevention or therapeutic activity against colitis model animals. In addition, the present inventors have found that a complex extract consisting of a hair extract, a gall bladder extract, a deodeok extract, and the like has excellent colitis prevention or therapeutic activity against colitis model animals, and completed the present invention. In addition, the present inventors have found that the complex extract consisting of hair extract and rhubarb extract has excellent colitis prevention or therapeutic activity against colitis model animals, and completed the present invention.
  • One aspect of the present invention is an extract containing any one selected from the hair extract, alcohol soluble fraction having 3 to 8 carbon atoms of the hair extract, Mangiferin, Neomangiferin or thymosaponin A-III as an active ingredient.
  • a composition for preventing or treating colitis is provided.
  • Another aspect of the present invention is a hair extract, a soluble fraction of alcohol having 3 to 8 carbon atoms in the hair extract, Mangiferin, Neomangiferin (Neomangiferin) or thymosaponin A-III and any selected from gallnut extract, Soluble fractions for alcohols with 3 to 8 carbons in gall bladder extract or 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl- ⁇ -D-glucose (glucose1,2,3,4,6-penta- It provides a composition for preventing or treating colitis comprising any one selected from O-galloyl- ⁇ -D-glucose) as an active ingredient.
  • the present invention is any one selected from the extract, soluble fraction of alcohol having 3 to 8 carbon atoms in the hair extract, Mangiferin, Neomangiferin or Timothy saponin A-III and Deodeok extract, Deodeok It provides a composition for preventing or treating colitis comprising an soluble fraction of the alcohol having 3 to 8 carbon atoms in the extract or any one selected from lancemaside A as an active ingredient.
  • the present invention is any one selected from the hair extract, soluble fraction of alcohol having 3 to 8 carbon atoms in the hair extract, Mangiferin, Neomangiferin (Neomangiferin) or thymosaponin A-III; Gall bladder extract, soluble fraction of alcohol having 3 to 8 carbons in gall bladder extract or 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl- ⁇ -D-glucose (glucose1,2,3,4,6 -penta-O-galloyl- ⁇ -D-glucose); And it provides a composition for preventing or treating colitis, including any one selected from deodeok extract, soluble fraction for alcohol having 3 to 8 carbon atoms in the deodeok extract or lancemaside A (Lancemaside A).
  • Another aspect of the present invention is any one selected from the hair extract, soluble fraction of alcohol having 3 to 8 carbon atoms in the hair extract, Mangiferin, Neomangiferin or thymosaponin A-III; And it provides a composition for the prevention or treatment of colitis, including any one selected from the soluble fraction for alcohol having 3 to 8 carbon atoms in the extract or sulfur extract.
  • composition for preventing or treating colitis according to the present invention is preferably a pharmaceutical composition or a food composition.
  • Hair extract according to the present invention Complex extracts consisting of gummy extracts, gall bladder extract and the like; Alternatively, the complex extract consisting of hair extract, etc., and rhubarb extract may be used as a pharmaceutical composition for constituting the pharmaceutical composition or the functional food composition.
  • Such pharmaceutical compositions or functional food compositions can be used to prevent or treat acute colitis or chronic colitis, and in particular, effectively prevent inflammatory bowel disease (IBD) or irritable bowel syndrome (IBS). , Delay, ameliorate or treat.
  • IBD inflammatory bowel disease
  • IBS irritable bowel syndrome
  • Figure 1 shows the chemical structural formula of Mangiferin and Neomangiferin (Neomangiferin).
  • Figure 2 shows that the expression of inflammatory response markers is suppressed in the large intestine of the experimental animal group administered n-butanol soluble fraction of the hair extract obtained in Preparation Example 2 after acute colitis was induced by TNBS treatment.
  • "JM” in Figure 2 represents the n-butanol soluble fraction of the hair extract obtained in Preparation Example 2
  • "MEL” represents mesalazine (Mesalazine).
  • Figure 3 is a result showing that the expression of inflammatory response indicators in the colon of the experimental animal group administered manjiferin (mangiferin) after acute colitis induced by TNBS treatment.
  • manjiferin mangiferin
  • MEL mesalazine
  • LPS lipopolysaccharide
  • PG peptidolgycan
  • Figure 5 shows the chemistry of 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl- ⁇ -D-glucose (glucose1,2,3,4,6-penta-O-galloyl- ⁇ -D-glucose). The structural formula is shown.
  • FIG. 6 is a graph showing the weight change of model animals induced by acute colitis by TNBS when the extract-based sample was administered.
  • FIG. 7 is a graph showing the weight change of model animals induced by acute colitis by TNBS when a butanol soluble fraction-based sample was administered.
  • FIG. 9 is a result showing that the expression of the inflammatory response indicators in the colon of the experimental animal group administered a sample based on butanol soluble fraction after acute colitis caused by TNBS treatment.
  • FIG. 11 is a graph showing the weight change and colon appearance score of a model animal induced by acute colitis by TNBS when n-butanol soluble fraction of the hair extract obtained in Preparation Example 22 was used as a drug sample, and FIG. When the n-butanol soluble fraction of the hair extract obtained in Preparation Example 22 was used as a drug sample, colonic length and MPO activity measurement results of a model animal induced by acute colitis by TNBS are shown.
  • FIG. 13 shows the results of measurement of weight change, colorectal appearance score, colorectal length, and MPO activity of a model animal in which acute colitis was induced by TNBS when using mangiferin obtained in Preparation Example 23 as a drug sample. .
  • FIG. 14 is a graph showing the weight change and colon appearance score of a model animal in which acute colitis was induced by TNBS when a complex extract was used as a drug sample
  • FIG. 15 is acute by TNBS when a complex extract was used as a drug sample. It shows the results of measuring colon length and MPO activity of the model animals induced colitis.
  • Figure 16 shows the expression levels of IL-1 beta and IL-6 in colon tissues of a model animal induced by acute colitis by TNBS when using n-butanol soluble fraction of the hair extract obtained in Preparation Example 22 as a drug sample.
  • 17 is a graph showing TNF-alpha and IL-10 in colon tissues of a model animal induced by acute colitis by TNBS when n-butanol soluble fraction of the hair extract obtained in Preparation Example 22 was used as a drug sample. It is a graph showing the expression amount.
  • cytokine 18 is a proinflammatory cytokine and anti-inflammatory cytokine (anti-inflammatory cytokine) in the colon tissue of a model animal induced by acute colitis by TNBS when using the mangiferin obtained in Preparation Example 23 as a drug sample (anti -inflammatory cytokine) is a graph showing the amount of expression.
  • FIG. 19 is a graph showing the expression levels of IL-1 beta and IL-6 in colon tissues of a model animal induced by acute colitis by TNBS when a complex extract was used as a drug sample
  • FIG. 20 is a complex extract as a drug sample. Is a graph showing the expression levels of TNF-alpha and IL-10 in colon tissues of a model animal induced by acute colitis caused by TNBS.
  • 21 is a result showing that the expression of the inflammatory response markers in the colon tissue of the model animal when the composite extract is administered to the model animal induced by acute colitis induced by TNBS.
  • FIG. 22 is a graph showing the weight change and colon appearance score of a model animal induced by acute colitis by DSS when using a complex extract as a drug sample
  • FIG. 23 is acute by DSS when using a complex extract as a drug sample. It shows the results of measuring colon length and MPO activity of the model animals induced colitis.
  • FIG. 24 is a graph showing the expression levels of IL-1 beta and IL-10 in colon tissues of a model animal induced by acute colitis when DSS is used as a drug sample
  • FIG. 25 is a compound extract as a drug sample. Is a graph showing the expression levels of TNF-alpha and IL-6 in colon tissues of a model animal induced by acute colitis caused by DSS.
  • Figure 26 shows that the expression of the inflammatory response markers in the colon tissue of the model animal when the composite extract is administered to the model animal induced by acute colitis induced by DSS.
  • Figure 27 is a graph showing the weight change and colon appearance score of model animals induced by chronic colitis caused by oxazolone when using a composite extract as a drug sample
  • Figure 28 is a graph showing the oxazolone when using a complex extract as a drug sample It shows the results of measuring colon length and MPO activity of model animals induced by chronic colitis.
  • FIG. 29 is a graph showing the expression levels of IL-1 beta and IL-10 in colon tissues of model animals induced with chronic colitis caused by oxazolone when a complex extract was used as a drug sample
  • FIG. 30 is a complex as a drug sample. It is a graph showing the expression levels of TNF-alpha and IL-6 in colon tissues of model animals in which chronic colitis was induced by oxazolone when the extract was used.
  • 31 is a result showing that the expression of the inflammatory response indicators in the colon tissue of the model animal when the complex extract is administered to the model animal induced chronic colitis induced by oxazolone.
  • FIG. 32 is a graph showing the weight change and colon appearance score of the model animal induced by chronic colitis caused by DSS when using the complex extract as a drug sample
  • Figure 33 is chronic by DSS when using the complex extract as a drug sample It shows the results of measuring colon length and MPO activity of the model animals induced colitis.
  • FIG. 34 is a graph showing the expression levels of IL-1 beta and IL-10 in colon tissues of model animals induced by chronic colitis when DSS is used as a drug sample
  • FIG. 35 is a compound sample as a drug sample. Is a graph showing the expression levels of TNF-alpha and IL-6 in colon tissues of model animals induced by chronic colitis by DSS.
  • FIG. 36 shows that expression of an inflammatory response marker in the colon tissue of a model animal is suppressed when the complex extract is administered to the model animal induced by chronic colitis by DSS.
  • Figure 37 shows the chemical structural formula of Timothy saponin A-III.
  • FIG. 38 is a graph showing the weight change of a model animal induced by acute colitis caused by TNBS when using thymosaponin A-III in Preparation Example 34
  • Figure 39 is a thymosaponin A in Preparation Example 34 as a drug sample
  • -III is used, it is a graph showing the appearance scores of colons extracted from model animals in which acute colitis was induced by TNBS.
  • FIG. 40 shows the colon length of a model animal induced by acute colitis by TNBS when thymosaponin A-III was used in Preparation Example 34
  • FIG. 41 is a thymosaponin A- in Preparation Example 34 as a drug sample. The results of measurement of MPO activity of colon collected from model animals in which acute colitis was induced by TNBS when III was used are shown.
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the progression of a particular disease by administration of a composition of the present invention.
  • treatment refers to any improvement action that improves or beneficially alters the symptoms of a particular disease by administration of a composition of the present invention.
  • the term "administration" means providing a subject with a composition of the present invention in any suitable manner.
  • the subject refers to all animals, such as humans, monkeys, dogs, goats, pigs or mice having a disease that can improve the symptoms of a particular disease by administering the composition of the present invention.
  • colitis refers to a condition in which the intestine is inflamed due to bacterial infection or pathological fermentation of intestinal contents, and is a concept including infective colitis and non-infectious colitis.
  • Specific types of colitis that can be prevented or treated through the complex extract according to the present invention include inflammatory bowel disease or irritable colitis syndrome, but are not limited thereto.
  • Inflammatory bowel disease includes, for example, ulcerative colitis, or Crohn's disease.
  • colitis that can be prevented or treated through the complex extract according to the present invention includes both acute colitis and chronic colitis.
  • Acute colitis is inflammation of the colon or colon that comes acutely, and the inflammation causes mucous membranes to show mucous diarrhea or bloodiness.
  • acute colitis includes not only acute infectious colitis but also acute gastric colitis and acute ulcerative colitis.
  • the composition for preventing or treating colitis is selected from the hair extract, alcohol soluble fraction having 3 to 8 carbon atoms of the hair extract, mangiferin, neomangiferin or thymosaponin A-III It includes any one (hereinafter referred to as "hair extract", etc.) as an active ingredient.
  • the hair extract extract improves the appearance of the colon and suppresses the contraction of the colon in the animal model of colitis caused by 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS), and myeloper It is possible to effectively prevent or treat colitis by keeping oxidase (Myeloperoxidase (MPO) activity low.
  • the hair extract may be extracted from various organs or parts of the hair, for example, leaves, flowers, roots, stems, rhizomes, fruits, seeds, and the like, and may be preferably extracted from the rhizomes.
  • hair extract may be prepared using conventional extraction methods known in the art, for example solvent extraction.
  • the extraction solvents used in the solvent extraction method are water, lower alcohols having 1 to 4 carbon atoms (e.g., methanol, ethanol, propanol and butanol) or hydrous lower alcohols, propylene glycol, 1,3-butylene glycol , Glycerine, acetone, diethyl ether, ethyl acetate, butyl acetate, dichloromethane, chloroform, hexane and mixtures thereof, preferably selected from double water, alcohols or mixtures thereof.
  • the water is preferably hot water.
  • the alcohol when used as the extraction solvent, the alcohol is preferably a lower alcohol having 1 to 4 carbon atoms, and the lower alcohol is more preferably selected from methanol or ethanol.
  • alcohol content when using hydrous alcohol as an extraction solvent, it is preferable that alcohol content is 50 to 90%, and it is more preferable that it is 60 to 80%.
  • the extract of Jimo in the present invention can be obtained in addition to the above-described extraction solvent, extracts having substantially the same effect using other extraction solvents.
  • the hair extract in the present invention includes not only the extract by the above-mentioned extraction solvent, but also extracts obtained through other conventional extraction methods, to extracts obtained through purification and fermentation.
  • decompression by carbon dioxide extraction by supercritical extraction by high temperature, extraction by ultrasonic extraction, separation using ultrafiltration membranes with constant molecular weight cut-off values, various chromatography (size, charge, hydrophobicity or affinity)
  • the active fraction obtained by various purification and extraction methods additionally carried out, such as by the separation by the sex) or by fermentation products using natural or various microorganisms, is also included in the extract of the present invention.
  • the decompression by carbon dioxide and the supercritical extraction by high temperature mean supercritical fluid extraction.
  • supercritical fluid is a liquid having a gas when it reaches a critical point under high temperature and high pressure.
  • the supercritical carbon dioxide containing a small amount of cosolvent is passed through the sample remaining in the extraction container to extract components that were not extracted with pure supercritical carbon dioxide alone.
  • the supercritical fluid used in the supercritical extraction method of the present invention can effectively extract the active ingredient by using a supercritical carbon dioxide or a mixed fluid in which a co-solvent is added to carbon dioxide.
  • the cosolvent may be used one or a mixture of two or more selected from the group consisting of chloroform, ethanol, methanol, water, ethyl acetate, hexane and diethyl ether. Most of the extracted samples contain carbon dioxide.
  • the extract obtained by the above method may be used as a cosmetic composition, and the cosolvent may be removed by a reduced pressure evaporator.
  • the ultrasonic extraction method is an extraction method using the energy generated by the ultrasonic vibration, the ultrasonic wave can destroy the insoluble solvent contained in the sample in the water-soluble solvent, due to the high local temperature is generated Since the kinetic energy of the reactant particles is increased, sufficient energy required for the reaction is obtained, and the extraction efficiency is increased by inducing high pressure by the impact effect of ultrasonic energy to increase the mixing effect of the substance and the solvent contained in the sample.
  • the extraction solvent that can be used in the ultrasonic extraction method may be used one or a mixture of two or more selected from the group consisting of chloroform, ethanol, methanol, water, ethyl acetate, hexane and diethyl ether.
  • the extracted sample is vacuum filtered to recover the filtrate, and then removed by a vacuum evaporator, the extract can be obtained through a conventional extract preparation method of freeze drying.
  • the hair extract according to the present invention also includes a fermented extract, the fermented extract of hair can be prepared as follows.
  • the culture temperature is incubated in the normal microbial culture conditions of 30 ⁇ 37 °C.
  • the pH is 5 to 7 incubated for about 5 to 10 days in aerobic or usually anaerobic conditions. It can then be obtained through aging and filtration.
  • the alcohol soluble fraction of the hair extract in the present invention can be obtained from the hair extract.
  • the alcohol used to obtain the alcohol-soluble fraction of the hair extract is 3 to 8 carbon atoms, and considering the solubility of the active material of the hair extract and concentration under reduced pressure after solubilization, it is preferable that the carbon number is 3 to 6 It is more preferable that carbon number is 3-5, and it is most preferable that carbon number is 4.
  • the alcohol having 4 carbon atoms used for solubilization of the hair extract in the present invention includes n-butanol, sec-butanol, isobutanol, tert-butanol, and the like.
  • the alcohol-soluble fraction of the hair extract is composed of components that can be soluble in alcohol having 3 to 8 carbon atoms among the components included in the hair extract, in which case the hair extract is water, alcohol having 1 to 2 carbon atoms or It is preferable to extract with these mixed solvents.
  • the alcohol soluble fraction of the hair extract is obtained by, for example, water, alcohol having 1 to 2 carbon atoms or a mixture thereof as an extraction solvent to obtain the hair extract, and then suspended by adding water thereto, and then having 3 to 8 carbon atoms.
  • Alcohol can be obtained by addition and fractionation, for example butanol.
  • the hair extract or alcohol soluble fraction thereof includes mangiferin or neomangiferin as an active substance.
  • Mangiferin or Neomangiferin in the present invention can be used as an active ingredient of the composition for preventing or treating colitis in place of the alcohol soluble fraction of the hair extract or hair extract.
  • the active material included in the extract or alcohol soluble fraction thereof may cause slight differences in the type or content of specific components depending on the extraction method or the fractionation method.
  • thymosaponin A-III can also be separated from the hair.
  • thymosaponin A-III comprises the steps of: (i) extracting gimo with alcohol, water, or a mixed solvent of alcohol and water, most preferably 70% ethanol and concentrating under reduced pressure; (ii) resuspending the resulting extract in water and fractionating with methylene chloride to obtain a water fraction; (iii) fractionating the obtained water fraction with butanol to obtain a butanol fraction; (iv) concentrating the obtained butanol fraction under reduced pressure and inducing recrystallization in methanol, and washing the resulting precipitate with methanol to obtain a methanol insoluble fraction and a methanol soluble fraction; And (v) column chromatography of the obtained methanol soluble fraction to obtain a fraction containing thymosaponin A-IIII as a main component.
  • step (v) column chromatography is preferably carried out on a silica gel column using a mixed solvent of methylene chloride, methanol and water.
  • the mixed solvent is preferably methylene chloride: methanol: water 7: 1: 0.5-7: 3: 1.
  • the composition for preventing or treating colitis is a hair extract, a soluble fraction of alcohol having 3 to 8 carbon atoms in the hair extract, mangiferin, neomangiferin or thymosaponin A-III Any one selected from (hereinafter referred to as "hair extract”, etc.) and gall bladder extract, soluble fraction of alcohol having 3 to 8 carbon atoms in gall bladder extract or 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl - ⁇ -D-glucose (glucose1,2,3,4,6-penta-O-galloyl- ⁇ -D-glucose) any one selected from the following (hereinafter referred to as "galm extract", etc.) as an active ingredient do.
  • composition for preventing or treating colitis is a hair extract, a soluble fraction of alcohol having 3 to 8 carbon atoms in the hair extract, mangiferin, Neomangiferin (Neomangiferin) or timosaponin A
  • hair extract Any one selected from -III (hereinafter referred to as "hair extract”, etc.) and any one selected from deodeok extract, soluble fraction of alcohol having 3 to 8 carbon atoms in deodeok extract or lancemaside A , Denoted as "deodeok extract,” and the like as an active ingredient.
  • composition for preventing or treating colitis is a hair extract, a soluble fraction of alcohol having 3 to 8 carbon atoms in the hair extract, mangiferin, Neomangiferin (Neomangiferin) or timosaponin A Any one selected from -III (hereinafter referred to as "hair extract etc.”);
  • Gall bladder extract soluble fraction of alcohol having 3 to 8 carbons in gall bladder extract or 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl- ⁇ -D-glucose (glucose1,2,3,4,6 any one selected from -penta-O-galloyl- ⁇ -D-glucose (hereinafter, referred to as "galm extract", etc.);
  • deodeok extract soluble fraction for alcohol having 3 to 8 carbon in the deodeok extract or any one selected from the lancemaside A (hereinafter referred to as "deodeok extract, etc.") as an active ingredient.
  • the composition for preventing or treating colitis is made up of extracts of at least two herbal drugs, such as hair extracts and gall extracts or hair extracts and etc.
  • the composite extract is included as an active ingredient, wherein the mixing ratio of the hair extract, such as the hair extract, the gall bladder extract and the deodeok extract, which constitutes the complex extract, is not greatly limited.
  • the complex extract consisting of three herbal extracts may be composed of 10 to 40% by weight, such as jimo extract, 20 to 80% by weight such as a gall bladder extract and 10 to 40% by weight, such as deodeok extract, based on the total weight of the complex extract. have.
  • the weight ratio of the hair extract, such as the gall bladder extract and the deodeok extract is preferably 1: 8: 1 to 4: 2: 4, and from 2: 6: 2 to It is more preferable that it is 3: 4: 3.
  • the composition for preventing or treating colitis according to another embodiment of the present invention may include a complex extract of various combinations as an active ingredient.
  • the composition for preventing or treating colitis includes a gall bladder extract, a balsam extract, and a deodeok extract as an active ingredient, or includes an alcohol-soluble fraction of the gall bladder extract, balm extract and deodeok extract, or Extracts, including alcohol soluble fractions and deodex extracts of hair extracts, or including blast extracts, alcohol soluble fractions of hair extracts, and alcohol soluble fractions of hair extracts, or comprising alcohol soluble fractions of hair extracts, hair extracts and deodex extracts , Alcohol soluble fractions of the gall bladder extract, alcohol soluble fractions of the hair extract and deodex extract, or include alcohol soluble fractions of the gall bladder extract, alcohol soluble fractions of the gummy extract, and alcohol of the gall extract A soluble fraction, an alcohol soluble fraction of a chymo extract and an alcohol soluble fraction of a deodex extract, or a manziperin (or neomanziferin), 1,2,3,
  • composition for preventing or treating colitis according to another embodiment of the present invention improves the appearance of colon in an animal model of colitis caused by 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS). It suppresses contraction of the colon and keeps myeloperoxidase (MPO) activity low to effectively prevent or treat colitis.
  • TNBS 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid
  • MPO myeloperoxidase
  • the composition for preventing or treating colitis according to another embodiment of the present invention is synergistic action such as hair extract and gall bladder extract, synergistic action such as hair extract and deodex extract, or hair extract, such as gall extract, germ extract and the like
  • the synergistic effect of colitis is superior to the case of including only extracts as an active ingredient to prevent or treat colitis.
  • Complex extract of the active ingredient of the composition for preventing or treating colitis can be prepared by various methods.
  • a complex extract consisting of three herbal extracts may be prepared by mixing five gall, gilt, and deodeok, adding an extraction solvent thereto, extracting a mixed extract, and again, an alcohol having 3 to 8 carbons in the mixed extract. It can also be prepared by adding fractions.
  • the complex extract consisting of the extracts of the three herbal medicines may be prepared by mixing them after the five gall extract, hair extract and deodeok extract from the gall bladder, hair and deodeok, respectively, or again from the gall bladder extract, hair extract and deodeok extract
  • the alcohol soluble fraction of the extract, the alcohol soluble fraction of the Jimmy extract and the alcohol soluble fraction of the deodeok extract may be obtained and then mixed. Since the manufacturing method of the gall bladder extract or deodeok extract is the same as or similar to the preparation method of the above-mentioned hair extract, a detailed description thereof will be omitted.
  • the alcohol soluble fraction of the gall extract, the alcohol soluble fraction of the hair extract or the alcohol soluble fraction of the deodeok extract constituting the complex extract which is an active ingredient of the composition for preventing or treating colitis according to another embodiment of the present invention, respectively, the gall extract It can be obtained from an extract or a deodeok extract.
  • the alcohol used to obtain the soluble fraction has a carbon number of 3 to 8, the carbon number of 3 to 6 in consideration of the solubility and solubilization of the active material of the gall extract, hair extract or deodeok extract and solubilization under reduced pressure. It is preferable, it is more preferable that carbon number is 3-5, and it is most preferable that carbon number is 4.
  • the alcohol having 4 carbon atoms used for the solubilization of the gall bladder extract, hair extract or deodeok extract includes n-butanol, sec-butanol, isobutanol, tert-butanol and the like.
  • Alcohol soluble fraction of the gall bladder extract used as an active ingredient of the composition for preventing or treating colitis is included in the gall bladder extract, hair extract or deodeok extract Of these components, which may be soluble in alcohols having 3 to 8 carbon atoms, in which case the gall bladder extract, hair extract or deodeok extract is extracted with water, alcohol having 1 to 2 carbon atoms or a mixed solvent thereof. desirable.
  • the alcohol soluble fraction of the gall bladder extract, the alcohol soluble fraction of the hair extract, or the alcohol soluble fraction of the deodeok extract may be, for example, water, gall bladder extract, hair extract, using an alcohol having 1 to 2 carbon atoms or a mixture thereof as an extractant.
  • a deodeok extract may be obtained and suspended by adding water thereto, followed by addition and fractionation of an alcohol having 3 to 8 carbon atoms (for example, butanol).
  • the gall bladder extract or alcohol soluble fraction thereof in the present invention is 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl- ⁇ -D-glucose as an active substance (glucose1,2,3,4,6-penta). -O-galloyl- ⁇ -D-glucose).
  • the hair extract or alcohol soluble fraction thereof includes mangiferin or neomangiferin as an active substance.
  • the deodeok extract or alcohol soluble fraction thereof includes Lancemaside A as an active substance.
  • the active substance contained in the gall bladder extract or alcohol soluble fraction thereof, gimo extract or alcohol soluble fraction thereof and deodeok extract or alcohol soluble fraction thereof has a slight difference in the kind or content of specific components depending on the extraction method or fractionation method. May occur.
  • the composition for preventing or treating colitis is a hair extract, a soluble fraction of alcohol having 3 to 8 carbon atoms in the hair extract, Mangiferin, Neomangiferin (Neomangiferin) or Timosaponin A- Any one selected from III (hereinafter referred to as "hair extract”, etc.); And any one selected from the soluble fractions for alcohols having 3 to 8 carbon atoms in the sulfur extract or the sulfur extract, (hereinafter, referred to as "yellow extract”, etc.) as an active ingredient.
  • the composition for preventing or treating colitis includes a complex extract consisting of extracts of at least two herbal drugs, such as a balm extract and a rhododendron extract, as an active ingredient, wherein the balm extract constituting the complex extract, etc.
  • the mixing ratio of the yellow lotus extract and the like is not particularly limited.
  • the complex extract may be composed of 10 to 90% by weight, such as the hair extract and 10 to 90% by weight, such as the extract of the rye or the extract of the rye based on the total weight of the complex extract.
  • the weight ratio of the hair extract and the like of the rye extract in the complex extract is preferably 9: 1 to 1: 9, more preferably 2: 8 to 8: 2.
  • composition for preventing or treating colitis according to another preferred embodiment of the present invention may include a complex extract of various combinations as an active ingredient.
  • the composition for preventing or treating colitis according to another preferred embodiment of the present invention includes a hair extract and a rhubarb extract as an active ingredient, an alcohol soluble fraction of the hair extract and a rhubarb extract, or an alcohol soluble fraction of the hair extract.
  • a rhubarb extract or an alcohol soluble extract of a chymo extract and an alcohol soluble fraction of a rhubarb extract, or include manziperin (or neomanziferrin) and a rhubarb extract, or a manziperin (or neomanziferin) and a rhubarb extract It may include an alcohol soluble fraction of.
  • Composition for preventing or treating colitis is a model animal, sodium dextran sulfate induced acute colitis by 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) Model animal induced acute colitis caused by dextran sulfate sodium (DSS), model animal induced chronic colitis caused by oxazolone, model animal induced chronic colitis by dextran sulfate sodium (DSS) Good colon appearance and inhibit the contraction of the colon, and myeloperoxidase (Myeloperoxidase (MPO)) to maintain a low activity can effectively prevent or treat colitis.
  • TNBS 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid
  • DSS dextran sulfate sodium
  • DSS model animal induced chronic colitis caused by oxazolone
  • DSS dextran sulfate sodium
  • MPO myeloperoxidase
  • composition for preventing or treating colitis is effective in the case of including only the extract of the hair as an active ingredient or the extract of the hair, such as gall bladder extract, and Deodeok extract by the synergistic action of the extract such as hair extract and rhubarb extract.
  • the extract of the hair such as gall bladder extract, and Deodeok extract by the synergistic action of the extract such as hair extract and rhubarb extract.
  • it shows an excellent effect of preventing or treating colitis.
  • Complex extract which is an active ingredient of the composition for preventing or treating colitis may be prepared by various methods.
  • the complex extract may be prepared by adding the extraction solvent and extracting the mixed extract after mixing the hair and the yellow lotus, or may be prepared by adding and fractionating an alcohol having 3 to 8 carbon atoms to the mixed extract.
  • the complex extract may be prepared by obtaining a hair extract and a rhubarb extract, respectively, from the hair and the rhubarb, and then mixing them, or again obtaining an alcohol-soluble fraction of the hair extract and an alcohol-soluble fraction of the rye extract from the hair extract and the rhubarb extract. You may mix and manufacture these.
  • the manufacturing method of the sulfur extract is the same as or similar to the preparation method of the above-mentioned hair extract, a detailed description thereof will be omitted.
  • the type is not limited if the corresponding to the genus Nasturtium ( Coptis ), for example Coptis teeta, Coptis japonica, Coptis chinensis, Coptis deltoidea, Coptis omeiensis, etc. There is this.
  • the yellow lotus is preferably Coptis chinensis in consideration of the amount and composition ratio of the active ingredient having a prophylactic or therapeutic effect of colitis contained in the root stem.
  • the alcohol soluble fraction of the hair extract and the alcohol soluble fraction of the rhubarb extract which constitute the complex extract of the composition for preventing or treating colitis according to another preferred embodiment of the present invention, are obtained from the hair extract and the rye extract, respectively.
  • the alcohol used to obtain the soluble fraction has a carbon number of 3 to 8, preferably considering the solubility of the active extract of the hair extract or the rhubarb extract and concentration step under reduced pressure after solubilization, etc., It is more preferable that carbon number is 3-5, and it is most preferable that carbon number is 4.
  • the alcohol having 4 carbon atoms used for solubilization of the hair extract or the rhubarb extract in the present invention includes n-butanol, sec-butanol, isobutanol, tert-butanol, and the like.
  • Alcohol-soluble fraction of the hair extract or alcohol-soluble fraction of the rhubarb extract used as an active ingredient of the composition for preventing or treating colitis according to another preferred embodiment of the present invention has a carbon number of 3 to 8 Consisting of the components that can be soluble in phosphorus alcohol, in this case, the hair extract or rhubarb extract is preferably extracted with water, alcohol having 1 to 2 carbon atoms or a mixed solvent thereof.
  • the alcohol soluble fraction of the hair extract or the alcohol soluble fraction of the rhubarb extract is obtained using, for example, water, an alcohol having 1 to 2 carbon atoms or a mixture thereof as an extractant to obtain a hair extract or a rhubarb extract, which is then suspended by adding water. After the addition, alcohol having 3 to 8 carbon atoms (for example, butanol) can be added and fractionated.
  • the hair extract or alcohol soluble fraction thereof includes mangiferin or neomangiferin as an active substance.
  • the sulfur extract or the alcohol soluble fraction thereof includes berberine as an active substance.
  • the rhubarb extract or an alcohol soluble fraction thereof may further include palmin, coctisin, columbine or jathrorizine as the active substance.
  • the active material included in the extract or alcohol soluble fraction thereof and the rhubarb extract or the alcohol soluble fraction thereof may cause slight differences in the type or content of specific components depending on the extraction method or fractionation method.
  • composition for preventing or treating colitis according to the present invention may be embodied as a pharmaceutical composition, a food composition (particularly a functional food), a feed additive, etc. according to the purpose or aspect of use, and the extract-based active ingredient content in the composition is also a composition. It can be adjusted in various ranges according to the specific form, purpose of use, and aspect.
  • the active ingredient content based on the extract in the pharmaceutical composition of the present invention is 0.1 to 99% by weight, preferably 0.5 to 50% by weight, more preferably 1 to 30% by weight, based on the total weight of the composition, but is not limited thereto.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include additives such as pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents in addition to the extract-based active ingredient.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical compositions of the invention include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • composition for preventing or treating colitis may further contain at least one known active ingredient having an effect of preventing or treating colitis in addition to the extract-based component.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be formulated into a formulation for oral administration or a parenteral administration by a conventional method, and when formulated, such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, etc. Diluents or excipients may be used.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, or the like based on the extract-based component.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, and syrups, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents, water and liquid paraffin. have.
  • Formulations for parenteral administration may include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • it may be preferably formulated according to each disease or component by an appropriate method in the art or using a method disclosed in Remington's Pharmaceutical Science (Recent Edition), Mack Publishing Company, Easton PA.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered orally or parenterally to mammals including humans according to a desired method, and parenteral administration methods include external skin, intraperitoneal injection, rectal injection, subcutaneous injection, intravenous injection, muscle Intra-injection or intrathoracic injection;
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention varies depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, administration method, excretion rate and severity of the patient.
  • Conventional daily dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is not largely limited, for example, it is preferably 0.1 to 1000 mg / kg, and 1 to 500 mg / kg based on the extract-based active ingredient More preferably, it may be administered once or several times a day.
  • the food composition of the present invention includes the form of pills, powders, granules, acupuncture, tablets, capsules, or liquids, and examples of specific foods include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionary, pizza, ramen, Other noodles, gums, dairy products, including ice cream, various soups, beverages, tea, functional water, drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes, and includes all of the health food in the usual sense.
