KR20070079683A - 계지, 지모 및 양강의 생약 혼합 추출물을 함유하는 염증관련 질환 예방 및 치료용 약학조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항염증 효과를 갖는 계지, 지모 및 양강의 생약 혼합추출물 및 이를 함유하는 약학조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 조성물은 항염증 효과가 있으므로, 이를 포함하는 조성물은 염증관련 질환, 특히 관절염의 통증 예방 및 치료에 효과적인 의약품 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다

계지, 지모, 양강, 항염증, 통증억제, 약학조성물, 건강기능식품

Description

계지, 지모 및 양강의 생약 혼합 추출물을 함유하는 염증 관련 질환 예방 및 치료용 약학조성물{Pharmaceutical composition comprising the herbal mixture extracts of Cinnamomi Ramulus, Anemarrhenae Rhizoma and Alpinia Officinarum for preventing and treating inflammatory disease}

도 1은 본 발명의 계지, 지모 및 양강을 함유한 조성물인 KHP116을 여러 농도로 마우스 대식세포에 투여하였을 시의 세포독성을 나타낸 도이고,

도 2는 본 발명의 계지, 지모 및 양강을 함유한 조성물인 KHP116을 마우스 대식세포에 전처리하였을 시의 LPS에 의해 생성되는 NO 생성 억제정도를 나타낸 도이며,

도 3은 본 발명의 본 발명의 계지, 지모 및 양강을 함유한 조성물인 KHP116을 마우스 대식세포에 전처리하였을 시의 LPS에 의해 유도되는 iNOS 단백질 발현을 억제정도를 나타낸 도이고,

도 4는 본 발명의 본 발명의 계지, 지모 및 양강을 함유한 조성물인 KHP116을 마우스 대식세포에 전처리하였을 시의 LPS에 의해 유도되는 NF-κB의 활성화 억제정도를 나타낸 도이며,

도 5는 본 발명의 본 발명의 본 발명의 계지, 지모 및 양강을 함유한 조성물인 KHP116을 마우스 대식세포에 전처리하였을 시의 LPS에 의해 유도되는 IκBα 의 분해 억제 정도를 나타낸 도이다.

본 발명은 항염증 및 통증억제 효과를 갖는 계지, 지모 및 양강의 생약 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증관련 질환 예방 및 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

염증(inflammation)은 여러 가지 형태의 감염(infection)이나 생체 내 대사산물 중의 자극성 물질에 대한 생체 내 방어기전의 발현이라 할 수 있고, 다양한 화학적 매개체가 염증의 발현 기전에 관여하고 있으며, 그 병인도 매우 복잡하다. 기존의 항염증제는 크게 스테로이드성 및 비스테로이드성 항염증제로 구분되며, 이중 대부분의 합성 항염증제는 주작용 이외에 여러 가지 부작용을 수반하는 경우가 많으므로 효과가 탁월하며 부작용이 적은 항염증제의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

관절염(arthritis)이란 연화, 동통(pain)이 2주 이상 지속되는 부종과 발적등의 증상을 특징으로 하는 질환이다. 관절염은 적어도 100가지 이상의 형태로 분류될 수 있으나 가장 빈번히 발병하는 것은 골관절염(osteoarthritis)과 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)이다. 골관절염은 퇴행성 관절염(degenerative arthritis)이라고도 하며, 연령의 증가에 따른 관절의 노쇠로 인하여 뼈를 감싸고 있는 연골의 파괴로 심한 통증과 관절의 경직이 유발되며, 대부분의 경우 '극돌기 (spurs)'라 불리는 뼈의 돌출물이 성장하여 통증을 더욱 악화시킨다. 특히 골관절염은 신진대사 및 세포 재생 능력이 저하되어 있는 고 연령층에서 일어나는 퇴행성 질환으로, 그 근본적 치료가 거의 불가능하며, 외과적 수술, 약물 요법 및 물리 치료 등이 시행되고 있으나, 일부 보조 요법을 제외하면 많은 부작용의 위험을 감수해야 한다.

퇴행성관절염은 관절의 점진적인 퇴행성 변화를 특징으로 하며, 체중 부하 관절에 흔히 침범한다. 퇴행성관절염은 활액 관절에 발생하는 관절염중 가장 흔한 형태로 노년에 흔히 나타난다(McAlindon TE et al., Am J Med. 106, pp 151-157, 1999). 슬관절은 퇴행성관절염이 진행하면서 관절염과 관련된 증상을 가장 흔하게 나타내는 부분이며, 체중부하 관절이면서 운동에 관련되어, 삶의 질에 직접적으로 영향을 미치게 된다(Felson DT et al., Arthritis Rheum. 30, pp 914-918, 1987). 여성에서 더 흔하게 증상을 나타내게 되며 연령이 증가하면서 증상의 발현이 증가되어 65세에서 70세 사이 인구의 7%, 80세 이상 인구에서 11.2%에서 증상을 나타내게 되며, 증상이 없더라도 방사선 사진에서 65세에서 70세 사이 인구의 27.4%, 80세 이상 인구의 43.7%에서 퇴행성관절염이 진단된다(Dougados M et al., J Rheumatol. 19(3), pp 378-84, 1992). 60세 이상 인구의 약 10%정도가 퇴행성관절염으로 불편감을 느끼게 되며, 미국의 경우 2천만명 정도가 삶의 질에 영향을 받고 있으며, 매년 600억 달러 이상이 관절염의 치료를 위해 사용되고 있다(Buckwalter JA et al., Clin Orthop Relat Res. 427S, pp 6-15, 2004).

연령의 증가 이외에 방사선학적 변성을 동반하는 퇴행성 슬관절염의 위험인 자로는 가족력, 골격이나 관절의 성장과 형태 발전에 영향을 미칠 수 있는 발생기의 문제들, 관절의 손상, 특정한 반복되는 동작들, 비만 등이 있다(Dieppe PA et al., Lancet. 365, pp 965-973, 2005; Felson DT., Clin. Orthop Relat Res. 427S, pp 16-21, 2004). 이환 관절 주변의 활액막염이 관정의 통증, 관절의 염증 그리고 연골의 손상에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있으며, 프로스타그란딘(prostaglandin E2, PGE2), 산화질소(nitric oxide, NO) 등이 염증과 연골의 손상을 매개하는 것으로 보고되고 있다(Brenner SS et al., Osteoarthritis Cartilage. 12, pp 469-475, 2003).

