KR20140119236A

KR20140119236A - 패류 추출물을 유효성분으로 포함하는 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 또는 수면 유도 또는 개선용 조성물

Info

Publication number: KR20140119236A
Application number: KR1020130032884A
Authority: KR
Inventors: 김세권; 조승목; 윤민석; 양혜진; 김지영
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2013-03-27
Filing date: 2013-03-27
Publication date: 2014-10-10
Also published as: WO2014157803A1; KR101474749B1

Abstract

본 발명은 홍합(Mytilus edulis), 꼬막(Tegillarca granosa) 및 백합(Mercenaria stimpsoni) 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 패류의 추출물을 유효성분으로 하는 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 활성용 조성물로서, 패류 추출물은 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 친화력을 가지는 것으로, 천연물로부터 얻어진 물질을 이용하기 때문에 부작용을 유발하지 않고, 안전성을 확보할 수 있으며, 패류 추출물을 유효성분으로 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 및 불면증 치료용 약학 조성물이나 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선용 식품 조성물으로 활용될 수 있다.

Description

패류 추출물을 유효성분으로 포함하는 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 또는 수면 유도 또는 개선용 조성물 {Composition for anxiolitic, anti-convulsant, anti-depressant or sleep-improving effect comprising shellfish extract as an effective component}

본 발명은 패류 추출물을 유효성분으로 포함하는 GABA_A-벤조다이아제핀(benzodiazepine) 수용체 활성용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 친화력을 가져서 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선 효과를 갖는 약학 조성물 또는 식품 조성물에 관한 것이다.

현대 사회에서 많은 사람들은 스트레스와 불안, 초조 때문에 수면장애를 겪고 있다. 통계에 의하면 성인의 약 15%가 불안증상에 의한 불면증 때문에 약물 치료가 필요하다고 알려져 있으며, 불면의 원인으로는 스트레스, 긴장, 공포 등 다양하며, 치료 약물로는 벤조다이아제핀 계열의 약물과 세로토닌 효능약 등이 사용되고 있으나, 이러한 약물들은 장기간 사용하였을 때 내성 및 의존성이 형성되는 부작용이 심한 문제점이 있다.

따라서, 수면제 장기복용자 및 제한자의 경우 이를 대체할 수 있는 수단으로 천연 보조제의 필요성이 높아지고 있으며, 수면 증진 건강기능식품에 대한 수요가 증대되고 있는 실정이다.

또한, GABA_A 수용체는 멤브레인 이온 채널을 형성하는 팬타머릭 단백질로서, 진정, 수면, 불안, 근육긴장, 경련, 기억 상실 등의 조절과 밀접한 관련이 있고, 이를 통하여 GABA(감마-아미노부티르산)이 작용하게 된다. 불안 치료제, 진정제 또는 수면유도제로서 벤조다이아제핀을 포함하여 많은 약물들이 이 수용체에 결합하여 약리작용을 행하고 있고, 벤조다이아제핀 부위에 약물 또는 보조제가 결합하면 GABA에 대한 GABA_A 수용체 친화도를 증진시키고 염소 이온의 세포 내 유입을 증가시켜 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선 효과를 보인다. 그러나, 여전히 약물 의존성을 보이고, 근육완화 및 건망증 등의 심각한 문제를 초래하기도 한다.

따라서, GABA_A 수용체의 벤조다이아제핀 사이트에 결합 작용하여 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 친화력을 가지면서 부작용의 위험이 없고 안전한 천연물로부터 얻어진 물질을 이용한 진정-수면 효과의 보조제 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

GABA_A 수용체의 벤조다이아제핀 부위에 작용하여 GABA_A 수용체가 GABA에 반응하여 염소이온 채널을 활성화시키고, 염소가 세포 내로 유입되어 세포막 전위의 과다 분극을 통해서 신경세포성(neuronal) 활동을 늦추는 육상의 허브 및 식물 추출물, 해조류 추출물 등에 대한 연구가 있었다.