  • the active ingredient content of the extract-based in the food composition of the present invention is 0.01 to 50% by weight, preferably 0.1 to 25% by weight, more preferably 0.5 to 10% by weight based on the total weight of the composition, but is not limited thereto. .
  • the food composition of the present invention may contain various flavors or natural carbohydrates as additional ingredients in addition to the extract-based active ingredient.
  • the food composition of the present invention is a variety of nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH regulators, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols And carbonation agents used in carbonated beverages.
  • the food composition of the present invention may contain a flesh for preparing natural fruit juice, fruit juice beverage and vegetable beverage. These components can be used independently or in combination.
  • the above-mentioned natural carbohydrates are glucose, monosaccharides such as fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, and polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, sugar alcohols such as xylitol, sorbitol and erythritol.
  • natural flavoring agents such as taumartin, stevia extract, synthetic flavoring agents such as saccharin, aspartame, etc. may be used.
  • Feed additive of the present invention is, for example, 0.1 to 20% by weight of the extract-based component, 0.001 to 0.01% by weight of lipase, 1 to 20% by weight of tricalcium phosphate, 0.01 to 0.1% by weight of vitamin E, enzyme powder 1 to 10% by weight, lactic acid bacteria 0.1 to 10% by weight, Bacillus ( Bacillus ) culture medium may be composed of 0.01 to 10% by weight and glucose 20 to 90% by weight, but is not particularly limited thereto.
  • the effective amount means the amount that can prevent or treat colitis by steadily ingesting poultry, livestock, and the like.
  • the amount of the extract-based component is preferably an amount that does not cause adverse effects beyond the benefits of the addition.
  • the feed additive may additionally contain a carrier that is acceptable to poultry and livestock.
  • the feed additive of the present invention may further include various nutrients such as vitamins, amino acids and minerals, antioxidants, antibiotics, antibacterial agents and other additives, if necessary, and the powder, granules, pellets, suspensions, etc. It may be in a suitable state such as. Feed additives of the present invention can be supplied alone or mixed in the feed for poultry and livestock.
  • n-butanol soluble fraction After 189 g of the hair extract obtained in Preparation Example 1 was suspended in 1.5 L of water, 1.5 L of n-butanol was added thereto, and the mixture was left to shake to separate an n-butanol soluble fraction layer and a water soluble fraction layer. The n-butanol soluble fraction layer was taken and concentrated under reduced pressure to give 41 g of n-butanol soluble fraction. The yield of n-butanol soluble fraction was 8.2% or more based on the hair, and the content of Mangiferin contained in the n-butanol soluble fraction was 10% or more.
  • Figure 1 shows the chemical structural formula of Mangiferin and Neomangiferin (Neomangiferin). The yields of Mangiferin and Neomangiferin were at least 0.5% and at least 0.1%, respectively, based on the hair mass.
  • mice Four-week-old ICR male mice (24-27 g) were purchased from Orient Bio. All mice were bred under controlled environmental conditions of 50 ⁇ 10% humidity and 25 ⁇ 2 ° C, and lighting was repeated for 12 hours and then turned off for 12 hours. Feed was used as standard experimental feed (Samyang, Korea) and drinking water was freely consumed. In all experiments, one group had 6 animals.
  • TNBS 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid
  • the experimental animal was lightly anesthetized with ether, and 2.5 g of NBS (2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid) solution was mixed with 50% ethanol. Inflammation was induced by injecting 0.1 ml inward and holding it vertically for 30 seconds. In contrast, the normal group was orally administered with 0.1 ml of saline solution.
  • the extracted colon was observed by observing its length and appearance and scored according to the criteria of Table 1 (Hollenbach et al., 2005 criteria for colitis degree). At this time, a mesalazine (Sigma) administration group was used as a positive control. In addition, a portion of the colon contents were taken for intestinal microbial analysis and stored frozen at minus 80 °C. Colon tissues were removed from the colon contents, washed in physiological saline, and some were fixed with 4% formaldehyde fixative for use as pathological samples. The rest were frozen and stored at -80 ° C for molecular biology analysis.
  • Table 1 Appearance score standard 0 No ulcers and inflammations found One Congestion without bleeding is found 2 Ulcers with congestion found 3 Ulcers and inflammations only found in one place 4 Ulcers and inflammations found in more than one place 5 Ulcers that extend beyond 2 cm
  • the plate was inverted and emptied, and each well was washed with 200 ⁇ l of washing buffer.
  • the washing process was repeated three times using 200 ⁇ l of wash buffer, and then 100 ⁇ l of diluted streptavidin-peroxidase conjugate was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • the plate was inverted and emptied, and each well was washed with 200 ⁇ l of washing buffer.
  • the washing process was repeated three times using 200 ⁇ l of wash buffer, and then 100 ⁇ l of TMB substrate solution was added and the plate was wrapped in aluminum foil to block light and allowed to react at room temperature for 30 minutes.
  • the reaction was stopped by adding 100 ⁇ l of a stop solution and the absorbance was measured at 450 nm using an ELISA reader.
  • Table 2 and Table 3 show the results of the appearance analysis and myeloperoxidase (MPO) activity of the large intestine.
  • hair extract is obtained in Preparation Example 1
  • hair fraction represents the n-butanol soluble fraction of the hair extract obtained in Preparation Example 2.
  • the hair extract, fractions thereof, and specific compounds isolated therefrom all exhibited excellent prophylactic or therapeutic effects against colitis.
  • hair extract is obtained in Preparation Example 1
  • hair fraction refers to the n-butanol soluble fraction of the hair extract obtained in Preparation Example 2.
  • TNBS Treatment and Oral Sample Information Sample dose (mg / kg) IL-1 beta concentration (pg / mg) IL-6 concentration (pg / mg) TNF-alpha concentration (pg / mg) Normal group 2 - 17.4 ⁇ 2.1 0.9 ⁇ 0.6 20.1 ⁇ 8.9 TNBS treatment group 2 - 161.0 ⁇ 17.0 18.9 ⁇ 3.2 192.2 ⁇ 42.6 TNBS treatment + mangiferin administration group 10 57.4 ⁇ 2.1 5.0 ⁇ 0.6 83.8 ⁇ 10.9 TNBS treatment + mangiferin administration group 20 28.1 ⁇ 12.1 2.2 ⁇ 0.8 40.8 ⁇ 10.9 TNBS treatment + neomangiferin administration group 10 62.2 ⁇ 5.1 6.9 ⁇ 1.2 93.6 ⁇ 9.2 TNBS treatment + mesalazine administration group 2 10 31.1 ⁇ 2.9 2.9 ⁇ 1.2 52.9 ⁇ 5.7
  • 0.3 g of colon tissue of the test animal was homogenized by adding 1 ml of RIPA buffer (Gibco) containing a protease inhibitor cocktail. Subsequently, the supernatant obtained by centrifugation for 15 minutes at 4 ° C. and 13000 rpm was stored at -80 ° C., while COX-2, iNOS, p65 (NF-kappa B), pp65 (phosphor-NF-kappa B) and ⁇ The expression level of -actin was measured by Western blotting method. First, 50 ⁇ g of the supernatant was electrophoresed for 1 hour and 30 minutes in SDS 10% (w / v) polyacrylamide gel.
  • the electrophoretic sample was transferred to nitrocellulose paper for 1 hour and 10 minutes at 100 V and 400 kPa.
  • the sample was blocked with 5% skim milk for 30 minutes after transferring the transferred nitrocellulose paper, and washed with PBS-Tween three times for 5 minutes and the primary antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA) at a ratio of 1: 100.
  • the reaction was overnight. Thereafter, the mixture was washed three times for 10 minutes, and reacted with a secondary antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA) at a ratio of 1: 1000 for 1 hour and 20 minutes. Thereafter, the mixture was washed three times for 15 minutes, and developed after fluorescence.
  • Figure 2 shows that the expression of inflammatory response markers is suppressed in the large intestine of the experimental animal group administered n-butanol soluble fraction of the hair extract obtained in Preparation Example 2 after acute colitis was induced by TNBS treatment.
  • "JM” in Figure 2 represents the n-butanol soluble fraction of the hair extract obtained in Preparation Example 2
  • "MEL” represents mesalazine (Mesalazine).
  • Figure 3 is a result showing that the expression of inflammatory response indicators in the colon of the experimental animal group administered manjiferin (mangiferin) after acute colitis induced by TNBS treatment.
  • "MF" represents mangiferin
  • MEL represents mesalazine.
  • COX-2, iNOS, p65 (NF-kappaB) and pp65 (phosphor-NF) were found in colon tissues of experimental animals administered with the extract, fractions thereof and specific compounds isolated therefrom.
  • the expression level of kappa B) was greatly reduced.
  • mice Four-week-old ICR male mice (20-28 g) were purchased from Orient Bio. 2 ml of sterilized 4% thioglycolate was administered to the abdominal cavity of the mice, and after 96 hours, the mice were anesthetized, and 8 ml of RPMI medium was again administered to the abdominal cavity of the mice. After about 5 to 10 minutes, RPMI (including macrophages) in the mouse abdominal cavity was extracted again and centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes to remove supernatant. In addition, fresh RPMI was added to the precipitate layer to wash the washed cells twice. Then, the fresh medium was put back and the cells were well suspended, and the number of macrophages was counted using a hematocytometer.
  • RPMI including macrophages
  • Macrophages were placed in a 24-well dish with 0.5 ⁇ 10 6 water per well, and the test material and the inflammatory response-inducing material were treated for 60 minutes and homogenized by the addition of RIPA buffer (Gibco). At this time, mangiferin was used as a test substance, and an inflammatory response inducing substance was selected from lipopolysaccharide (LPS) or peptidolgycan (PG).
  • LPS lipopolysaccharide
  • PG peptidolgycan
  • the supernatant obtained by centrifuging the homogenized macrophage sample at 4 ° C and 13000 rpm for 15 minutes was stored at -80 ° C, while IRleu-1 (Interleukin-1 receptor-associated kinase 1), p-IRAK-1
  • IRleu-1 Interleukin-1 receptor-associated kinase 1
  • p-IRAK-1 The expression levels of (phosphor-Interleukin-1 receptor-associated kinase 1), p65 (NF-kappa B), pp65 (phosphor-NF-kappa B) and ⁇ -actin were measured by Western blotting.
  • 50 ⁇ g of the supernatant was electrophoresed for 1 hour and 30 minutes in SDS 10% (w / v) polyacrylamide gel.
  • the electrophoretic sample was transferred to nitrocellulose paper for 1 hour and 10 minutes at 100 V and 400 kPa.
  • the sample was blocked with 5% skim milk for 30 minutes after transferring the transferred nitrocellulose paper, and washed with PBS-Tween three times for 5 minutes and the primary antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA) at a ratio of 1: 100.
  • the reaction was overnight. Thereafter, the mixture was washed three times for 10 minutes, and reacted with a secondary antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA) at a ratio of 1: 1000 for 1 hour and 20 minutes. Thereafter, the mixture was washed three times for 15 minutes, and developed after fluorescence.
  • FIG. 4 is a result showing that the inflammatory response is suppressed by mangiferin in macrophages treated with lipopolysaccharide (LPS) or peptidolgycan (PG).
  • LPS lipopolysaccharide
  • PG peptidolgycan
  • n-butanol soluble fraction 190 g of the five gall extract obtained in Preparation Example 4 was suspended in 1.5 L of water, and then, 1.5 L of n-butanol was added thereto, and the mixture was left to shake to separate an n-butanol soluble fraction layer and a water soluble fraction layer. The n-butanol soluble fraction layer was taken and concentrated under reduced pressure to give 102 g of n-butanol soluble fraction.
  • n-butanol soluble fraction Yield of n-butanol soluble fraction was at least 21% based on the gallant, and 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl- ⁇ -D-glucose contained in the n-butanol soluble fraction ( glucose1,2,3,4,6-penta-O-galloyl- ⁇ -D-glucose) was more than 30%.
  • 189 g of the hair extract obtained in Preparation Example 7 was suspended in 1.5 L of water, and 1.5 L of n-butanol was added thereto, and the mixture was left to shake to separate an n-butanol soluble fraction layer and a water soluble fraction layer.
  • the n-butanol soluble fraction layer was taken and concentrated under reduced pressure to give 41 g of n-butanol soluble fraction.
  • the yield of n-butanol soluble fraction was 8.2% or more based on the hair, and the content of Mangiferin contained in the n-butanol soluble fraction was 10% or more.
  • the structure was confirmed by mass spectrometry and 13 C-NMR (Bruker, AVANCE digital 400) to confirm that Mangiferin and Neo It was found to be Neomangiferin.
  • the yields of Mangiferin and Neomangiferin were at least 0.5% and at least 0.1%, respectively, based on the hair mass.
  • n-butanol soluble fraction 185 g was suspended in 1.5 L of water, and 1.5 L of n-butanol was added thereto, and the mixture was left to shake to separate an n-butanol soluble fraction layer and a water soluble fraction layer.
  • the n-butanol soluble fraction layer was taken and concentrated under reduced pressure to give 112 g of n-butanol soluble fraction.
  • the yield of n-butanol soluble fraction was at least 5.5%, and the content of Lancemaside A contained in the n-butanol soluble fraction was at least 4%.
  • the 13th fraction of the 14 subfractions was separated by performing MPLC (medium pressure liquid chromatography; Yamazen 540-SY-S2CSC, Japan) for 4 hours (mobile phase: 10% ACN in water to 70% ACN in water). , 4 ml / min), 80 small fractions were obtained. 37-42 fractions of 80 subfractions were concentrated under reduced pressure and lyophilized to obtain 620 mg of a compound in the form of a white amorphous powder. The structure was confirmed by mass spectrometry and 13 C-NMR (Bruker, AVANCE digital 400) to confirm the structure. Identified as Lancemaside A.
  • a complex extract was prepared by mixing 50 parts by weight of the gall bladder extract obtained in Preparation Example 4, 25 parts by weight of the hair extract obtained in Preparation Example 7 and 25 parts by weight of the deodeok extract obtained in Preparation Example 10.
  • a composite extract was prepared by mixing 50 parts by weight of the gall bladder extract obtained in Preparation Example 4, 25 parts by weight of Deodeok extract obtained in Preparation Example 10 and 25 parts by weight of thawed extract obtained in Preparation Example 13.
  • a complex extract was prepared by mixing 75 parts by weight of the gall bladder extract obtained in Preparation Example 4 and 25 parts by weight of thawed extract obtained in Preparation Example 13.
  • a composite extract was prepared by mixing 50 parts by weight of the gall bladder extract obtained in Preparation Example 4 and 25 parts by weight of the hair extract obtained in Preparation Example 7.
  • a composite extract was prepared by mixing 50 parts by weight of Deodeok extract obtained in Preparation Example 10 and 50 parts by weight of thawed extract obtained in Preparation Example 13.
  • mice Four-week-old ICR male mice (24-27 g) were purchased from Orient Bio. All mice were bred under controlled environmental conditions of 50 ⁇ 10% humidity and 25 ⁇ 2 ° C, and lighting was repeated for 12 hours and then turned off for 12 hours. Feed was used as standard experimental feed (Samyang, Korea) and drinking water was freely consumed. In all experiments, one group had 6 animals.
  • TNBS 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid
  • the experimental animal was lightly anesthetized with ether, and 2.5 g of NBS (2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid) solution was mixed with 50% ethanol. Inflammation was induced by injecting 0.1 ml inward and holding it vertically for 30 seconds. In contrast, the normal group was orally administered with 0.1 ml of saline solution.
  • the extracted colon was observed by observing its length and appearance and scored according to the criteria in Table 6 below (Hollenbach et al., 2005 criteria for colitis degree). At this time, a mesalazine (Sigma) administration group was used as a positive control. In addition, a portion of the colon contents were taken for intestinal microbial analysis and stored frozen at minus 80 °C. Colon tissues were removed from the colon contents, washed in physiological saline, and some were fixed with 4% formaldehyde fixative for use as pathological samples. The rest were frozen and stored at -80 ° C for molecular biology analysis.
  • the plate was inverted and emptied, and each well was washed with 200 ⁇ l of washing buffer.
  • the washing process was repeated three times using 200 ⁇ l of wash buffer, and then 100 ⁇ l of diluted streptavidin-peroxidase conjugate was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • the plate was inverted and emptied, and each well was washed with 200 ⁇ l of washing buffer.
  • the washing process was repeated three times using 200 ⁇ l of wash buffer, and then 100 ⁇ l of TMB substrate solution was added and the plate was wrapped in aluminum foil to block light and allowed to react at room temperature for 30 minutes.
  • the reaction was stopped by adding 100 ⁇ l of a stop solution and the absorbance was measured at 450 nm using an ELISA reader.
  • Table 7 shows the results of appearance analysis and myeloperoxidase (MPO) activity of the colon extracted from animals induced by acute colitis by TNBS when an extract-based sample was administered.
  • MPO myeloperoxidase
  • Table 8 shows the results of appearance analysis and myeloperoxidase (MPO) activity of the colon extracted from animals induced by acute colitis by TNBS when a sample based on butanol soluble fraction was administered.
  • MPO myeloperoxidase
  • the complex extract consisting of butanol soluble fraction of the gall bladder extract, butanol soluble fraction of chylo extract and butanol soluble fraction of deodeok extract is superior to mesalazine (mesalazine) used as the administration sample in the positive control. It showed an effect.
  • FIG. 6 is a graph showing the weight change of model animals induced by acute colitis by TNBS when the extract-based sample was administered.
  • "NOR" on the X axis means normal group 1
  • "TNBS” means group 1 treated only with TNBS
  • "O10" is obtained in Preparation Example 4 in a model animal in which acute colitis is induced by TNBS.
  • OJD10 is a group in which the complex extract obtained in Preparation Example 14 was administered to the model animal induced by acute colitis caused by TNBS in an amount of 10 mg / kg
  • OJD10 means a group in which the complex extract obtained in Preparation Example 15 was administered to the model animal induced by acute colitis by TNBS in an amount of 10 mg / kg
  • OH10 means acute colitis by TNBS.
  • the complex extract obtained in Preparation 16 to the induced model animal means a group administered in an amount of 10 mg / kg
  • "OJ10” is a complex extract obtained in Preparation 17 in a model animal induced acute colitis by TNBS Means the group administered in an amount of 10 mg / kg
  • "HD20” is represented by TNBS
  • JD20 is obtained in Preparation Example 19 in a model animal induced by acute colitis by TNBS
  • Me10 refers to a group 1 administered with mesalazine (mesalazine) in an amount of 10 mg / kg to a model animal induced by acute colitis caused by TNBS it means.
  • Figure 7 is a graph showing the weight change of the model animal induced acute colitis induced by TNBS when administered butanol soluble fraction-based sample.
  • NOR on the X axis means normal group 2
  • TNBS means group 2 treated only with TNBS
  • OJD10 is obtained in Preparation Example 20 in a model animal induced by acute colitis by TNBS Means a group administered with a complex extract in an amount of 10 mg / kg
  • "O5" is the amount of 5 mg / kg butanol soluble fraction of the gall extract extract obtained in Preparation Example 5 in a model animal induced by acute colitis caused by TNBS
  • O10 refers to the group administered with butanol soluble fraction of the gallnut extract obtained in Preparation Example 5 in a model animal induced by acute colitis by TNBS in an amount of 10 mg / kg
  • J10 refers to a group in which a butanol-soluble fraction of the hair extract obtained in Preparation Example
  • Butanol soluble fraction of the extract means the group administered in the amount of 10 mg / kg
  • “Me10” means that the administration of mesalazine (mesalazine) in the amount of 10 mg / kg to the model animal induced by acute colitis caused by TNBS Mean group 2.
  • the complex extract consisting of the gall bladder extract, the hair extract and the deodeok extract or the butanol soluble fraction of the gall extract, the butanol soluble fraction of the balm extract, and the butanol soluble fraction of the deodex extract in the positive control group.
  • the weight gain was almost equivalent to or greater than that of mesalazine used as the administration sample.
  • the composite extract consisting of the deodeok extract and the hair extract was almost the same weight gain as mesalazine (mesalazine) used as the administration sample in the positive control.
  • Table 9 shows the results of measuring the expression levels of IL-1 beta, IL-6 and TNF-alpha in colon tissues extracted from animals acute colitis induced by TNBS when an extract-based sample was administered.
  • Table 10 shows the results of measuring the expression levels of IL-1 beta, IL-6 and TNF-alpha in colon tissues extracted from animals acute colitis induced by TNBS when a sample based on butanol soluble fraction was administered. .
  • TNBS Treatment and Oral Sample Information Sample dose (mg / kg) IL-1 beta concentration (pg / mg) IL-6 concentration (pg / mg) TNF-alpha concentration (pg / mg) Normal group 2 - 1.61 ⁇ 3.78 1.14 ⁇ 1.08 6.26 ⁇ 2.73 TNBS treatment group 2 - 120.0 ⁇ 28.75 13.12 ⁇ 2.27 193.84 ⁇ 43.29 TNBS treatment + OJD administration group 10 17.96 ⁇ 9.43 3.07 ⁇ 1.06 32.02 ⁇ 9.66 TNBS treatment + gall fraction fraction administration group 5 43.37 ⁇ 27.07 6.60 ⁇ 1.94 75.52 ⁇ 25.60 TNBS treatment + gall fraction fraction administration group 10 30.52 ⁇ 5.00 4.40 ⁇ 2.51 49.29 ⁇ 11.63 TNBS treatment + hair fraction administration group 10 54.37 ⁇ 23.27 6.37 ⁇ 1.57 81.01 ⁇ 24.75 TNBS treatment + deodeok fraction administration group 10 57.70 ⁇ 32
  • 0.3 g of colon tissue of the test animal was homogenized by adding 1 ml of RIPA buffer (Gibco) containing a protease inhibitor cocktail. Subsequently, the supernatant obtained by centrifugation at 4 ° C. and 13000 rpm for 15 minutes was stored at -80 ° C., while COX-2, p65 (NF-kappa B), p-p65 (phosphor-NF-kappa B), and IRAK The expression levels of -1 (Interleukin-1 receptor-associated kinase 1), p-IRAK-1 (phosphor-Interleukin-1 receptor-associated kinase 1), p-IKK- ⁇ and ⁇ -actin were measured by Western blotting. .
  • FIG. 8 is a result showing that the expression of the inflammatory response indicators in the large intestine of the experimental animal group administered the extract-based sample after acute colitis induced by TNBS treatment.
  • O10 refers to a group administered with a gall bladder extract obtained in Preparation Example 4 in an amount of 10 mg / kg in a model animal induced by acute colitis caused by TNBS
  • OJD10 refers to acute colitis caused by TNBS.
  • OJ10 refers to the group administered with a compound extract obtained in Preparation Example 17 in an amount of 10 mg / kg to a model of acute colitis caused by TNBS
  • HD20 is acute colitis caused by TNBS 20 mg / g of the composite extract obtained in Preparation Example 18 to a model animal
  • JD20 refers to the group administered with the compound extract obtained in Preparation Example 19 in an amount of 20 mg / kg to a model animal induced by acute colitis by TNBS
  • Me10 means a complex extract obtained in Preparation Example 15 to the model animal induced by acute colitis by TNBS
  • OJ10 refers to the group administered with a compound extract obtained in Preparation Example 17 in an amount of 10 mg / kg to a model of acute colitis caused by TNBS
  • HD20 is acute colitis caused by TNBS 20 mg / g of the composite extract obtained in Preparation Example 18 to a model animal
  • JD20 refers to the group administered with the compound extract obtained in Preparation
  • Figure 9 is a result showing that the expression of inflammatory response indicators in the colon of the experimental animal group administered a sample based on butanol soluble fraction after acute colitis caused by TNBS treatment.
  • OJD10 refers to a group in which the composite extract obtained in Preparation Example 20 was administered to a model animal induced by acute colitis caused by TNBS in an amount of 10 mg / kg
  • O5" refers to acute colitis caused by TNBS.
  • butanol-soluble fractions of the experimental animal groups or the gall-nut extracts, the butanol-soluble fractions of the hair extracts, and the butanol-soluble fractions of the deodeok extracts were administered the complex extract consisting of the gall bladder extract, the hair extract and the deodeok extract.
  • COX-2 COX-2, p65 (NF-kappaB), p-p65 (phosphor-NF-kappaB), IRAK-1 (Interleukin-1 receptor-associated kinase 1), The expression levels of p-IRAK-1 (phosphor-Interleukin-1 receptor-associated kinase 1) and p-IKK- ⁇ were significantly decreased, and the level of expression was significantly higher than that of mesalazine.
  • the composite extract consisting of the deodeok extract and the hair extract was almost the same effect as mesalazine (mesalazine) used as the administration sample in the positive control.
  • mice Four-week-old ICR male mice (20-28 g) were purchased from Orient Bio. 2 ml of sterilized 4% thioglycolate was administered to the abdominal cavity of the mice, and after 96 hours, the mice were anesthetized, and 8 ml of RPMI medium was again administered to the abdominal cavity of the mice. After about 5 to 10 minutes, RPMI (including macrophages) in the mouse abdominal cavity was extracted again and centrifuged at 1000 rpm for 10 minutes to remove supernatant. In addition, fresh RPMI was added to the precipitate layer to wash the washed cells twice. Then, the fresh medium was put back and the cells were well suspended, and the number of macrophages was counted using a hematocytometer.
  • RPMI including macrophages
  • Macrophages were placed in a 24-well dish with 0.5 ⁇ 10 6 water per well, and the test material and the inflammatory response-inducing material were treated for 60 minutes and homogenized by the addition of RIPA buffer (Gibco).
  • RIPA buffer Gibco
  • the composite extract prepared in Preparation Example 14 was used as the test substance, and LPS (lipopolysaccharide) was used as the inflammatory response inducing substance.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the sample was blocked with 5% skim milk for 30 minutes after transferring the transferred nitrocellulose paper, and washed with PBS-Tween three times for 5 minutes and the primary antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA) at a ratio of 1: 100. The reaction was overnight. Thereafter, the mixture was washed three times for 10 minutes, and reacted with a secondary antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA) at a ratio of 1: 1000 for 1 hour and 20 minutes. Thereafter, the mixture was washed three times for 15 minutes, and developed after fluorescence.
  • FIG. 10 is a result showing that the inflammatory response is suppressed by a complex extract consisting of gall bladder extract, hair extract and deodeok extract in macrophages treated with lipopolysaccharide (LPS).
  • OJD in Figure 10 means a complex extract prepared in Preparation Example 14. As shown in FIG. 10, the complex extract consisting of a gall bladder extract, a hair extract, and a deodeok extract showed an excellent anti-inflammatory effect.
  • 189 g of the hair extract obtained in Preparation Example 21 was suspended in 1.5 L of water, and then, 1.5 L of n-butanol was added thereto, and the mixture was left to shake to separate an n-butanol soluble fraction layer and a water soluble fraction layer.
  • the n-butanol soluble fraction layer was taken, concentrated under reduced pressure and lyophilized to give 41 g of n-butanol soluble fraction.
  • the yield of n-butanol soluble fraction was 8.2% or more based on the hair, and the content of Mangiferin contained in the n-butanol soluble fraction was 10% or more.
  • FIG. 1 shows the chemical structural formula of Mangiferin (Neomangiferin) and Neomangiferin.
  • the yields of Mangiferin and Neomangiferin were at least 0.5% and at least 0.1%, respectively, based on the hair mass.
  • n-butanol soluble fraction 190 g of the five-fold extract obtained in Preparation Example 24 was suspended in 1.5 L of water, and then 1.5 L of n-butanol was added thereto, and the mixture was left to shake to separate an n-butanol soluble fraction layer and a water soluble fraction layer. The n-butanol soluble fraction layer was taken, concentrated under reduced pressure and lyophilized to give 102 g of n-butanol soluble fraction.
  • n-butanol soluble fraction Yield of n-butanol soluble fraction was at least 21% based on the gallant, and 1,2,3,4,6-penta-O-galloyl- ⁇ -D-glucose contained in the n-butanol soluble fraction ( glucose1,2,3,4,6-penta-O-galloyl- ⁇ -D-glucose) was more than 30%.
  • n-butanol soluble fraction layer was taken, concentrated under reduced pressure and lyophilized to give 112 g of n-butanol soluble fraction.
  • the yield of n-butanol soluble fraction was at least 5.5%, and the content of Lancemaside A contained in the n-butanol soluble fraction was at least 4%.
  • n-butanol soluble fraction 123 g of the extract of Cheonhwang Lotus obtained in Preparation Example 28 was suspended in 1.5 L of water, and then 1.5 L of n-butanol was added thereto, and the mixture was left to shake to separate an n-butanol soluble fraction layer and a water soluble fraction layer. The n-butanol soluble fraction layer was taken, concentrated under reduced pressure and lyophilized to give 63 g of n-butanol soluble fraction. The yield of n-butanol soluble fraction was at least 12.5% based on cheonyan lotus. Components for n-butanol soluble fractions were analyzed using high performance liquid chromatography (HPLC; Waters Alliance 2695 model).
  • the column was YMC Hydrosphere C18 (YMC Hydrosphere C18, S-5 ⁇ m, 120nm, 4.6 ⁇ 250mm I.D) and the sample temperature was maintained at 25 °C ⁇ 1, column temperature 30 °C ⁇ 1.
  • the sample concentration was prepared at 1 mg / ml and injected into 10 ⁇ l, and the flow rate was analyzed at 1.0 ml / min.
  • the standard materials were commercially available berberine, palmin, Copticin, etc. from Sigma, and was used to separate and purify the columbine and jathrorizine from the rye.
  • Calculation of the active ingredient content indicated the area ratio for each standard in weight percent.
  • the n-butanol soluble fraction of the extract of Cheonhwang Lyeon contains 27-30% berberine, 7-8% palmatin, 5-6% copticin, 0.8-1.2% columamine, 0.8-1.2% jatrorizine It was.
  • a complex extract was prepared by mixing 50 parts by weight of a butanol soluble fraction of the hair extract obtained in Preparation Example 22 and 50 parts by weight of a butanol soluble fraction of the ginseng extract obtained in Preparation Example 25.
  • a complex extract was prepared by mixing 50 parts by weight of a butanol soluble fraction of the hair extract obtained in Preparation Example 22 and 50 parts by weight of a butanol soluble fraction of Deodeok extract obtained in Preparation Example 27.
  • a complex extract was prepared by mixing 50 parts by weight of butanol soluble fraction of the hair extract obtained in Preparation Example 22 and 50 parts by weight of butanol soluble fraction of the cheonyan lotus extract obtained in Preparation Example 29.
  • mice Six-week old male mice (C57BL / 6, 18-22 g) were purchased from Orient Bio. All mice were bred under controlled environmental conditions of 50 ⁇ 10% humidity and 20 ⁇ 22 ° C, and lighting was repeated for 12 hours and then turned off for 12 hours. Feed was used as standard experimental feed (Samyang, Korea) and drinking water was freely consumed. In all experiments, one group had 6 animals.
  • TNBS 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid
  • the experimental animal was lightly anesthetized with ether, and 2.5 g of NBS (2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid) solution was mixed with 50% ethanol. Inflammation was induced by injecting 0.1 ml inward and holding it vertically for 30 seconds.
  • the normal group was orally administered with 0.1 ml of saline solution. Thereafter, the drug sample is dissolved in physiological saline once daily for 3 days starting the next day and orally administered at a predetermined dose.
  • the weight of the experimental animal was measured on the next day, and the weight change amount was calculated by comparing with the initial weight.
  • the extracted colon was observed by observing its length and appearance and scored according to the criteria in Table 11 (Hollenbach et al., 2005 criteria for colitis degree). At this time, a mesalazine (Sigma) administration group was used as a positive control. In addition, a portion of the colon contents were taken for intestinal microbial analysis and stored frozen at minus 80 °C. Colon tissues were removed from the colon contents, washed in physiological saline, and some were fixed with 4% formaldehyde fixative for use as pathological samples. The rest were frozen and stored at -80 ° C for molecular biology analysis.
  • the plate was inverted and emptied, and each well was washed with 200 ⁇ l of washing buffer.
  • the washing process was repeated three times using 200 ⁇ l of wash buffer, and then 100 ⁇ l of diluted streptavidin-peroxidase conjugate was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • the plate was inverted and emptied, and each well was washed with 200 ⁇ l of washing buffer.
  • the washing process was repeated three times using 200 ⁇ l of wash buffer, and then 100 ⁇ l of TMB substrate solution was added and the plate was wrapped in aluminum foil to block light and allowed to react at room temperature for 30 minutes.
  • the reaction was stopped by adding 100 ⁇ l of a stop solution and the absorbance was measured at 450 nm using an ELISA reader.
  • FIG. 11 is a graph showing the weight change and colon appearance score of model animals in which acute colitis was induced by TNBS when n-butanol soluble fraction of the hair extract obtained in Preparation Example 22 was used as a drug sample.
  • FIG. When the n-butanol soluble fraction of the hair extract obtained in Preparation Example 22 was used as a drug sample, colonic length and MPO activity measurement results of a model animal induced by acute colitis by TNBS are shown.
  • TNBS refers to a group in which physiological saline instead of a separate drug sample to a model animal that caused acute colitis caused by TNBS
  • a “or” AJ means n-butanol soluble fraction of the hair extract.
  • A10 and A20 mean that the single dose of the drug sample “A” is 10 mg / kg and 20 mg / kg, respectively.
  • M means mesalazine used as a positive control drug, and a single dose of mesalazine is 10 mg / kg of mouse.
  • the n-butanol soluble fraction of the hair extract showed a concentration-dependent effect of alleviating or ameliorating acute colitis induced by TNBS.