퇴행성관절염은 관절의 동통과 기능의 이상을 나타내게 되며, 질환의 발병을 방지하거나 진행을 둔화시키는 명확한 치료법은 개발되어 있지 않으며, 대중요법으로 환자의 불편감을 경감시키는 것을 주된 목적으로 하고 있다(NIH conference., Annals of Internal Med. 133, pp 635-646, 2000).

만성적인 진행과 장기간 치료의 필요성으로 인하여, 합병증과 부작용의 조정이 중요시 되고 있어(Berman B. BMJ. 326, pp 1320-1322, 2003). 개체내의 균형을 중시하여 전일적으로 접근하는 한의학적 치료에 대한 수요가 지속적으로 증가되고 있다(Ernst E. BMJ. Nov;321, pp 1133-1135, 2000). 한의학 치료방법의 임상적 효과와 그 과학적 증거를 확보하고자 하는 연구가 현재 활발하게 이루어지고 있으며, 무작위 통제 시험(randomized controlled trial)을 수행하여야 할 필요성이 대두되고 있다(Fontanarosa PB et al., JAMA. Nov;280(18), pp 1618-1619, 1998).

현대에 와서 관절염은 식습관 변화와 교통의 발달로 인한 비만 환자의 급증 으로 그 연령층이 낮고 광범위해진 일반적인 질환인데 반해, 아직까지 관절염 발병기전이 밝혀지지 않아 선택적인 치료 약물 또한 없는 실정이다. 따라서 관절염의 치료목적은 관절의 통증과 염증을 감소시키고, 관절의 변형을 방지하는데 있다. 관절염에 대한 근본적인 치료법이 없으므로 기초 치료법으로 물리, 운동 요법을 행하고, 적당한 비스테로이드성 항염증 약물(NSAIDs)을 사용하여 염증을 완화시키며, 염증이 심하면 금염(gold salt) 요법 또는 페니실라민(penicillamine)요법을 실시하고 있다. 상기의 방법이 효능이 없으면 스테로이드(steroid) 제제를 사용하며, 난치성인 경우 면역 억제제를 사용하고, 변형 관절염으로 이행되면 수술요법을 실시한다. 관절염에 대한 소염 · 진통 작용을 위해 사용되는 비스테로이드성 항염증약물(NSAIDs)은 주로 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase)를 억제하여 염증반응에 관여하는 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생성을 억제함으로써 항염증 작용을 나타내며, 그 중 인도메타신(indomethacin)과 페닐부타존(phenylbutazone)의 경우 다른 NSAIDs에 비해 강력한 항염증 효과를 가지고 있다. 인도메타신은 염증을 유발하는 프로스타글란딘의 생성을 가장 강력하게 억제하는 약물 중에 하나로 경구 투여로 잘 흡수되나, 이러한 약물은 NSAIDs에서 나타나는 일반적인 위장관에 대한 부작용 이외에 현기증, 정신 착란, 드물게는 환각증을 동반한 정신병이 보고되어 있을 만큼 심한 독성을 갖고 있어, 고용량에서 환자의 33%가 투약을 중지해야 하는 등 많은 부작용을 갖고 있다. 페닐부타존 역시 사용 초기 다른 NSAIDs에 비해 류마티스 관절염, 강직성 척추염, 급성 통풍성 관절염 치료에 효과적으로 사용되어 왔으나, 과립구 감소증이나 재생 불량성 빈혈 등을 일으키는 혈액학적 이상을 포함하는 심한 독성 때문에 현재 사용되지 않고 있다. 이런 NSAIDs에 비해 스테로이드 제제는 환자에게 사용할 수 있는 가장 빠른 방법으로, 항염증 효과가 빠르고 극적으로 나타나며 환자에게 쾌감을 주는 약물로 알려져 있다. 그러나 널리 알려진 것처럼 이 약물은 세균 감염에 대한 저항력을 약하게 하고, 당뇨병의 악화, 쿠싱(Cushing) 증후군, 부신 부전증, 정신 기능장애 등을 일으키는 것으로 독성이 매우 심각할 뿐만 아니라 치료를 시작하면 중지하기가 어렵기 때문에 사용상 주의를 요하며, 가능하면 금해야 하는 것으로 알려져 있다. 이처럼 합성 항염증제는 여러 가지 부작용을 수반하는 경우가 많으므로 앞서 언급한 바와 같이 효력이 강하면서도 비교적 부작용이 적은 항염증제의 개발이 꾸준히 요구되고 있는 실정이다. 특히 효능 및 부작용 측면에서 볼 때, 고래로부터 임상적 경험이 풍부하고 안전성 측면에서 탁월한 평가를 받고 있는 한방제제와 천연물제제의 경우, 관절염 치료 약물로의 개발 가능성은 한층 더 풍부할 것으로 사료된다.

한편, 소모설은 기계를 오래 사용하면 소모가 되는 것처럼 생물체의 구성세포가 시간의 경과에 따라 기능이 저하된다고 설명하거나(wear & tear theory), 유해물질의 축적에 의한 것으로 설명하며, 특히 그 중에서도 인체 대사과정, 방사능 노출, 바이러스, 중금속 및 대기오염 등을 통해 생성되는 자유라디칼들이 독성이 강한 물질을 형성함으로써 노화를 촉진할 뿐 아니라 노화와 관련된 각종 질병을 일으킨다는 자유 라디칼 이론(free radical theory)이 가장 유력한 학설로 받아들여지고 있다.

자유 라디칼은 최외곽 전자궤도에 짝짓지 않은 전자를 하나 가지는 물질을 총칭하는데, 그 구조가 매우 불안정하여 전자를 얻어 안정화하려는 성질로 인해 반응성이 매우 높다. 특히 산소에서 유래되는 자유 라디칼을 활성산소라 칭하며, 이들은 단백질, 지질, 탄수화물 등과 반응하여 지질과산화, DNA손상, 단배질의 산화등을 유발하여 세포내 구조물에 손상을 야기하며 결과적으로 세포의 사멸을 초래하게 되며 특히 혈관노화의 원인으로 염증과정에 관여함으로써 동맥경화, 알츠하이머, 혈중에 호모시스테인을 증가시킨다.