한편, 패류는 보편적으로 일상에 많이 쓰이는 재료 중 하나이며 조개 가루는 다른 천연 재료들과 함께 여러 가지 조합을 통해 전통적인 치료제로 사용되었다[Biol. Rev. Camb. Philos. Soc. 85, 757-775. Benkendorff, 2010]. 조개 가루는 상처개선, 신장병 치료, 골다공증, 두통, 현기증, 자궁출혈, 간 질환, 관절염 및 피부 트러블 등의 치료에 사용되는 것으로 보고되고 있으며, 패류 추출물은 항산화 작용을 포함한 항암작용, 항고혈압작용 및 항응혈작용의 효과가 있는 것으로 알려져 있다[Adv. Food Nutr. Res. 65, 153-169. De Zoysa, 2012]. 예를 들어, 청자고동(Conus geographus)으로부터 분리한 conopeptide는 Ziconotide/Prialt의 성분을 대표하며 이 제제는 미국뿐만 아니라 유럽에서도 FDA로부터 승인을 받아 만성질환의 치료에 사용되고 있다[Biochemistry 23, 5087-5090. Olivera et al., 1984].

그러나 아직까지 해양생물소재, 특히 패류로부터 중추신경계 진정 효과를 가지는 해양기능성 소재를 개발하는 것에 대해서는 세계적으로 사례가 거의 없었다.

따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 첫 번째 과제는 패류 추출물을 포함하는 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 또는 불면증 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명이 해결하고자 하는 두 번째 과제는 패류 추출물을 포함하는 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 첫 번째 과제를 달성하기 위하여, 패류 추출물을 유효성분으로 하는 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 또는 불면증 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 활성용 조성물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 패류 추출물은 홍합(Mytilus edulis), 꼬막(Tegillarca granosa) 및 백합(Mercenaria stimpsoni) 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 패류의 추출물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 패류 추출물은 홍합 추출물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 패류 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매에 의한 패류 추출물일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 패류 추출물은 40 ~ 100℃의 물로 2 ~ 48시간 동안 추출하여 제조하는 패류 물 추출물일 수 있다.

상기 패류 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매에 의한 패류 추출물을 헥산 또는 에틸아세테이트로 재분획한 분획물일 수 있다.

본 발명은 상기 두 번째 과제를 달성하기 위하여, 패류 추출물을 유효성분으로 하는 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 조성물은 정제, 산제, 과립제 및 캅셀제 중에서 어느 하나의 형태로 제제화된 건강기능식품일 수 있다.

본 발명에 따른 패류 추출물은 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 친화력을 가져 이를 포함하는 조성물은 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선에 효과적이고, 천연물로부터 얻어진 물질을 이용하기 때문에 부작용을 유발하지 않고, 안전성을 확보할 수 있으며, 약학 조성물이나 건강기능식품 등의 식품 조성물로도 매우 유용하다.