  • FIG. 13 shows the results of measurement of weight change, colorectal appearance score, colorectal length, and MPO activity of a model animal in which acute colitis was induced by TNBS when using mangiferin obtained in Preparation Example 23 as a drug sample.
  • "NOR" represents a normal group
  • MF means mangiferin.
  • MF10 and “MF20” mean that the single doses of the drug sample “MF” are 10 mg / kg and 20 mg / kg, respectively.
  • MS in FIG. 13 means mesalazine used as a positive control drug, and the single dose of mesalazine is 10 mg / kg of mouse.
  • Mangiferin showed an effect of alleviating or ameliorating acute colitis induced by TNBS in a concentration-dependent manner.
  • FIG. 14 is a graph showing the weight change and colon appearance score of a model animal in which acute colitis was induced by TNBS when a complex extract was used as a drug sample
  • FIG. 15 is acute by TNBS when a complex extract was used as a drug sample. It shows the results of measuring colon length and MPO activity of the model animals induced colitis.
  • "NOR" represents a normal group
  • "AC” refers to the complex extract prepared in Preparation Example 33
  • ALG refers to the complex extract prepared in Preparation Example 32.
  • “AC10” and “AC20” mean that the single dose of the drug sample “AC” is 10 mg / kg and 20 mg / kg, respectively.
  • M means mesalazine used as a positive control drug, and a single dose of mesalazine is 10 mg / kg of mouse.
  • the complex extract consisting of the fraction of the extract of Jimmy and the extract of the extract of Cheonhwang Lyeon, the fraction of the extract of Jimo, the fraction of the gall bladder extract, and the fraction of the deodeok extract were used as a positive control drug.
  • the composite extract consisting of the fraction of the hair extract and the extract of the cheonyan lotus extract has the effect of the fraction of the hair extract, the fraction of the gall bladder extract and the fraction of the deodeok extract Better than the complex extract.
  • Figure 16 shows the expression levels of IL-1 beta and IL-6 in colon tissues of a model animal induced by acute colitis by TNBS when using n-butanol soluble fraction of the hair extract obtained in Preparation Example 22 as a drug sample.
  • 17 is a graph showing TNF-alpha and IL-10 in colon tissues of a model animal induced by acute colitis by TNBS when n-butanol soluble fraction of the hair extract obtained in Preparation Example 22 was used as a drug sample. It is a graph showing the expression amount.
  • "NOR" refers to the normal group and "A” refers to the n-butanol soluble fraction of the hair extract.
  • “A10” and “A20” mean that the single dose of the drug sample “A” is 10 mg / kg and 20 mg / kg, respectively.
  • “M” means mesalazine used as a positive control drug.
  • IL-1 beta corresponding to proinflammatory cytokine in the colon tissue of a model animal induced by acute colitis by TNBS when n-butanol soluble fraction of the hair extract was administered.
  • the expression levels of IL-6 and TNF-alpha decreased depending on the drug dose, and the expression levels of IL-10 corresponding to the anti-inflammatory cytokine increased depending on the drug dose.
  • cytokine 18 is a proinflammatory cytokine and anti-inflammatory cytokine (anti-inflammatory cytokine) in the colon tissue of a model animal induced by acute colitis by TNBS when using the mangiferin obtained in Preparation Example 23 as a drug sample (anti -inflammatory cytokine) is a graph showing the amount of expression.
  • MF refers to Mangiferin
  • MS refers to mesalazine used as a positive control drug.
  • IL-1 beta, IL-6, and TNF corresponding to proinflammatory cytokine in the colon tissue of a model animal induced by acute colitis by TNBS when mangiferin was administered.
  • the expression level of alpha decreased depending on the drug dose, and the expression level of IL-10 corresponding to the anti-inflammatory cytokine increased depending on the drug dose.
  • FIG. 19 is a graph showing the expression levels of IL-1 beta and IL-6 in colon tissues of a model animal induced by acute colitis by TNBS when a complex extract was used as a drug sample
  • FIG. 20 is a complex extract as a drug sample.
  • I a graph showing the expression levels of TNF-alpha and IL-10 in colon tissues of a model animal induced by acute colitis caused by TNBS.
  • N or "NOR” represents a normal group
  • AC means a complex extract prepared in Preparation Example 33
  • ALG means a complex extract prepared in Preparation Example 32. .
  • AC10 and AC20 mean that the single dose of the drug sample “AC” is 10 mg / kg and 20 mg / kg, respectively.
  • M means mesalazine used as a positive control drug, and a single dose of mesalazine is 10 mg / kg of mouse.
  • the complex extract consisting of the fraction of the extract of Jimmy and the extract of the extract of Cheonhwang Lyeon and the fraction of the extract of Jimo, the fraction of the gall bladder extract, and the fraction of the deodeok extract were used as a positive control drug.
  • 0.3 g of colon tissue of the model animal was homogenized by adding 1 ml of RIPA buffer (Gibco) containing a protease inhibitor cocktail. Subsequently, the supernatant obtained by centrifugation for 15 minutes at 4 ° C. and 13000 rpm was stored at minus 80 ° C., while COX-2, iNOS, p65 (NF-kappa B) and p-p65 (phosphor-NF-kappa B) And ⁇ -actin expression level was measured by Western blotting method. First, 50 ⁇ g of the supernatant was electrophoresed for 1 hour and 30 minutes in SDS 10% (w / v) polyacrylamide gel.
  • the electrophoretic sample was transferred to nitrocellulose paper for 1 hour and 10 minutes at 100 V and 400 kPa.
  • the sample was blocked with 5% skim milk for 30 minutes after transferring the transferred nitrocellulose paper, and washed with PBS-Tween three times for 5 minutes and the primary antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA) at a ratio of 1: 100.
  • the reaction was overnight. Thereafter, the mixture was washed three times for 10 minutes, and reacted with a secondary antibody (Santa Cruz Biotechnology, USA) at a ratio of 1: 1000 for 1 hour and 20 minutes. Thereafter, the mixture was washed three times for 15 minutes, and developed after fluorescence.
  • FIG. 21 is a result showing that the expression of the inflammatory response markers in the colon tissue of the model animal when the composite extract is administered to the model animal induced by acute colitis induced by TNBS.
  • N represents a normal group
  • AC refers to the complex extract prepared in Preparation Example 33
  • AG refers to the complex extract prepared in Preparation Example 32.
  • AC10 and “AC20” mean that the single dose of the drug sample “AC” is 10 mg / kg and 20 mg / kg, respectively.
  • M means mesalazine used as a positive control drug, and the single dose of mesalazine is 10 mg / kg of mouse. As shown in FIG.
  • the complex extract consisting of the fraction of the extract of Jimmy and the extract of the cheonyan lotus extract and the extract of the extract of the extract, the fraction of the gallant extract and the fraction of the deodeok extract are used as a positive control drug mesalazine (mesalazine) Inhibitory levels of COX-2, iNOS, and p-p65 (phosphor-NF-kappa B) were inhibited.
  • mesalazine mesalazine
  • Inhibitory levels of COX-2, iNOS, and p-p65 phosphor-NF-kappa B
  • the composite extract consisting of the fraction of the hair extract and the fraction of the cheonyan lotus extract had a better effect than the complex extract consisting of the fraction of the hair extract, the fraction of the gall bladder extract and the fraction of the deodeok extract.
  • Table 12 summarizes the effect of alleviating or improving colitis of drug samples administered to a model animal induced by acute colitis by TNBS.
  • the value of the analysis item is expressed as a percentage of the value of the group of physiological saline used as a vehicle of the drug sample instead of a separate drug sample to the model animal induced acute colitis by TNBS.
  • the complex extract consisting of the fraction of the extract of the hair extract and the fraction of the extract of Cheonhwang Lotus extract, the complex of the extract of the gall extract, the extract of the extract and the deodeok extract of the complex acute colitis induced by TNBS model
  • the fractions of the hair extract, the extracts of the gall bladder extract, the fractions of the deodeok extracts, or the fractions of the rhubarb extracts each showed significantly improved colitis relief or improvement.
  • the composite extract consisting of the fraction of the hair extract and the fraction of the cheonyan lotus extract was more effective than the complex extract consisting of the fraction of the hair extract, the fraction of the gall bladder extract and the fraction of the deodeok extract.
  • the fraction of the hair extract and the fraction of the cheonyan lotus extract act on different targets related to colitis relief or treatment, respectively, and thus show a high synergy effect when used in combination.
  • the colitis-relieving or improving effect of the fractions of the extract and Cheonryeon lotus extract can be replaced even if the fraction of the extract is replaced with Manjiferin, which is a compound separated from the extract of the hair, or the extract of Cheonryeon lotus extract. It is expected to be the same.
  • mice Six-week old male mice (C57BL / 6, 18-22 g) were purchased from Orient Bio. All mice were bred under controlled environmental conditions of 50 ⁇ 10% humidity and 20 ⁇ 22 ° C, and lighting was repeated for 12 hours and then turned off for 12 hours. Feed was used as standard experimental feed (Samyang, Korea) and drinking water was freely consumed. In all experiments, one group had 6 animals.
  • test animals One group of test animals was normal, and the other group of test animals induced acute colitis with dextran sulfate sodium (molecular weight: 36-50 kDaltons). Specifically, a 2.5% (w / v) aqueous dextran sulfate solution was used instead of water for 7 days to prepare a model for acute colitis. On the other hand, the normal group was supplied with drinking water. Thereafter, the drug sample is dissolved in physiological saline once daily for 3 days starting the next day and orally administered at a predetermined dose. The day after the administration of the sample, the animal is choked with carbon dioxide and killed, and the large intestine from the cecum to the anus immediately before It extracted.
  • Body weight change was analyzed in the same manner as in the model animal experiment in which colitis was induced by TNBS.
  • the appearance of the colon was analyzed in the same manner as in the model animal experiment in which colitis was induced by TNBS.
  • MPO Myeloperoxidase
  • FIG. 22 is a graph showing the weight change and colon appearance score of a model animal induced by acute colitis by DSS when using a complex extract as a drug sample
  • FIG. 23 is acute by DSS when using a complex extract as a drug sample. It shows the results of measuring colon length and MPO activity of the model animals induced colitis. 22 and 23, "NOR” represents a normal group, “AC” refers to the complex extract prepared in Preparation Example 33, “ALG” refers to the complex extract prepared in Preparation Example 32.
  • “AC10” and “AC20” mean that the single dose of the drug sample “AC” is 10 mg / kg and 20 mg / kg, respectively.
  • M means mesalazine used as a positive control drug, and a single dose of mesalazine is 10 mg / kg of mouse.
  • the complex extract consisting of the fraction of the extract of Jimmy and the extract of the extract of Cheonhwang Lyeon, the fraction of the extract of Jimo, the fraction of the gall bladder extract, and the fraction of the deodeok extract were used as a positive control drug.
  • the composite extract consisting of the fraction of the hair extract and the extract of the cheonyan lotus extract has the effect of the fraction of the hair extract, the fraction of the gall bladder extract and the fraction of the deodeok extract Better than the complex extract.
  • the expression level of proinflammatory cytokine and anti-inflammatory cytokine in colon tissue was determined by TNBS. Measurement was carried out in the same manner as the model animal experiment.
  • FIG. 24 is a graph showing the expression levels of IL-1 beta and IL-10 in colon tissues of a model animal induced by acute colitis when DSS is used as a drug sample
  • FIG. 25 is a compound extract as a drug sample. Is a graph showing the expression levels of TNF-alpha and IL-6 in colon tissues of a model animal induced by acute colitis caused by DSS.
  • "NOR" represents a normal group
  • "AC” means a complex extract prepared in Preparation Example 33
  • AG means a complex extract prepared in Preparation Example 32.
  • AC10 and “AC20” mean that the single dose of the drug sample "AC” is 10 mg / kg and 20 mg / kg, respectively.
  • FIG. 24 is a graph showing the expression levels of IL-1 beta and IL-10 in colon tissues of a model animal induced by acute colitis when DSS is used as a drug sample
  • FIG. 25 is a compound extract as a drug sample. Is a graph showing the expression levels of TNF-al
  • M means mesalazine used as a positive control drug, and a single dose of mesalazine is 10 mg / kg of mouse.
  • the complex extract consisting of the fraction of the hair extract and the fraction of the cheonyan lotus extract and the fraction of the hair extract, the fraction of the gall bladder extract, and the fraction of the deodeok extract were used as a positive control drug.
  • Similar levels of mesalazine reduced the expression of proinflammatory cytokine and increased the expression of anti-inflammatory cytokine.
  • the composite extract consisting of the fraction of the hair extract and the fraction of the cheonyan lotus extract was more effective than the complex extract consisting of the fraction of the hair extract, the fraction of the gall bladder extract and the fraction of the deodeok extract.
  • Drug samples were administered to COX-2, iNOS, p65 (NF-kappaB), p-p65 (phosphor-NF-kappaB) and ⁇ -actin in colon tissue when administered to model animals induced by acute colitis caused by DSS. Expression levels were measured in the same manner as in the model animal experiment in which colitis was induced by TNBS.
  • Figure 26 shows that the expression of the inflammatory response markers in the colon tissue of the model animal when the composite extract is administered to the model animal induced by acute colitis induced by DSS.
  • N represents a normal group
  • AC means a complex extract prepared in Preparation Example 33
  • AG means a complex extract prepared in Preparation Example 32.
  • AC10 and AC20 mean that the single dose of the drug sample “AC” is 10 mg / kg and 20 mg / kg, respectively.
  • M means mesalazine used as a positive control drug, and the single dose of mesalazine is 10 mg / kg of mouse. As shown in FIG.
  • the composite extract consisting of the fraction of the extract of Jimmy and the extract of the cheonnyeon lotus extract and the extract of the extract of the Jimmy, the extract of the gall bladder extract and the fraction of the deodeok extract were used as a positive control drug mesalazine (mesalazine). Inhibitory levels of COX-2, iNOS, and p-p65 (phosphor-NF-kappa B) were inhibited.
  • the composite extract consisting of the fraction of the hair extract and the fraction of the cheonyan lotus extract was more effective than the complex extract consisting of the fraction of the hair extract, the fraction of the gall bladder extract and the fraction of the deodeok extract.
  • mice Six-week old male mice (C57BL / 6, 18-22 g) were purchased from Orient Bio. All mice were bred under controlled environmental conditions of 50 ⁇ 10% humidity and 20 ⁇ 22 ° C, and lighting was repeated for 12 hours and then turned off for 12 hours. Feed was used as standard experimental feed (Samyang, Korea) and drinking water was freely consumed. In all experiments, one group had 6 animals.
  • One group of test animals was normal, and the other group of test animals induced chronic colitis with oxazolone. Specifically, the hair on the back of the mouse was shaved and sensitized by applying 0.2 ml of a 3% (w / v) oxazolone solution in an area of about 1.5 cm x 1.5 cm. After 8 days the mice were anesthetized and 0.1 ml of 1% oxazolone solution was administered rectally through the colon. After that, the drug sample is dissolved in physiological saline once daily for 15 days from the next day and orally administered according to a predetermined dose. The day after the administration of the sample, the animal is choked with carbon dioxide and killed, and the large intestine from the cecum to the anus immediately before It extracted.
  • Body weight change was analyzed in the same manner as in the model animal experiment in which colitis was induced by TNBS.
  • the appearance of the colon was analyzed in the same manner as in the model animal experiment in which colitis was induced by TNBS.
  • MPO Myeloperoxidase
  • Figure 27 is a graph showing the weight change and colon appearance score of model animals induced by chronic colitis caused by oxazolone when using a composite extract as a drug sample
  • Figure 28 is a graph showing the oxazolone when using a complex extract as a drug sample It shows the results of measuring colon length and MPO activity of model animals induced by chronic colitis.
  • "NOR" in Figures 27 and 28 represents a normal group
  • "OXA” represents an experimental group orally administered only saline after inducing chronic colitis with oxazolone
  • AC is a complex extract prepared in Preparation Example 33
  • AG refers to the complex extract prepared in Preparation Example 32.
  • AC-10 and AC-20 mean that the single dose of the drug sample “AC” is 10 mg / kg and 20 mg / kg, respectively.
  • M means mesalazine used as a positive control drug, and a single dose of mesalazine is 10 mg / kg of mouse.
  • the complex extract consisting of the fraction of the hair extract and the fraction of the cheonyan lotus extract and the complex of the hair extract, the fraction of the gallella extract and the fraction of the deodeok extract were used as a positive control drug.
  • FIG. 29 is a graph showing the expression levels of IL-1 beta and IL-10 in colon tissues of model animals induced with chronic colitis caused by oxazolone when a complex extract was used as a drug sample
  • FIG. 30 is a complex as a drug sample. It is a graph showing the expression levels of TNF-alpha and IL-6 in colon tissues of model animals in which chronic colitis was induced by oxazolone when the extract was used.
  • the complex extract consisting of the fraction of the extract of Jimmy and the extract of the Cheonhwang lotus extract and the extract of the extract of the Jimmy, the extract of the Gallja extract, and the fraction of the deodeok extract were used as a positive control drug. Similar levels of mesalazine reduced the expression of proinflammatory cytokine and increased the expression of anti-inflammatory cytokine.
  • the composite extract consisting of the fraction of the hair extract and the fraction of the cheonyan lotus extract was more effective than the complex extract consisting of the fraction of the hair extract, the fraction of the gall bladder extract and the fraction of the deodeok extract.
  • Drug samples were administered to COX-2, iNOS, p65 (NF-kappaB), p-p65 (phosphor-NF-kappaB) and ⁇ -actin in colon tissue when administered to model animals induced by chronic colitis caused by oxazolone.
  • the expression level of was measured in the same manner as the model animal experiment in which colitis was induced by TNBS.
  • FIG. 31 is a result showing that the expression of the inflammatory response indicators in the colon tissue of the model animal when the complex extract is administered to the model animal induced chronic colitis induced by oxazolone.
  • NOR represents a normal group
  • Oxa represents an experimental group orally administered only saline after inducing chronic colitis with oxazolone
  • AC refers to the complex extract prepared in Preparation Example 33
  • AG refers to the complex extract prepared in Preparation Example 32.
  • “AC10” and “AC20” mean that the single dose of the drug sample “AC” is 10 mg / kg and 20 mg / kg, respectively.
  • M means mesalazine used as a positive control drug, and a single dose of mesalazine is 10 mg / kg of mouse.
  • the complex extract consisting of the fraction of the extract of Jimmy and the extract of the cheonyan lotus extract and the extract of the extract of the extract, the fraction of the gall extract, and the fraction of the deodeok extract were used as a positive control drug mesalazine (mesalazine).
  • Inhibitory levels of COX-2, iNOS, and p-p65 (phosphor-NF-kappa B) were inhibited.
  • the composite extract consisting of the fraction of the hair extract and the fraction of the cheonyan lotus extract was more effective than the complex extract consisting of the fraction of the hair extract, the fraction of the gall bladder extract and the fraction of the deodeok extract.
  • mice Six-week old male mice (C57BL / 6, 18-22 g) were purchased from Orient Bio. All mice were bred under controlled environmental conditions of 50 ⁇ 10% humidity and 20 ⁇ 22 ° C, and lighting was repeated for 12 hours and then turned off for 12 hours. Feed was used as standard experimental feed (Samyang, Korea) and drinking water was freely consumed. In all experiments, one group had 6 animals.
  • One group of test animals was normal, and the other group of test animals induced chronic colitis with dextran sulfate sodium (molecular weight: 36-50 kDaltons). Specifically, drink 3% (w / v) sodium dextran sulfate solution for 7 days first, instead of drinking water for 7 days, and then drink water for 5 days with drinking water, and add 3% (w / v) aqueous sodium dextran sulfate solution to 2 After drinking for 3 days by car, drinking water for 3 days again. On the other hand, the normal group was supplied with only drinking water.
  • the drug sample is dissolved in physiological saline and orally administered once a day at a predetermined dose starting from the day when the second aqueous solution of sodium dextran sulfate is consumed.
  • the day after the administration of the sample the animal is choked with carbon dioxide and killed, and the cecum of the large intestine is Large intestine from to the site just before anus was extracted.
  • Body weight change was analyzed in the same manner as in the model animal experiment in which colitis was induced by TNBS.
  • the appearance of the colon was analyzed in the same manner as in the model animal experiment in which colitis was induced by TNBS.
  • MPO Myeloperoxidase
  • FIG. 32 is a graph showing the weight change and colon appearance score of the model animal induced by chronic colitis caused by DSS when using the complex extract as a drug sample
  • Figure 33 is chronic by DSS when using the complex extract as a drug sample It shows the results of measuring colon length and MPO activity of the model animals induced colitis.
  • "NOR" represents a normal group
  • "AC” means a complex extract prepared in Preparation Example 33
  • "ALG” means a complex extract prepared in Preparation Example 32.
  • AC-10” and “AC-20” mean that the single dose of the drug sample “AC” is 10 mg / kg and 20 mg / kg, respectively.
  • M means mesalazine used as a positive control drug, and a single dose of mesalazine is 10 mg / kg of mouse.
  • the complex extract consisting of the fraction of the extract of Jimmy and the extract of the cheonnyeon lotus extract, the fraction of the extract of Jimo, the fraction of the gall bladder extract, and the fraction of the deodeok extract were used as a positive control drug.
  • FIG. 34 is a graph showing the expression levels of IL-1 beta and IL-10 in colon tissues of model animals induced by chronic colitis when DSS is used as a drug sample
  • FIG. 35 is a compound sample as a drug sample. Is a graph showing the expression levels of TNF-alpha and IL-6 in colon tissues of model animals induced by chronic colitis by DSS.
  • NOR represents a normal group
  • AC means a complex extract prepared in Preparation Example 33
  • ALG means a complex extract prepared in Preparation Example 32.
  • AC-10” and “AC-20” mean that the single dose of the drug sample “AC” is 10 mg / kg and 20 mg / kg, respectively.
  • M means mesalazine used as a positive control drug, and a single dose of mesalazine is 10 mg / kg of mouse.
  • the composite extract consisting of the fraction of the extract of Jimmy and the extract of the cheonnyeon lotus extract and the extract of the extract of the extract, the fraction of the gall bladder extract, and the fraction of the deodeok extract were used as a positive control drug. Similar levels of mesalazine reduced the expression of proinflammatory cytokine and increased the expression of anti-inflammatory cytokine.
  • the composite extract consisting of the fraction of the hair extract and the fraction of the cheonyan lotus extract was more effective than the complex extract consisting of the fraction of the hair extract, the fraction of the gall bladder extract and the fraction of the deodeok extract.
  • Drug samples were administered to COX-2, iNOS, p65 (NF-kappa B), p-p65 (phosphor-NF-kappa B) and ⁇ -actin in colon tissues when administered to model animals induced by DSS. Expression levels were measured in the same manner as in the model animal experiment in which colitis was induced by TNBS.
  • FIG. 36 shows that expression of an inflammatory response marker in the colon tissue of a model animal is suppressed when the complex extract is administered to the model animal induced by chronic colitis by DSS.
  • NOR represents a normal group
  • AC refers to the complex extract prepared in Preparation Example 33
  • AG refers to the complex extract prepared in Preparation Example 32.
  • AC10 and AC20 mean that the single dose of the drug sample “AC” is 10 mg / kg and 20 mg / kg, respectively.
  • M means mesalazine used as a positive control drug, and the single dose of mesalazine is 10 mg / kg of mouse. As shown in FIG.
  • the complex extract consisting of the fraction of the extract of Jimmy and the extract of the extract of Cheonhwang Lotus and the extract of the extract of the extract of Jimmy, the fraction of the Gallja extract, and the fraction of the deodeok extract were used as a positive control drug mesalazine (mesalazine).
  • mesalazine mesalazine
  • Inhibitory levels of COX-2, iNOS, and p-p65 (phosphor-NF-kappa B) were inhibited.
  • the composite extract consisting of the fraction of the hair extract and the fraction of the cheonyan lotus extract was more effective than the complex extract consisting of the fraction of the hair extract, the fraction of the gall bladder extract and the fraction of the deodeok extract.
  • the hair was dried as it was or peeled, and then extracted in a water bath using 70% ethanol, followed by complete drying to prepare 70% ethanol extract of hair.
  • the obtained 70% ethanol extract was resuspended in water, fractionated with CH 2 Cl 2 , the aqueous layer was extracted with BuOH, and concentrated under reduced pressure.
  • the concentrated BuOH extract under reduced pressure was induced to recrystallize with MeOH and the crystallized precipitate precipitate was washed with MeOH to obtain a methanol insoluble fraction and methanol soluble fraction.
  • the isolation of thymosaponin A-III was confirmed by mass spectrometry and 13 C-NMR (Bruker, AVANCE digital 400).
  • Figure 37 shows the chemical structural formula of Timothy saponin A-III.
  • mice Four-week-old ICR male mice (24-27 g) were purchased from Orient Bio. All mice were bred under controlled environmental conditions of 50 ⁇ 10% humidity and 25 ⁇ 2 ° C, and lighting was repeated for 12 hours and then turned off for 12 hours. Feed was used as standard experimental feed (Samyang, Korea) and drinking water was freely consumed. In all experiments, one group had 6 animals.
  • TNBS 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid
  • the experimental animal was lightly anesthetized with ether, and 2.5 g of NBS (2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid) solution was mixed with 50% ethanol. Inflammation was induced by injecting 0.1 ml inward and holding it vertically for 30 seconds. In contrast, the normal group was orally administered with 0.1 ml of saline solution.
  • the body weight of the experimental animal was measured the next day, and the weight change amount was calculated by comparing with the initial weight.
  • the extracted colon was observed and scored according to the criteria of Table 13 below (Hollenbach et al., 2005 Colitis Degree). At this time, a mesalazine (Sigma) administration group was used as a positive control. In addition, a portion of the colon contents were taken for intestinal microbial analysis and stored frozen at minus 80 °C. Colon tissues were removed from the colon contents, washed in physiological saline, and some were fixed with 4% formaldehyde fixative for use as pathological samples. The rest were frozen and stored at -80 ° C for molecular biology analysis.
  • the plate was inverted and emptied, and each well was washed with 200 ⁇ l of washing buffer.
  • the washing process was repeated three times using 200 ⁇ l of wash buffer, and then 100 ⁇ l of diluted streptavidin-peroxidase conjugate was added and reacted at room temperature for 1 hour.
  • the plate was inverted and emptied, and each well was washed with 200 ⁇ l of washing buffer.
  • the washing process was repeated three times using 200 ⁇ l of wash buffer, and then 100 ⁇ l of TMB substrate solution was added and the plate was wrapped in aluminum foil to block light and allowed to react at room temperature for 30 minutes.
  • the reaction was stopped by adding 100 ⁇ l of a stop solution and the absorbance was measured at 450 nm using an ELISA reader.
  • FIG. 38 is a graph showing the weight change of a model animal induced by acute colitis caused by TNBS when using thymosaponin A-III in Preparation Example 34
  • Figure 39 is a thymosaponin A in Preparation Example 34 as a drug sample
  • -III is used, it is a graph showing the appearance scores of colons extracted from model animals in which acute colitis was induced by TNBS.
  • 40 shows the colon length of a model animal induced by acute colitis by TNBS when thymosaponin A-III was used in Preparation Example 34
  • FIG. 41 is a thymosaponin A- in Preparation Example 34 as a drug sample.
  • thymosaponin A-III showed an effect of alleviating or ameliorating acute colitis induced by TNBS in a concentration-dependent manner.
  • the prophylactic or therapeutic effect of thymosaponin A-III was equivalent to that of mesalazine used as a positive control drug.
  • the extract of hair is a butanol soluble fraction of the extract of hair, Mangiferin, Neomangiferin, Neomangiferin, complex extract of Preparation Example 14, complex extract of Preparation Example 20, complex extract of Preparation Example 33 It can be replaced with thymosaponin A-III of Preparation Example 34.
  • tablets were prepared by tableting according to a conventional method for producing tablets.
  • the capsule was prepared by filling in gelatin capsules according to the conventional method for producing a capsule.
  • the hair extract is a butanol soluble fraction of hair extract, Mangiferin, Neomangiferin, Neomangiferin, complex extract of Preparation Example 14, complex extract of Preparation Example 20, complex extract of Preparation Example 33 It can be replaced with thymosaponin A-III of Preparation Example 34.
  • Brown rice, barley, glutinous rice, and yulmu were alphad by a known method, and then dried and roasted to prepare a powder having a particle size of 60 mesh.
  • Black beans, black sesame seeds, and perilla were also steamed and dried by a known method, and then ground to a powder having a particle size of 60 mesh.
  • Cereals (30 parts by weight brown rice, 15 parts by weight brittle, 20 parts by weight of barley),
  • Seeds (7 parts by weight perilla, 8 parts by weight black beans, 7 parts by weight black sesame seeds),
  • a homogeneous blend of subsidiary materials such as liquid fructose (0.5 g), oligosaccharide (2 g), sugar (2 g), salt (0.5 g) and water (75 g) and 5 g of the extract of Jim 1 of Preparation Example 1 of the present invention After instant sterilization it was prepared by packaging in a small packaging container such as glass bottles, plastic bottles.
  • the hair extract is a butanol soluble fraction of hair extract, Mangiferin, Neomangiferin, a composite extract of Preparation Example 14, a complex extract of Preparation Example 20, a complex extract of Preparation Example 33 It can be replaced with thymosaponin A-III of Preparation Example 34.
  • 0.1 to 20 parts by weight of the extract of Preparation Example 1 0.001 to 0.01 parts by weight of lipolysis enzyme, 1 to 20 parts by weight of tricalcium phosphate, 0.01 to 0.1 parts by weight of vitamin E, 1 to 10 parts by weight of enzyme powder, 0.1 to 10 parts by weight of lactic acid bacteria, 0.01 to 10% by weight of Bacillus culture and 20 to 90 parts by weight of glucose were combined to prepare a feed additive.
  • a feed additive was prepared by combining 24 parts by weight of the extract of Preparation Example 1, 24 parts by weight of Echochocho extract powder, 1 part by weight of lactic acid bacteria, 10 parts by weight of yeast, 1 part by weight of colostrum, 20 parts by weight of glucose and 20 parts by weight of alfalfa powder.

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Abstract

본 발명은 지모 추출물 등의 신규 용도에 관한 것으로서, 지모 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 단리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 생약의 복합 추출물에 대한 신규 용도에 관한 것으로서, 지모 추출물 등, 오배자 추출물 등 및 더덕 추출물 등을 유효성분으로 포함하거나 지모 추출물 등 및 황련 추출물 등을 유효성분으로 포함하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 지모 추출물 등 또는 복합 추출물은 약학 조성물 또는 기능성 식품 조성물을 구성하는 식의약적 소재로 사용될 수 있다. 이러한 약학 조성물 또는 기능성 식품 조성물은 급성 대장염이나 만성 대장염을 예방 또는 치료하는데에 사용될 수 있고, 특히, 염증성 대장 질환(Inflammatory bowel disease; IBD) 또는 과민성 대장염 증후군(irritable bowel syndrome, IBS)등을 효과적으로 예방, 지연, 개선 또는 치료할 수 있다.

Description

대장염 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 지모 추출물 등의 신규 용도에 관한 것으로서, 더 상세하게는 지모 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 지모 추출물과 다른 생약 추출물 등으로 이루어진 복합 추출물의 대장염 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
대장염은 대장에 염증이 발생하는 질환으로, 다양한 원인에 의해 발생하고, 테네스무스(tenesmus, 시원치 않음), 복부팽만감, 하복 부통, 설사 등이 주요 증상으로 나타나고, 분변 중에 점액, 고름이나 혈액이 섞이는 경우도 있다. 대장염은 원인에 따라 크게 감염성 대장염과 비감염성 대장염으로 구분될 수도 있고, 발병 기간에 따라 급성 대장염과 만성 대장염으로 구분될 수도 있다. 급성 대장염에는 아메바성이질, 세균성이질, 살모넬라나 항생물질에 의한 위막성 대장염(pseudomembranous enteritis) 등이 있고 만성 대장염에는 궤양성 대장염, 크론병, 결핵, 매독, X선 등에 의한 것이 있다. 또한, 대장염은 염증성 대장 질환(Inflammatory bowel disease; IBD) 뿐만 아니라 과민성 대장염 증후군(irritable bowel syndrome, IBS)등을 포함한다. 염증성 대장 질환(Inflammatory bowel disease; IBD) 중 대표적인 질환인 궤양성 대장염(ulcerative colitis; UC)과 크론병(Crohn's disease; CD)은 아직 원인이 명확히 밝혀져 있지 않고 있으며, 복통과 더불어 심한 만성 설사와 혈성 설사를 일으킬 수 있으며, 완치가 힘들고 호전과 악화를 반복하는 특성이 있다. 궤양성 대장염은 대장의 점막에 진무름(미란)이나 궤양이 연속적으로 형성되는 질환으로, 혈변, 점혈변, 설사, 복통이 일어나고, 중증인 경우에는 발열, 체중감소, 빈혈 등의 전신성의 증상이 나타난다. 또한, 궤양성 대장염은 위장관 어느 부위에서도 발생할 수 있다. 크론병은 입에서 항문에 이르는 소화관의 임의의 부위에 궤양 등의 병변이 비연속적으로 발생하는 질환으로서, 복통, 설사, 혈변과 더불어, 중증의 경우에는 발열, 하혈, 체중감소, 전신권태감, 빈혈 등의 증상이 나타난다. 궤양성 대장염과 크론병은 병변과 염증 증상에 있어서 차이가 있지만 여러 면에서 유사한 양상을 보이기 때문에 두 질환의 구분이 서로 명확하지 않은 경우가 흔하다.