산소와 관련된 인체내 독성물질을 활성산소종(ROS: reactive oxygen species)이라고 하는데 이러한 ROS의 종류로는 수퍼옥사이드(superoxide), 히드록실(hydroxyl), 페록실(peroxyl), 알콕실(alkoxyl), 히드로페록실(hydroperoxyl)과 같은 프리라디칼(유리기, free radical)과 히드로젠페록사이드(hydrogenperoxide), 히포클로로스 산(hypochlorous acid), 오존(ozone), 일중항 산소(singlet oxygen), 페록시니트라이트(peroxinitrite) 등과 같은 비(非)프리 라디칼(비유리기, non free radial)이 있다. 이 중에서 산소 독성 중 가장 많이 연구되어 왔고 중요한 역할을 하는 것은 수퍼옥사이드로 프리 라디칼(superoxide free radical, 활성 산소 또는 유해산소)이라고 알려져 있다(Fridovich L., Science, 201: pp175-180,1978).

특히 생체내에서는 산화질소와 수퍼옥사이드( O₂ ^-: superoxide)가 동시에 발생하는 조건에서 라디칼-라디칼 반응으로 비프리라디칼 페록시니트라이트(Peroxynitrite, ONOO^-)가 쉽게 생성된다. 페록시니트라이트는 그 반감기가 밀리초(milisecond)로 다른 라디칼에 비하여 오랜 시간 존재하며 그 반응성 또한 매우 높 으므로 활성 질소종 유래 독작용의 가장 큰 원인이라 할 수 있다. 페록시니트라이트의 독성 작용은 알츠하이머, 암, 관절염, 동맥경화, 피부 염증 등 여러 질환 및 노화 관련 질환과 관련되는 것으로 보고되고 있다(Ray G, Husain SA, Indian J. Exp. Biol., Nov;40(11): pp1213-1232, 2002; Oliveira GV et al., Shock., Sep;22(3): pp278-282, 2004; Lancel S et al., J. Am. Coll. Cardiol., 16;43(12): pp2348-2358, 2004).

이렇게 생성된 페록시니트라이트는 그 반감기가 밀리초 범위(millesecond range)로 세포를 통과하기에 충분한 시간이며, 세포내 표적물과 반응해서 산화, 니트로화를 일으키고 세포신호전달을 혼란시킨다. 페록시니트라이트는 산화질소(NO)와 슈퍼옥사이드(O₂ ^-)보다 독성이 더 강한 것으로 알려져 있으며, 지질, 단백질, 그리고 DNA의 산화와 니트로화 과정을 통해 혈관 평활근 세포의 이완, 혈소판 응집 저해 및 아미노산의 변형, 지질과산화의 유도에 의한 세포독성 등에 관여한다. 이러한 페록시니트라이트가 암, 관절염, 동맥경화 뿐만 아니라 노화 과정에서도 중요한 역할을 한다는 것으로 보고되고 있다.(Ray G, Husain SA, Indian J. Exp. Biol., Nov;40(11): pp1213-1232, 2002; Oliveira GV et al., Shock., Sep;22(3): pp278-282, 2004; Lancel S. et al., J. Am. Coll. Cardiol., 16;43(12): pp2348-2358, 2004)

상기의 페록시니트라이트에 의한 산화적 손상을 예방하기 위한 다양한 노력이 진행되어 왔으며, 천연물에서 유래한 항산화제와 합성산화제가 다수 개발되어 의약품과 식품 분야에서 이용되고 있다. 특히 생체에는 페록시니트라이트를 제거하는 효소가 없으므로, 천연물을 이용한 페록시니트라이트에 대한 독성을 방지하는 연구들이 몇몇 연구자들에 의해 연구되어, 플라보노이드(flavonoids), 비타민 E 등이 보고되었다. (Stevens JF et al., Chem. Res. Toxicol., 16(10): pp1277-1286, 2003; Beharka AA et al., Free Radic. Biol. Med., 15;32(6): pp503-511, 2002).

생체에 있어서 염증의 발생 원인으로서는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있다. 대식세포(Macrophage)는 다양한 기능을 가진 세포로 산화적 스트레스 상황에서 여러 가지 사이토카인(cytokine)과 NO를 생성하여 염증반응에서 중요한 역할을 한다. 특히 대식세포에서 리포다당류(Lipopolysaccharide; LPS), 사이토카인, TNF-α와 같은 자극에 의해 발현되는 iNOS는 장시간 동안 다량의 NO를 생산한다. 이러한 산화적 스트레스는 염증반응의 전사인자인 NFκB 활성을 촉진시키는 것으로 알려져 있다. p50과 p65의 이형이합체(heterodimer)로 구성된 NFκB는 활성화된 후 핵으로 이동하여 iNOS와 COX-2 등의 염증반응을 유도하는 유전자 발현을 촉진시키는 것으로 알려져 있으며, 이러한 NFκB 활성을 저해하면 염증반응을 억제하는 것으로 알려져 있다(Baeuerle P. et al., Annu. Rev. Immunol., 12, pp141-179, 1994; Allenm R. et al, Free Radic. Biol. Med., 28, pp463-499, 2000).

최근의 연구 결과에 따르면, NO는 세 가지 주요한 NOS 이성질체(isoform)인 neuronal NOS(nNOS), endothelial NOS(eNOS), inducible NOS(iNOS)에 의해 아르기닌(arginine)으로부터 생성되는 자유라디칼이다. nNOS와 eNOS는 Ca²⁺/칼모듈린 (calmodulin)에 의해 조절되지만, iNOS는 인터루킨(interleukin), 인터페론(interferon), LPS와 같은 염증성 자극에 의해 전사 수준에서 조절된다. nNOS나 eNOS에 의해 소량 생성된 NO는 혈관확장, 신경전달, 병원체에 대한 세포파괴 등과 같은 정상적인 생리기능을 담당하지만, 대식세포에서 iNOS에 의해 과다 생성된 NO는 수퍼옥사이드(superoxide)와 반응하여 퍼옥시니트라이트(peroxynitrite)를 형성하고 이는 강력한 산화제로 작용하여 세포에 손상을 입히고, 염증성 자극에 의해 활성화된 대식세포에서 NFκB를 활성화시켜 염증반응, 암, 동맥경화 등 만성질환에 관련하는 것으로 알려져 있다(Lawrence T. et al., Nat Med., 7, pp1291-1297, 2001; Riehemann K. et al., FEBS Lett., 442, pp89-94, 1999; Kang JL. et al., Mol. Cell. Biochem., 215, pp1-9, 2000; El-Mahmoudy A. et al., International Immunopharmacology, 2, pp1603-1611, 2002).