도 1은 2007년부터 2011년까지 최근 5년간 패류의 평균 가격을 나타낸 그래프이다. 패류에서 각각 AN, Argopecten nucleus (가리비); AP, Atrina pectinata (키패류); CS, Cyclina sinensis (가무락); ME, Mytilus edulis (홍합); MS, Mercenaria stimpsoni (백합); MV, Mactra veneriformis (동죽); NC, Neptunea cumingi (고둥); RV, Ruditapes variegatus (바지락); SP, Saxidomus purpuratus (개패류); TG, Tegillarca granosa (꼬막)을 나타낸다.
도 2a는 펜토바비탈 수면용량(45 mg/kg, i.p.)을 투여한 마우스의 입면시간에 대한 패류 물 추출물의 효과를 나타내는 그래프이며, 도 2b는 펜토바비탈 수면용량(45 mg/kg, i.p.)을 투여한 마우스의 수면시간에 대한 패류 물 추출물의 효과를 나타내는 그래프이다. 각 그래프는 평균값(means±SEM, n=10)을 나타낸다. *은 대조구와 비교하여 p<0.05에서, **은 대조군과 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미한다. 대조군(0.5% CMC-식염수) 10 mL/kg, 디아제팜 30 mg/kg 및 패류 물 추출물 1,000 mg/kg을 각각 경구투여(p.o.)하고 45분 후 펜토바비탈을 투여하였다. C은 대조군; D는 디아제팜, 패류에서 각각 AN, Argopecten nucleus (가리비); AP, Atrina pectinata (키패류); CS, Cyclina sinensis (가무락); ME, Mytilus edulis (홍합); MS, Mercenaria stimpsoni (백합); MV, Mactra veneriformis (동죽); NC, Neptunea cumingi (고둥); RV, Ruditapes variegatus (바지락); SP, Saxidomus purpuratus (개패류); TG, Tegillarca granosa (꼬막)을 나타낸다.
도 3a는 펜토바비탈 수면(hypnotic)용량(45 mg/kg, i.p.)을 투여한 마우스의 입면시간에 대한 홍합 물 추출물의 효과를 나타내는 그래프이며, 도 3b는 펜토바비탈 수면용량(45 mg/kg, i.p.)을 투여한 마우스의 수면시간에 대한 홍합 물 추출물의 효과를 나타내는 그래프이다. 대조군(0.5% CMC-식염수) 10 mL/kg, 디아제팜 2 mg/kg 및 홍합 물 추출물 125, 250, 500, 1000 mg/kg을 각각 경구투여(p.o.)하고 45분 후 펜토바비탈을 투여하였다. 각 그래프는 평균값(means±SEM, n=10)을 나타낸다. *은 대조구와 비교하여 p<0.05에서, **은 대조군과 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미한다. CON은 대조군; DPZ는 디아제팜, ME는 홍합 물 추출물을 나타낸다.
도 4a는 펜토바비탈 서브-수면(sub-hypnotic)용량(30 mg/kg, i.p.)을 투여한 마우스의 수면개시율에 대한 홍합 물 추출물의 효과를 나타내는 그래프이며, 도 4b는 펜토바비탈 서브-수면(sub-hypnotic)용량(30 mg/kg, i.p.)을 투여한 마우스의 수면시간에 대한 홍합 물 추출물의 효과를 나타내는 그래프이다. 대조군(0.5% CMC-식염수) 10 mL/kg, 디아제팜 2 mg/kg 및 홍합 물 추출물 125, 250, 500, 1000 mg/kg을 각각 경구투여(p.o.)하고 45분 후 펜토바비탈을 투여하였다. 각 그래프는 평균값(means±SEM, n=10)을 나타낸다. *은 대조군와 비교하여 p<0.05에서, **은 대조군과 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미한다. CON은 대조군; DPZ는 디아제팜, ME는 홍합 물 추출물을 나타낸다.
도 5a는 홍합 물 추출물(ME)와 히스타민 수용체에 작용하는 길항제(DH, 독세핀 디하이드로클로라이드)에 대한 히스타민 수용체 효능제(PD, 2-피리딜에틸아민 디하이드로클로라이드) 투여에 따른 입면시간을 나타낸 것이고, 도 5b는 홍합 물 추출물(ME)와 히스타민 수용체에 작용하는 길항제(DH)에 대한 히스타민 수용체 효능제(PD) 투여에 따른 수면시간을 나타낸 그래프이다. 대조군(CON, 0.5% CMC-식염수 10 mL/kg), DH(30 mg/kg), ME(1500 mg/kg)을 펜토바비탈 투여(hypnotic dosage 45 ㎎/㎏) 45분 전에 경구 투여하였다. *은 대조구와 비교하여 p<0.05에서, **은 대조군과 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미한다.