종래, 궤양성 대장염 및 크론병의 발생율은 서양인에게 높다고 알려져 있었지만, 최근, 식습관 등의 생활습관의 변화로 인해 우리나라 등 동양에서도 환자수가 급증하고 있다. 그렇지만, 원인이 불분명한 이유도 있어 근본적 치료법은 확립되어 있지 않다. 이 때문에 완전한 치료를 목표로 하는 것이 아니라, 증상을 완해시키고, 이러한 상태를 가능한 한 장기간 유지하는 약제가 사용되고 있는 실정이다. 이러한 대증요법을 위한 약제로서, 주로 아미노살리실산제제, 부신피질 스테로이드제, 면역억제제 등이 사용되지만, 다양한 부작용이 보고되고 있다. 예를 들어, 아미노살리실산 제제로서 자주 사용되는 살라조설파피리딘은 구역질, 구토, 식욕부진, 발진, 두통, 간장해, 백혈구 감소, 이상 적혈구, 단백뇨, 설사 등의 부작용이 보고되고 있다. 또한 부신피질스테로이드제는 일반적으로는 프레드니솔론의 경구투여, 관장, 좌약, 정맥 주사 등으로 사용되지만, 위궤양이나 장기사용에 의한 대퇴골두 괴사 등 부작용이 강하다. 그러나 투약의 중단은 증상을 재발시키기 때문에, 이들 약제는 계속적으로 사용하지 않을 수 없다. 따라서, 효과가 우수하면서도, 안전하고 부작용을 일으키지 않는 궤양성 대장염, 크론병 등의 장질환 치료제의 개발이 요구되고 있다. 과민성 대장염 증후군(irritable bowel syndrome, IBS)도 마찬가지로 그 원인이 명확하지 않은 만성 복부 질환이다. 현재, IBS의 근본적인 치료제는 존재하지 않으며, 각 타입의 증상 경감을 목적으로 한 대증요법이 행해지고 있다. 예를 들어, 하리형 IBS에 대해서는 평활근의 수축을 억제하는 진경작용을 갖는 항콜린제가 사용되며, 변비형 IBS에는 염류 하제, 대체형 IBS에는 약제로 조절하기 곤란하고, 기본적으로 소화관 운동기능 개선제가 사용되고 있다.
한편, 지모(知母, Anemarrhena asphodeloides Bunge)는 외떡잎식물 백합목 지모과의 여러해살이풀로서, 이를 껍질째 말린 모지모(毛知母) 또는 이의 뿌리줄기를 약재로 사용하고 있다. 한방에서 지모의 뿌리줄기는 해열제로 사용하고, 만성기관지염 또는 당뇨병에 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 지모의 약학적 용도와 관련하여 대한민국 등록특허 공보 제10-0856335호에는 지모로부터 분리된 화합물의 호흡기 질환 예방 및 치료 효과가 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-0923953호에는 지모 추출물의 콜린신경계 손상 개선 효과가 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허공보 제10-1075742호에는 지모로부터 분리된 화합물의 지질대사 질환 예방 및 치료 효과가 개시되어 있다.
또한, 오배자(五倍子, Galla Rhois)는 매미목 진딧물과의 오배자면충(Schlechtendalia chinensis Bell)이 옻나무과의 붉나무(오배자나무, Rhus javanica L.)의 잎에 기생하여 만든 벌레집이다. 한방에서는 벌레를 제거한 것을 오배자라 하고 약재로 사용한다. 오배자의 약리작용으로 수렴효과, 항미생물작용, 항생육작용, 간기능보호작용, 항산화작용이 보고된바 있고, 대한민국 등록특허 공보 제10-0588470호에는 오배자 추출물의 암세포 전이 억제 효과가 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허공보 제10-1078002호에는 오배자 추출물의 비만 예방 및 치료 효과가 개시되어 있다.
또한, 더덕(Codonopsis lanceolata)은 초롱꽃과에 속하는 다년생 덩굴식물로, 대한민국 전역에 걸쳐 야생한다. 더덕의 비대해진 뿌리는 약용으로 널리 이용되고 있으며, 거담 등의 약효를 갖는 것으로 알려져 있다.
또한, 황련(
Figure 9ec3
連, Coptis)은 쌍떡잎식물 미나리아재비목 미나리아재비과의 상록 여러해살이풀로서, 구체적인 예로는 Coptis teeta, Coptis japonica, Coptis chinensis, Coptis deltoidea, Coptis omeiensis 등이 있다. 한방에서는 이의 뿌리줄기를 채취하여 햇볕에 말린 것을 약재로 사용하고 있고, 약효 성분으로 베르베린(Berberine), 콥티신(Coptisine), 워레닌(Worenine), 팔마틴(Palmatine) 등이 알려져 있으며, 항균, 소염, 해열, 담즙 분비 촉진, 혈압 하강 작용 등의 효능이 있는 것으로 보고되고 있다. 황련의 약학적 용도와 관련하여 대한민국 공개특허공보 제10-2001-0085669호에는 황련 추출물을 유효성분으로 포함하는 약물 중독 예방 및 치료를 위한 약제학적 조성물이 개시되어 있고, 대한민국 공개특허공보 제10-2009-0029022호에는 황련 추출물을 유효성분으로 하는 자외선으로 인한 피부질환 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있고, 대한민국 공개특허공보 제10-2013-0022733호에는 천황련 추출물을 포함하는 췌장암 치료용 조성물이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허공보 제10-0970739호에는 황련 추출물을 유효성분으로 함유하는 호흡기 질환의 예방 및 치료용 조성물이 개시되어 있고, 이 밖에도 황련 추출물을 포함하는 치주질환용 조성물, 황련 추출물을 포함하는 당뇨합병증의 예방 및 치료용 조성물, 황련 추출물을 포함하는 신경세포 보호 및 재생용 조성물 등이 개시되어 있다.
그러나, 대장염 예방 또는 치료와 관련된 지모의 효과는 알려진 바가 없으며, 나아가 지모, 오배자 및 더덕의 병용 또는 지모와 황련의 병용에 의한 대장염 예방 또는 치료와 관련된 약리 효과는 연구된 바가 없다.
본 발명은 종래의 기술적 배경하에서 도출된 것으로서, 본 발명의 일 목적은 지모 추출물 등의 대장염 예방 또는 치료에 관한 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 지모 추출물 등, 오배자 추출물 등 및 더덕 추출물 등을 포함하는 복합 추출물의 대장염 예방 또는 치료에 관한 용도를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은 지모 추출물 등과 황련 추출물 등을 포함하는 복합 추출물의 대장염 예방 또는 치료에 관한 용도를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 합성 화학물질에 비해 안전성이 확보된 수많은 천연물을 대상으로 대장염에 대한 예방 또는 치료 활성을 갖는 추출물을 개발하기 위하여 연구를 수행하였다. 그 결과, 지모로부터 얻어진 추출물, 이의 분획물 또는 이로부터 분리된 화합물 등이 대장염 모델동물에 대해 우수한 대장염 예방 또는 치료 활성을 가진다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다. 또한, 본 발명자들은 지모 추출물 등, 오배자 추출물 등 및 더덕 추출물 등으로 이루어진 복합 추출물이 대장염 모델동물에 대해 우수한 대장염 예방 또는 치료 활성을 가진다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다. 또한, 본 발명자들은 지모 추출물 등과 황련 추출물 등으로 이루어진 복합 추출물이 대장염 모델동물에 대해 우수한 대장염 예방 또는 치료 활성을 가진다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 측면은 지모 추출물, 지모 추출물의 탄소 수가 3 내지 8인 알코올 가용성 분획물, 만지페린(Mangiferin), 네오만지페린(Neomangiferin) 또는 티모사포닌 A-Ⅲ에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 지모 추출물, 지모 추출물 중 탄소 수가 3 내지 8인 알코올에 대한 가용성 분획물, 만지페린(Mangiferin), 네오만지페린(Neomangiferin) 또는 티모사포닌 A-Ⅲ에서 선택된 어느 하나 및 오배자 추출물, 오배자 추출물 중 탄소 수가 3 내지 8인 알코올에 대한 가용성 분획물 또는 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-β-D-글루코스(glucose1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 지모 추출물, 지모 추출물 중 탄소 수가 3 내지 8인 알코올에 대한 가용성 분획물, 만지페린(Mangiferin), 네오만지페린(Neomangiferin) 또는 티모사포닌 A-Ⅲ에서 선택된 어느 하나 및 더덕 추출물, 더덕 추출물 중 탄소 수가 3 내지 8인 알코올에 대한 가용성 분획물 또는 란세마사이드 A(Lancemaside A)에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 지모 추출물, 지모 추출물 중 탄소 수가 3 내지 8인 알코올에 대한 가용성 분획물, 만지페린(Mangiferin), 네오만지페린(Neomangiferin) 또는 티모사포닌 A-Ⅲ에서 선택된 어느 하나; 오배자 추출물, 오배자 추출물 중 탄소 수가 3 내지 8인 알코올에 대한 가용성 분획물 또는 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-β-D-글루코스(glucose1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)에서 선택된 어느 하나; 및 더덕 추출물, 더덕 추출물 중 탄소 수가 3 내지 8인 알코올에 대한 가용성 분획물 또는 란세마사이드 A(Lancemaside A)에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 지모 추출물, 지모 추출물 중 탄소 수가 3 내지 8인 알코올에 대한 가용성 분획물, 만지페린(Mangiferin), 네오만지페린(Neomangiferin) 또는 티모사포닌 A-Ⅲ에서 선택된 어느 하나; 및 황련 추출물 또는 황련 추출물 중 탄소 수가 3 내지 8인 알코올에 대한 가용성 분획물에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 상기 상기 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 바람직하게는 약학 조성물 또는 식품 조성물이다.
본 발명에 따른 지모 추출물 등; 지모 추출물 등, 오배자 추물물 등 및 더덕 추출물 등으로 이루어진 복합 추출물; 또는 지모 추출물 등 및 황련 추출물 등으로 이루어진 복합 추출물은 약학 조성물 또는 기능성 식품 조성물을 구성하는 식의약적 소재로 사용될 수 있다. 이러한 약학 조성물 또는 기능성 식품 조성물은 급성 대장염이나 만성 대장염을 예방 또는 치료하는데에 사용될 수 있고, 특히, 염증성 대장 질환(Inflammatory bowel disease; IBD) 또는 과민성 대장염 증후군(irritable bowel syndrome, IBS)등을 효과적으로 예방, 지연, 개선 또는 치료할 수 있다.
도 1은 만지페린(Mangiferin) 및 네오만지페린(Neomangiferin)의 화학 구조식을 나타낸 것이다.
도 2는 TNBS 처리에 의해 급성 대장염을 유발한 후 제조예 2에서 얻은 지모 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 투여한 실험동물군의 대장에서 염증 반응 지표 물질의 발현이 억제되는 것을 나타낸 결과이다. 도 2에서 "JM"은 제조예 2에서 얻은 지모 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 나타내고, "MEL"은 메살라진(Mesalazine)을 나타낸다.
도 3은 TNBS 처리에 의해 급성 대장염을 유발한 후 만지페린(mangiferin)을 투여한 실험동물군의 대장에서 염증 반응 지표 물질의 발현이 억제되는 것을 나타낸 결과이다. 도 3에서 "MF"는 만지페린(mangiferin)을 나타내고, "MEL"은 메살라진(Mesalazine)을 나타낸다.
도 4는 LPS(lipopolysaccharide) 또는 PG(peptidolgycan)로 처리된 대식세포에서 만지페린(mangiferin)에 의해 염증 반응이 억제되는 것을 나타낸 결과이다.
도 5는 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-β-D-글루코스(glucose1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)의 화학 구조식을 나타낸 것이다.
도 6은 추출물 기반의 시료를 투여했을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물의 체중 변화량을 나타낸 그래프이다.
도 7은 부탄올 가용성 분획물 기반의 시료를 투여했을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물의 체중 변화량을 나타낸 그래프이다.
도 8은 TNBS 처리에 의해 급성 대장염을 유발한 후 추출물 기반의 시료를 투여한 실험동물군의 대장에서 염증 반응 지표 물질의 발현이 억제되는 것을 나타낸 결과이다.
도 9는 TNBS 처리에 의해 급성 대장염을 유발한 후 부탄올 가용성 분획물 기반의 시료를 투여한 실험동물군의 대장에서 염증 반응 지표 물질의 발현이 억제되는 것을 나타낸 결과이다.
도 10은 LPS(lipopolysaccharide)로 처리된 대식세포에서 오배자 추출물, 지모 추출물 및 더덕 추출물로 이루어진 복합 추출물에 의해 염증 반응이 억제되는 것을 나타낸 결과이다.
도 11은 약물 시료로 제조예 22에서 수득한 지모 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 체중 변화 및 대장의 외관 점수를 나타낸 그래프이고, 도 22는 약물 시료로 제조예 22에서 수득한 지모 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장 길이 및 MPO 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 약물 시료로 제조예 23에서 수득한 만지페린(Mangiferin)을 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 체중 변화, 대장의 외관 점수, 대장 길이 및 MPO 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 체중 변화 및 대장의 외관 점수를 나타낸 그래프이고 도 15는 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장 길이 및 MPO 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 약물 시료로 제조예 22에서 수득한 지모 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 IL-1 베타 및 IL-6의 발현량을 나타낸 그래프이고, 도 17은 약물 시료로 제조예 22에서 수득한 지모 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 TNF-알파 및 IL-10의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 18은 약물 시료로 제조예 23에서 수득한 만지페린(Mangiferin)을 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 염증 유발 사이토카인(proinflammatory cytokine) 및 항염증 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 19는 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 IL-1 베타 및 IL-6의 발현량을 나타낸 그래프이고, 도 20은 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 TNF-알파 및 IL-10의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 21은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 복합 추출물을 투여하였을 때 모델동물의 대장조직에서 염증 반응 지표 물질의 발현이 억제되는 것을 나타낸 결과이다.
도 22는 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 DSS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 체중 변화 및 대장의 외관 점수를 나타낸 그래프이고 도 23은 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 DSS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장 길이 및 MPO 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 24는 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 DSS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 IL-1 베타 및 IL-10의 발현량을 나타낸 그래프이고, 도 25는 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 DSS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 TNF-알파 및 IL-6의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 26은 DSS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 복합 추출물을 투여하였을 때 모델동물의 대장조직에서 염증 반응 지표 물질의 발현이 억제되는 것을 나타낸 결과이다.
도 27은 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 옥사졸론에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물의 체중 변화 및 대장의 외관 점수를 나타낸 그래프이고 도 28은 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 옥사졸론에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물의 대장 길이 및 MPO 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 29는 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 옥사졸론에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 IL-1 베타 및 IL-10의 발현량을 나타낸 그래프이고, 도 30은 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 옥사졸론에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 TNF-알파 및 IL-6의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 31은 옥사졸론에 의해 만성 대장염이 유도된 모델동물에 복합 추출물을 투여하였을 때 모델동물의 대장조직에서 염증 반응 지표 물질의 발현이 억제되는 것을 나타낸 결과이다.
도 32는 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 DSS에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물의 체중 변화 및 대장의 외관 점수를 나타낸 그래프이고 도 33은 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 DSS에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물의 대장 길이 및 MPO 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 34는 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 DSS에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 IL-1 베타 및 IL-10의 발현량을 나타낸 그래프이고, 도 35는 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 DSS에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 TNF-알파 및 IL-6의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 36은 DSS에 의해 만성 대장염이 유도된 모델동물에 복합 추출물을 투여하였을 때 모델동물의 대장조직에서 염증 반응 지표 물질의 발현이 억제되는 것을 나타낸 결과이다.
도 37은 티모사포닌 A-Ⅲ의 화학 구조식을 나타낸 것이다.
도 38은 약물 시료로 제조예 34에서 티모사포닌 A-Ⅲ를 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 체중 변화를 나타낸 그래프이고, 도 39는 약물 시료로 제조예 34에서 티모사포닌 A-Ⅲ를 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에서 적출한 대장의 외관 점수를 나타낸 그래프이다.
도 40은 약물 시료로 제조예 34에서 티모사포닌 A-Ⅲ를 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장 길이를 나타낸 것이고, 도 41은 약물 시료로 제조예 34에서 티모사포닌 A-Ⅲ를 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에서 적출한 대장의 MPO 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료"는 본 발명의 조성물의 투여로 특정 질환의 증상을 호전 또는 이롭게 변경시키는 모든 개선 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다. 이때, 개체는 본 발명의 조성물을 투여하여 특정 질환의 증상이 호전될 수 있는 질환을 가진 인간, 원숭이, 개, 염소, 돼지 또는 쥐 등 모든 동물을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 대장염 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 본 발명에서 대장염은 세균 감염이나 장 내용물의 병적 발효 등으로 인해 대장에 염증이 발생한 상태를 말하며, 감염성 대장염과 비감염성 대장염을 포함하는 개념이다. 본 발명에 따른 복합 추출물을 통해 예방 또는 치료가 가능한 구체적인 대장염의 종류는 염증성 대장 질환 또는 과민성 대장염 증후군 등이 있으나, 여기에 제한되는 것은 아니다. 염증성 대장 질환은 예를 들어 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 또는 크론병(Crohn's disease) 등이 있다. 또한, 본 발명에 따른 복합 추출물을 통해 예방 또는 치료가 가능한 대장염은 급성 대장염과 만성 대장염을 모두 포함한다. 급성 대장염은 급성으로 오는 대장 또는 결장에의 염증을 말하는데, 염증으로 인해 점막이 손상되어 점액성 설사나 선혈 증상을 주로 보인다. 본 발명에서 급성 대장염은 일반적인 급성 감염성 대장염뿐만 아니라 급성 위막성 대장염 및 급성 궤양성 대장염을 포함한다.
본 발명의 일 예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 지모 추출물, 지모 추출물의 탄소 수가 3 내지 8인 알코올 가용성 분획물, 만지페린(Mangiferin), 네오만지페린(Neomangiferin) 또는 티모사포닌 A-Ⅲ에서 선택된 어느 하나(이하, "지모 추출물 등"으로 표기함)를 유효성분으로 포함한다. 상기 지모 추출물 등은 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)에 의해 유발된 대장염 동물 모델에서 대장의 외관을 양호하게 하고 결장의 수축을 억제하며, 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성을 낮게 유지시켜 대장염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명에서 지모 추출물은 지모의 다양한 기관 또는 부분, 예를 들어 잎, 꽃, 뿌리, 줄기, 뿌리줄기, 열매, 종자 등으로부터 추출될 수 있으며, 바람직하게는 뿌리줄기로부터 추출될 수 있다. 또한, 지모 추출물은 당업계에 공지된 통상의 추출 방법, 예를 들어 용매 추출법을 사용하여 제조될 수 있다. 용매 추출법에 사용되는 추출 용매는 물, 탄소 수가 1 내지 4인 저급 알코올(예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 부탄올) 또는 이들의 혼합물인 함수 저급 알코올, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 글리세린, 아세톤, 디에틸에테르, 에틸 아세테이트, 부틸아세테이트, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 이들의 혼합물로 구성된 군으로부터 선택될 수 있고, 이중 물, 알코올 또는 이들의 혼합물에서 선택되는 것이 바람직하다. 추출 용매로 물을 사용하는 경우 물은 열수인 것이 바람직하다. 또한, 추출 용매로 알코올을 사용하는 경우 알코올은 탄소 수가 1 내지 4인 저급 알코올인 것이 바람직하고, 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올에서 선택되는 것이 더 바람직하다. 또한, 추출 용매로 함수 알코올을 사용하는 경우 알코올 함량은 50~90%인 것이 바람직하고, 60~80%인 것이 더 바람직하다. 한편, 본 발명에서 지모 추출물은 상기한 추출 용매뿐만 아니라, 다른 추출 용매를 이용하여도 실질적으로 동일한 효과를 나타내는 추출물이 얻어질 수 있다는 것은 당업자에게 자명한 것이다. 또한, 본 발명에서 지모 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 다른 추출 방법을 통해 얻어진 추출물 내지 정제 및 발효 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계 추출법에 의한 추출, 초음파를 이용한 추출법에 의한 추출, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의해 분리하거나 자연 상태나 각종 미생물을 이용한 발효산물에 의한 추출물 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 및 추출방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함된다. 상기 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계 추출법에 의한 추출법은 초임계 유체 추출법(supercritical fluid extraction)을 의미하는 것으로, 일반적으로 초임계 유체는 기체가 고온 고압 조건에서 임계점에 도달하였을 때 갖는 액체 및 기체의 성질을 지니고 있으며, 화학적으로 비극성 용매와 유사한 극성을 지니고 있으며 이러한 특성으로 인해 초임계 유체는 지용성 물질의 추출에 사용되고 있다(J. Chromatogr. A. 1998;479:200-205). 이산화탄소는 초임계 유체기기의 작동으로 압력 및 온도가 임계점까지 이르는 과정을 거치면서 액체 및 기체 성질을 동시에 지닌 초임계 유체가 되고 그 결과 지용성 용질에 대한 용해도가 증가한다. 초임계 이산화탄소가 일정량의 시료를 함유한 추출 용기를 통과하게 되면 시료에 함유된 지용성 물질은 초임계 이산화탄소에 추출되어 나온다. 지용성 물질을 추출한 후 추출 용기에 남아있는 시료에 다시 소량의 공용매가 함유된 초임계 이산화탄소를 흘려 통과시키면 순수한 초임계 이산화탄소만으로는 추출되지 않았던 성분들이 추출되어 나오게 할 수 있다. 본 발명의 초임계추출법에 사용되는 초임계 유체는 초임계 이산화탄소 또는 이산화탄소에 추가적으로 공용매를 혼합한 혼합유체를 사용함으로써 효과적으로 유효 성분을 추출할 수 있다. 이러한 공용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출된 시료는 대부분 이산화탄소를 함유하고 있는데 이산화탄소는 실온에서 공기 중으로 휘발되므로 상기 방법으로 얻은 추출물을 화장료 조성물로서 사용할 수 있으며, 공용매는 감압증발기로 제거할 수 있다. 또한, 상기 초음파 추출법은 초음파 진동에 의해 발생되는 에너지를 이용하는 추출방법으로, 초음파가 수용성 용매 속에서 시료에 포함된 불용성인 용매를 파괴시킬 수 있으며, 이때 발생되는 높은 국부온도로 인하여 주위에 위치하는 반응물 입자들의 운동에너지를 크게 하기 때문에 반응에 필요한 충분한 에너지를 얻게 되고, 초음파 에너지의 충격효과로 높은 압력을 유도하여 시료에 함유된 물질과 용매의 혼합 효과를 높여주어 추출효율을 증가시키게 된다. 초음파 추출법에 사용할 수 있는 추출용매는 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 물, 에틸아세테이트, 헥산 및 디에틸 에테르로 이루어진 군에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출된 시료는 진공 여과하여 여과액을 회수한 후 감압증발기로 제거하고, 동결 건조하는 통상의 추출물 제조방법을 통해 추출물을 얻을 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 지모 추출물은 발효과정을 거친 추출물도 포함하는데, 지모의 발효추출물은 다음과 같이 제조할 수 있다. 지모를 100~500메쉬 정도로 미세하게 파쇄한 다음 통상적인 미생물 배양액을 1~50g/L를 첨가하고 효모균주 또는 유산균등의 미생물을 10,000~100,000 cfu/L의 양으로 첨가한다. 배양온도는 30~37℃의 통상적인 미생물 배양조건으로 배양한다. pH는 5~7로 호기적 또는 통상 혐기(anaerobic)적인 조건으로 약 5일 내지 10일간 배양한다. 이후 숙성 및 여과를 통해 얻을 수 있다.
또한, 본 발명에서 지모 추출물의 알코올 가용성 분획물은 지모 추출물로부터 얻어질 수 있다. 이때, 상기 지모 추출물의 알코올 가용성 분획물을 얻기 위해 사용되는 알코올은 탄소 수가 3 내지 8이고, 지모 추출물의 활성 물질에 대한 가용성 및 가용화 후의 감압 농축 공정 등을 고려할 때 탄소 수가 3 내지 6인 것이 바람직하고, 탄소 수가 3 내지 5인 것이 더 바람직하고 탄소 수가 4인 것이 가장 바람직하다. 본 발명에서 지모 추출물의 가용화를 위해 사용되는 탄소 수 4의 알코올에는 n-부탄올, sec-부탄올, 이소부탄올, tert-부탄올 등이 있다. 본 발명에서 지모 추출물의 알코올 가용성 분획물은 지모 추출물에 포함된 성분들 중 탄소 수가 3 내지 8인 알코올에 가용 될 수 성분들로 이루어진 것으로서, 이 경우 지모 추출물은 물, 탄소 수가 1 내지 2인 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출되는 것이 바람직하다. 지모 추출물의 알코올 가용성 분획물물은 예를 들어 물, 탄소 수가 1 내지 2인 알코올 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 사용하여 지모 추출물을 얻고, 여기에 물을 가하여 현탁시킨 후, 탄소 수가 3 내지 8인 알코올(예를 들어, 부탄올)을 첨가하고 분획하여 수득할 수 있다.
또한, 본 발명에서 지모 추출물 또는 이의 알코올 가용성 분획물은 활성 물질로 만지페린(Mangiferin) 또는 네오만지페린(Neomangiferin)을 포함한다. 본 발명에서 만지페린(Mangiferin) 또는 네오만지페린(Neomangiferin)은 지모 추출물 또는 지모 추출물의 알코올 가용성 분획물을 대신하여 대장염 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다. 다만, 지모 추출물 또는 이의 알코올 가용성 분획물에 포함된 활성 물질은 추출방법 또는 분획방법에 따라 구체적인 성분의 종류나 함량에 약간의 차이가 발생할 수 있다.
또한, 본 발명에서 티모사포닌 A-Ⅲ는 지모로부터 분리될 수 있다. 예를 들어 티모사포닌 A-Ⅲ는 (i) 지모를 알코올, 물, 또는 알코올과 물의 혼합용매, 가장 바람직하게는 70% 에탄올로 추출하고 감압농축시키는 단계; (ii) 생성된 추출물을 물에 재현탁하고 메틸렌클로라이드로 분획하여 물 분획을 수득하는 단계; (iii) 수득된 물 분획을 부탄올로 분획하여 부탄올 분획을 수득하는 단계; (iv) 수득된 부탄올 분획을 감압농축하고 메탄올에서 재결정을 유도한 후, 생성된 침전물을 메탄올로 세척하여 메탄올 불용성 분획과 메탄올 가용성 분획을 수득하는 단계; 및 (v) 수득된 메탄올 가용성 분획을 컬럼 크로마토그래피하여 티모사포닌 A-ⅢI를 주성분으로 함유하는 분획을 수득하는 단계에 의해 제조될 수 있다. 상기 단계 (v)에서, 컬럼 크로마토그래피는 바람직하게는 실리카겔 컬럼 상에서 메틸렌클로라이드, 메탄올 및 물의 혼합용매를 사용하여 수행한다. 상기 혼합용매는 메틸렌클로라이드:메탄올:물이 7:1:0.5~7:3:1인 것이 바람직하다.
본 발명의 다른 예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 지모 추출물, 지모 추출물 중 탄소 수가 3 내지 8인 알코올에 대한 가용성 분획물, 만지페린(Mangiferin), 네오만지페린(Neomangiferin) 또는 티모사포닌 A-Ⅲ에서 선택된 어느 하나(이하 "지모 추출물 등"으로 표기함) 및 오배자 추출물, 오배자 추출물 중 탄소 수가 3 내지 8인 알코올에 대한 가용성 분획물 또는 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-β-D-글루코스(glucose1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)에서 선택된 어느 하나(이하, "오배자 추출물 등"으로 표기함)를 유효성분으로 포함한다. 또한, 본 발명의 다른 예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 지모 추출물, 지모 추출물 중 탄소 수가 3 내지 8인 알코올에 대한 가용성 분획물, 만지페린(Mangiferin), 네오만지페린(Neomangiferin) 또는 티모사포닌 A-Ⅲ에서 선택된 어느 하나(이하 "지모 추출물 등"으로 표기함) 및 더덕 추출물, 더덕 추출물 중 탄소 수가 3 내지 8인 알코올에 대한 가용성 분획물 또는 란세마사이드 A(Lancemaside A)에서 선택된 어느 하나(이하, "더덕 추출물 등"으로 표기함)를 유효성분으로 포함한다. 또한, 본 발명의 다른 예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 지모 추출물, 지모 추출물 중 탄소 수가 3 내지 8인 알코올에 대한 가용성 분획물, 만지페린(Mangiferin), 네오만지페린(Neomangiferin) 또는 티모사포닌 A-Ⅲ에서 선택된 어느 하나(이하 "지모 추출물 등"으로 표기함); 오배자 추출물, 오배자 추출물 중 탄소 수가 3 내지 8인 알코올에 대한 가용성 분획물 또는 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-β-D-글루코스(glucose1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)에서 선택된 어느 하나(이하, "오배자 추출물 등"으로 표기함); 및 더덕 추출물, 더덕 추출물 중 탄소 수가 3 내지 8인 알코올에 대한 가용성 분획물 또는 란세마사이드 A(Lancemaside A)에서 선택된 어느 하나(이하, "더덕 추출물 등"으로 표기함)를 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 다른 예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 지모 추출물 등 및 오배자 추출물 등 또는 지모 추출물 등 및 더덕 추출물 등 또는 지모 추출물 등, 오배자 추출물 등 및 더덕 추출물 등과 같이 적어도 2가지 생약의 추출물로 이루어진 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는데, 이때, 복합 추출물을 구성하는 지모 추출물 등, 오배자 추출물 등 및 더덕 추출물 등의 혼합비는 크게 제한되지 않는다. 예를 들어, 3가지 생약의 추출물로 이루어진 복합 추출물은 복합 추출물 전체 중량을 기준으로 지모 추출물 등 10~40 중량%, 오배자 추출물 등 20~80 중량% 및 더덕 추출물 등 10~40 중량%로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 3가지 생약의 추출물로 이루어진 복합 추출물 내에서 지모 추출물 등, 오배자 추출물 등 및 더덕 추출물 등의 중량비는 1:8:1 내지 4:2:4인 것이 바람직하고, 2:6:2 내지 3:4:3인 것이 더 바람직하다. 본 발명의 다른 예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 유효성분으로 다양한 조합의 복합 추출물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 다른 예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 유효성분으로 오배자 추출물, 지모 추출물 및 더덕 추출물을 포함하거나, 오배자 추출물, 지모 추출물 및 더덕 추출물의 알코올 가용성 분획물을 포함하거나, 오배자 추출물, 지모 추출물의 알코올 가용성 분획물 및 더덕 추출물을 포함하거나, 오배자 추출물, 지모 추출물의 알코올 가용성 분획물 및 더덕 추출물의 알코올 가용성 분획물을 포함하거나, 오배자 추출물의 알코올 가용성 분획물, 지모 추출물 및 더덕 추출물을 포함하거나, 오배자 추출물의 알코올 가용성 분획물, 지모 추출물 및 더덕 추출물의 알코올 가용성 분획물을 포함하거나, 오배자 추출물의 알코올 가용성 분획물, 지모 추출물의 알코올 가용성 분획물 및 더덕 추출물을 포함하거나, 오배자 추출물의 알코올 가용성 분획물, 지모 추출물의 알코올 가용성 분획물 및 더덕 추출물의 알코올 가용성 분획물을 포함하거나, 만지페린(또는, 네오만지페린), 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-β-D-글루코스(glucose1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose) 및 란세마사이드 A(Lancemaside A)를 포함할 수 있다. 본 발명의 다른 예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)에 의해 유발된 대장염 동물 모델에서 대장의 외관을 양호하게 하고 결장의 수축을 억제하며, 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성을 낮게 유지시켜 대장염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 지모 추출물 등 및 오배자 추출물 등의 상승 작용, 지모 추출물 등 및 더덕 추출물 등의 상승 작용, 또는 지모 추출물 등, 오배자 추출물 등 및 더덕 추출물 등의 상승 작용으로 지모 추출물 등만을 유효성분으로 포함하는 경우보다 우수한 대장염 예방 또는 치료 효과를 나타낸다.
본 발명의 다른 예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분인 복합 추출물은 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 3가지 생약의 추출물로 이루어진 복합 추출물은 오배자, 지모 및 더덕을 혼합한 후 여기에 추출 용매를 가하고 혼합 추출물을 추출하여 제조할 수도 있고, 다시 혼합 추출물에 탄소 수가 3 내지 8인 알코올을 가하고 분획하여 제조할 수도 있다. 또한, 상기 3가지 생약의 추출물로 이루어진 복합 추출물은 오배자, 지모 및 더덕으로부터 각각 오배자 추출물, 지모 추출물 및 더덕 추출물을 얻은 후 이들을 혼합하여 제조할 수도 있고, 다시 오배자 추출물, 지모 추출물 및 더덕 추출물로부터 오배자 추출물의 알코올 가용성 분획물, 지모 추출물의 알코올 가용성 분획물 및 더덕 추출물의 알코올 가용성 분획물을 얻은 후 이들을 혼합하여 제조할 수도 있다. 오배자 추출물 또는 더덕 추출물의 제조방법은 전술한 지모 추출물의 제조방법과 동일하거나 유사하므로 구체적인 설명을 생략한다.