NO는 염증과 암을 포함한 다양한 병리생리학적 과정에서 iNOS에 의해 생성되는 것으로 알려져 있다. NOS는 염증, 혈관확장, 신경전달, 종양세포와 신체의 항상성을 조절하는 중요한 효소로 L-아르기닌(L-arginine)으로부터 NO를 생성하며, 염증 상태에서는 대식세포에서 iNOS에 의해 NO를 다량 생성하여 여러 만성질환을 일으키는 것으로 알려져 있다(Kim KM. et al., Free Radic. Biol. Med., 30(7), pp747-756, 2001; Stamler J S. et al., Science, 258, pp1898-1902, 1992). iNOS의 발현은 NFκB 활성으로 유도되며 이는 대식세포에서 LPS나 사이토카인(cytokine)에 의해 염증성 매개물들이 과잉 생산되는 중요한 매카니즘이 된다. 대식세포에서 NO의 생성은 iNOS의 발현과 직접적으로 연관되어 있고, LPS는 그램 (Gram) 음성 세균의 세포벽 물질로서 면역 세포 등을 자극하여 NO의 생성을 상승적으로 증가 시킨다.

NFκB는 사이토카인 반응, 염증, 세포 성장 조절과 같은 다양한 단계에 참여하는 전사 인자로 최근의 연구들은 유도(inducible) NFκB가 죽상동맥경화 발병에 관여함을 강하게 제기되고 있다. 많은 세포에서 NFκB는 세포질에서 핵으로의 다양한 신호 전달에 관여하는 산화환원 의존적 전사인자(redox-sensitive transcription factor)로 세포질 속에서 p50, p65, IκB 서브유닛(subunit)의 삼합체(trimer)로 발견되고, 산화적 스트레스에 의해 IκB가 분해되면 p50/p65 이형이합체(heterodimer)가 핵 속으로 이동하여 연속적인 DNA 결합을 초래하는 것으로 알려져 있다(Gius D. et al., Toxicol. Lett., 106, pp93-106, 1999).

세균감염 하에서 항생제로 치료 시, 박테리아를 죽이면서 세포외막으로부터 방출되는 LPS는 엔도톡신 쇼크(endotoxin shock)을 일으키며, 이러한 과정에 의해 심하게 파괴될 경우, 계속해서 생성되는 LPS를 중화시키지 못하게 된다(Dunn, D. L., Surg. Clin. North. Am., 74, 1994). 그러므로 약물 처리를 하여 LPS의 작용을 줄임으로서 효과를 볼 수 있을 것이다. 현재까지의 비스테로이드성 항-염증 약물(nonsteroidal anti-inflammatory drug, NSAID)의 사용으로 인한 염증의 감소는 흔히 상당한 기간 동안 통증의 완화를 초래해 왔으며, 비마약성 진통제(아스피린 등)의 대부분 역시 항염증 효과를 가지므로 급성 및 만성 염증 질환의 치료에 적절히 사용되어 왔다. 그러나 부작용 때문에 장기적으로 사용하기가 곤란하며, 결과적으 로 현재까지의 치료법에 부작용의 심각성이 너무 크기 때문에 새롭거나 개선된 치료제 개발은 필수적이고 시급하다고 할 수 있다. 이러한 부작용을 극복하는 문제와 관련지어 최근에는 민간에서 사용되어지는 천연물에서 그 활성 성분을 찾으려는 노력이 진행되고 있다.

따라서 본 시험은 임상적으로 관절염 환자에게 사용되어 항염증, 진통 효과가 있을 것으로 예상되는 한방 복합제제의 항염증 및 진통 효능을 관찰함으로써 향후 관절염 치료 약물로서의 개발 가능성을 평가하고자 하였다

본 발명에 사용되는 계지(桂枝)는 녹나무과(Lauraceae)의 사철푸른 교목이며 그 껍질을 말려서 쓰며 중국의 남부나 월남등지에 자생한다. 계지는 그 가지이며, 육계는 두터운 껍질을 말하며, 계심은 오래된 나무의 두터운 껍질을 펴서 말린 것을 말하는데, 그 성분은 정유(계피알데히드75~90%, 신나밀알데히드 등) 1~3.4%, 탄닌질 2~3%, 점액, 탄수화물 등이 있으며, 가지에도 정유가 있으며 5~6년 자란 나무에서 정유함량이 높다고 한다. 또한 계지는 예로부터 땀내기약, 열내림약, 진통약, 허한을 따뜻하게 보하는 약으로 써왔으며 땀을 멎게 한다고 하며, 열을 내리고 몸살 등의 통증을 풀어주는 효과가 있고 방향성건위약으로 쓰며, 계피유 제조 원료로 쓰고, 식료품의 향료로도 쓰인다.

지모는 중국이 원산지이고, 한국에서는 중부지방에서 재배되는 다년초이다. 본 발명에서는 지모의 근경을 건조하여 사용하였으며, 그의 대표적인 것은 아네마레나 아스포데로리디스 본지(Anemarrhena asphodelorides BUNGE)로 이의 근경은 약전(KP, JP)에서소염, 해열, 지사, 이뇨, 요통, 진정에 사용되고 있다. 이 약용식물 에는 아스포닌(Asphonin) 6% 이외에도, 살사사포닌(Sarsasaponin), 말코게닌(Markogenin; 2-hydroxy sarsasapogenin) 등의 스테로이드 사포게닌, 플라보노이드(Flavonoids), 탄닌 등이 함유되어 있다. 동의보감이나 본초강목 등에서는 지모를 골증노열(骨蒸勞熱)에 사용하였는데, 골증노열(骨蒸勞熱)이란 용어를 해석하면 골중(骨中)에서 골소송증(Osteoporosis)이 발증되어 만성적인 동통을 호소하는 것을 의미한다.

양강(Alpinia Officinarum)은 생강과에 속하는 다년생 초본인 양강의 뿌리줄기를 말린 것으로 구부러진 원주형 또는 원추형이고 길이 2-7mm, 지름 1-2mm이고 때로는 몇 개의 곁뿌리가 달려있다. 표면은 적갈색 또는 암갈색이고 회백색의 마디가 있고 마디사이에 세로주름이 있으며 재질은 단단하고 쉽게 꺽이지 않는다. 정유의 주요성분은 시네올(cineole), 계피산(cinnamic acid), 메틸 에스테르(methyl ester)등이며, 맛은 맵고 쓰고, 성질은 따뜻하며 비, 위에 작용한다. 비위를 따뜻하게 하여 한사(寒邪; 찬기운)가 위장에 정체되어 설사, 구토하며, 통증을 일으키는 것에 사용된다.