도 6a는 GABA A형 벤조다이아제핀 수용체 길항제인 플루마제닐(FLU) 투여 여부에 따른 디아제팜(DZP)과 홍합 물 추출물(ME)의 입면시간을 나타낸 그래프이고, 도 6b는 플루마제닐(FLU) 투여 여부에 따른 디아제팜(DZP)과 홍합 물 추출물(ME)의 수면시간을 나타낸 그래프이다. 대조군(CON, 0.5% CMC-식염수 10 mL/kg), DZP(2 mg/kg), ME(1500 mg/kg)을 펜토바비탈 투여(hypnotic dosage 45 ㎎/㎏) 45분 전에 경구 투여하였고, FLU(8 mg/kg)는 DZP, ME 경구투여 10분 전에 미리 복강 주사하였다. *은 대조구와 비교하여 p<0.05에서, **은 대조군과 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미한다.
도 7은 홍합 물 추출물(ME)의 용량에 따른 입면시간 효과를 나타낸다. ME 500, 1000, 1500 mg/kg, DZP 6 mg/kg을 투여했을 때의 입면시간을 나타낸다. *은 대조구와 비교하여 p<0.05에서, **은 대조군과 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미한다.
도 8은 수면 구조에 대한 홍합 물 추출물(ME)의 효과를 나타낸다. ME 500, 1000, 1500 mg/kg, DZP 6 mg/kg을 투여했을 때의 각성(Wake), 논렘수면(NREMS) 및 렘수면(REMS) 시간을 나타낸다. *은 대조구와 비교하여 p<0.05에서, **은 대조군과 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미한다.
도 9a는 디아제팜(DPZ, 6 mg/kg)의 시간별 각성, 논렘수면 및 렘수면의 변화를 나타낸 그래프이고, 도 9b는 홍합 물 추출물(ME, 1500 mg/kg)의 시간별 각성, 논렘수면 및 렘수면의 변화를 나타낸 그래프이다. Vehicle은 대조군을 나타낸다.
도 10a는 디아제팜(DPZ, 6 mg/kg)의 각성, 논렘수면 및 렘수면 각 단계의 평균 시간 변화를 나타낸 그래프이고, 도 10b는 홍합 물 추출물(ME, 1500 mg/kg)의 각성, 논렘수면 및 렘수면 각 단계의 평균 시간 변화를 나타낸 그래프이다. Vehicle은 대조군을 나타내고, *은 대조구와 비교하여 p<0.05에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미한다.
도 11a는 디아제팜(DPZ, 6 mg/kg)의 논렘수면에서 뇌파(EEG, elctroencephalogram) 파워 밀도 및 델타 활성(Delta activity)를 나타낸 그래프이고, 도 10b는 홍합 물 추출물(ME, 1500 mg/kg)의 논렘수면에서 뇌파(EEG, elctroencephalogram) 파워 밀도 및 델타 활성(Delta activity)를 나타낸 그래프이다. Vehicle은 대조군을 나타내고, *은 대조구와 비교하여 p<0.05에서, **은 대조군과 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미한다.
도 12는 홍합 물 추출물로부터 용매 분획을 제조하는 과정을 나타낸 개요도이다.
도 13a는 펜토바비탈 수면(hypnotic)용량(45 mg/kg, i.p.)을 투여한 마우스의 입면시간에 대한 홍합 물 추출물 용매 분획의 효과를 나타내는 그래프이며, 도 13b는 펜토바비탈 수면용량(45 mg/kg, i.p.)을 투여한 마우스의 수면시간에 대한 홍합 물 추출물 용매 분획의 효과를 나타내는 그래프이다. 대조군(0.5% CMC-식염수) 10 mL/kg, 디아제팜 2 mg/kg 및 홍합 물 추출물의 물 분획(DW), 헥산 분획(HX), 에틸아세테이트 분획(EA), 부탄올 분획(BT) 250 mg/kg을 각각 경구투여(p.o.)하고 45분 후 펜토바비탈을 투여하였다. 각 그래프는 평균값(means±SEM, n=10)을 나타낸다. *은 대조구와 비교하여 p<0.05에서, **은 대조군과 비교하여 p<0.01에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미한다. CON은 대조군; DPZ는 디아제팜, ME는 홍합 물 추출물을 나타낸다.
도 14a와 도 14b는 플루마제닐(flumazenil, FLU)이 홍합 물 추출물 헥산 분획(ME-HX)의 수면유도 효과에 미치는 영향에 대해서 알아보기 위하여 ME-HX는 25, 50, 100, 250 mg/kg, DZP는 2 mg/kg을 펜토바비탈 투여(hypnotic dosage 45 mg/kg) 45분 전에 경구 투여하였고, 플루마제닐(flumazenil, FLU)은 8 mg/kg을 ME-HX 250 mg/kg, DZP는 2 mg/kg 경구 투여 10분 전에 미리 복강 주사하여 입면시간(sleep latency)과 수면시간(sleep duration)에 대해서 측정한 그래프이다. *은 대조구와 비교하여 p<0.05에서, **은 p<0.01에서 유의적 차이가 있음(Dunnet's test)을 의미하고, #은 p<0.05에서, ##은 p<0.01에서 플루마제닐을 처리한 그룹과 처리하지 않는 그룹 사이의 유의적인 차이가 있다는 것을 의미한다(Unpaired Student's t-test). NS는 유의적인 차이가 없다는 것을 의미한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