또한, 본 발명의 다른 예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분인 복합 추출물을 구성하는 오배자 추출물의 알코올 가용성 분획물, 지모 추출물의 알코올 가용성 분획물 또는 더덕 추출물의 알코올 가용성 분획물은 각각 오배자 추출물, 지모 추출물 또는 더덕 추출물로부터 얻어질 수 있다. 이때, 상기 가용성 분획물을 얻기 위해 사용되는 알코올은 탄소 수가 3 내지 8이고, 오배자 추출물, 지모 추출물 또는 더덕 추출물의 활성 물질에 대한 가용성 및 가용화 후의 감압 농축 공정 등을 고려할 때 탄소 수가 3 내지 6인 것이 바람직하고, 탄소 수가 3 내지 5인 것이 더 바람직하고 탄소 수가 4인 것이 가장 바람직하다. 본 발명에서 오배자 추출물, 지모 추출물 또는 더덕 추출물의 가용화를 위해 사용되는 탄소 수 4의 알코올에는 n-부탄올, sec-부탄올, 이소부탄올, tert-부탄올 등이 있다. 본 발명의 다른 예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분로 사용되는 오배자 추출물의 알코올 가용성 분획물, 지모 추출물의 알코올 가용성 분획물 또는 더덕 추출물의 알코올 가용성 분획물은 오배자 추출물, 지모 추출물 또는 더덕 추출물에 포함된 성분들 중 탄소 수가 3 내지 8인 알코올에 가용 될 수 성분들로 이루어진 것으로서, 이 경우 오배자 추출물, 지모 추출물 또는 더덕 추출물은 물, 탄소 수가 1 내지 2인 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출되는 것이 바람직하다. 또한, 오배자 추출물의 알코올 가용성 분획물, 지모 추출물의 알코올 가용성 분획물 또는 더덕 추출물의 알코올 가용성 분획물은 예를 들어 물, 탄소 수가 1 내지 2인 알코올 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 사용하여 오배자 추출물, 지모 추출물 또는 더덕 추출물을 얻고, 여기에 물을 가하여 현탁시킨 후, 탄소 수가 3 내지 8인 알코올(예를 들어, 부탄올)을 첨가하고 분획하여 수득할 수 있다.
또한, 본 발명에서 오배자 추출물 또는 이의 알코올 가용성 분획물은 활성 물질로 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-β-D-글루코스(glucose1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)를 포함한다. 또한, 본 발명에서 지모 추출물 또는 이의 알코올 가용성 분획물은 활성 물질로 만지페린(Mangiferin) 또는 네오만지페린(Neomangiferin)을 포함한다. 또한, 본 발명에서 더덕 추출물 또는 이의 알코올 가용성 분획물은 활성 물질로 란세마사이드 A(Lancemaside A)를 포함한다. 다만, 상기 오배자 추출물 또는 이의 알코올 가용성 분획물, 지모 추출물 또는 이의 알코올 가용성 분획물 및 더덕 추출물 또는 이의 알코올 가용성 분획물에 포함된 활성 물질은 추출방법 또는 분획방법에 따라 구체적인 성분의 종류나 함량에 약간의 차이가 발생할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 지모 추출물, 지모 추출물 중 탄소 수가 3 내지 8인 알코올에 대한 가용성 분획물, 만지페린(Mangiferin), 네오만지페린(Neomangiferin) 또는 티모사포닌 A-Ⅲ에서 선택된 어느 하나(이하, "지모 추출물 등"으로 표기함); 및 황련 추출물 또는 황련 추출물 중 탄소 수가 3 내지 8인 알코올에 대한 가용성 분획물에서 선택된 어느 하나(이하, "황련 추출물 등"으로 표기함)를 유효성분으로 포함한다. 본 발명의 바람직한 다른 예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 지모 추출물 등 및 황련 추출물 등과 같이 적어도 2가지 생약의 추출물로 이루어진 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는데, 이때, 복합 추출물을 구성하는 지모 추출물 등 및 황련 추출물 등의 혼합비는 크게 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 복합 추출물은 복합 추출물 전체 중량을 기준으로 지모 추출물 등 10~90 중량% 및 황련 추출물 또는 황련 추출물 등 10~90 중량%로 이루어질 수 있다. 또한, 상기 복합 추출물 내에서 지모 추출물 등 및 황련 추출물 등의 중량비는 9:1 내지 1:9인 것이 바람직하고, 2:8 내지 8:2인 것이 더 바람직하다. 본 발명의 바람직한 다른 예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 유효성분으로 다양한 조합의 복합 추출물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 다른 예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 유효성분으로 지모 추출물 및 황련 추출물을 포함하거나, 지모 추출물 및 황련 추출물의 알코올 가용성 분획물을 포함하거나, 지모 추출물의 알코올 가용성 분획물 및 황련 추출물을 포함하거나, 지모 추출물의 알코올 가용성 추출물 및 황련 추출물의 알코올 가용성 분획물을 포함하거나, 만지페린(또는 네오만지페린) 및 황련 추출물을 포함하거나, 만지페린(또는 네오만지페린) 및 황련 추출물의 알코올 가용성 분획물을 포함할 수 있다. 본 발명의 바람직한 다른 예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물, 덱스트란황산나트륨(dextran sulfate sodium, DSS)에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물, 옥사졸론(Oxazolone)에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물, 덱스트란황산나트륨(dextran sulfate sodium, DSS)에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물에서 대장의 외관을 양호하게 하고 결장의 수축을 억제하며, 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성을 낮게 유지시켜 대장염을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, 본 발명의 다른 예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 지모 추출물 등과 황련 추출물 등의 상승 작용으로 지모 추출물 등만을 유효성분으로 포함하는 경우 또는 지모 추출물등, 오배자 추출물 등 및 더덕 추출물 등을 유효성분으로 포함하는 경우보다 우수한 대장염 예방 또는 치료 효과를 나타낸다.
본 발명의 바람직한 다른 예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분인 복합 추출물은 다양한 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 복합 추출물은 지모 및 황련을 혼합한 후 여기에 추출 용매를 가하고 혼합 추출물을 추출하여 제조할 수도 있고, 다시 혼합 추출물에 탄소 수가 3 내지 8인 알코올을 가하고 분획하여 제조할 수도 있다. 또한, 상기 복합 추출물은 지모 및 황련으로부터 각각 지모 추출물 및 황련 추출물을 얻은 후 이들을 혼합하여 제조할 수도 있고, 다시 지모 추출물 및 황련 추출물로부터 지모 추출물의 알코올 가용성 분획물 및 황련 추출물의 알코올 가용성 분획물을 얻은 후 이들을 혼합하여 제조할 수도 있다. 황련 추출물의 제조방법은 전술한 지모 추출물의 제조방법과 동일하거나 유사하므로 구체적인 설명을 생략한다. 한편, 본 발명에서 황련 추출물을 제조하기 위해 사용되는 황련은 황련속(Coptis) 속에 해당하는 것이라면 그 종류가 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 Coptis teeta, Coptis japonica, Coptis chinensis, Coptis deltoidea, Coptis omeiensis 등이 있다. 또한, 본 발명에서 황련은 그 뿌리줄기에 포함된 대장염의 예방 또는 치료 효과를 가진 활성성분의 양과 구성비를 고려할 때 천황련(Coptis chinensis)인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 바람직한 다른 예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분인 복합 추출물을 구성하는 지모 추출물의 알코올 가용성 분획물 및 황련 추출물의 알코올 가용성 분획물은 각각 지모 추출물 및 황련 추출물로부터 얻어진다. 이때, 상기 가용성 분획물을 얻기 위해 사용되는 알코올은 탄소 수가 3 내지 8이고, 지모 추출물 또는 황련 추출물의 활성 물질에 대한 가용성 및 가용화 후의 감압 농축 공정 등을 고려할 때 탄소 수가 3 내지 6인 것이 바람직하고, 탄소 수가 3 내지 5인 것이 더 바람직하고 탄소 수가 4인 것이 가장 바람직하다. 본 발명에서 지모 추출물 또는 황련 추출물의 가용화를 위해 사용되는 탄소 수 4의 알코올에는 n-부탄올, sec-부탄올, 이소부탄올, tert-부탄올 등이 있다. 본 발명의 바람직한 다른 예에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물의 유효성분로 사용되는 지모 추출물의 알코올 가용성 분획물 또는 황련 추출물의 알코올 가용성 분획물은 지모 추출물 또는 황련 추출물에 포함된 성분들 중 탄소 수가 3 내지 8인 알코올에 가용 될 수 성분들로 이루어진 것으로서, 이 경우 지모 추출물 또는 황련 추출물은 물, 탄소 수가 1 내지 2인 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출되는 것이 바람직하다. 지모 추출물의 알코올 가용성 분획물 또는 황련 추출물의 알코올 가용성 분획물은 예를 들어 물, 탄소 수가 1 내지 2인 알코올 또는 이들의 혼합물을 추출용매로 사용하여 지모 추출물 또는 황련 추출물을 얻고, 여기에 물을 가하여 현탁시킨 후, 탄소 수가 3 내지 8인 알코올(예를 들어, 부탄올)을 첨가하고 분획하여 수득할 수 있다.
또한, 본 발명에서 지모 추출물 또는 이의 알코올 가용성 분획물은 활성 물질로 만지페린(Mangiferin) 또는 네오만지페린(Neomangiferin)을 포함한다. 또한, 본 발명에서 황련 추출물 또는 이의 알코올 가용성 분획물은 활성 물질로 베르베린(Berberine)을 포함한다. 아울러, 상기 황련 추출물 또는 이의 알코올 가용성 분획물은 활성 물질로 팔마틴, 콥티신, 컬럼바민 또는 자트로리진 등을 더 포함할 수 있다. 다만, 지모 추출물 또는 이의 알코올 가용성 분획물 및 황련 추출물 또는 이의 알코올 가용성 분획물에 포함된 활성 물질은 추출방법 또는 분획방법에 따라 구체적인 성분의 종류나 함량에 약간의 차이가 발생할 수 있다.
본 발명에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 사용 목적 내지 양상에 따라 약학 조성물, 식품 조성물(특히 기능성 식품), 또는 사료 첨가제 등으로 구체화될 수 있고, 조성물 내에서의 추출물 기반의 유효성분 함량도 조성물의 구체적인 형태, 사용 목적 내지 양상에 따라 다양한 범위에서 조정될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에서 추출물 기반의 유효성분 함량은 조성물 총 중량을 기준으로 0.1~99 중량%, 바람직하게는 0.5~50 중량%, 더 바람직하게는 1~30 중량%이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 추출물 기반의 유효성분 외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 같은 첨가제를 더 포함할 수 있다. 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 대장염 예방 또는 치료용 조성물은 추출물 기반의 성분 외에 대장염 예방 또는 치료 효과를 갖는 공지의 유효 성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 의해 경구 투여를 위한 제형 또는 비경구 투여를 위한 제형으로 제제화될 수 있고, 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 추출물 기반의 성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 인간을 포함한 포유류에 경구 투여되거나 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여 방식으로는 피부 외용, 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식 등이 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량은 크게 제한되지 않으며, 예를 들어 추출물 기반의 유효성분을 기준으로 할 때 0.1 내지 1000 ㎎/㎏인 것이 바람직하고, 1 내지 500 ㎎/㎏인 것이 더 바람직하며, 하루 1회 또는 수회로 나누어 투여될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐, 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 구체적인 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다. 본 발명의 식품 조성물에서 추출물 기반의 유효성분 함량은 조성물 총 중량을 기준으로 0.01~50 중량%, 바람직하게는 0.1~25 중량%, 더 바람직하게는 0.5~10 중량%이나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 식품 조성물은 추출물 기반의 유효성분 외에 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분들은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올이다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 향미제나 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 향미제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 사료 첨가제는 예를 들어 추출물 기반 성분 0.1 ~ 20 중량%, 지방분해효소(Lipase) 0.001 ~ 0.01 중량%, 제 3 인산칼슘 1 ~ 20 중량%, 비타민 E 0.01 ~ 0.1 중량%, 효소분말 1 ~ 10 중량%, 유산균 0.1 ~ 10 중량%, 바실러스(Bacillus) 배양액 0.01 ~ 10 중량% 및 포도당 20 ~ 90 중량%로 구성될 수 있으나, 특별히 이에 한정되는 것은 아니다. 즉, 추출물 기반 성분이 유효량으로 첨가되어 있다면, 본 발명의 사료첨가제로서 가능하며, 이때, 상기 유효량이란, 가금류, 가축 등이 꾸준히 섭취함으로써 대장염을 예방하거나 치료할 수 있는 양을 의미한다. 또한, 추출물 기반 성분의 양은 첨가에 의한 이익을 넘는 악영향이 생기지 않는 양이 바람직하다. 또한, 상기 사료첨가제는 추가적으로 가금류 및 가축 등에 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본 발명의 사료 첨가제는 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제, 항생물질, 항균제 및 기타의 첨가제 등을 더 포함할 수 있고, 그 형상으로는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료첨가제는 가금류 및 가축 등에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 구체적으로 설명한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 기술적 특징을 명확하게 예시하기 위한 것 일뿐, 본 발명의 보호범위를 한정하는 것은 아니다.
Ⅰ. 1차 실험 : 지모 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 화합물의 대장염 예방 또는 치료 효과 확인
1. 지모 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 화합물의 제조
제조예 1 : 지모 추출물의 제조
지모 500 g에 80% 메탄올 수용액 2ℓ를 가하고 수욕 상에서 약 2시간 동안 추출한 후 여과하였다. 또한, 남은 잔사에 동일한 용매 1ℓ를 가하고 동일한 조건에서 재추출한 후 여과하였다. 여과된 추출액을 감압 조건하에서 농축하여 지모 추출물 189g을 얻었다.
제조예 2 : 지모 추출물로부터 부탄올 가용성 분획물의 제조
제조예 1에서 얻은 지모 추출물 189g을 물 1.5ℓ에 현탁한 후, 여기에 n-부탄올 1.5ℓ를 가하고 진탕 방치하여 n-부탄올 가용성 분획층과 물 가용성 분획층으로 분리하였다. n-부탄올 가용성 분획층을 취하고 감압 조건하에서 농축하여 n-부탄올 가용성 분획물 41g을 얻었다. n-부탄올 가용성 분획물의 수율은 지모를 기준으로 할 때 8.2% 이상이었고, n-부탄올 가용성 분획물에 함유된 만지페린(Mangiferin)의 함량은 10% 이상이었다.
제조예 3 : 지모 추출물의 부탄올 가용성 분획물로부터 화합물의 분리
제조예 2에서 얻은 n-부탄올 가용성 분획물 10g에 대하여 용출 용매(클로로포름:메탄올:물=65:35:10)로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Merck, 10㎝×30㎝, 70~230 mesh)를 실시하여 9개의 소분획을 얻었다. 9개의 소분획 중 대장염 동물모델 시험에서 효과가 가장 우수했던 소분획인 Fr. Ⅶ에 대하여 25% 메탄올을 용출 용매로 MPLC(Medium pressure liquid chromatography; C18 reverse Merck, 3㎝×20㎝)를 실시하여 2개의 분획을 얻었다. 2개의 분획을 농축한 후 이를 각각 메탄올로 재결정하여 흰색 분말 형태의 화합물 2개를 얻었으며 질량 분석 및 13C-NMR(Bruker, AVANCE digital 400)로 구조를 확인한 결과, 만지페린(Mangiferin)과 네오만지페린(Neomangiferin)인 것으로 확인되었다. 도 1은 만지페린(Mangiferin) 및 네오만지페린(Neomangiferin)의 화학 구조식을 나타낸 것이다. 만지페린(Mangiferin) 및 네오만지페린(Neomangiferin)의 수율은 지모를 기준으로 할 때 각각 0.5% 이상 및 0.1% 이상이었다.
<만지페린>
ESI(-)-MS/MS 421, 301 [M-Na]-
13C NMR (100 MHz) peaks : 162.254 (C-1), 108.04 (C-2), 164.295 (C-3), 93.813 (C-4), 103.088 (C-5), 154.606 (C-6), 144.228 (C-7), 108.489 (C-8), 179.551 (C-9), 156.697 (C-4a), 151.286 (C-4b), 112.128 (C-8a), 101.772 (C-8b), 82.025 (2-glc C-1’), 73.564 (C-2’), 71.103 (C-3’), 70.724 (C-4’), 79.449 (C-5’), 61.961 (C-6’).
<네오만지페린>
ESI(-)-MS/MS 421, 301 [M-Na]-
13C NMR (100 MHz) 162.5 (C-1), 108.3 (C-2), 164. 5 (C-3), 94.0 (C-4), 103.3 (C-5), 156.9 (C-6), 144.4 (C-7), 112.4 (C-8), 179.8 (C-9), 154.7(C-4a), 151.5 (C-4b), 108.8 (C-8a), 102.0 (C-8b), 73.8 (2-glc C-1’), 71.3 (C-2’), 79.7 (C-3’), 71.0 (C-4’), 82.2 (C-5’), 61.4 (C-6’), 103.4 (7-glc C-1”) 73.5 (C-2”), 76.1 (C-3”), 69.6 (C-4”), 77.3 (C-5”), 60.7 (C-6”).
2. 대장염이 유도된 모델동물 실험을 통한 대장염 치료 효과 측정
(1) 실험동물의 준비
4주령 ICR 수컷 생쥐(24-27g)를 오리엔트바이오㈜로부터 구입하였다. 모든 생쥐는 습도 50±10%, 온도 25±2℃의 조절된 환경 조건에서 사육하였으며 조명은 12시간 킨 후 12 시간 끄는 것을 반복하였다. 사료는 표준 실험용 사료(Samyang, Korea)를 사용하였으며 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 모든 실험에서 한군은 6마리로 하였다.
(2) TNBS에 의한 급성 대장염 유발 및 시료 투여
실험동물 중 한 군을 정상군으로 하고, 나머지 군의 실험동물에 대해서는 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)으로 대장염을 유발하였다. 구체적으로 실험동물을 가볍게 에테르로 마취한 후 NBS(2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid) 용액 2.5g을 50% 에탄올에 혼합한 용액을 끝이 둥근 1㎖ 용량의 주사기를 이용하여 항문을 통해 대장 내로 0.1㎖ 씩 투여하고 수직으로 들어 30초간 유지하여 염증을 유발하였다. 반면, 정상군에는 생리식염수 0.1㎖를 경구투여하였다. 이후, 익일부터 매일 1회씩 3일간 시료를 생리식염수에 녹여 미리 정한 용량대로 경구투여하고 시료 투여가 종료된 다음날에 실험동물을 이산화탄소로 질식시켜 죽이고 대장부위 중 맹장으로부터 항문 직전 부위까지의 대장을 적출하였다.
(3) 대장의 외관 분석 및 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정
1) 외관 분석
적출한 대장은 그 길이와 외관을 관찰하여 하기 표 1의 기준(Hollenbach 등, 2005 대장염 정도에 대한 기준)에 따라 점수로 매겼다. 이때 양성 대조군으로 메살라진(Mesalazine; Sigma) 투여군을 사용하였다. 또한, 장내 미생물 분석을 위해 대장 내용물의 일부를 채취하여 영하 80℃에서 냉동보관하였다. 대장 조직은 대장 내용물을 모두 제거하고, 생리 식염수에 세척한 후 일부는 병리조직용 샘플로 사용하기 위해 4% 포름알데히드 고정액으로 고정하였으며, 나머지는 분자생물학적 분석을 영하 80℃에서 냉동보관하였다.
표 1
외관 점수 기준
0 어떠한 궤양과 염증도 발견되지 않음
1 출혈이 없는 충혈이 발견됨
2 충혈이 있는 궤양이 발견됨
3 한 곳에서만 궤양과 염증이 발견됨
4 궤양과 염증이 2곳 이상에서 발견됨
5 궤양이 2㎝ 이상으로 확대되어 있음
2) MPO 활성 측정
대장조직 100㎎에 lysis buffer 200㎕를 넣고 균질화(homogenization) 하였다. 그 후 4℃ 및 13000 rpm의 조건에서 15분간 원심분리하여 상층액을 얻은 다음 Mouse MPO assay ELISA kit(Hbt HK210, USA)을 사용하여 MPO 활성을 측정하였다. 상층액 100㎕를 96 well plate에 넣은 다음 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 완료된 후 plate를 뒤집어 비운 다음 200㎕의 세척 완충용액을 사용하여 세척과정을 3회 반복한 다음 100㎕의 희석된 tracer를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 plate를 뒤집어 비운 다음 200㎕의 세척 완충용액을 사용하여 각 well을 세척하였다. 200㎕의 세척 완충용액을 사용하여 세척과정을 3회 반복한 다음 100㎕의 희석된 streptavidin-peroxidase conjugate를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 plate를 뒤집어 비운 다음 200㎕의 세척 완충용액을 사용하여 각 well을 세척하였다. 200㎕의 세척 완충용액을 사용하여 세척과정을 3회 반복한 다음 100㎕의 TMB substrate solution을 첨가하고 plate를 알루미늄 호일로 감싸 빛을 차단하고 실온에서 30분간 반응시켰다. 그리고 100㎕의 정지 용액을 첨가하여 반응을 중지시키고 ELISA reader를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.
3) 대장의 외관 분석 및 MPO 활성 측정 결과
하기 표 2 및 표 3은 대장의 외관 분석 및 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
표 2
TNBS 처리 및 경구투여 시료 정보 시료 투여 용량(㎎/㎏) Colon length(㎝) 외관 점수(Mean score) MPO activity(μUnit/㎎)
정상군 1 - 7.25±0.20 0.4±0.6 0.8±0.1
TNBS 처리군 1 - 3.31±0.39 3.8±0.2 7.0±0.9
TNBS 처리+지모 추출물 투여군 20 3.58±0.32 2.2±0.76 2.5±0.6
TNBS 처리+지모 분획물 투여군 10 4.58±0.32 1.8±0.76 2.4±0.2
TNBS 처리+지모 분획물 투여군 20 5.27±0.72 1.6±0.42 1.8±0.5
TNBS 처리+mesalazine 투여군 1 10 5.78±0.54 1.6±0.54 1.8±0.2
상기 표 2에서 "지모 추출물은 제조예 1에서 얻은 것이고, "지모 분획물"은 제조예 2에서 얻은 지모 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 나타낸다.
표 3
TNBS 처리 및 경구투여 시료 정보 시료 투여 용량(㎎/㎏) Colon length(㎝) 외관 점수(Mean score) MPO activity(μUnit/㎎)
정상군 2 - 7.54±0.20 0.4±0.6 0.2±0.1
TNBS 처리군 2 - 4.36±0.41 3.9±0.2 2.3±0.4
TNBS 처리+mangiferin 투여군 10 5.81±0.09 2.7±0.45 0.5±0.2
TNBS 처리+mangiferin 투여군 20 6.98±0.21 1.7±0.27 0.2±0.2
TNBS 처리+neomangiferin 투여군 10 5.78±0.10 2.8±0.51 0.6±0.2
TNBS 처리+mesalazine 투여군 2 10 7.1±0.46 1.6±0.55 0.2±0.1
상기 표 2 및 표 3에서 보이는 바와 같이 지모 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 특정 화합물은 모두 대장염에 대해 우수한 예방 또는 치료 효과를 나타냈다.
(4) 염증 반응 지표 물질의 발현 억제 여부 분석
1) IL-1 베타, IL-6 및 TNF-알파의 발현 억제 여부
실험동물의 대장조직 100㎎에 protease inhibitor cocktail이 함유된 250 ㎕l의 RIPA buffer를 첨가하여 균질화 하였다. 그 후 4℃ 및 13000 rpm의 조건에서 15분간 원심분리하여 얻은 상층액을 영하 80℃에서 보관하면서 IL-1 베타, IL-6 및 TNF-알파의 발현량을 96-well ELISA plate kits(Pierce Biotechology, Inc., Rockford, IL, USA)를 이용하여 측정하였다. 하기 표 4 및 표 5는 IL-1 베타, IL-6 및 TNF-알파의 발현량 측정 결과를 나타낸 것이다.
표 4
TNBS 처리 및 경구투여 시료 정보 시료 투여 용량(㎎/㎏) IL-1 베타 농도(pg/㎎) IL-6 농도(pg/㎎) TNF-알파 농도(pg/㎎)
정상군 1 - 1.6±3.8 1.1±1.3 6.3±2.7
TNBS 처리군 1 - 120.0±28.7 17.5±3.9 193.8±43.3
TNBS 처리+지모 추출물 투여군 20 52.4±9.1 5.7±4.6 73.8±7.9
TNBS 처리+지모 분획물 투여군 10 44.4±28.7 4.9±0.4 61.0±16.3
TNBS 처리+지모 분획물 투여군 20 14.0±3.5 2.3±2.2 26.0±11.0
TNBS 처리+mesalazine 투여군 1 10 19.8±14.4 3.1±2.3 26.1±8.8
상기 표 4에서 "지모 추출물"은 제조예 1에서 얻은 것이고, "지모 분획물"은 제조예 2에서 얻은 지모 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 나타낸다.
표 5
TNBS 처리 및 경구투여 시료 정보 시료 투여 용량(㎎/㎏) IL-1 베타 농도(pg/㎎) IL-6 농도(pg/㎎) TNF-알파 농도(pg/㎎)
정상군 2 - 17.4±2.1 0.9±0.6 20.1±8.9
TNBS 처리군 2 - 161.0±17.0 18.9±3.2 192.2±42.6
TNBS 처리+mangiferin 투여군 10 57.4±2.1 5.0±0.6 83.8±10.9
TNBS 처리+mangiferin 투여군 20 28.1±12.1 2.2±0.8 40.8±10.9
TNBS 처리+neomangiferin 투여군 10 62.2±5.1 6.9±1.2 93.6±9.2
TNBS 처리+mesalazine 투여군 2 10 31.1±2.9 2.9±1.2 52.9±5.7
상기 표 4 및 표 5에서 보이는 바와 같이 지모 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 특정 화합물을 투여한 실험동물군의 대장 조직에서 IL-1 베타, IL-6 및 TNF-알파의 발현이 유의적으로 억제되었다.
2) COX-2, iNOS, p65(NF-카파B) 및 pp65(phosphor-NF-카파B)의 발현 억제 여부
실험동물의 대장조직 0.3 g에 protease inhibitor cocktail이 함유된 1㎖의 RIPA buffer(Gibco사)를 첨가하여 균질화 하였다. 그 후 4℃ 및 13000 rpm의 조건에서 15분간 원심분리하여 얻은 상층액을 영하 80℃에서 보관하면서 COX-2, iNOS, p65(NF-카파B), pp65(phosphor-NF-카파B) 및 β-actin의 발현량을 Western blotting 방법으로 측정하였다. 먼저 상층액 50㎍을 취해 SDS 10%(w/v) polyacrylamide gel에서 1시간 30분간 전기영동을 하였다. 전기영동한 샘플을 니트로셀룰로스지에 100V, 400㎃의 조건에서 1시간 10분간 트랜스퍼(transfer) 하였다. 샘플이 트랜스퍼된 니트로셀로로스지를 5% skim milk로 30분간 blocking 한 후, 5분씩 3회에 걸쳐 PBS-Tween으로 세척하고, 1차 antibody(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:100의 비율로 하여 하룻밤 동안 반응시켰다. 이후, 10분씩 3회에 걸쳐 세척하고, 2차 antibody(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:1000의 비율로 하여 1시간 20분간 반응시켰다. 이후, 15분씩 3회에 걸쳐 세척하고, 형광발색 시킨 후 현상하였다.
도 2는 TNBS 처리에 의해 급성 대장염을 유발한 후 제조예 2에서 얻은 지모 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 투여한 실험동물군의 대장에서 염증 반응 지표 물질의 발현이 억제되는 것을 나타낸 결과이다. 도 2에서 "JM"은 제조예 2에서 얻은 지모 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 나타내고, "MEL"은 메살라진(Mesalazine)을 나타낸다. 도 3은 TNBS 처리에 의해 급성 대장염을 유발한 후 만지페린(mangiferin)을 투여한 실험동물군의 대장에서 염증 반응 지표 물질의 발현이 억제되는 것을 나타낸 결과이다. 도 3에서 "MF"는 만지페린(mangiferin)을 나타내고, "MEL"은 메살라진(Mesalazine)을 나타낸다. 도 2 및 도 3에서 보이는 바와 같이 지모 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 특정 화합물을 투여한 실험동물군의 대장 조직에서 COX-2, iNOS, p65(NF-카파B) 및 pp65(phosphor-NF-카파B)의 발현량이 크게 감소하였다.
3. LPS 또는 PG로 유도한 대식세포의 염증반응에 대한 특정 화합물의 항염 효과
4주령 ICR 수컷 생쥐(20-28g)를 오리엔트바이오㈜로부터 구입하였다. 생쥐의 복강에 멸균된 4% thioglycolate를 2㎖를 투여하고, 96시간이 지난 뒤에 생쥐를 마취시키고, 다시 생쥐 복강에 RPMI 배지 8㎖를 투여하였다. 약 5~10분이 지난 뒤에 생쥐 복강 내의 RPMI(대식세포를 포함)를 다시 뽑아내고 1000 rpm의 조건에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 또한, 침전층에 새로운 RPMI를 넣어 가라앉은 세포를 2회 세척하였다. 이후, 새로운 배지를 다시 넣어 세포를 잘 현탁하고, hematocytometer를 이용하여 대식세포의 수를 카운트하였다. 24 well dish에 대식세포를 각 well당 0.5×106의 수로 깔고, 시험 물질과 염증 반응 유도 물질을 60분간 처리한 후 RIPA buffer (Gibco사)를 첨가하여 균질화 하였다. 이때, 시험 물질로 만지페린(mangiferin)을 사용하였고, 염증 반응 유도 물질은 LPS(lipopolysaccharide) 또는 PG(peptidolgycan)에서 선택되었다. 이후, 균질화된 대식세포 샘플을 4℃ 및 13000 rpm의 조건에서 15분간 원심분리하여 얻은 상층액을 영하 80℃에서 보관하면서 IRAK-1(Interleukin-1 receptor-associated kinase 1), p-IRAK-1(phosphor-Interleukin-1 receptor-associated kinase 1), p65(NF-카파B), pp65(phosphor-NF-카파B) 및 β-actin의 발현량을 Western blotting 방법으로 측정하였다. 먼저 상층액 50㎍을 취해 SDS 10%(w/v) polyacrylamide gel에서 1시간 30분간 전기영동을 하였다. 전기영동한 샘플을 니트로셀룰로스지에 100V, 400㎃의 조건에서 1시간 10분간 트랜스퍼(transfer) 하였다. 샘플이 트랜스퍼된 니트로셀로로스지를 5% skim milk로 30분간 blocking 한 후, 5분씩 3회에 걸쳐 PBS-Tween으로 세척하고, 1차 antibody(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:100의 비율로 하여 하룻밤 동안 반응시켰다. 이후, 10분씩 3회에 걸쳐 세척하고, 2차 antibody(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:1000의 비율로 하여 1시간 20분간 반응시켰다. 이후, 15분씩 3회에 걸쳐 세척하고, 형광발색 시킨 후 현상하였다.
도 4는 LPS(lipopolysaccharide) 또는 PG(peptidolgycan)로 처리된 대식세포에서 만지페린(mangiferin)에 의해 염증 반응이 억제되는 것을 나타낸 결과이다. 도 4에서 보이는 바와 같이 지모로부터 분리된 만지페린(mangiferin)은 우수한 항염증 효과를 나타내었다.
Ⅱ. 2차 실험 : 지모 추출물 등, 오배자 추출물 등 및 더덕 추출물 등의 병용에 의한 대장염 예방 또는 치료 효과 확인
4. 오배자 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 화합물의 제조
제조예 4 : 오배자 추출물의 제조
오배자 500 g에 80% 메탄올 수용액 2ℓ를 가하고 수욕 상에서 약 2시간 동안 추출한 후 여과하였다. 또한, 남은 잔사에 동일한 용매 1ℓ를 가하고 동일한 조건에서 재추출한 후 여과하였다. 여과된 추출액을 감압 조건하에서 농축하여 오배자 추출물 190g을 얻었다.
제조예 5 : 오배자 추출물로부터 부탄올 가용성 분획물의 제조
제조예 4에서 얻은 오배자 추출물 190g을 물 1.5ℓ에 현탁한 후, 여기에 n-부탄올 1.5ℓ를 가하고 진탕 방치하여 n-부탄올 가용성 분획층과 물 가용성 분획층으로 분리하였다. n-부탄올 가용성 분획층을 취하고 감압 조건하에서 농축하여 n-부탄올 가용성 분획물 102g을 얻었다. n-부탄올 가용성 분획물의 수율은 오배자를 기준으로 할 때 21% 이상이었고, n-부탄올 가용성 분획물에 함유된 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-β-D-글루코스(glucose1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)의 함량은 30% 이상이었다.
제조예 6 : 오배자 추출물의 부탄올 가용성 분획물로부터 화합물의 분리
제조예 5에서 얻은 n-부탄올 가용성 분획물 20g에 대하여 용출 용매(클로로포름:메탄올:물=65:35:10)로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Merck, 10㎝×50㎝, 70~230 mesh)를 실시하여 5개의 소분획을 얻었다. 5개의 소분획 중 대장염 동물모델 시험에서 효과가 가장 우수했던 소분획인 Fr. Ⅳ를 메탄올로 재결정하여 미황색 분말 형태의 화합물을 얻었으며 1H-NMR(Bruker, AVANCE digital 400) 및 13C-NMR(Bruker, AVANCE digital 400)로 구조를 확인한 결과, 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-β-D-글루코스(glucose1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)인 것으로 확인되었다. 도 5는 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-β-D-글루코스(glucose1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)의 화학 구조식을 나타낸 것이다.
1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-β-D-글루코스(glucose1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)의 수율은 오배자를 기준으로 할 때 2.6% 이상이었다.