이에 본 발명자들은 LPS로 자극한 RAW 264.7 세포에서 본 발명의 계지, 지모 및 양강의 생약 혼합 추출물이 NO와 생성 억제 등의 산화적 스트레스 억제 효과와 iNOS의 발현에 미치는 영향을 규명하고 그 작용 기작을 밝힘으로써 우수한 항염증 효과를 가짐을 확인하였고, 생약 혼합 추출물의 항염증 및 진통 효과를 약리학적으로 관찰한 결과, 관절염 예방 및 치료 효과가 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항염증 및 진통 효과를 갖는 계지, 지모 및 양강의 생약 혼합 추출물인 KHP116의 신규한 용도를 제공하기 위한 것으로, 본 발명의 생약 혼합 추출물은 NO 생성을 감소시키어 세포내 산화적 스트레스를 감소시키고, iNOS 발현에 미치는 영향을 RAW 264.7 세포를 이용하여 검증하고 그 작용기작을 밝혀 염증관련 질환에 대한 약리기전을 규명함으로써, 계지, 지모 및 양강을 유효성분으로 함유하는 염증관련 질환 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 식품조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 항염증 및 진통 효과를 갖는 계지, 지모 및 양강의 생약 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증관련 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 염증 관련 질환에는 퇴행성관절염, 류마티스성 관절염, 급성 통증, 만성 통증, 관절통, 천식, 신경병적 통증, 수술 후 통증, 편두통, 신경병증, 신경손상, 과민성 장증후군, 내독소에 의한 쇼크, 염증성 장 질환 등, 바람직하게는 퇴행성관절염, 류마티스성 관절염, 급성통증, 만성통증, 관절통 등, 더욱 바람직하게는 퇴행성관절염을 포함한다.

상기 혼합추출물은 그 구성 배합비가 계지 : 지모 : 양강의 중량비(w/w) 1~6 : 1~3 : 1~6가 바람직하며, 보다 바람직하게는 2: 1: 2 임을 특징으로 한다.

본원에서 정의되는 혼합 추출물은 물, 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 저급 알콜 용매 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매 가용 추출물이며, 바람직하게는 물 및 에탄올 혼합 용매 가용 추출물, 더욱 바람직하게는 60~90% 에탄올 가용 추출물을 포함한다.

이하, 본 발명의 혼합추출물을 제조하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 계지, 지모 및 양강의 생약 혼합 추출물을 구입하여 불순물을 제거하여 세절한 후, 그 중량의 약 2 내지 20배, 바람직하게는 약 8 내지 15배 부피의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 물 및 에탄올의 혼합용매, 바람직하게는 에탄올로 80 내지 100 ℃, 바람직하게는 100 ℃에서 약 1 시간 내지 2일, 바람직하게는 1 시간 내지 5 시간 동안 열수 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 열수 추출 방법으로 1회 내지 5회, 바람직하게는 2회 내지 3회 반복하여 추출물을 수득한 후, 이 추출물을 실온에서 방냉한 후 여과하고 여과한 추출물을 혼합하여 회전진공농축기로 감압 농축한 다음, 동결 건조하여 본 발명의 계지, 지모 및 양강의 생약 혼합 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제법으로 얻어진 계지, 지모 및 양강의 생약 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증관련 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 계지, 지모 및 양강을 함유한 조성물인 KHP116의 항염증의 효능을 알아보기 위하여, RAW 264.7 대식 세포주를 선택하여 LPS로 산화적 스트레스를 유발시키고, KHP116을 처리하여 산화적 스트레스와 iNOS, NFκB 활성 및 IκBα 분해 억제 등에 미치는 영향을 조사한 결과, 본 발명의 KHP116은 대식세포에서 효과적으로 염증반응의 생성물인 NO를 감소시키어, 세포내 산화적 스트레스를 감소시키고, NFκB 활성을 억제하고, NFκB의 결합에 관여하는 IκBα의 분해를 억제하며, iNOS 단백질과 mRNA 유전자의 발현정도를 억제함으로서, KHP116의 항염증 효과를 확인하였다.

또한, 계지, 지모 및 양강의 생약 혼합 추출물은 오랫동안 생약으로 사용되어 오던 약재로서 이로부터 추출된 본 발명의 추출물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.

본 발명의 계지, 지모 및 양강을 함유하는 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 내지 80 중량%로 포함한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 외용제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 바람직하게는 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제의 피부 외용제 형태의 약학 조성물을 제공한다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피 롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물을 1일 0.0001 내지 1000mg/kg으로 바람직하게는 0.001 내지 100mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여 할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 동맥, 골내, 근육, 피하, 자궁 내, 경막 또는 뇌혈관 내(뇌실내, intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증관련 질환 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 염증관련 질환 예방 및 치료용 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다.

이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은, 일반적으로 본 발명의 건강 기능 식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 50 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 20 중량%로 가할 수 있으며, 건강 기능 음료 조성물의 경우 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추 출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며, 통상의 음료와 같이 성분으로서 함유할 수 있다. 상술여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

이 외 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물: 예를 들어, 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그다지 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 계지, 지모 및 양강의 생약 혼합 추출물의 제조

계지, 지모 및 양강의 생약 혼합 추출물을 제조하기 위하여, 경희의료원에서 구입한 계지, 지모 및 양강을 불순물을 제거하여 세절한 후 계지 60g, 지모 30g, 양강 60g (중량비(w/w) = 2 : 1 : 2)을 준비하여 80%(v/v) 에탄올 수용액을 가한 후 환류 장치를 이용하여 90℃에서 3시간 동안 2회 내지 3회 반복하여 추출하고 와트만지(whatman No.2)에 여과한 후 감압 농축하여 에탄올 추출물을 수득하였다. 상기 에탄올 추출물에 60 내지 70℃ 온도에서 감압 농축 후, 증류수를 가해 현탁 하여 -44℃조건 하에서 2 ~ 3일 동안 동결 건조하여 최종적으로 분말 상태의 계지, 지모 및 양강의 혼합 추출물 18.3g (12.22%)을 수득하여 상기 혼합추출물을 제통단이라 명명(이하 "KHP116" 이라 함)하여 본 발명의 시료로 사용하였다.

참고예 1. 세포배양

본 실험에 사용된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's minimum essential medium)배지, 우 태아 혈청(fetal bovine serum; FBS), 100% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)은 Invitrogen(Carlsbad, CA)에서 구입하였고, 모든 다른 시약들은 Sigma Chemical Co.(St. Louis, MO)로부터 구입하였다. iNOS, IkB-α 단일클론항체와 퍼록시다제 컨쥬게이트된 이차항체(peroxidase-conjugated secondary antibody)는 Santa Cruz Biotechnology, Inc.(Santa Cruz, CA)로부터 구입되었다. 본 실험에 사용된 RAW 264.7 마우스 대식 세포주는 한국 세 포주은행(Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였다. RAW 264.7 세포들은 10% FBS와 1% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin)을 각각의 DMEM 배지에 첨가하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

실험예 1. 세포 독성 측정

1-1. 실험준비

KHP116의 세포독성을 알아보기 위하여 기존문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다(Alley MC. et al., Cancer. Res., 48, pp 589-601, 1988).