GABA_A 수용체는 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선 효과와 관련되어 있으며, GABA_A 수용체에 작용하는 약물로는 작용제(agonist)로서는 벤조다이아제핀, 디아제팜(diazepam, DZP), 졸피뎀(zolpidem) 등이 있고, 길항제(antagonist)로는 플루마제닐(flumazenil, FLU)이 있다. 상기에서 언급하였듯이 GABA_A수용체에 작용하는 약물의 경우 의존성 및 부작용을 초래하는 문제점이 있다.

본 발명에서는, 패류 추출물 중에서 홍합(Mytilus edulis), 꼬막(Tegillarca granosa) 및 백합(Mercenaria stimpsoni) 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 패류의 추출물이 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 작용하여 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선 효과를 가지고 있는 것을 확인하였다. 상기 수면 개선은 입면시간(sleep latency)가 감소하거나, 수면시간(sleep duration)이 증가하거나 또는 논렘 수면(NREMS)이 증가하는 효과일 수 있으나, 이에 본 발명의 범위가 제한되지 아니한다.

상기 패류 추출물은 바람직하게는 홍합(Mytilus edulis) 추출물이다.

상기 패류 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 그 혼합물을 추출 용매로 이용하여 추출된 것일 수 있다. 상기 저급 알코올은 탄소수 1 내지 6의 알코올일 수 있다. 예를 들어, 저급 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올 또는 노말-부탄올 등을 이용할 수 있다.

예를 들어, 물 추출물의 제조는 패류를 40 ~ 100℃의 물로 2 ~ 48시간 동안 추출하여 제조할 수 있다.

예를 들어, 에탄올 추출물의 제조는 패류를 35 ~ 75 중량%의 에탄올로 20 ~ 60℃에서 2 ~ 36 시간, 바람직하게는 40 ~ 50℃에서 2.5 ~ 6 시간 동안 추출하여 제조할 수 있고, 보다 바람직하게는 70 중량%의 에탄올 수용액으로 45℃에서 3시간 동안 추출하여 제조한다.

예를 들어, 메탄올 추출물의 제조는 패류를 35 ~ 85 중량%의 메탄올로 20 ~ 60℃에서 2 ~ 36 시간 동안 추출하여 제조할 수 있고, 바람직하게는 20 ~ 30℃에서 22 ~ 26 시간 동안 추출하여 제조할 수 있고, 보다 바람직하게는 80 중량% 의 메탄올로 25℃에서 24시간 동안 추출하여 제조한다.

상기 패류 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매에 의한 패류 추출물을 유기용매로 재분획한 분획물일 수 있다. 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 헥산, 아세톤, 에틸 아세테이트, 클로로포름, 및 디에틸에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유기용매일 수 있고, 바람직하게는 헥산 또는 에틸아세테이트이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 추출물을 추가적으로 농축, 정제 또는 분리한 정제물도 포함한다. 즉, 패류 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 농축시켜 얻은 것도 포함한다. 또한, 상기 추출물이나 분획물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 패류 추출물에 포함된다.

본 발명의 패류 추출물을 유효성분으로 하는 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 활성용 조성물은 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 및 불면증 치료용 약학 조성물일 수 있다.

상기 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 및 불면증 치료용 약학 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있고, 단독으로 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합의 형태로 사용할 수 있다.

또한 본 발명에 따른 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 및 불면증 치료용 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 저제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.

경구 투여를 위한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.

경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 및 불면증 치료용 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에 따른 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 및 불면증 치료용 약학 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 패류 추출물을 유효성분으로 하는 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선용 식품 조성물인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 추출물을 건강기능식품 또는 일반 식품의 유효성분 첨가물로 사용하는 경우 본 발명에 따른 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 예방, 건강 또는 치료 등의 각 사용 목적에 따라 적합하게 결정할 수 있다.

일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명에 따른 추출물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가할 수 있다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 또한 본 발명은 천연물로부터의 추출물을 이용하는 점에서 안전성 면에서 문제가 없으므로 상기 범위 이상의 양으로도 사용할 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별히 제한은 없고, 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸콜렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 건강기능식품 중 음료 식품은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜일 수 있다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명에 따른 기능성 식품 100 mL당 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g일 수 있다.

상기 외에 본 발명에 따른 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선용 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제를 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 수면 개선용 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 제한되지 않으나 본 발명의 조성물 100 중량부 대비 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

참고예 1: GABA _A - 벤조다이아제핀 수용체 결합 활성 탐색 대상 패류의 선정

패류로부터 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 및 수면 유도 및 개선 활성을 나타내는 소재를 개발하기 위하여, 국내에서 많이 소비되고 있는 다소비 패류 10종을 선택하여 생산량(단위: 톤)을 [표 1]에 나타내었다(2012년 통계청 자료 참조).