1H-NMR (300 MHz, CD3OD) δ : 7.12, 7.06, 7.00, 6.96 and 6.91 (each 2H, s, Gal H-2,6), 6.25 (1H, d, J = 8.3 Hz, Glc H-1), 5.92 (1H, t, J = 9.7 Hz, Glc H-4), 5.62 (1H, t, J = 9.7 Hz, Glc H-3), 5.57 (1H, dd, J = 9.7, 8.3 Hz, Glc H-2), 4.52 (1H, d, J = 10.5 Hz, Glc H-6), 4.38 (1H, d, J = 10.0 Hz, Glc H-5)
13C-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 168.0. 167.4, 167.1, 167.0, 166.3, 146.7, 146.6, 146.5, 146.5, 146.3, 140.8, 140.3, 140.2, 140.1, 140.0, 139.9, 121.1, 120.4, 120.2, 120.2, 119.7, 110.6, 110.5, 110.4, 110.4, 110.3, 93.8 (Glc C-1), 74.4 (Glc C-5), 74.1 (Glc C-3), 72.2 (Glc C-2), 69.8 (Glc C-4), 63.1 (Glc C-6).
5. 지모 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 화합물의 제조
제조예 7 : 지모 추출물의 제조
지모 500 g에 80% 메탄올 수용액 2ℓ를 가하고 수욕 상에서 약 2시간 동안 추출한 후 여과하였다. 또한, 남은 잔사에 동일한 용매 1ℓ를 가하고 동일한 조건에서 재추출한 후 여과하였다. 여과된 추출액을 감압 조건하에서 농축하여 지모 추출물 189g을 얻었다.
제조예 8 : 지모 추출물로부터 부탄올 가용성 분획물의 제조
제조예 7에서 얻은 지모 추출물 189g을 물 1.5ℓ에 현탁한 후, 여기에 n-부탄올 1.5ℓ를 가하고 진탕 방치하여 n-부탄올 가용성 분획층과 물 가용성 분획층으로 분리하였다. n-부탄올 가용성 분획층을 취하고 감압 조건하에서 농축하여 n-부탄올 가용성 분획물 41g을 얻었다. n-부탄올 가용성 분획물의 수율은 지모를 기준으로 할 때 8.2% 이상이었고, n-부탄올 가용성 분획물에 함유된 만지페린(Mangiferin)의 함량은 10% 이상이었다.
제조예 9 : 지모 추출물의 부탄올 가용성 분획물로부터 화합물의 분리
제조예 8에서 얻은 n-부탄올 가용성 분획물 10g에 대하여 용출 용매(클로로포름:메탄올:물=65:35:10)로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Merck, 10㎝×30㎝, 70~230 mesh)를 실시하여 9개의 소분획을 얻었다. 9개의 소분획 중 대장염 동물모델 시험에서 효과가 가장 우수했던 소분획인 Fr. Ⅶ에 대하여 25% 메탄올을 용출 용매로 MPLC(Medium pressure liquid chromatography; C18 reverse Merck, 3㎝×20㎝)를 실시하여 2개의 분획을 얻었다. 2개의 분획을 농축한 후 이를 각각 메탄올로 재결정하여 흰색 분말 형태의 화합물 2개를 얻었으며 질량 분석 및 13C-NMR(Bruker, AVANCE digital 400)로 구조를 확인한 결과, 만지페린(Mangiferin)과 네오만지페린(Neomangiferin)인 것으로 확인되었다. 만지페린(Mangiferin) 및 네오만지페린(Neomangiferin)의 수율은 지모를 기준으로 할 때 각각 0.5% 이상 및 0.1% 이상이었다.
<만지페린>
ESI(-)-MS/MS 421, 301 [M-Na]-
13C NMR (100 MHz) peaks : 162.254 (C-1), 108.04 (C-2), 164.295 (C-3), 93.813 (C-4), 103.088 (C-5), 154.606 (C-6), 144.228 (C-7), 108.489 (C-8), 179.551 (C-9), 156.697 (C-4a), 151.286 (C-4b), 112.128 (C-8a), 101.772 (C-8b), 82.025 (2-glc C-1’), 73.564 (C-2’), 71.103 (C-3’), 70.724 (C-4’), 79.449 (C-5’), 61.961 (C-6’).
<네오만지페린>
ESI(-)-MS/MS 421, 301 [M-Na]-
13C NMR (100 MHz) 162.5 (C-1), 108.3 (C-2), 164. 5 (C-3), 94.0 (C-4), 103.3 (C-5), 156.9 (C-6), 144.4 (C-7), 112.4 (C-8), 179.8 (C-9), 154.7(C-4a), 151.5 (C-4b), 108.8 (C-8a), 102.0 (C-8b), 73.8 (2-glc C-1’), 71.3 (C-2’), 79.7 (C-3’), 71.0 (C-4’), 82.2 (C-5’), 61.4 (C-6’), 103.4 (7-glc C-1”) 73.5 (C-2”), 76.1 (C-3”), 69.6 (C-4”), 77.3 (C-5”), 60.7 (C-6”).
6. 더덕 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 화합물의 제조
제조예 10 : 더덕 추출물의 제조
건조된 더덕(Codonopsis lanceolata Trautv) 뿌리(경동시장, 서울, 대한민국) 2㎏에 80% 메탄올 수용액 4ℓ를 가하고 수욕 상에서 약 2시간 동안 추출한 후 여과하였다. 또한, 남은 잔사에 동일한 용매 2ℓ를 가하고 동일한 조건에서 재추출한 후 여과하였다. 여과된 추출액을 감압 조건하에서 농축하여 더덕 추출물 185g을 얻었다.
제조예 11 : 더덕 추출물로부터 부탄올 가용성 분획물의 제조
제조예 10에서 얻은 더덕 추출물 185g을 물 1.5ℓ에 현탁한 후, 여기에 n-부탄올 1.5ℓ를 가하고 진탕 방치하여 n-부탄올 가용성 분획층과 물 가용성 분획층으로 분리하였다. n-부탄올 가용성 분획층을 취하고 감압 조건하에서 농축하여 n-부탄올 가용성 분획물 112g을 얻었다. n-부탄올 가용성 분획물의 수율은 더덕을 기준으로 할 때 5.5% 이상이었고, n-부탄올 가용성 분획물에 함유된 란세마사이드 A(Lancemaside A)의 함량은 4% 이상이었다.
제조예 12 : 더덕 추출물의 부탄올 가용성 분획물로부터 화합물의 분리
제조예 11에서 얻은 n-부탄올 가용성 분획물 20g에 대하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Merck, 10㎝×50㎝, 70~230 mesh)를 실시하여 14개의 소분획을 얻었다. 이때, 이동상으로는 다이클로로메탄(Dichloromethane)과 메탄올의 기울기 용리 시스템을 사용하였다(다이클로로메탄:메탄올=100:0, 95:5, 90:10, 85:15, 80:20, 75:25, 70:30, 65:35, 60:40, 55:45, 50:50, 45:55, 40:60, 30:70; 각각 1ℓ씩). 또한, 14개의 소분획 중 13번째 분획에 대해 MPLC(medium pressure liquid chromatography; Yamazen 540-SY-S2CSC, 일본)를 실시하여 4시간 동안 분리하였고(이동상 : 10% ACN in water to 70% ACN in water, 4 ㎖/min), 80개의 소분획을 얻었다. 80개의 소분획 중 37~42번 분획을 감압 농축하고 동결건조하여 백색 무정형 분말 형태의 화합물 620㎎을 얻었으며, 질량 분석 및 13C-NMR(Bruker, AVANCE digital 400)로 구조를 확인한 결과 란세마사이드 A(Lancemaside A)로 확인되었다.
HR-ESI-MS(negative mode) : m/z 1189.6 [M-H]-
13C-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: (aglycone) 38.6, 26.5, 89.0, 39.5, 55.8, 18.3, 33.4, 39.9, 47.0, 36.9, 23.7, 122.8, 144.3, 42.0, 36.1, 74.0, 49.5, 41.2, 47.1, 30.9, 35.9, 32.1, 28.1, 16.9, 15.6, 17.5, 27.1, 175.9, 33.2, 24.7, (GlcA ) 107.1, 75.3, 78.2, 73.4, 77.9, 172.7, (ara) 93.4, 75.1, 69.4, 65.7, 62.7, (rha) 100.9, 71.8, 72.7, 83.3, 68.4, 18.4, (xyl) 106.0, 74.9, 87.0, 68.9, 66.8, (xyl)106.1, 75.5, 78.1, 70.8, 67.2.
7. 해동피 추출물의 제조
제조예 13 : 해동피 추출물의 제조
건조된 엄나무(Kalopanax Pictus NAKAI)의 껍질 3a Trautv) 뿌리(경동시장, 서울, 대한민국) 3㎏에 80% 메탄올 수용액 5ℓ를 가하고 수욕 상에서 약 2시간 동안 추출한 후 여과하였다. 또한, 남은 잔사에 동일한 용매 2ℓ를 가하고 동일한 조건에서 재추출한 후 여과하였다. 여과된 추출액을 감압 조건하에서 농축하여 해동피 추출물 125g을 얻었다.
8. 복합 추출물의 제조
제조예 14.
제조예 4에서 얻은 오배자 추출물 50 중량부, 제조예 7에서 얻은 지모 추출물 25 중량부 및 제조예 10에서 얻은 더덕 추출물 25 중량부를 혼합하여 복합 추출물을 제조하였다.
제조예 15.
제조예 4에서 얻은 오배자 추출물 50 중량부, 제조예 10에서 얻은 더덕 추출물 25 중량부 및 제조예 13에서 얻은 해동피 추출물 25 중량부를 혼합하여 복합 추출물을 제조하였다.
제조예 16.
제조예 4에서 얻은 오배자 추출물 75 중량부 및 제조예 13에서 얻은 해동피 추출물 25 중량부를 혼합하여 복합 추출물을 제조하였다.
제조예 17.
제조예 4에서 얻은 오배자 추출물 50 중량부 및 제조예 7에서 얻은 지모 추출물 25 중량부를 혼합하여 복합 추출물을 제조하였다.
제조예 18.
제조예 10에서 얻은 더덕 추출물 50 중량부 및 제조예 13에서 얻은 해동피 추출물 50 중량부를 혼합하여 복합 추출물을 제조하였다.
제조예 19.
제조예 7에서 얻은 지모 추출물 50 중량부 및 제조예 10에서 얻은 더덕 추출물 50 중량부를 혼합하여 복합 추출물을 제조하였다.
제조예 20.
제조예 5에서 얻은 오배자 추출물의 부탄올 가용성 분획물 50 중량부, 제조예 8에서 얻은 지모 추출물의 부탄올 가용성 분획물 25 중량부 및 제조예 11에서 얻은 더덕 추출물의 부탄올 가용성 분획물 25 중량부를 혼합하여 복합 추출물을 제조하였다.
9. 대장염이 유도된 모델동물 실험을 통한 대장염 치료 효과 측정
(1) 실험동물의 준비
4주령 ICR 수컷 생쥐(24-27g)를 오리엔트바이오㈜로부터 구입하였다. 모든 생쥐는 습도 50±10%, 온도 25±2℃의 조절된 환경 조건에서 사육하였으며 조명은 12시간 킨 후 12 시간 끄는 것을 반복하였다. 사료는 표준 실험용 사료(Samyang, Korea)를 사용하였으며 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 모든 실험에서 한군은 6마리로 하였다.
(2) TNBS에 의한 급성 대장염 유발 및 시료 투여
실험동물 중 한 군을 정상군으로 하고, 나머지 군의 실험동물에 대해서는 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)으로 대장염을 유발하였다. 구체적으로 실험동물을 가볍게 에테르로 마취한 후 NBS(2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid) 용액 2.5g을 50% 에탄올에 혼합한 용액을 끝이 둥근 1㎖ 용량의 주사기를 이용하여 항문을 통해 대장 내로 0.1㎖ 씩 투여하고 수직으로 들어 30초간 유지하여 염증을 유발하였다. 반면, 정상군에는 생리식염수 0.1㎖를 경구투여하였다. 이후, 익일부터 매일 1회씩 3일간 시료를 생리식염수에 녹여 미리 정한 용량대로 경구투여하고 시료 투여가 종료된 다음날에 실험동물을 이산화탄소로 질식시켜 죽이고 대장부위 중 맹장으로부터 항문 직전 부위까지의 대장을 적출하였다. 한편, 투여 시료는 추출물 기반의 시료와 부탄올 가용성 분획물 기반의 시료를 사용하였고, 추출물 기반의 시료 투여와 부탄올 가용성 분획물 기반의 시료 투여는 별개의 실험으로 진행하였다.
(3) 대장의 외관 분석 및 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정
1) 외관 분석
적출한 대장은 그 길이와 외관을 관찰하여 하기 표 6의 기준(Hollenbach 등, 2005 대장염 정도에 대한 기준)에 따라 점수로 매겼다. 이때 양성 대조군으로 메살라진(Mesalazine; Sigma) 투여군을 사용하였다. 또한, 장내 미생물 분석을 위해 대장 내용물의 일부를 채취하여 영하 80℃에서 냉동보관하였다. 대장 조직은 대장 내용물을 모두 제거하고, 생리 식염수에 세척한 후 일부는 병리조직용 샘플로 사용하기 위해 4% 포름알데히드 고정액으로 고정하였으며, 나머지는 분자생물학적 분석을 영하 80℃에서 냉동보관하였다.
표 6
외관 점수 기준
0 어떠한 궤양과 염증도 발견되지 않음
1 출혈이 없는 충혈이 발견됨
2 충혈이 있는 궤양이 발견됨
3 한 곳에서만 궤양과 염증이 발견됨
4 궤양과 염증이 2곳 이상에서 발견됨
5 궤양이 2㎝ 이상으로 확대되어 있음
2) MPO 활성 측정
대장조직 100㎎에 lysis buffer 200㎕를 넣고 균질화(homogenization) 하였다. 그 후 4℃ 및 13000 rpm의 조건에서 15분간 원심분리하여 상층액을 얻은 다음 Mouse MPO assay ELISA kit(Hbt HK210, USA)을 사용하여 MPO 활성을 측정하였다. 상층액 100㎕를 96 well plate에 넣은 다음 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 완료된 후 plate를 뒤집어 비운 다음 200㎕의 세척 완충용액을 사용하여 세척과정을 3회 반복한 다음 100㎕의 희석된 tracer를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 plate를 뒤집어 비운 다음 200㎕의 세척 완충용액을 사용하여 각 well을 세척하였다. 200㎕의 세척 완충용액을 사용하여 세척과정을 3회 반복한 다음 100㎕의 희석된 streptavidin-peroxidase conjugate를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 plate를 뒤집어 비운 다음 200㎕의 세척 완충용액을 사용하여 각 well을 세척하였다. 200㎕의 세척 완충용액을 사용하여 세척과정을 3회 반복한 다음 100㎕의 TMB substrate solution을 첨가하고 plate를 알루미늄 호일로 감싸 빛을 차단하고 실온에서 30분간 반응시켰다. 그리고 100㎕의 정지 용액을 첨가하여 반응을 중지시키고 ELISA reader를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.
3) 대장의 외관 분석 및 MPO 활성 측정 결과
하기 표 7은는 추출물 기반의 시료를 투여했을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 동물에서 적출한 대장의 외관 분석 및 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
표 7
TNBS 처리 및 경구투여 시료 정보 시료 투여 용량(㎎/㎏) Colon length(㎝) 외관 점수(Mean score) MPO activity(μUnit/㎎)
정상군 1 - 7.26±0.20 0.4±0.55 0.69±0.60
TNBS 처리군 1 - 3.31±0.39 3.8±0.23 3.92±0.55
TNBS 처리+오배자 추출물 투여군 10 5.15±0.28 2.2±0.45 1.96±0.08
TNBS 처리+OJD 투여군 10 5.94±0.75 1.4±0.42 1.28±0.73
TNBS 처리+OHD 투여군 10 4.88±0.22 2.4±0.38 2.01±0.46
TNBS 처리+OH 투여군 10 4.78±0.32 2.2±0.27 2.26±1.08
TNBS 처리+OJ 투여군 10 4.50±0.31 2.2±0.76 2.67±0.49
TNBS 처리+HD 투여군 20 4.67±0.34 2.2±0.45 2.47±0.02
TNBS 처리+JD 투여군 20 5.50±0.49 1.6±0.22 1.58±0.31
TNBS 처리+mesalazine 투여군 1 10 5.64±0.51 1.6±0.55 1.42±0.08
상기 표 7에서 "오배자 추출물"은 제조예 4에서 얻은 것이고, "OJD"는 제조예 14에서 제조한 복합 추출물을 나타내고, "OHD"는 제조예 15에서 제조한 복합 추출물을 나타내고, "0H"는 제조예 16에서 제조한 복합 추출물을 나타내고, "0J"는 제조예 17에서 제조한 복합 추출물을 나타내고, "HD"는 제조예 18에서 제조한 복합 추출물을 나타내고, "JD"는 제조예 19에서 제조한 복합 추출물을 나타낸다. 상기 표 7에서 보이는 바와 같이 오배자 추출물, 지모 추출물 및 더덕 추출물로 이루어진 복합 추출물은 가장 뛰어난 대장염 예방 또는 치료 효과를 나타냈고, 더덕 추출물과 지모 추출물로 이루어진 복합 추출물도 양성 대조군에서 투여 시료로 사용한 메살라진(mesalazine)과 거의 동등한 효과를 보였다.
또한, 하기 표 8은 부탄올 가용성 분획물 기반의 시료를 투여했을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 동물에서 적출한 대장의 외관 분석 및 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정 결과를 나타낸 것이다.
표 8
TNBS 처리 및 경구투여 시료 정보 시료 투여 용량(㎎/㎏) Colon length(㎝) 외관 점수(Mean score) MPO activity(μUnit/㎎)
정상군 2 - 7.20±0.15 0.4±0.55 0.82±0.14
TNBS 처리군 2 - 3.31±0.39 3.84±0.23 6.99±0.89
TNBS 처리+OJD 투여군 10 5.94±0.75 1.2±0.45 2.09±1.01
TNBS 처리+오배자 분획물 투여군 5 4.47±0.52 2.7±0.67 3.50±0.94
TNBS 처리+오배자 분획물 투여군 10 5.15±0.28 2.2±0.45 2.88±1.10
TNBS 처리+지모 분획물 투여군 10 3.58±0.32 2.6±0.42 3.72±2.12
TNBS 처리+더덕 분획물 투여군 10 5.09±0.30 2.1±0.22 3.75±1.00
TNBS 처리+mesalazine 투여군 2 10 5.64±0.51 1.6±0.55 2.98±1.04
상기 표 8에서 "OJD"는 제조예 20에서 제조한 복합 추출물을 나타내고, "오배자 분획물"은 제조예 5에서 얻은 오배자 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 나타내고, "지모 분획물"은 제조예 8에서 얻은 지모 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 나타내고, "더덕 분획물"은 제조예 11에서 얻은 더덕 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 나타낸다. 상기 표 8에서 보이는 바와 같이 오배자 추출물의 부탄올 가용성 분획물, 지모 추출물의 부탄올 가용성 분획물 및 더덕 추출물의 부탄올 가용성 분획물로 이루어진 복합 추출물은 양성 대조군에서 투여 시료로 사용한 메살라진(mesalazine)보다 우수한 대장염 예방 또는 치료 효과를 보였다.
(4) TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물의 체중 변화량 분석
TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 시료 투여를 종료하고 다음날에 실험동물의 체중을 측정한 후 최초 체중과 비교하여 체중 변화량을 산출하였다. 도 6은 추출물 기반의 시료를 투여했을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물의 체중 변화량을 나타낸 그래프이다. 도 3에서 X 축의 "NOR"은 정상군 1을 의미하고, "TNBS"는 TNBS만을 처리한 군 1을 의미하고, "O10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 4에서 얻은 오배자 추출물을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "OJD10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 14에서 얻은 복합 추출물을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "OHD10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 15에서 얻은 복합 추출물을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "OH10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 16에서 얻은 복합 추출물을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "OJ10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 17에서 얻은 복합 추출물을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "HD20"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 18에서 얻은 복합 추출물을 20 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "JD20"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 19에서 얻은 복합 추출물을 20 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "Me10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 메살라진(mesalazine)을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군 1을 의미한다.
또한, 도 7은 부탄올 가용성 분획물 기반의 시료를 투여했을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물의 체중 변화량을 나타낸 그래프이다. 도 7에서 X 축의 "NOR"은 정상군 2를 의미하고, "TNBS"는 TNBS만을 처리한 군 2를 의미하고, "OJD10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 20에서 얻은 복합 추출물을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "O5"는 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 5에서 얻은 오배자 추출물의 부탄올 가용성 분획물을 5 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "O10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 5에서 얻은 오배자 추출물의 부탄올 가용성 분획물을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "J10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 8에서 얻은 지모 추출물의 부탄올 가용성 분획물을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "D10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 11에서 얻은 더덕 추출물의 부탄올 가용성 분획물을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "Me10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 메살라진(mesalazine)을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군 2를 의미한다.
도 6 및 도 7에서 보이는 바와 같이 오배자 추출물, 지모 추출물 및 더덕 추출물로 이루어진 복합 추출물 또는 오배자 추출물의 부탄올 가용성 분획물, 지모 추출물의 부탄올 가용성 분획물 및 더덕 추출물의 부탄올 가용성 분획물로 이루어진 복합 추출물은 양성 대조군에서 투여 시료로 사용한 메살라진(mesalazine)과 거의 동등하거나 더 큰 체중 증가량을 보였다. 또한, 더덕 추출물과 지모 추출물로 이루어진 복합 추출물도 양성 대조군에서 투여 시료로 사용한 메살라진(mesalazine)과 거의 동등한 체중 증가량을 보였다.
(5) 염증 반응 지표 물질의 발현 억제 여부 분석
1) IL-1 베타, IL-6 및 TNF-알파의 발현 억제 여부
실험동물의 대장조직 100㎎에 protease inhibitor cocktail이 함유된 250 ㎕l의 RIPA buffer를 첨가하여 균질화 하였다. 그 후 4℃ 및 13000 rpm의 조건에서 15분간 원심분리하여 얻은 상층액을 영하 80℃에서 보관하면서 IL-1 베타, IL-6 및 TNF-알파의 발현량을 96-well ELISA plate kits(Pierce Biotechology, Inc., Rockford, IL, USA)를 이용하여 측정하였다.
하기 표 9는 추출물 기반의 시료를 투여했을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 동물에서 적출한 대장조직에서의 IL-1 베타, IL-6 및 TNF-알파의 발현량 측정 결과를 나타낸 것이다.
표 9
TNBS 처리 및 경구투여 시료 정보 시료 투여 용량(㎎/㎏) IL-1 베타 농도(pg/㎎) IL-6 농도(pg/㎎) TNF-알파 농도(pg/㎎)
정상군 1 - 2.90±4.57 0.96±0.15 17.70±6.13
TNBS 처리군 1 - 87.25±12.18 6.85±1.47 85.40±26.78
TNBS 처리+오배자 추출물 투여군 10 16.81±11.84 2.25±0.28 31.03±8.50
TNBS 처리+OJD 투여군 10 9.28±2.89 1.18±0.21 19.43±2.11
TNBS 처리+OHD 투여군 10 29.71±7.23 2.53±0.20 38.62±2.74
TNBS 처리+OH 투여군 10 35.07±14.13 2.82±0.41 43.91±13.77
TNBS 처리+OJ 투여군 10 30.22±17.52 3.64±0.61 59.66±8.92
TNBS 처리+HD 투여군 20 30.29±14.13 3.11±1.13 47.47±9.02
TNBS 처리+JD 투여군 20 21.96±0.92 1.75±0.48 24.14±3.16
TNBS 처리+mesalazine 투여군 1 10 16.30±3.38 1.32±0.11 23.79±2.82
상기 표 9에서 "오배자 추출물"은 제조예 4에서 얻은 것이고, "OJD"는 제조예 14에서 제조한 복합 추출물을 나타내고, "OHD"는 제조예 15에서 제조한 복합 추출물을 나타내고, "0H"는 제조예 16에서 제조한 복합 추출물을 나타내고, "0J"는 제조예 17에서 제조한 복합 추출물을 나타내고, "HD"는 제조예 18에서 제조한 복합 추출물을 나타내고, "JD"는 제조예 19에서 제조한 복합 추출물을 나타낸다. 상기 표 9에서 보이는 바와 같이 오배자 추출물, 지모 추출물 및 더덕 추출물로 이루어진 복합 추출물을 투여한 실험동물군의 대장 조직에서 IL-1 베타, IL-6 및 TNF-알파의 발현이 유의적으로 억제되었고, 억제 수준은 메살라진(mesalazine)보다 더 크게 나타났다. 또한, 더덕 추출물과 지모 추출물로 이루어진 복합 추출물도 양성 대조군에서 투여 시료로 사용한 메살라진(mesalazine)과 거의 동등한 효과를 보였다.
하기 표 10은 부탄올 가용성 분획물 기반의 시료를 투여했을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 동물에서 적출한 대장조직에서의 IL-1 베타, IL-6 및 TNF-알파의 발현량 측정 결과를 나타낸 것이다.
표 10
TNBS 처리 및 경구투여 시료 정보 시료 투여 용량(㎎/㎏) IL-1 베타 농도(pg/㎎) IL-6 농도(pg/㎎) TNF-알파 농도(pg/㎎)
정상군 2 - 1.61±3.78 1.14±1.08 6.26±2.73
TNBS 처리군 2 - 120.0±28.75 13.12±2.27 193.84±43.29
TNBS 처리+OJD 투여군 10 17.96±9.43 3.07±1.06 32.02±9.66
TNBS 처리+오배자 분획물 투여군 5 43.37±27.07 6.60±1.94 75.52±25.60
TNBS 처리+오배자 분획물 투여군 10 30.52±5.00 4.40±2.51 49.29±11.63
TNBS 처리+지모 분획물 투여군 10 54.37±23.27 6.37±1.57 81.01±24.75
TNBS 처리+더덕 분획물 투여군 10 57.70±32.96 5.89±1.49 91.33±10.26
TNBS 처리+mesalazine 투여군 2 10 31.62±14.67 3.07±1.88 51.04±15.88
상기 표 10에서 "OJD"는 제조예 20에서 제조한 복합 추출물을 나타내고, "오배자 분획물"은 제조예 5에서 얻은 오배자 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 나타내고, "지모 분획물"은 제조예 8에서 얻은 지모 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 나타내고, "더덕 분획물"은 제조예 11에서 얻은 더덕 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 나타낸다. 상기 표 10에서 보이는 바와 같이 오배자 추출물의 부탄올 가용성 분획물, 지모 추출물의 부탄올 가용성 분획물 및 더덕 추출물의 부탄올 가용성 분획물로 이루어진 복합 추출물을 투여한 실험동물군의 대장 조직에서 IL-1 베타, IL-6 및 TNF-알파의 발현이 유의적으로 억제되었다.
2) 염증 반응 지표 물질의 발현 억제 여부
실험동물의 대장조직 0.3 g에 protease inhibitor cocktail이 함유된 1㎖의 RIPA buffer(Gibco사)를 첨가하여 균질화 하였다. 그 후 4℃ 및 13000 rpm의 조건에서 15분간 원심분리하여 얻은 상층액을 영하 80℃에서 보관하면서 COX-2, p65(NF-카파B), p-p65(phosphor-NF-카파B), IRAK-1(Interleukin-1 receptor-associated kinase 1), p-IRAK-1(phosphor-Interleukin-1 receptor-associated kinase 1), p-IKK-β 및 β-actin의 발현량을 Western blotting 방법으로 측정하였다. 먼저 상층액 50㎍을 취해 SDS 10%(w/v) polyacrylamide gel에서 1시간 30분간 전기영동을 하였다. 전기영동한 샘플을 니트로셀룰로스지에 100V, 400㎃의 조건에서 1시간 10분간 트랜스퍼(transfer) 하였다. 샘플이 트랜스퍼된 니트로셀로로스지를 5% skim milk로 30분간 blocking 한 후, 5분씩 3회에 걸쳐 PBS-Tween으로 세척하고, 1차 antibody(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:100의 비율로 하여 하룻밤 동안 반응시켰다. 이후, 10분씩 3회에 걸쳐 세척하고, 2차 antibody(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:1000의 비율로 하여 1시간 20분간 반응시켰다. 이후, 15분씩 3회에 걸쳐 세척하고, 형광발색 시킨 후 현상하였다.
도 8은 TNBS 처리에 의해 급성 대장염을 유발한 후 추출물 기반의 시료를 투여한 실험동물군의 대장에서 염증 반응 지표 물질의 발현이 억제되는 것을 나타낸 결과이다. 도 8에서 "O10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 4에서 얻은 오배자 추출물을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "OJD10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 14에서 얻은 복합 추출물을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "OHD10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 15에서 얻은 복합 추출물을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "OH10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 16에서 얻은 복합 추출물을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "OJ10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 17에서 얻은 복합 추출물을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "HD20"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 18에서 얻은 복합 추출물을 20 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "JD20"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 19에서 얻은 복합 추출물을 20 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "Me10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 메살라진(mesalazine)을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미한다.
또한, 도 9는 TNBS 처리에 의해 급성 대장염을 유발한 후 부탄올 가용성 분획물 기반의 시료를 투여한 실험동물군의 대장에서 염증 반응 지표 물질의 발현이 억제되는 것을 나타낸 결과이다. 도 9에서 "OJD10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 20에서 얻은 복합 추출물을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "O5"는 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 5에서 얻은 오배자 추출물의 부탄올 가용성 분획물을 5 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "O10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 5에서 얻은 오배자 추출물의 부탄올 가용성 분획물을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "J10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 8에서 얻은 지모 추출물의 부탄올 가용성 분획물을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "D10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 제조예 11에서 얻은 더덕 추출물의 부탄올 가용성 분획물을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군을 의미하고, "Me10"은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 메살라진(mesalazine)을 10 ㎎/㎏의 양으로 투여한 군를 의미한다.
도 8 및 도 9에서 보이는 바와 같이 오배자 추출물, 지모 추출물 및 더덕 추출물로 이루어진 복합 추출물을 투여한 실험동물군 또는 오배자 추출물의 부탄올 가용성 분획물, 지모 추출물의 부탄올 가용성 분획물 및 더덕 추출물의 부탄올 가용성 분획물로 이루어진 복합 추출물을 투여한 실험동물군의 대장 조직에서 COX-2, p65(NF-카파B), p-p65(phosphor-NF-카파B), IRAK-1(Interleukin-1 receptor-associated kinase 1), p-IRAK-1(phosphor-Interleukin-1 receptor-associated kinase 1) 및 p-IKK-β의 발현량이 크게 감소하였고, 발현량의 감소 수준은 메살라진(mesalazine)보다 더 크게 나타났다. 또한, 더덕 추출물과 지모 추출물로 이루어진 복합 추출물도 양성 대조군에서 투여 시료로 사용한 메살라진(mesalazine)과 거의 동등한 효과를 보였다.
10. LPS로 유도한 대식세포의 염증반응에 대한 복합 추출물의 항염 효과
4주령 ICR 수컷 생쥐(20-28g)를 오리엔트바이오㈜로부터 구입하였다. 생쥐의 복강에 멸균된 4% thioglycolate를 2㎖를 투여하고, 96시간이 지난 뒤에 생쥐를 마취시키고, 다시 생쥐 복강에 RPMI 배지 8㎖를 투여하였다. 약 5~10분이 지난 뒤에 생쥐 복강 내의 RPMI(대식세포를 포함)를 다시 뽑아내고 1000 rpm의 조건에서 10분간 원심분리하여 상층액을 제거하였다. 또한, 침전층에 새로운 RPMI를 넣어 가라앉은 세포를 2회 세척하였다. 이후, 새로운 배지를 다시 넣어 세포를 잘 현탁하고, hematocytometer를 이용하여 대식세포의 수를 카운트하였다. 24 well dish에 대식세포를 각 well당 0.5×106의 수로 깔고, 시험 물질과 염증 반응 유도 물질을 60분간 처리한 후 RIPA buffer (Gibco사)를 첨가하여 균질화 하였다. 이때, 시험 물질로는 제조예 14에서 제조한 복합 추출물을 사용하였고, 염증 반응 유도 물질로는 LPS(lipopolysaccharide)를 사용하였다. 이후, 균질화된 대식세포 샘플을 4℃ 및 13000 rpm의 조건에서 15분간 원심분리하여 얻은 상층액을 영하 80℃에서 보관하면서 COX-2, iNOS, p65(NF-카파B), p-p65(phosphor-NF-카파B), IRAK-1(Interleukin-1 receptor-associated kinase 1), p-IKK-β, p-IκB-α, IκB-α 및 β-actin의 발현량을 Western blotting 방법으로 측정하였다. 먼저 상층액 50㎍을 취해 SDS 10%(w/v) polyacrylamide gel에서 1시간 30분간 전기영동을 하였다. 전기영동한 샘플을 니트로셀룰로스지에 100V, 400㎃의 조건에서 1시간 10분간 트랜스퍼(transfer) 하였다. 샘플이 트랜스퍼된 니트로셀로로스지를 5% skim milk로 30분간 blocking 한 후, 5분씩 3회에 걸쳐 PBS-Tween으로 세척하고, 1차 antibody(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:100의 비율로 하여 하룻밤 동안 반응시켰다. 이후, 10분씩 3회에 걸쳐 세척하고, 2차 antibody(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:1000의 비율로 하여 1시간 20분간 반응시켰다. 이후, 15분씩 3회에 걸쳐 세척하고, 형광발색 시킨 후 현상하였다.