살상세포를 유도하지 않는 적절한 투여량을 알아보기 위하여 세포독성효과는 3-[4,5-디메틸티아졸-2yl]-2,5-디페닐 테트라졸륨 브로마이드 MTT 법(3-[4,5-dimethylthiazol-2yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide MTT assay)를 이용하여 96-웰 플레이트(2X10⁴ 세포/웰)에 세포를 주입하여 부착시키고, KHP116을 농도별로 처리하여 48시간동안 배양된 세포로 평가되었다. 배양이 끝난 후 PBS에 0.5 mg/ml의 농도로 녹인 MTT 용액을 배지에 첨가시켜 37℃에서 4시간 동안 반응하였다. 배지를 제거한 후 DMSO를 넣어 포마즌(formazan) 색소를 용해시켜 540 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존력을 측정하였다.

1-2. 실험결과

KHP115의 세포독성을 알아보기 위해, RAW 264.7 세포들은 48시간 동안 KHP116의 5 내지 100μg/ml의 농도로 처리되었으며, MTT법을 사용하여 세포생존율 실험을 수행하였다. 도 1에서 보는 바와 같이 KHP116은 RAW 세포에 대해 세포독성효과가 거의 없다는 것을 알 수 있었다. 대조군과 비교하여 KHP116(5내지 100μg/ml)로 처리된 세포의 생존율도 특별히 달라지지 않았다.

실험예 2. 산화적 스트레스 억제 효과

2-1. NO 생성 억제 효과

LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 RAW 264.7 세포에서 KHP116이 NO 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 기존문헌에 기재된 방법을 응용하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다(Green LC. et al., Anal. Biochem., 126, pp 131-138, 1982).

NO 생성 정도는 그린(Green) 등의 방법으로 NO 생성의 지표인 배지에 생성된 NO의 양을 측정하여 결정하였다. 24-웰 플레이트(8X10⁵ 세포/웰)에 세포를 주입하여 부착시키고, KHP116을 농도별로 처리하여 2시간 배양한 후, LPS(1㎍/㎖)를 첨가하여 20시간 배양하였다. 100㎕의 배지 상등액에 50㎕의 1% 설파닐아미드(in 5% phosphoric acid)와 50㎕의 0.1% 나프틸렌디아민 디히드로클로라이드(naphthylenediamine dihydrochloride)를 넣어 실온에서 10분간 반응시킨 후 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준곡선은 NaNO₂를 농도별로 조제하여 사용하였다.

본 실험 수행 결과, 도 2에서 보는 바와 같이, KHP116는 투여량에 따라 NO 생성을 저해하였다. 100μg/ml일 때, NO 생성을 90%이상 저해하였다. 50μg/ml또는 그 이상일 경우 KHP116는 NO 생성을 크게 저해하였다(p<0.05). 따라서 산화적 스트레스 유발 상황에서 KHP116은 NO 생성을 농도 의존적으로 억제함을 확인할 수 있었다.

실험예 3. 염증 억제 효과

3-1. iNOS 단백질 발현 정도

LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 대식 세포를 활성화시키는 것으로 잘 알려진 iNOS 단백질의 유전자 발현에 미치는 KHP116의 영향을 알아보기 위하여 같은 과정으로 실험하였다(Liang YC. et al., Carcinogenesis., 20, pp 1945-1952, 1999).

RAW 264.7 세포는 100 mm 배양 디쉬에 1X10⁶ 으로 부착시킨 후 다양한 농도의 KHP116 (0 내지 100μg/ml)를 처리 30분 후 LPS를 처리하여 24시간 동안 배양시켰다. 배양이 끝난 후 신속히 차가운 PBS로 수세하고 세포용해 완충용액(lysis buffer)으로 용해시켰다. 얼음 위에서 30분 동안 반응시킨 후 용해액은 13,000 rpm에서 15분 동안 원심 분리하여 상층액을 회수하여 시료의 단백질 농도를 측정하였다. iNOS 단백질의 발현 변화는 웨스턴 블로팅(Western blotting)으로 확인하였다.

각 시료로부터 같은 양의 단백질은 SDS/10% 폴리 아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에서 전기영동 하였으며, 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 전이시켰다. 막은 항-iNOS, 항-actin(1:1000)으로 4℃에서 밤새 반응시킨 후 세 번 수세하여 이차 항체로 실온에서 1시간 동안 반응시 켰다. 특정 밴드는 유도된 케밀루미네신스 감지 장치(chemiluminescence's detection system)를 사용하여 감지되었다.

본 실험 수행 결과, 도 3에서 보는 바와 같이, 24시간 동안 KHP116치료는 두드러지게 RAW 264.7 세포의 iNOS 단백질 발현을 저해한 것을 확인할 수 있었다.

3-2. NF κB DNA 결합 활성 억제 효과

LPS로 산화적 스트레스를 유발시킨 RAW 264.7 세포에서 KHP116이 NFκB 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기와 같은 과정으로 실험을 수행하였다(Xie QW. et al., J. Bio. Chem., 269, pp4705-4708, 1994).

LPS는 다수의 IEG(immediate early genes)의 발현의 유도를 이끄는 NF-κB 전사인자를 활성화시키는 것이라는 점이 증명되어 왔다. LPS유도된 iNOS의 발현을 위한 KHP116의 활성 기전을 명백히 하기 위해, LPS 유도된 NF-κB 활성에 대한 KHP116의 저해효과가 실험되었다. 데이터는 포스트 혹 테스트(post hoc test)로써 뉴만-쿨스 검정법(Newman-Keuls test)에 따라 분석되었다.

RAW 264.7 세포는 100 mm 배양 디쉬에 2 X 10⁷ 으로 부착시킨 후 다양한 농도의 KHP116 (0 내지 100μg/ml)를 처리 30분 후 LPS(1μg/ml)를 처리하여 2시간 동안 배양시켰다. 배양이 끝난 후 신속히 차가운 PBS로 수세하고 저 삼투압 완충용액 A(hypotonic buffer A) [10 mM HEPES (pH 7.6), 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF]으로 얼음 위에서 10분동안 용해시킨 후 12,000g에서 5분 동안 원심 분리하여 핵을 침전시켰다. 핵침전물은 얼음위에서 완충용액 B [20 mM HEPES (pH 7.6), 25% glycerol, 0.4 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF]에 30분간 녹인 후 12,000g에서 20분 동안 원심 분리하여 핵단백질을 포함한 상층액을 회수하여 핵단백질 농도를 측정하였다. NF-κB의 DNA결합 활성에 대한 KHP116의 영향은 매우 특정하고 민감한 ELISA kit(Active motif, Carlsbad, CA)를 사용하여 정량되었다. 각 용해액으로부터 5 μg의 단백질을 취하여 5'-GGGACTTTCC-3' 의 NF-κB 염기서열이 코팅되어있는 ELISA plate에 처리하여 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 수세 완충용액으로 수세시킨 후 항 NF-κB/p65 항체를 각 웰에 넣어준 후 실온에서 한 시간 동안 반응시켰다. 수세 후 이차 항체로 반응시켜 혼합액의 흡광도는 655nm를 표준파장으로 450nm에서 ELISA 리더(reader)로 측정되었다.

본 실험 수행 결과, 도 4에서 보는 바와 같이, LPS로 활성화된 RAW 264.7세포에 KHP116로 처리된(10, 50, 100μg/ml) RAW 264.7 세포로부터 얻어진 핵 추출물 안에 NF-κB DNA 결합 활성의 감소가 ELISA 분석을 통해 증명되었다.

3-3. IκBα 단백질 분해 억제 효과

핵 전좌(nuclear translocation)와 NF-κB/Rel 전사 인자의 DNA 결합은 IκBα의 인산화와 분해에 의해 먼저 일어난다. IκBα분해효과에 의한 KHP116의 NF-κB DNA 결합이 억제되는지를 알아보기 위해, IκBα의 세포질 레벨(cytoplasmic levels)이 웨스턴 이뮤노블럿 분석(Western immunoblot analysis)에 의해 실험되었다(Stancovski I. et al., Cell., 91, pp299-302, 1997).

RAW 264.7 세포는 100 mm 배양 디쉬에 1 X 10⁶ 으로 부착시킨 후 다양한 농 도의 KHP116를 100μg/ml로 처리 30분 후 LPS(1μg/ml)를 처리하여 2분, 5분, 10분간 배양시켰다. 배양이 끝난 후 신속히 차가운 PBS로 수세하고 세포용해 완충용액(lysis buffer)으로 용해시켰다. 얼음 위에서 30분 동안 반응시킨 후 용해액은 13,000 rpm에서 15분동안 원심분리하여 상층액을 회수하여 시료의 단백질 농도를 측정하였다. IκBα 단백질의 발현 변화는 웨스턴 블로팅(Western blotting)으로 확인하였다.

각 시료로부터 같은 양의 단백질은 SDS/10% 폴리 아크릴아마이드 겔(polyacrylamide gel)에서 전기영동 하였으며, 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 전이시켰다. 막은 항-IκBα, 항-actin(1:1000)으로 4℃에서 밤새 반응시킨 후 세 번 수세하여 이차 항체로 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 특정 밴드는 유도된 케밀루미네신스 감지 장치(chemiluminescence's detection system)를 사용하여 감지되었다.

본 실험 수행 결과, 도 5에서 보는 바와 같이, RAW 264.7 세포에서, IκBα 단백질은 LPS(1μg/ml)처리 후 5분 안에 거의 완전하게 감소 되었으며, 10분 안에 정상 레벨로 되돌아 왔다. 100μg/ml KHP116에 의한 RAW 264.7 세포의 전처리(pretreatment)는 LPS 유도된 IκBα분해를 크게 억제하였다(p<0.05).

실험예 4. 관절염의 임상실험효과

본 발명의 실시예 1에서 제조된 제통단에 대한 관절염 치료효과를 확인하기 위하여, 여러 종류의 관절염 환자를 대상으로 하기와 같은 임상실험(Human study)을 실시하였다.

2005년 1월 1일부터 5월 1일까지 슬관절의 동통을 호소하는 남녀 80명을 선정하여 두 군의 환자수가 동일하게 만들어진 무작위법(randomization code)에 따라 치료군과 대조군의 순서대로 할당하여, 치료군은 제통단을 1회 3캡슐, 1일 3회 투약하였으며, 대조군은 제통단과 성상이 구분할 수 없도록 캡슐에 담아서 같은 방법으로 투약하였다.

통계분석은 SPSS 12.0 for windows를 사용하였으며, 군간의 동질성 검증은 독립적인 t검정(independent t-test)을 이용하였고, 제통단의 효과 검증은 반복측정 분산분석법(repeated measures analysis of variance)을 이용하였고, WOMAC(Western Ontario McMaster Universities Osteoarthritis)서브스케일(subscale)의 내적 타당도(internal validity)검증은 크론바흐 알파(Cronbach alpha)를 이용하여, p<0.05를 유의한 것으로 하였다.

WOMAC 지수(index)는 퇴행성 슬관절염 환자의 동통과 기능상태를 평가하는 종합지표로서, 퇴행성관절염 환자의 증상의 중증도와 치료의 효과 판정에 광범위하게 사용되고 있으며 많은 연구들을 통해서 안정성이 입증되고 있다. LFI(Lequesne's functional index), VAS등 다른 치료효과 측정(outcome measure)들과의 상관성도 보고되고 있다(Bellamy N et al., J Rheumatol . 15, pp 1833-1840, 1988).

4-1. 제통단 투약이 종합 골관절염 증상 지수(composite WOMAC index score)에 미치는 영향

제통단 투약 전후의 종합 골관절염 증상 지수의 변화를 반복측정 분산분석법 으로 분석한 결과, 종합 골관절염 증상 지수는 시간의 변화에 따라 유의하게 감소되었으며(p<0.001), 군의 차이에 따라 유의하게 감소되었으나 (p<0.05),시간과 약물투여에 의해서도 유의하지는 않았다(표 1 참조).