도 10은 LPS(lipopolysaccharide)로 처리된 대식세포에서 오배자 추출물, 지모 추출물 및 더덕 추출물로 이루어진 복합 추출물에 의해 염증 반응이 억제되는 것을 나타낸 결과이다. 도 10에서 "OJD"는 제조예 14에서 제조한 복합 추출물을 의미한다. 도 10에서 보이는 바와 같이 오배자 추출물, 지모 추출물 및 더덕 추출물로 이루어진 복합 추출물은 우수한 항염증 효과를 나타내었다.
Ⅲ. 3차 실험 : 지모 추출물 등 및 황련 추출물 등의 병용에 의한 대장염 예방 또는 치료 효과 확인
11. 지모 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 화합물의 제조
제조예 21 : 지모 추출물의 제조
지모 500 g에 80% 메탄올 수용액 2ℓ를 가하고 수욕 상에서 약 2시간 동안 추출한 후 여과하였다. 또한, 남은 잔사에 동일한 용매 1ℓ를 가하고 동일한 조건에서 재추출한 후 여과하였다. 여과된 추출액을 감압 조건하에서 농축하고 동결건조하여 지모 추출물 189g을 얻었다.
제조예 22 : 지모 추출물로부터 부탄올 가용성 분획물의 제조
제조예 21에서 얻은 지모 추출물 189g을 물 1.5ℓ에 현탁한 후, 여기에 n-부탄올 1.5ℓ를 가하고 진탕 방치하여 n-부탄올 가용성 분획층과 물 가용성 분획층으로 분리하였다. n-부탄올 가용성 분획층을 취하고 감압 조건하에서 농축하고 동결건조하여 n-부탄올 가용성 분획물 41g을 얻었다. n-부탄올 가용성 분획물의 수율은 지모를 기준으로 할 때 8.2% 이상이었고, n-부탄올 가용성 분획물에 함유된 만지페린(Mangiferin)의 함량은 10% 이상이었다.
제조예 23 : 지모 추출물의 부탄올 가용성 분획물로부터 화합물의 분리
제조예 22에서 얻은 n-부탄올 가용성 분획물 10g에 대하여 용출 용매(클로로포름:메탄올:물=65:35:10)로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Merck, 10㎝×30㎝, 70~230 mesh)를 실시하여 9개의 소분획을 얻었다. 9개의 소분획 중 대장염 동물모델 시험에서 효과가 가장 우수했던 소분획인 Fr. Ⅶ에 대하여 25% 메탄올을 용출 용매로 MPLC(Medium pressure liquid chromatography; C18 reverse Merck, 3㎝×20㎝)를 실시하여 2개의 분획을 얻었다. 2개의 분획을 농축한 후 이를 각각 메탄올로 재결정하여 흰색 분말 형태의 화합물 2개를 얻었으며 질량 분석 및 13C-NMR(Bruker, AVANCE digital 400)로 구조를 확인한 결과, 만지페린(Mangiferin)과 네오만지페린(Neomangiferin)인 것으로 확인되었다. 도 2는 만지페린(Mangiferin) 및 네오만지페린(Neomangiferin)의 화학 구조식을 나타낸 것이다. 만지페린(Mangiferin) 및 네오만지페린(Neomangiferin)의 수율은 지모를 기준으로 할 때 각각 0.5% 이상 및 0.1% 이상이었다.
<만지페린>
ESI(-)-MS/MS 421, 301 [M-Na]-
13C NMR (100 MHz) peaks : 162.254 (C-1), 108.04 (C-2), 164.295 (C-3), 93.813 (C-4), 103.088 (C-5), 154.606 (C-6), 144.228 (C-7), 108.489 (C-8), 179.551 (C-9), 156.697 (C-4a), 151.286 (C-4b), 112.128 (C-8a), 101.772 (C-8b), 82.025 (2-glc C-1’), 73.564 (C-2’), 71.103 (C-3’), 70.724 (C-4’), 79.449 (C-5’), 61.961 (C-6’).
<네오만지페린>
ESI(-)-MS/MS 421, 301 [M-Na]-
13C NMR (100 MHz) 162.5 (C-1), 108.3 (C-2), 164. 5 (C-3), 94.0 (C-4), 103.3 (C-5), 156.9 (C-6), 144.4 (C-7), 112.4 (C-8), 179.8 (C-9), 154.7(C-4a), 151.5 (C-4b), 108.8 (C-8a), 102.0 (C-8b), 73.8 (2-glc C-1’), 71.3 (C-2’), 79.7 (C-3’), 71.0 (C-4’), 82.2 (C-5’), 61.4 (C-6’), 103.4 (7-glc C-1”) 73.5 (C-2”), 76.1 (C-3”), 69.6 (C-4”), 77.3 (C-5”), 60.7 (C-6”).
12. 오배자 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 화합물의 제조
제조예 24 : 오배자 추출물의 제조
오배자 500 g에 80% 메탄올 수용액 2ℓ를 가하고 수욕 상에서 약 2시간 동안 추출한 후 여과하였다. 또한, 남은 잔사에 동일한 용매 1ℓ를 가하고 동일한 조건에서 재추출한 후 여과하였다. 여과된 추출액을 감압 조건하에서 농축하고 동결건조하여 오배자 추출물 190g을 얻었다.
제조예 25 : 오배자 추출물로부터 부탄올 가용성 분획물의 제조
제조예 24에서 얻은 오배자 추출물 190g을 물 1.5ℓ에 현탁한 후, 여기에 n-부탄올 1.5ℓ를 가하고 진탕 방치하여 n-부탄올 가용성 분획층과 물 가용성 분획층으로 분리하였다. n-부탄올 가용성 분획층을 취하고 감압 조건하에서 농축하고 동결건조하여 n-부탄올 가용성 분획물 102g을 얻었다. n-부탄올 가용성 분획물의 수율은 오배자를 기준으로 할 때 21% 이상이었고, n-부탄올 가용성 분획물에 함유된 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-β-D-글루코스(glucose1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)의 함량은 30% 이상이었다.
13. 더덕 추출물, 이의 분획물 및 이로부터 분리된 화합물의 제조
제조예 26 : 더덕 추출물의 제조
건조된 더덕(Codonopsis lanceolata Trautv) 뿌리(경동시장, 서울, 대한민국) 2㎏에 80% 메탄올 수용액 4ℓ를 가하고 수욕 상에서 약 2시간 동안 추출한 후 여과하였다. 또한, 남은 잔사에 동일한 용매 2ℓ를 가하고 동일한 조건에서 재추출한 후 여과하였다. 여과된 추출액을 감압 조건하에서 농축하고 동결건조하여 더덕 추출물 185g을 얻었다.
제조예 27 : 더덕 추출물로부터 부탄올 가용성 분획물의 제조
제조예 26에서 얻은 더덕 추출물 185g을 물 1.5ℓ에 현탁한 후, 여기에 n-부탄올 1.5ℓ를 가하고 진탕 방치하여 n-부탄올 가용성 분획층과 물 가용성 분획층으로 분리하였다. n-부탄올 가용성 분획층을 취하고 감압 조건하에서 농축하고 동결건조하여 n-부탄올 가용성 분획물 112g을 얻었다. n-부탄올 가용성 분획물의 수율은 더덕을 기준으로 할 때 5.5% 이상이었고, n-부탄올 가용성 분획물에 함유된 란세마사이드 A(Lancemaside A)의 함량은 4% 이상이었다.
14. 천황련 추출물 및 이의 분획물의 제조
제조예 28 : 천황련 추출물의 제조
건조된 천황련(Coptis chinensis) 뿌리(경동시장, 서울, 대한민국) 500g에 80% 에탄올 수용액 2ℓ를 가하고 수욕 상에서 약 2시간 동안 추출한 후 여과하였다. 또한, 남은 잔사에 동일한 용매 1ℓ를 가하고 동일한 조건에서 재추출한 후 여과하였다. 여과된 추출액을 감압 조건하에서 농축하고 동결건조하여 천황련 추출물 123g을 얻었다.
제조예 29 : 천황련 추출물로부터 부탄올 가용성 분획물의 제조
제조예 28에서 얻은 천황련 추출물 123g을 물 1.5ℓ에 현탁한 후, 여기에 n-부탄올 1.5ℓ를 가하고 진탕 방치하여 n-부탄올 가용성 분획층과 물 가용성 분획층으로 분리하였다. n-부탄올 가용성 분획층을 취하고 감압 조건하에서 농축하고 동결건조하여 n-부탄올 가용성 분획물 63g을 얻었다. n-부탄올 가용성 분획물의 수율은 천황련을 기준으로 할 때 12.5% 이상이었다. n-부탄올 가용성 분획물에 대한 성분을 고성능액체크로마토그래피(HPLC; Waters Alliance 2695 모델)를 이용하여 분석하였다. 컬럼은 와이엠씨 하이드로스피어 C18(YMC Hydrosphere C18, S-5㎛, 120㎚, 4.6×250㎜ I.D)를 사용하였고 시료 온도는 25℃±1, 컬럼 온도는 30℃±1을 유지하였다. 시료 농도는 1㎎/㎖로 제조하여 10㎕ 주입하였으며 유속은 1.0㎖/min으로 분석하였다. 또한 표준물질은 베르베린, 팔마틴, 콥티신 등은 상용화되어 있는 것을 시그마사로부터 구입하여 사용하였고 컬럼바민과 자트로리진은 황련으로부터 분리, 정제하여 사용하였다. 이동상은 0.2% 인산용액(용매 A)과 메탄올(용매 B)의 gradient 조건으로　0분~60분(A:B=9:1~6:4), 60분~70분(A:B=6:4~5:5), 70분~90분(A:B=5:5~0:10)으로 분석하였다. 활성성분 함량의 계산은 각각의 표준물질에 대한 면적비를 중량 백분율로 나타내었다. 분석 결과, 천황련 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물은 베르베린 27~30%, 팔마틴 7~8%, 콥티신 5~6%, 컬럼바민 0.8~1.2%, 자트로리진 0.8~1.2% 정도를 함유하였다.
15. 복합 추출물의 제조
제조예 30.
제조예 22에서 얻은 지모 추출물의 부탄올 가용성 분획물 50 중량부 및 제조예 25에서 얻은 오배자 추출물의 부탄올 가용성 분획물 50 중량부를 혼합하여 복합 추출물을 제조하였다.
제조예 31.
제조예 22에서 얻은 지모 추출물의 부탄올 가용성 분획물 50 중량부 및 제조예 27에서 얻은 더덕 추출물의 부탄올 가용성 분획물 50 중량부를 혼합하여 복합 추출물을 제조하였다.
제조예 32.
제조예 22에서 얻은 지모 추출물의 부탄올 가용성 분획물 50 중량부, 제조예 25에서 얻은 오배자 추출물의 부탄올 가용성 분획물 50 중량부 및 제조예 27에서 얻은 더덕 추출물의 부탄올 가용성 분획물 50 중량부를 혼합하여 복합 추출물을 제조하였다.
제조예 33.
제조예 22에서 얻은 지모 추출물의 부탄올 가용성 분획물 50 중량부 및 제조예 29에서 얻은 천황련 추출물의 부탄올 가용성 분획물 50 중량부를 혼합하여 복합 추출물을 제조하였다.
16. TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물 실험을 통한 대장염 치료 효과 측정
(1) 실험동물의 준비
6주령 수컷 생쥐(C57BL/6, 18-22g)를 오리엔트바이오㈜로부터 구입하였다. 모든 생쥐는 습도 50±10%, 온도 20~22℃의 조절된 환경 조건에서 사육하였으며 조명은 12시간 킨 후 12 시간 끄는 것을 반복하였다. 사료는 표준 실험용 사료(Samyang, Korea)를 사용하였으며 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 모든 실험에서 한군은 6마리로 하였다.
(2) TNBS에 의한 급성 대장염 유발 및 시료 투여
실험동물 중 한 군을 정상군으로 하고, 나머지 군의 실험동물에 대해서는 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)으로 급성 대장염을 유발하였다. 구체적으로 실험동물을 가볍게 에테르로 마취한 후 NBS(2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid) 용액 2.5g을 50% 에탄올에 혼합한 용액을 끝이 둥근 1㎖ 용량의 주사기를 이용하여 항문을 통해 대장 내로 0.1㎖ 씩 투여하고 수직으로 들어 30초간 유지하여 염증을 유발하였다. 반면, 정상군에는 생리식염수 0.1㎖를 경구투여하였다. 이후, 익일부터 매일 1회씩 3일간 약물 시료를 생리식염수에 녹여 미리 정한 용량대로 경구투여하고 시료 투여가 종료된 다음날에 실험동물을 이산화탄소로 질식시켜 죽이고 대장부위 중 맹장으로부터 항문 직전 부위까지의 대장을 적출하였다. 이때, 약물 시료로 지모 추출물의 부탄올 분획물, 만지페린 및 복합 추출물을 사용한 실험은 각각 시간적 간격을 두고 별개의 실험으로 이루어졌으며, 약물 시료의 대장염 예방 또는 치료 효과는 각각의 실험 안에서 TNBS에 의해 급성 대장염을 유발한 모델동물에 별도의 약물 시료 대신 생리식염수를 공급한 군을 기준으로 분석하는 것이 합리적이다.
(3) 모델동물의 체중 변화, 대장의 외관 및 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정
1) 체중 변화량 분석
TNBS에 의해 대장염이 유발된 모델동물에 시료 투여를 종료하고 다음날에 실험동물의 체중을 측정한 후 최초 체중과 비교하여 체중 변화량을 산출하였다.
2) 외관 분석
적출한 대장은 그 길이와 외관을 관찰하여 하기 표 11의 기준(Hollenbach 등, 2005 대장염 정도에 대한 기준)에 따라 점수로 매겼다. 이때 양성 대조군으로 메살라진(Mesalazine; Sigma) 투여군을 사용하였다. 또한, 장내 미생물 분석을 위해 대장 내용물의 일부를 채취하여 영하 80℃에서 냉동보관하였다. 대장 조직은 대장 내용물을 모두 제거하고, 생리 식염수에 세척한 후 일부는 병리조직용 샘플로 사용하기 위해 4% 포름알데히드 고정액으로 고정하였으며, 나머지는 분자생물학적 분석을 영하 80℃에서 냉동보관하였다.
표 11
외관 점수(Macroscopic Score) 기준
0 어떠한 궤양과 염증도 발견되지 않음
1 출혈이 없는 충혈이 발견됨
2 충혈이 있는 궤양이 발견됨
3 한 곳에서만 궤양과 염증이 발견됨
4 궤양과 염증이 2곳 이상에서 발견됨
5 궤양이 2㎝ 이상으로 확대되어 있음
3) 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정
대장조직 100㎎에 lysis buffer 200㎕를 넣고 균질화(homogenization) 하였다. 그 후 4℃ 및 13000 rpm의 조건에서 15분간 원심분리하여 상층액을 얻은 다음 Mouse MPO assay ELISA kit(Hbt HK210, USA)을 사용하여 MPO 활성을 측정하였다. 상층액 100㎕를 96 well plate에 넣은 다음 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 완료된 후 plate를 뒤집어 비운 다음 200㎕의 세척 완충용액을 사용하여 세척과정을 3회 반복한 다음 100㎕의 희석된 tracer를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 plate를 뒤집어 비운 다음 200㎕의 세척 완충용액을 사용하여 각 well을 세척하였다. 200㎕의 세척 완충용액을 사용하여 세척과정을 3회 반복한 다음 100㎕의 희석된 streptavidin-peroxidase conjugate를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 plate를 뒤집어 비운 다음 200㎕의 세척 완충용액을 사용하여 각 well을 세척하였다. 200㎕의 세척 완충용액을 사용하여 세척과정을 3회 반복한 다음 100㎕의 TMB substrate solution을 첨가하고 plate를 알루미늄 호일로 감싸 빛을 차단하고 실온에서 30분간 반응시켰다. 그리고 100㎕의 정지 용액을 첨가하여 반응을 중지시키고 ELISA reader를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.
4) 체중 변화량, 대장의 외관, 대장의 길이 및 MPO 활성 측정 결과
도 11은 약물 시료로 제조예 22에서 수득한 지모 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 체중 변화 및 대장의 외관 점수를 나타낸 그래프이고, 도 12는 약물 시료로 제조예 22에서 수득한 지모 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장 길이 및 MPO 활성 측정 결과를 나타낸 것이다. 도 11 및 도 12에서 "N" 또는 "NOR"은 정상군을 나타내고, "TNBS"는 TNBS에 의해 급성 대장염을 유발한 모델동물에 별도의 약물 시료 대신 생리식염수를 공급한 군을 의미하고, "A" 또는 "AJ"는 지모 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 의미한다. 또한, "A10" 및 "A20"는 각각 약물 시료 "A"의 1회 투여량이 10㎎/마우스 ㎏ 및 20㎎/마우스 ㎏인 것을 의미한다. 또한, 도 11 및 도 12에서 "M"은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)을 의미하고, 메살라진의 1회 투여량은 10㎎/마우스 ㎏이다. 도 11 및 도 12에서 보이는 바와 같이 지모 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물은 농도 의존적으로 TNBS에 의해 유도된 급성 대장염을 완화하거나 개선하는 효과를 나타내었다.
도 13은 약물 시료로 제조예 23에서 수득한 만지페린(Mangiferin)을 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 체중 변화, 대장의 외관 점수, 대장 길이 및 MPO 활성 측정 결과를 나타낸 것이다. 도 13에서 "NOR"은 정상군을 나타내고, "MF"는 만지페린(Mangiferin)을 의미한다. 또한, "MF10" 및 "MF20"는 각각 약물 시료 "MF"의 1회 투여량이 10㎎/마우스 ㎏ 및 20㎎/마우스 ㎏인 것을 의미한다. 또한, 도 13에서 "MS"는 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)을 의미하고, 메살라진의 1회 투여량은 10㎎/마우스 ㎏이다. 도 13에서 보이는 바와 같이 만지페린(Mangiferin)은 농도 의존적으로 TNBS에 의해 유도된 급성 대장염을 완화하거나 개선하는 효과를 나타내었다.
도 14는 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 체중 변화 및 대장의 외관 점수를 나타낸 그래프이고 도 15는 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장 길이 및 MPO 활성 측정 결과를 나타낸 것이다. 도 14 및 도 15에서 "NOR"은 정상군을 나타내고, "AC"는 제조예 33에서 제조한 복합 추출물을 의미하고, "ALG"는 제조예 32에서 제조한 복합 추출물을 의미한다. 또한, "AC10" 및 "AC20"은 각각 약물 시료 "AC"의 1회 투여량이 10㎎/마우스 ㎏ 및 20㎎/마우스 ㎏인 것을 의미한다. 또한, 도 14 및 도 15에서 "M"은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)을 의미하고, 메살라진의 1회 투여량은 10㎎/마우스 ㎏이다. 도 14 및 도 15에서 보이는 바와 같이 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물과 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)과 유사한 수준의 급성 대장염 억제 효과를 나타내었고, 특히 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 그 효과가 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물보다 더 우수하였다.
(4) 염증 반응 지표 물질의 발현에 미치는 영향 분석
1) 염증 유발 사이토카인(proinflammatory cytokine) 및 항염증 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)의 발현에 미치는 영향
모델동물의 대장조직 100㎎에 protease inhibitor cocktail이 함유된 250 ㎕l의 RIPA buffer를 첨가하여 균질화 하였다. 그 후 4℃ 및 13000 rpm의 조건에서 15분간 원심분리하여 얻은 상층액을 영하 80℃에서 보관하면서 염증 유발 사이토카인(proinflammatory cytokine)에 해당하는 IL-1 베타, IL-6 및 TNF-알파의 발현량과 항염증 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)에 해당하는 IL-10의 발현량을 96-well ELISA plate kits(Pierce Biotechology, Inc., Rockford, IL, USA)를 이용하여 측정하였다.
도 16은 약물 시료로 제조예 22에서 수득한 지모 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 IL-1 베타 및 IL-6의 발현량을 나타낸 그래프이고, 도 17은 약물 시료로 제조예 22에서 수득한 지모 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 TNF-알파 및 IL-10의 발현량을 나타낸 그래프이다. 도 16 및 도 17에서 "NOR"은 정상군을 나타내고, "A"는 지모 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 의미한다. 또한, "A10" 및 "A20"는 각각 약물 시료 "A"의 1회 투여량이 10㎎/마우스 ㎏ 및 20㎎/마우스 ㎏인 것을 의미한다. 또한, 도 16 및 도 17에서 "M"은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)을 의미한다. 도 16 및 도 17에서 보이는 바와 같이 지모 추출물의 n-부탄올 가용성 분획물을 투여하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물의 대장조직에서 염증 유발 사이토카인(proinflammatory cytokine)에 해당하는 IL-1 베타, IL-6 및 TNF-알파의 발현량이 약물 투여량에 의존적으로 감소하였고, 항염증 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)에 해당하는 IL-10의 발현량이 약물 투여량에 의존적으로 증가하였다.
도 18은 약물 시료로 제조예 23에서 수득한 만지페린(Mangiferin)을 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 염증 유발 사이토카인(proinflammatory cytokine) 및 항염증 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)의 발현량을 나타낸 그래프이다. 도 18에서 "MF"는 만지페린(Mangiferin)을 의미하고, "MS"는 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)을 의미한다. 도 8에서 보이는 바와 같이 만지페린(Mangiferin)을 투여하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물의 대장조직에서 염증 유발 사이토카인(proinflammatory cytokine)에 해당하는 IL-1 베타, IL-6 및 TNF-알파의 발현량이 약물 투여량에 의존적으로 감소하였고, 항염증 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)에 해당하는 IL-10의 발현량이 약물 투여량에 의존적으로 증가하였다.
도 19는 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 IL-1 베타 및 IL-6의 발현량을 나타낸 그래프이고, 도 20은 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 TNF-알파 및 IL-10의 발현량을 나타낸 그래프이다. 도 19 및 도 20에서 "N" 또는 "NOR"은 정상군을 나타내고, "AC"는 제조예 33에서 제조한 복합 추출물을 의미하고, "ALG"는 제조예 32에서 제조한 복합 추출물을 의미한다. 또한, "AC10" 및 "AC20"은 각각 약물 시료 "AC"의 1회 투여량이 10㎎/마우스 ㎏ 및 20㎎/마우스 ㎏인 것을 의미한다. 또한, 도 19 및 도 20에서 "M"은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)을 의미하고, 메살라진의 1회 투여량은 10㎎/마우스 ㎏이다. 도 19 및 도 20에서 보이는 바와 같이 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물과 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)과 유사한 수준으로 염증 유발 사이토카인(proinflammatory cytokine)의 발현을 감소시켰고 항염증 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)의 발현을 증가시켰다. 특히, 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 그 효과가 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물보다 더 우수하였다.
2) 염증 반응 지표 물질의 발현 억제 여부
모델동물의 대장조직 0.3 g에 protease inhibitor cocktail이 함유된 1㎖의 RIPA buffer(Gibco사)를 첨가하여 균질화 하였다. 그 후 4℃ 및 13000 rpm의 조건에서 15분간 원심분리하여 얻은 상층액을 영하 80℃에서 보관하면서 COX-2, iNOS, p65(NF-카파B), p-p65(phosphor-NF-카파B) 및 β-actin의 발현량을 Western blotting 방법으로 측정하였다. 먼저 상층액 50㎍을 취해 SDS 10%(w/v) polyacrylamide gel에서 1시간 30분간 전기영동을 하였다. 전기영동한 샘플을 니트로셀룰로스지에 100V, 400㎃의 조건에서 1시간 10분간 트랜스퍼(transfer) 하였다. 샘플이 트랜스퍼된 니트로셀로로스지를 5% skim milk로 30분간 blocking 한 후, 5분씩 3회에 걸쳐 PBS-Tween으로 세척하고, 1차 antibody(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:100의 비율로 하여 하룻밤 동안 반응시켰다. 이후, 10분씩 3회에 걸쳐 세척하고, 2차 antibody(Santa Cruz Biotechnology, 미국)를 1:1000의 비율로 하여 1시간 20분간 반응시켰다. 이후, 15분씩 3회에 걸쳐 세척하고, 형광발색 시킨 후 현상하였다.
도 21은 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 복합 추출물을 투여하였을 때 모델동물의 대장조직에서 염증 반응 지표 물질의 발현이 억제되는 것을 나타낸 결과이다. 도 21에서 "N"은 정상군을 나타내고, "AC"는 제조예 33에서 제조한 복합 추출물을 의미하고, "ALG"는 제조예 32에서 제조한 복합 추출물을 의미한다. 또한, "AC10" 및 "AC20"은 각각 약물 시료 "AC"의 1회 투여량이 10㎎/마우스 ㎏ 및 20㎎/마우스 ㎏인 것을 의미한다. 또한, 도 21에서 "M"은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)을 의미하고, 메살라진의 1회 투여량은 10㎎/마우스 ㎏이다. 도 21에서 보이는 바와 같이 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물과 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)과 유사한 수준으로 염증 반응 물질인 COX-2, iNOS, p-p65(phosphor-NF-카파B) 등의 발현을 억제하였다. 특히 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 그 효과가 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물보다 더 우수하였다.
(5) TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물 실험 결과 요약
하기 표 12는 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 투여된 약물 시료의 대장염 완화 내지 개선 효과를 요약한 것이다. 하기 표 12에서, 분석 항목의 값은 TNBS에 의해 급성 대장염을 유발한 모델동물에 별도의 약물 시료 대신 약물 시료의 비클(vehicle)로 사용한 생리식염수를 공급한 군의 값에 대한 백분율로 나타내었다.
하기 표 12에서 보이는 바와 같이 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물 또는 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물을 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 투여하였을 때 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물, 더덕 추출물의 분획물 또는 황련 추출물의 분획물을 각각 단독으로 투여하였을 때보다 크게 향상된 대장염 완화 내지 개선 효과를 나타내었다. 특히, 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 그 효과가 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물보다 더 우수하였다. 이는, 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물이 각각 대장염 완화 내지 치료와 관련된 서로 다른 타겟에서 작용하여, 병용 시 높은 시너지 효과를 보이는 것으로 판단된다. 또한, 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 대장염 완화 내지 개선 효과는 지모 추출물의 분획물을 지모 추출물이나 지모로부터 분리된 화합물인 만지페린으로 대체하거나 천황련 추출물의 분획물을 천황련 추출물로 대체하는 경우에도 동일하게 발휘될 것으로 기대된다.
표 12
실험군 구분 분석항목 값(TNBS 처리 후 생리식염수 공급 군에 대한 백분율, %)
TNBS 처리 여부 투여 약물 시료 약물 시료 1회 투여량(㎎/㎏) Body weight Macroscopic score Colon length MPO활성 TNF-α IL-1β IL-6 IL-10
- vehicle - 121.8 11.1 172.5 4.3 12.1 4.9 14 800
+ vehicle - 100 100 100 100 100 100 100 100
+ 제조예 22 20 112 66.7 115 52.2 29.8 29.8 59.6 450
+ 제조예 25 20 113.8 72.2 115 43.5 32.4 34.1 62.9 396.4
+ 제조예 27 20 110.9 77.8 107.5 65.2 37 36 74.7 253.6
+ 제조예 29 20 109.8 72.2 115 69.6 29.1 33.3 58.1 364.3
+ 제조예 31 20 113.1 66.7 115 47.8 29.6 28.9 54.9 457.1
+ 제조예 33 20 116.7 38.9 160 30.4 25 18.9 23.5 575
+ 제조예 30 20 111.6 61.1 120 47.8 28.6 32.2 45.3 525
+ 제조예 32 20 113.8 50 125 39.1 32.5 29.9 28.2 435.7
+ 메살라진 10 113.5 61.1 155 47.8 36.8 30.3 26.6 425
다만, 지모 추출물의 분획물과 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물 또는 지모 추출물의 분획물과 오배자 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물을 TNBS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 투여하였을 때에는 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물, 더덕 추출물의 분획물 또는 황련 추출물의 분획물을 각각 단독으로 투여하였을 때와 대장염 완화 내지 개선 효과 측면에서 유의성 있는 차이가 나타나지 않았다.
17. DSS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물 실험을 통한 대장염 치료 효과 측정
(1) 실험동물의 준비
6주령 수컷 생쥐(C57BL/6, 18-22g)를 오리엔트바이오㈜로부터 구입하였다. 모든 생쥐는 습도 50±10%, 온도 20~22℃의 조절된 환경 조건에서 사육하였으며 조명은 12시간 킨 후 12 시간 끄는 것을 반복하였다. 사료는 표준 실험용 사료(Samyang, Korea)를 사용하였으며 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 모든 실험에서 한군은 6마리로 하였다.
(2) DSS에 의한 급성 대장염 유발 및 시료 투여
실험동물 중 한 군을 정상군으로 하고, 나머지 군의 실험동물에 대해서는 덱스트란황산나트륨(dextran sulfate sodium; 분자량 : 36~50 kDaltons)으로 급성 대장염을 유발하였다. 구체적으로 음용수로 물 대신 2.5%(w/v) 덱스트란황산나트륨 수용액을 7일간 음용하게 하여 급성 대장염이 유도된 모델동물을 제작하였다. 반면, 정상군에는 음용수로 물을 공급하였다. 이후, 익일부터 매일 1회씩 3일간 약물 시료를 생리식염수에 녹여 미리 정한 용량대로 경구투여하고 시료 투여가 종료된 다음날에 실험동물을 이산화탄소로 질식시켜 죽이고 대장부위 중 맹장으로부터 항문 직전 부위까지의 대장을 적출하였다.
(3) 모델동물의 체중 변화, 대장의 외관 및 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정
1) 체중 변화량 분석
TNBS에 의해 대장염이 유발된 모델동물 실험과 동일한 방법으로 체중 변화량을 분석하였다.
2) 외관 분석
TNBS에 의해 대장염이 유발된 모델동물 실험과 동일한 방법으로 대장의 외관을 분석하였다.
3) MPO 활성 측정
TNBS에 의해 대장염이 유발된 모델동물 실험과 동일한 방법으로 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성을 측정하였다.
4) 체중 변화량, 대장의 외관, 대장의 길이 및 MPO 활성 측정 결과
도 22는 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 DSS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 체중 변화 및 대장의 외관 점수를 나타낸 그래프이고 도 23은 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 DSS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장 길이 및 MPO 활성 측정 결과를 나타낸 것이다. 도 22 및 도 23에서 "NOR"은 정상군을 나타내고, "AC"는 제조예 33에서 제조한 복합 추출물을 의미하고, "ALG"는 제조예 32에서 제조한 복합 추출물을 의미한다. 또한, "AC10" 및 "AC20"은 각각 약물 시료 "AC"의 1회 투여량이 10㎎/마우스 ㎏ 및 20㎎/마우스 ㎏인 것을 의미한다. 또한, 도 22 및 도 23에서 "M"은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)을 의미하고, 메살라진의 1회 투여량은 10㎎/마우스 ㎏이다. 도 22 및 도 23에서 보이는 바와 같이 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물과 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)과 유사한 수준의 급성 대장염 억제 효과를 나타내었고, 특히 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 그 효과가 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물보다 더 우수하였다.
(4) 염증 반응 지표 물질의 발현에 미치는 영향 분석
1) 염증 유발 사이토카인(proinflammatory cytokine) 및 항염증 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)의 발현에 미치는 영향
약물 시료를 DSS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 투여하였을 때 대장 조직에서 염증 유발 사이토카인(proinflammatory cytokine) 및 항염증 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)의 발현량을 TNBS에 의해 대장염이 유발된 모델동물 실험과 동일한 방법으로 측정하였다.
도 24는 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 DSS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 IL-1 베타 및 IL-10의 발현량을 나타낸 그래프이고, 도 25는 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 DSS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 TNF-알파 및 IL-6의 발현량을 나타낸 그래프이다. 도 24 및 도 25에서 "NOR"은 정상군을 나타내고, "AC"는 제조예 33에서 제조한 복합 추출물을 의미하고, "ALG"는 제조예 32에서 제조한 복합 추출물을 의미한다. 또한, "AC10" 및 "AC20"은 각각 약물 시료 "AC"의 1회 투여량이 10㎎/마우스 ㎏ 및 20㎎/마우스 ㎏인 것을 의미한다. 또한, 도 24 및 도 25에서 "M"은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)을 의미하고, 메살라진의 1회 투여량은 10㎎/마우스 ㎏이다. 도 24 및 도 25에서 보이는 바와 같이 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물과 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)과 유사한 수준으로 염증 유발 사이토카인(proinflammatory cytokine)의 발현을 감소시켰고 항염증 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)의 발현을 증가시켰다. 특히, 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 그 효과가 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물보다 더 우수하였다.
2) 염증 반응 지표 물질의 발현 억제 여부
약물 시료를 DSS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 투여하였을 때 대장 조직에서 COX-2, iNOS, p65(NF-카파B), p-p65(phosphor-NF-카파B) 및 β-actin의 발현량을 TNBS에 의해 대장염이 유발된 모델동물 실험과 동일한 방법으로 측정하였다.
도 26은 DSS에 의해 급성 대장염이 유도된 모델동물에 복합 추출물을 투여하였을 때 모델동물의 대장조직에서 염증 반응 지표 물질의 발현이 억제되는 것을 나타낸 결과이다. 도 26에서 "N"은 정상군을 나타내고, "AC"는 제조예 33에서 제조한 복합 추출물을 의미하고, "ALG"는 제조예 32에서 제조한 복합 추출물을 의미한다. 또한, "AC10" 및 "AC20"은 각각 약물 시료 "AC"의 1회 투여량이 10㎎/마우스 ㎏ 및 20㎎/마우스 ㎏인 것을 의미한다. 또한, 도 26에서 "M"은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)을 의미하고, 메살라진의 1회 투여량은 10㎎/마우스 ㎏이다. 도 26에서 보이는 바와 같이 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물과 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)과 유사한 수준으로 염증 반응 물질인 COX-2, iNOS, p-p65(phosphor-NF-카파B) 등의 발현을 억제하였다. 특히, 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 그 효과가 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물보다 더 우수하였다.