종합 골관절염 증상 지수에 대한 제통단의 영향

자료(Source)	TypeⅡ제곱합	자유도 (df)	평균제곱	F	유의확률 (Sig.†)
시간	2304.776	2	1152.388	12.132	0.000**
군	2577.938	1	2577.938	4.421	0.400*
시간*군	21.776	2	10.888	0.115	0.892

†변수의 반복된 수치분석. *p<0.05, *p<0.001

4-2. 제통단 투약이 골관절염 증상 동통 척도 지수(WOMAC pain subscale index score) 에 미치는 영향

제통단 투약 전후의 골관절염 증상 동통 척도 지수의 변화를 반복측정 분산분석법으로 분석한 결과, 골관절염 증상 동통 척도 지수는 시간의 변화에 따라 유의하게 감소되었으나 (p<0.001), 군의 차이에 따라서는 유의하지 않았으며, 시간과 약물투여에 의해서도 유의하지 않았다(표 2 참조).

골관절염 증상 동통 척도 지수에 대한 제통단의 영향

자료(Source)	TypeⅡ제곱합	자유도 (df)	평균제곱	F	유의확률 (Sig.†)
시간	86.489	2	43.25	7.25	0.001**
군	79.951	1	79.951	2.944	0.092
시간*군	1.847	2	0.923	0.16	0.857

†변수의 반복된 수치분석. *p<0.001

4-3. 제통단 투약이 골관절염 증상 강직감 척도 지수( WOMAC stiffness subscale index )에 미치는 영향

제통단 투약 전후의 골관절염 증상 강직감 척도 지수의 변화를 반복측정 분산분석법으로 분석한 결과, 골관절염 증상 강직감 척도 지수는 시간의 변화에 따라 유의하지 않았으며, 군의 차이에 따라서는 유의하지 않았으며, 약물투여에 의해서도 유의하지 않았다(표 3 참조).

골관절염 증상 강직감 척도 지수에 대한 제통단의 영향

자료(Source)	TypeⅡ제곱합	자유도 (df)	평균제곱	F	유의확률(Sig.†)
시간	6.837	2	3.418	2.006	0.140
군	15.199	1	15.199	2.197	0.144
시간*군	0.908	2	0.454	0.266	0.767

†변수의 반복된 수치분석.

4-4. 제통단 투약이 골관절염 증상 신체적 기능 지수(WOMAC physical function subscale index score) 에 미치는 영향

제통단 투약 전후의 골관절염 증상 신체적 기능 지수의 변화를 반복측정 분산분석법으로 분석한 결과, 골관절염 증상 신체적 기능 지수는 시간의 변화에 따라 유의하게 감소 되었으며 (p<0.001), 군의 차이에 따라서도 유의하게 감소 되었으나 (p<0.05), 시간과 약물투여에 의해서는 유의하지 않았다(표 4 참조).

골관절염 증상 신체적 기능 지수에 대한 제통단의 영향

자료(Source)	TypeⅡ제곱합	자유도(df)	평균제곱	F	유의확률(Sig.†)
시간	1367.650	2	683.825	13.132	0.000**
군	1438.930	1	1438.930	4.789	0.033*
시간*군	15.364	2	7.682	0.148	0.863

†변수의 반복된 수치분석. *p<0.05, *p<0.001

4-5. 제통단 투약이 ESR 에 미치는 영향

제통단 투약 전후의 ESR의 변화를 반복측정 분산분석법으로 분석한 결과, ESR은 시간의 변화에 따라 유의하지 않았으며, 군의 차이에 따라서도 유의하지 않았고, 시간과 약물투여에 의해서도 유의하지 않았다(표 5 참조).

ESR 에 대한 제통단의 영향

자료(Source)	TypeⅡ제곱합	자유도 (df)	평균제곱	F	유의확률(Sig.†)
시간	89.740	1	89.740	2.267	0.138
군	28.568	1	28.568	0.176	0.676
시간*군	3.712	1	3.712	0.094	0.761

†변수의 반복된 수치분석. *p<0.05, *p<0.001

4-6. 제통단의 안전성

제통단 투약 전후의 AST는 각각 24.32(SD 7.073), 23.72 (SD 7.086), ALT는 각각 22.62(SD 10.177), 20.11 (SD 8.683), BUN은 각각 14.91 (SD 3.740), 16.1702 (SD 3.738), Cr는 각각 0.825 (SD 0.151), 0.809 (SD 0.136)으로 모두 유의한 차이가 없었으며, 모두 연령대비 정상범위를 벗어나지 않았다. 따라서 제통단이 간기능과 신장기능에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 사료된다.

본 임상 실험 수행 결과, 골관절염 증상 척도의 크롬바흐 알파(Cronbach α)는 0.8 이상으로 높은 내적 타당도를 보였으며, 제통단이 간 기능과 신장 기능에 부정적인 영향을 미치지 않았고, 제통단이 골관절염 증상 지수와 ESR 수치에 효과가 있는 것으로 나타났다.

하기에 본 발명의 계지, 지모 및 양강의 생약 혼합 추출물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

실시예 1의 추출물 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

실시예 1의 추출물 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

실시예 1의 추출물 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

실시예 1의 추출물 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO_4,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

실시예 1의 추출물 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

실시예 1의 추출물 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

실시예 1의 추출물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85??에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강 음료 조성물 제조에 사용한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 계지, 지모 및 양강의 생약 혼합 추출물은 항염증 효과 및 진통 효과 실험에서 뛰어난 항염증 및 통증억제 효과를 나타내므로, 계지, 지모 및 양강의 생약 혼합 추출물을 포함하는 조성물은 염증관련 질환 예방 및 치료용 의약품 및 건강기능식품으로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims (8)

1. 항염증 및 진통 효과를 갖는 계지, 지모 및 양강의 생약 혼합 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증관련 질환 예방 및 치료용 약학조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 혼합 추출물은 그 구성 배합비가 계지 : 지모 : 양강(1~6 : 1~3 : 1~6)의 중량비(w/w)인 약학 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매에 가용한 추출물인 약학조성물.
4. 제 1항에 있어서, 상기 염증 관련 질환은 류마티스성 관절염, 퇴행성 관절염, 급성 통증, 만성 통증, 관절통, 천식, 신경병적 통증, 수술 후 통증, 편두통, 신경병증, 신경손상, 과민성 장 증후군, 내독소에 의한 쇼크, 염증성 장 질환인 약학 조성물.
5. 제 4항에 있어서, 상기 염증 관련 질환이 류마티스성 관절염, 퇴행성관절염, 급성통증, 만성통증, 관절통인 약학조성물
6. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약학조성물은 산제, 과립 제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 또는 에어로졸 형태를 포함하는 경구형 제형인 약학조성물.
7. 항염증 및 진통 효과를 갖는 계지, 지모 및 양강의 생약 혼합 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증 관련 질환 예방 및 개선용 건강기능식품.
8. 제 7항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽제 또는 음료인 건강기능식품.

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