18. 옥사졸론(Oxazolone)에 의해 만성 대장염이 유도된 모델동물 실험을 통한 대장염 치료 효과 측정
(1) 실험동물의 준비
6주령 수컷 생쥐(C57BL/6, 18-22g)를 오리엔트바이오㈜로부터 구입하였다. 모든 생쥐는 습도 50±10%, 온도 20~22℃의 조절된 환경 조건에서 사육하였으며 조명은 12시간 킨 후 12 시간 끄는 것을 반복하였다. 사료는 표준 실험용 사료(Samyang, Korea)를 사용하였으며 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 모든 실험에서 한군은 6마리로 하였다.
(2) 옥사졸론에 의한 만성 대장염 유발 및 시료 투여
실험동물 중 한 군을 정상군으로 하고, 나머지 군의 실험동물에 대해서는 옥사졸론으로 만성 대장염을 유발하였다. 구체적으로 생쥐의 등에 있는 털을 깍고 약 1.5㎝×1.5㎝의 면적에 3%(w/v) 옥사졸론 용액 0.2㎖를 발라 감작시켰다. 8일 후에 생쥐를 마취하고 1% 옥사졸론 용액 0.1㎖를 직장을 통해 대장 내로 투여하였다. 이후, 익일부터 매일 1회씩 15일간 약물 시료를 생리식염수에 녹여 미리 정한 용량대로 경구투여하고 시료 투여가 종료된 다음날에 실험동물을 이산화탄소로 질식시켜 죽이고 대장부위 중 맹장으로부터 항문 직전 부위까지의 대장을 적출하였다.
(3) 모델동물의 체중 변화, 대장의 외관 및 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정
1) 체중 변화량 분석
TNBS에 의해 대장염이 유발된 모델동물 실험과 동일한 방법으로 체중 변화량을 분석하였다.
2) 외관 분석
TNBS에 의해 대장염이 유발된 모델동물 실험과 동일한 방법으로 대장의 외관을 분석하였다.
3) MPO 활성 측정
TNBS에 의해 대장염이 유발된 모델동물 실험과 동일한 방법으로 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성을 측정하였다.
4) 체중 변화량, 대장의 외관, 대장의 길이 및 MPO 활성 측정 결과
도 27은 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 옥사졸론에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물의 체중 변화 및 대장의 외관 점수를 나타낸 그래프이고 도 28은 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 옥사졸론에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물의 대장 길이 및 MPO 활성 측정 결과를 나타낸 것이다. 도 27 및 도 28에서 "NOR"은 정상군을 나타내고, "OXA"는 옥사졸론으로 만성 대장염을 유발시킨 후 생리식염수만을 경구투여한 실험군을 나타내고, "AC"는 제조예 33에서 제조한 복합 추출물을 의미하고, "ALG"는 제조예 32에서 제조한 복합 추출물을 의미한다. 또한, "AC-10" 및 "AC-20"은 각각 약물 시료 "AC"의 1회 투여량이 10㎎/마우스 ㎏ 및 20㎎/마우스 ㎏인 것을 의미한다. 또한, 도 27 및 도 28에서 "M"은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)을 의미하고, 메살라진의 1회 투여량은 10㎎/마우스 ㎏이다. 도 27 및 도 28에서 보이는 바와 같이 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물과 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)과 유사한 수준의 만성 대장염 억제 효과를 나타내었고, 특히 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 그 효과가 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물보다 더 우수하였다.
(4) 염증 반응 지표 물질의 발현에 미치는 영향 분석
1) 염증 유발 사이토카인(proinflammatory cytokine) 및 항염증 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)의 발현에 미치는 영향
약물 시료를 옥사졸론에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물에 투여하였을 때 대장 조직에서 염증 유발 사이토카인(proinflammatory cytokine) 및 항염증 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)의 발현량을 TNBS에 의해 대장염이 유발된 모델동물 실험과 동일한 방법으로 측정하였다.
도 29는 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 옥사졸론에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 IL-1 베타 및 IL-10의 발현량을 나타낸 그래프이고, 도 30은 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 옥사졸론에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 TNF-알파 및 IL-6의 발현량을 나타낸 그래프이다. 도 29 및 도 30에서 "NOR"은 정상군을 나타내고, "OXA"는 옥사졸론으로 만성 대장염을 유발시킨 후 생리식염수만을 경구투여한 실험군을 나타내고, "AC"는 제조예 33에서 제조한 복합 추출물을 의미하고, "ALG"는 제조예 32에서 제조한 복합 추출물을 의미한다. 또한, "AC-10" 및 "AC-20"은 각각 약물 시료 "AC"의 1회 투여량이 10㎎/마우스 ㎏ 및 20㎎/마우스 ㎏인 것을 의미한다. 또한, 도 29 및 도 30에서 "M"은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)을 의미하고, 메살라진의 1회 투여량은 10㎎/마우스 ㎏이다. 도 29 및 도 30에서 보이는 바와 같이 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물과 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)과 유사한 수준으로 염증 유발 사이토카인(proinflammatory cytokine)의 발현을 감소시켰고 항염증 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)의 발현을 증가시켰다. 특히, 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 그 효과가 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물보다 더 우수하였다.
2) 염증 반응 지표 물질의 발현 억제 여부
약물 시료를 옥사졸론에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물에 투여하였을 때 대장 조직에서 COX-2, iNOS, p65(NF-카파B), p-p65(phosphor-NF-카파B) 및 β-actin의 발현량을 TNBS에 의해 대장염이 유발된 모델동물 실험과 동일한 방법으로 측정하였다.
도 31은 옥사졸론에 의해 만성 대장염이 유도된 모델동물에 복합 추출물을 투여하였을 때 모델동물의 대장조직에서 염증 반응 지표 물질의 발현이 억제되는 것을 나타낸 결과이다. 도 31에서 "NOR"은 정상군을 나타내고, "Oxa"는 옥사졸론으로 만성 대장염을 유발시킨 후 생리식염수만을 경구투여한 실험군을 나타내고, "AC"는 제조예 33에서 제조한 복합 추출물을 의미하고, "ALG"는 제조예 32에서 제조한 복합 추출물을 의미한다. 또한, "AC10" 및 "AC20"은 각각 약물 시료 "AC"의 1회 투여량이 10㎎/마우스 ㎏ 및 20㎎/마우스 ㎏인 것을 의미한다. 또한, 도 31에서 "M"은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)을 의미하고, 메살라진의 1회 투여량은 10㎎/마우스 ㎏이다. 도 31에서 보이는 바와 같이 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물과 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)과 유사한 수준으로 염증 반응 물질인 COX-2, iNOS, p-p65(phosphor-NF-카파B) 등의 발현을 억제하였다. 특히, 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 그 효과가 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물보다 더 우수하였다.
19. DSS에 의해 만성 대장염이 유도된 모델동물 실험을 통한 대장염 치료 효과 측정
(1) 실험동물의 준비
6주령 수컷 생쥐(C57BL/6, 18-22g)를 오리엔트바이오㈜로부터 구입하였다. 모든 생쥐는 습도 50±10%, 온도 20~22℃의 조절된 환경 조건에서 사육하였으며 조명은 12시간 킨 후 12 시간 끄는 것을 반복하였다. 사료는 표준 실험용 사료(Samyang, Korea)를 사용하였으며 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 모든 실험에서 한군은 6마리로 하였다.
(2) DSS에 의한 만성 대장염 유발 및 시료 투여
실험동물 중 한 군을 정상군으로 하고, 나머지 군의 실험동물에 대해서는 덱스트란황산나트륨(dextran sulfate sodium; 분자량 : 36~50 kDaltons)으로 만성 대장염을 유발하였다. 구체적으로 음용수로 물 대신 3%(w/v) 덱스트란황산나트륨 수용액을 1차로 7일간 음용하게 하고, 다시 음용수로 물을 5일간 음용하게 하고, 3%(w/v) 덱스트란황산나트륨 수용액을 2차로 3일간 음용하게 한 후, 다시 음용수로 물을 3일간 음용하게 하였다. 반면, 정상군에는 음용수로 물만을 공급하였다. 또한, 약물 시료는 생리식염수에 녹여 2차로 덱스트란황산나트륨 수용액을 음용하게 한 날부터 매일 1회씩 미리 정한 용량대로 경구투여하고 시료 투여가 종료된 다음날에 실험동물을 이산화탄소로 질식시켜 죽이고 대장부위 중 맹장으로부터 항문 직전 부위까지의 대장을 적출하였다.
(3) 모델동물의 체중 변화, 대장의 외관 및 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정
1) 체중 변화량 분석
TNBS에 의해 대장염이 유발된 모델동물 실험과 동일한 방법으로 체중 변화량을 분석하였다.
2) 외관 분석
TNBS에 의해 대장염이 유발된 모델동물 실험과 동일한 방법으로 대장의 외관을 분석하였다.
3) MPO 활성 측정
TNBS에 의해 대장염이 유발된 모델동물 실험과 동일한 방법으로 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성을 측정하였다.
4) 체중 변화량, 대장의 외관, 대장의 길이 및 MPO 활성 측정 결과
도 32는 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 DSS에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물의 체중 변화 및 대장의 외관 점수를 나타낸 그래프이고 도 33은 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 DSS에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물의 대장 길이 및 MPO 활성 측정 결과를 나타낸 것이다. 도 32 및 도 33에서 "NOR"은 정상군을 나타내고, "AC"는 제조예 33에서 제조한 복합 추출물을 의미하고, "ALG"는 제조예 32에서 제조한 복합 추출물을 의미한다. 또한, "AC-10" 및 "AC-20"은 각각 약물 시료 "AC"의 1회 투여량이 10㎎/마우스 ㎏ 및 20㎎/마우스 ㎏인 것을 의미한다. 또한, 도 32 및 도 33에서 "M"은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)을 의미하고, 메살라진의 1회 투여량은 10㎎/마우스 ㎏이다. 도 32 및 도 33에서 보이는 바와 같이 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물과 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)과 유사한 수준의 만성 대장염 억제 효과를 나타내었고, 특히 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 그 효과가 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물보다 더 우수하였다.
(4) 염증 반응 지표 물질의 발현에 미치는 영향 분석
1) 염증 유발 사이토카인(proinflammatory cytokine) 및 항염증 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)의 발현에 미치는 영향
약물 시료를 DSS에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물에 투여하였을 때 대장 조직에서 염증 유발 사이토카인(proinflammatory cytokine) 및 항염증 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)의 발현량을 TNBS에 의해 대장염이 유발된 모델동물 실험과 동일한 방법으로 측정하였다.
도 34는 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 DSS에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 IL-1 베타 및 IL-10의 발현량을 나타낸 그래프이고, 도 35는 약물 시료로 복합 추출물을 사용하였을 때 DSS에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물의 대장조직에서 TNF-알파 및 IL-6의 발현량을 나타낸 그래프이다. 도 34 및 도 35에서 "NOR"은 정상군을 나타내고, "AC"는 제조예 33에서 제조한 복합 추출물을 의미하고, "ALG"는 제조예 32에서 제조한 복합 추출물을 의미한다. 또한, "AC-10" 및 "AC-20"은 각각 약물 시료 "AC"의 1회 투여량이 10㎎/마우스 ㎏ 및 20㎎/마우스 ㎏인 것을 의미한다. 또한, 도 34 및 도 35에서 "M"은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)을 의미하고, 메살라진의 1회 투여량은 10㎎/마우스 ㎏이다. 도 34 및 도 35에서 보이는 바와 같이 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물과 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)과 유사한 수준으로 염증 유발 사이토카인(proinflammatory cytokine)의 발현을 감소시켰고 항염증 사이토카인(anti-inflammatory cytokine)의 발현을 증가시켰다. 특히, 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 그 효과가 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물보다 더 우수하였다.
2) 염증 반응 지표 물질의 발현 억제 여부
약물 시료를 DSS에 의해 만성 대장염이 유발된 모델동물에 투여하였을 때 대장 조직에서 COX-2, iNOS, p65(NF-카파B), p-p65(phosphor-NF-카파B) 및 β-actin의 발현량을 TNBS에 의해 대장염이 유발된 모델동물 실험과 동일한 방법으로 측정하였다.
도 36은 DSS에 의해 만성 대장염이 유도된 모델동물에 복합 추출물을 투여하였을 때 모델동물의 대장조직에서 염증 반응 지표 물질의 발현이 억제되는 것을 나타낸 결과이다. 도 36에서 "NOR"은 정상군을 나타내고, "AC"는 제조예 33에서 제조한 복합 추출물을 의미하고, "ALG"는 제조예 32에서 제조한 복합 추출물을 의미한다. 또한, "AC10" 및 "AC20"은 각각 약물 시료 "AC"의 1회 투여량이 10㎎/마우스 ㎏ 및 20㎎/마우스 ㎏인 것을 의미한다. 또한, 도 36에서 "M"은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)을 의미하고, 메살라진의 1회 투여량은 10㎎/마우스 ㎏이다. 도 36에서 보이는 바와 같이 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물과 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)과 유사한 수준으로 염증 반응 물질인 COX-2, iNOS, p-p65(phosphor-NF-카파B) 등의 발현을 억제하였다. 특히, 지모 추출물의 분획물 및 천황련 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물은 그 효과가 지모 추출물의 분획물, 오배자 추출물의 분획물 및 더덕 추출물의 분획물로 이루어진 복합 추출물보다 더 우수하였다.
Ⅳ. 4차 실험 : 티모사포닌 A-Ⅲ(timosaponin A-Ⅲ)의 대장염 예방 또는 치료 효과 확인
20. 지모로부터 분리된 티모사포닌 A-Ⅲ(timosaponin A-Ⅲ)의 제조
제조예 34 : 지모로부터 티모사포닌 A-Ⅲ의 제조
지모를 그대로 또는 거피하여 잘 말린 후, 70% 에탄올을 이용해 수욕상에서 추출한 후 완전 건조시켜 지모의 70% 에탄올 추출물을 제조하였다. 수득한 지모의 70% 에탄올 추출물을 물에 재현탁한 후 CH2Cl2로 분획하고, 물층을 BuOH로 추출한 다음 감압농축하였다. 감압농축된 BuOH 추출물을 MeOH로 재결정을 유도하고 결정화되어 침전된 침전물을 MeOH로 세척하여, 메탄올 불용성 분획과 메탄올 가용성 분획을 수득하였다. 그런 다음, 메탄올 가용성 분획은 메틸렌클로라이드, 메탄올 및 물의 혼합용매를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (CH2Cl2:MeOH:H2O = 7:1:0.5 -> 7:2:0.5 -> 7:3:1)하여 티모사포닌 A-Ⅲ, 티모사포닌 B-Ⅱ, 티모사포닌 B-Ⅲ 및 티모사포닌 D를 분리하였다. 티모사포닌 A-Ⅲ의 분리 여부는 질량 분석 및 13C-NMR(Bruker, AVANCE digital 400)로 확인하였다. 도 37은 티모사포닌 A-Ⅲ의 화학 구조식을 나타낸 것이다.
<티모사포닌 A-Ⅲ : 백색 무정형 분말>
FAB-MS m/z: 763.5 [M+Na]+
13C NMR (125 MHz) 30.971 (C-1). 27.031 (C-2), 75.522 (C-3), 30.971 (C-4), 36.963 (C-5), 26.833 (C-6), 26.833 (C-7), 35.557 (C-8), 40.260 (C-9), 35.278 (C-10), 21.174 (C-11), 40.341 (C-12), 42.503 (C-13), 56.483 (C-14), 32.183 (C-15), 81.376 (C-16), 62.216 (C-17), 16.622 (C-18), 24.040 (C-19), 40.907 (C-20), 14.941 (C-21), 109.7 (C-22), 26.434 (C-23), 26.229 (C-24), 27.573 (C-25), 69.882 (C-26), 16.308 (C-27), 102.588 (3-Gal C-1'), 81.879 (C-2'), 75.263 (C-3'), 71.753 (C-4'), 76.650 (C-5'), 62.824 (C-6'), 106.167 (O-3 Glu C-1"), 76.987 (C-2"), 78.459 (C-3"), 72.987 (C-4"), 78.064 (C-5"), 65.129 (C-6")
21. 대장염이 유도된 모델동물 실험을 통한 대장염 치료 효과 측정
(1) 실험동물의 준비
4주령 ICR 수컷 생쥐(24-27g)를 오리엔트바이오㈜로부터 구입하였다. 모든 생쥐는 습도 50±10%, 온도 25±2℃의 조절된 환경 조건에서 사육하였으며 조명은 12시간 킨 후 12 시간 끄는 것을 반복하였다. 사료는 표준 실험용 사료(Samyang, Korea)를 사용하였으며 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였다. 모든 실험에서 한군은 6마리로 하였다.
(2) TNBS에 의한 급성 대장염 유발 및 시료 투여
실험동물 중 한 군을 정상군으로 하고, 나머지 군의 실험동물에 대해서는 2,4,6-트리니트로벤젠술폰산(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid, TNBS)으로 대장염을 유발하였다. 구체적으로 실험동물을 가볍게 에테르로 마취한 후 NBS(2,4,6-Trinitrobenzene sulfonic acid) 용액 2.5g을 50% 에탄올에 혼합한 용액을 끝이 둥근 1㎖ 용량의 주사기를 이용하여 항문을 통해 대장 내로 0.1㎖ 씩 투여하고 수직으로 들어 30초간 유지하여 염증을 유발하였다. 반면, 정상군에는 생리식염수 0.1㎖를 경구투여하였다. 이후, 익일부터 매일 1회씩 3일간 시료를 생리식염수에 녹여 미리 정한 용량대로 경구투여하고 시료 투여가 종료된 다음날에 실험동물을 이산화탄소로 질식시켜 죽이고 대장부위 중 맹장으로부터 항문 직전 부위까지의 대장을 적출하였다.
(3) 모델동물의 체중 변화, 대장의 외관 및 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정
1) 체중 변화량 분석
TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에 시료 투여를 종료하고 다음날에 실험동물의 체중을 측정한 후 최초 체중과 비교하여 체중 변화량을 산출하였다.
2) 외관 분석
적출한 대장은 그 길이와 외관을 관찰하여 하기 표 13의 기준(Hollenbach 등, 2005 대장염 정도에 대한 기준)에 따라 점수로 매겼다. 이때 양성 대조군으로 메살라진(Mesalazine; Sigma) 투여군을 사용하였다. 또한, 장내 미생물 분석을 위해 대장 내용물의 일부를 채취하여 영하 80℃에서 냉동보관하였다. 대장 조직은 대장 내용물을 모두 제거하고, 생리 식염수에 세척한 후 일부는 병리조직용 샘플로 사용하기 위해 4% 포름알데히드 고정액으로 고정하였으며, 나머지는 분자생물학적 분석을 영하 80℃에서 냉동보관하였다.
표 13
외관 점수(Macroscopic Score) 기준
0 어떠한 궤양과 염증도 발견되지 않음
1 출혈이 없는 충혈이 발견됨
2 충혈이 있는 궤양이 발견됨
3 한 곳에서만 궤양과 염증이 발견됨
4 궤양과 염증이 2곳 이상에서 발견됨
5 궤양이 2㎝ 이상으로 확대되어 있음
3) 미엘로퍼옥시다아제(Myeloperoxidase, MPO) 활성 측정
대장조직 100㎎에 lysis buffer 200㎕를 넣고 균질화(homogenization) 하였다. 그 후 4℃ 및 13000 rpm의 조건에서 15분간 원심분리하여 상층액을 얻은 다음 Mouse MPO assay ELISA kit(Hbt HK210, USA)을 사용하여 MPO 활성을 측정하였다. 상층액 100㎕를 96 well plate에 넣은 다음 실온에서 1시간 반응시켰다. 반응이 완료된 후 plate를 뒤집어 비운 다음 200㎕의 세척 완충용액을 사용하여 세척과정을 3회 반복한 다음 100㎕의 희석된 tracer를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 plate를 뒤집어 비운 다음 200㎕의 세척 완충용액을 사용하여 각 well을 세척하였다. 200㎕의 세척 완충용액을 사용하여 세척과정을 3회 반복한 다음 100㎕의 희석된 streptavidin-peroxidase conjugate를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후 plate를 뒤집어 비운 다음 200㎕의 세척 완충용액을 사용하여 각 well을 세척하였다. 200㎕의 세척 완충용액을 사용하여 세척과정을 3회 반복한 다음 100㎕의 TMB substrate solution을 첨가하고 plate를 알루미늄 호일로 감싸 빛을 차단하고 실온에서 30분간 반응시켰다. 그리고 100㎕의 정지 용액을 첨가하여 반응을 중지시키고 ELISA reader를 이용하여 450㎚에서 흡광도를 측정하였다.
4) 체중 변화량, 대장의 외관, 대장의 길이 및 MPO 활성 측정 결과
도 38은 약물 시료로 제조예 34에서 티모사포닌 A-Ⅲ를 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 체중 변화를 나타낸 그래프이고, 도 39는 약물 시료로 제조예 34에서 티모사포닌 A-Ⅲ를 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에서 적출한 대장의 외관 점수를 나타낸 그래프이다. 도 40은 약물 시료로 제조예 34에서 티모사포닌 A-Ⅲ를 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물의 대장 길이를 나타낸 것이고, 도 41은 약물 시료로 제조예 34에서 티모사포닌 A-Ⅲ를 사용하였을 때 TNBS에 의해 급성 대장염이 유발된 모델동물에서 적출한 대장의 MPO 활성 측정 결과를 나타낸 것이다. 도 38 내지 도 41에서 "Nor"은 정상군을 나타내고, "TNBS"는 TNBS에 의해 급성 대장염을 유발한 모델동물에 별도의 약물 시료 대신 생리식염수를 공급한 군을 의미하고, "T"는 티모사포닌 A-Ⅲ를 의미한다. 또한, "T10" 및 "T20"은 각각 약물 시료 "T"의 1회 투여량이 10㎎/마우스 ㎏ 및 20㎎/마우스 ㎏인 것을 의미한다. 또한, 도 38 내지 도 41에서 "M"은 양성 대조 약물로 사용한 메살라진(mesalazine)을 의미하고, 메살라진의 1회 투여량은 10㎎/마우스 ㎏이다. 도 38 내지 도 41에서 보이는 바와 같이 티모사포닌 A-Ⅲ는 농도 의존적으로 TNBS에 의해 유도된 급성 대장염을 완화하거나 개선하는 효과를 나타내었다. 또한, 티모사포닌 A-Ⅲ의 대장염 예방 또는 치료 효과는 양성 대조 약물로 사용한 메살라진과 동등한 수준이었다.
Ⅴ. 약학 조성물 및 식품 조성물 등의 제조
22. 지모 추출물 등을 포함하는 약학 조성물의 제조
하기의 약학 조성물의 제조에서 지모 추출물은 지모 추출물의 부탄올 가용성 분획물, 만지페린(Mangiferin), 네오만지페린(Neomangiferin), 제조예 14의 복합 추출물, 제조예 20의 복합 추출물, 제조예 33의 복합 추출물, 제조예 34의 티모사포닌 A-Ⅲ로 대체가 가능하다.
<22-1> 산제의 제조
제조예 1의 지모 추출물 2 g
유당 1 g
상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<22-2> 정제의 제조
제조예 1의 지모 추출물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
<22-3> 캡슐제의 제조
제조예 1의 지모 추출물 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유 당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
<22-4> 환의 제조
제조예 1의 지모 추출물 1 g
유당 1.5 g
글리세린 1 g
자일리톨 0.5 g
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 방법에 따라 1환 당 4 g이 되도록 제조하였다.
<22-5> 과립의 제조
제조예 1의 지모 추출물 150 ㎎
대두추출물 50 ㎎
포도당 200 ㎎
전분 600 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 30% 에탄올 100 ㎎을 첨가하여 섭씨 60 ℃에서 건조하여 과립을 형성한 후 포에 충진하였다.
<22-6> 주사제의 제조
제조예 1의 지모 추출물 100 ㎎
소디움 메타비설파이트 3.0 ㎎
메틸파라벤 0.8 ㎎
프로필파라벤 0.1 ㎎
주사용 멸균증류수 적량
상기의 성분을 혼합한 후, 이중 2㎖를 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.
23. 지모 추출물 등을 포함하는 식품 조성물의 제조
하기의 식품 조성물의 제조에서 지모 추출물은 지모 추출물의 부탄올 가용성 분획물, 만지페린(Mangiferin), 네오만지페린(Neomangiferin), 제조예 14의 복합 추출물, 제조예 20의 복합 추출물, 제조예 33의 복합 추출물, 제조예 34의 티모사포닌 A-Ⅲ로 대체가 가능하다.
<23-1> 밀가루 식품의 제조
본 발명의 제조예 1의 지모 추출물 0.5~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하였다.
<23-2> 스프 및 육즙(gravies)의 제조
본 발명의 제조예 1의 지모 추출물 0.1~5.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.
<23-3> 그라운드 비프(ground beef)의 제조
본 발명의 제조예 1의 지모 추출물 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.
<23-4> 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 제조예 1의 지모 추출물 5~10 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
<23-5> 선식의 제조
현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.
상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 제조예 1의 지모 추출물을 다음의 비율로 배합하여 제조하였다.
곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),
종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),
제조예 1의 지모 추출물(3 중량부),
영지(0.5 중량부),
지황(0.5 중량부)
<23-6> 건강음료의 제조
액상과당(0.5 g), 올리고당(2 g), 설탕(2 g), 식염(0.5 g), 물(75 g)과 같은 부재료와 본 발명의 제조예 1의 지모 추출물 5 g을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 제조하였다.
<23-7> 야채 주스의 제조
본 발명의 제조예 1의 지모 추출물 5 g을 토마토 또는 당근 주스 1,000 ㎖에 가하여 야채 주스를 제조하였다.
<23-8> 과일 주스의 제조
본 발명의 제조예 1의 지모 추출물 1 g을 사과 또는 포도 주스 1,000 ㎖ 에 가하여 과일 주스를 제조하였다.
24. 지모 추출물 등을 포함하는 사료 첨가제의 제조
하기의 사료 첨가제의 제조에서 지모 추출물은 지모 추출물의 부탄올 가용성 분획물, 만지페린(Mangiferin), 네오만지페린(Neomangiferin), 제조예 14의 복합 추출물, 제조예 20의 복합 추출물, 제조예 33의 복합 추출물, 제조예 34의 티모사포닌 A-Ⅲ로 대체가 가능하다.
<24-1> 사료 첨가제 1
제조예 1의 지모 추출물 0.1 ~ 20 중량부, 지방분해효소(Lipase) 0.001 ~ 0.01 중량부, 제 3 인산칼슘 1 ~ 20 중량부, 비타민 E 0.01 ~ 0.1 중량부, 효소 분말 1 ~ 10 중량부, 유산균 0.1 ~ 10 중량부, 바실러스(Bacillus) 배양액 0.01 ~ 10% 중량부 및 포도당 20 ~ 90 중량부를 배합하여 사료 첨가제를 제조하였다.
<24-2> 사료 첨가제 2
제조예 1의 지모 추출물 24 중량부, 어성초 추출 분말 24 중량부, 유산균 1 중량부, 효모 10 중량부, 초유 1 중량부, 포도당 20 중량부 및 알팔파 가루 20 중량부를 배합하여 사료 첨가제를 제조하였다.
이상에서와 같이 본 발명을 상기의 실시예를 통해 설명하였지만 본 발명이 반드시 여기에만 한정되는 것은 아니며 본 발명의 범주와 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 변형실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 보호범위는 본 발명에 첨부된 특허청구의 범위에 속하는 모든 실시 형태를 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (30)

  1. 지모 추출물, 지모 추출물의 탄소 수가 3 내지 8인 알코올 가용성 분획물, 만지페린(Mangiferin), 네오만지페린(Neomangiferin) 또는 티모사포닌 A-Ⅲ에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 포함하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 오배자 추출물, 오배자 추출물의 탄소 수가 3 내지 8인 알코올 가용성 분획물 또는 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-β-D-글루코스(glucose1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 더덕 추출물, 더덕 추출물의 탄소 수가 3 내지 8인 알코올 가용성 분획물 또는 란세마사이드 A(Lancemaside A)에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 오배자 추출물, 오배자 추출물의 탄소 수가 3 내지 8인 알코올 가용성 분획물 또는 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-β-D-글루코스(glucose1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)에서 선택된 어느 하나; 및 더덕 추출물, 더덕 추출물의 탄소 수가 3 내지 8인 알코올 가용성 분획물 또는 란세마사이드 A(Lancemaside A)에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 황련 추출물 또는 황련 추출물의 탄소 수가 3 내지 8인 알코올 가용성 분획물에서 선택된 어느 하나를 유효성분으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 지모 추출물은 물, 탄소 수가 1 내지 2인 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 지모 추출물의 알코올 가용성 분획물은 지모 추출물에 물을 가하여 현탁시킨 후, 탄소 수가 3 내지 8인 알코올을 첨가하고 분획하여 수득한 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 지모 추출물의 알코올 가용성 분획물은 지모 추출물의 부탄올 가용성 분획물인 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 지모 추출물 또는 지모 추출물의 알코올 가용성 분획물은 만지페린(Mangiferin) 또는 네오만지페린(Neomangiferin)을 포함하는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  10. 제 2항에 있어서, 상기 오배자 추출물은 물, 탄소 수가 1 내지 2인 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  11. 제 2항에 있어서, 상기 오배자 추출물의 알코올 가용성 분획물은 오배자 추출물에 물을 가하여 현탁시킨 후, 탄소 수가 3 내지 8인 알코올을 첨가하고 분획하여 수득한 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  12. 제 2항에 있어서, 상기 오배자 추출물의 알코올 가용성 분획물은 오배자 추출물의 부탄올 가용성 분획물인 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  13. 제 2항에 있어서, 상기 오배자 추출물 또는 오배자 추출물의 알코올 가용성 분획물은 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-β-D-글루코스(glucose1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)를 포함하는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  14. 제 3항에 있어서, 상기 더덕 추출물은 물, 탄소 수가 1 내지 2인 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  15. 제 3항에 있어서, 상기 더덕 추출물의 알코올 가용성 분획물은 더덕 추출물에 물을 가하여 현탁시킨 후, 탄소 수가 3 내지 8인 알코올을 첨가하고 분획하여 수득한 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  16. 제 3항에 있어서, 상기 더덕 추출물의 알코올 가용성 분획물은 더덕 추출물의 부탄올 가용성 분획물인 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  17. 제 3항에 있어서, 상기 더덕 추출물 또는 더덕 추출물의 알코올 가용성 분획물은 란세마사이드 A(Lancemaside A)를 포함하는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  18. 제 4항에 있어서, 상기 오배자 추출물은 물, 탄소 수가 1 내지 2인 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출되고, 상기 상기 더덕 추출물은 물, 탄소 수가 1 내지 2인 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  19. 제 4항에 있어서, 상기 오배자 추출물의 알코올 가용성 분획물은 오배자 추출물에 물을 가하여 현탁시킨 후, 탄소 수가 3 내지 8인 알코올을 첨가하고 분획하여 수득한 것이고, 상기 더덕 추출물의 알코올 가용성 분획물은 더덕 추출물에 물을 가하여 현탁시킨 후, 탄소 수가 3 내지 8인 알코올을 첨가하고 분획하여 수득한 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  20. 제 4항에 있어서, 상기 오배자 추출물의 알코올 가용성 분획물은 오배자 추출물의 부탄올 가용성 분획물이고, 상기 더덕 추출물의 알코올 가용성 분획물은 더덕 추출물의 부탄올 가용성 분획물인 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  21. 제 4항에 있어서, 상기 오배자 추출물 또는 오배자 추출물의 알코올 가용성 분획물은 1,2,3,4,6-펜타-O-갈로일-β-D-글루코스(glucose1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)를 포함하고, 상기 더덕 추출물 또는 더덕 추출물의 알코올 가용성 분획물은 란세마사이드 A(Lancemaside A)를 포함하는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  22. 제 5항에 있어서, 상기 황련은 천황련(Coptis chinensis)인 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  23. 제 5항에 있어서, 상기 황련 추출물은 물, 탄소 수가 1 내지 2인 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  24. 제 5항에 있어서, 상기 황련 추출물의 알코올 가용성 분획물은 황련 추출물에 물을 가하여 현탁시킨 후, 탄소 수가 3 내지 8인 알코올을 첨가하고 분획하여 수득한 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  25. 제 5항에 있어서, 상기 황련 추출물의 알코올 가용성 분획물은 황련 추출물의 부탄올 가용성 분획물인 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  26. 제 5항에 있어서, 상기 황련 추출물 또는 황련 추출물의 알코올 가용성 분획물은 베르베린(Berberine)을 포함하는 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  27. 제 5항에 있어서, 지모 추출물, 지모 추출물의 탄소 수가 3 내지 8인 알코올 가용성 분획물, 만지페린(Mangiferin) 또는 네오만지페린(Neomangiferin)에서 선택된 어느 하나 대 황련 추출물 또는 황련 추출물의 탄소 수가 3 내지 8인 알코올 가용성 분획물에서 선택된 어느 하나의 중량비는 9:1 내지 1:9인 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  28. 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대장염은 염증성 대장 질환 또는 과민성 대장염 증후군인 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  29. 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약학 조성물인 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
  30. 제 1항 내지 제 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 식품 조성물인 것을 특징으로 하는 대장염 예방 또는 치료용 조성물.
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