구분	2007	2008	2009	2010	2011	평균
ME	99,741	69,890	58,434	57,711	72,642	71,684
RV	27,459	36,302	40,393	36,248	37,929	35,666
AP	11,767	6,805	8,688	10,972	8,351	9,317
NC	-	5,592	5,799	7,242	6,913	5,109
TG	28,853	2,957	6,831	5,114	3,197	9,390
SP	3,422	2,672	1,918	1,950	2,314	2,455
CS	808	1,105	938	2,424	1,659	1,387
MV	2,604	1,657	698	1,393	1,444	1,559
MS	2,843	1,454	1,460	1,146	800	1,541
AN	564	436	398	385	454	447

상기 표 1에 사용된 약어는AN, Argopecten nucleus (가리비); AP, Atrina pectinata (키조개); CS, Cyclina sinensis (가무락); ME, Mytilus edulis (홍합); MS, Mercenaria stimpsoni (백합); MV, Mactra veneriformis (동죽); NC, Neptunea cumingi (고둥); RV, Ruditapes variegatus (바지락); SP, Saxidomus purpuratus (개조개); TG, Tegillarca granosa (꼬막)이다.

최근 5년간의 생산량을 보면 홍합이 71,684 톤으로 가장 많았으며 바지락, 키조개, 꼬막 등의 순이었다.

해양생물의 진정용 소재 개발을 위하여 선택된 패류의 생산 단가를 알아본 결과, 패류의 생산단가는 홍합이 1 kg에 501원으로 가장 저렴하였고 동죽, 바지락, 꼬막 순이었다[도 1].

산업적 활용도를 위해 생산량과 단가를 고려하여 10 종의 패류를 선정하였으며 선정된 패류는 [표 2]에 나타내었다.

국문명	학명	영문명
바지락	Ruditapes variegatus	Manila clam
키조개	Atrina pectinata	Comb pen shell
고둥	Neptunea cumingi	Gastropods
꼬막	Tegillarca granosa	Cockle
개조개	Saxidomus purpuratus	Purple Washington clam
가무락	Cyclina sinensis	Venus clam
동죽	Mactra veneriformis	Surf clam
가리비	Argopecten nucleus	Scallop
백합	Mercenaria stimpsoni	Common orient clam
홍합	Mytilus edulis	Mussel

참고예 2: 경구투여 용액의 GABA _A - 벤조다이아제핀 수용체 결합 활성 탐색

일반적으로 추출물의 경우 지용성 성분을 다량 함유하고 있어 CMC 및 DMSO 용액에 녹이거나 현탁시켜 동물실험에 사용하는 경우가 빈번하다. 경구투여를 위한 추출물 용액을 제조하는데 있어서 빈번하게 사용된 CMC-식염수 및 DMSO 용액 자체가 동물의 진정 또는 수면에 직접적으로 영향을 미치는지 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 결합 활성 실험을 통해 알아보았다.

GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 결합 활성 측정은 SD 래트의 대뇌피질을 적출한 후 즉시 30 mM Tris-HCl buffer (pH 7.4, keep at 4) 20 mL에 넣어 균질화시키고 10초 동안 초음파를 처리하였다. 이 후 27,000×g 및 4℃의 조건에서 15분간 원심분리한 후 상층액을 버리고 다시 buffer 20 mL을 취하여 원심분리하였으며, 이 과정을 3번 반복하였다. 뇌 조직 안의 GABA를 제거하기 위하여 37℃의 water bath에서 30분간 incubation 시키고 원심분리한 후 pellet을 수집하여 -80℃에서 동결보관하여 사용하였다. 동결된 membrane을 해동시킨 후 27,000×g 및 4℃의 조건에서 10분간 원심분리한 후 상층액을 버리고 50 mM Tris-citrate buffer (binding buffer, pH 7.1, keep at 4℃) 20 mL을 넣고 원심분리하였다. 이 과정을 3번 반복한 후 membrane을 binding buffer에 500 mL buffer/original tissue g의 농도로 현탁시켜 결합력 평가 시험에 사용하였다. 96-well plate에 membrane suspension 180 ㎕, 각각의 추출물 시료 10 ㎕ 및 [3H] flumazenil (1 nM, final concentration) (Ro 15-1788; PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA, USA) 10 ㎕을 넣고 ice-bath에서 40분간 incubation 하였다. 이 후 glass fiber filter (GF/C, Whatman)을 이용하여 수집하였다. 샘플의 radioactivity는 Tri-Carb Liquid Scintillation Analyzers (Perkin-Elmer, Shelton, CT, USA)를 통해 측정되었다. 비특이적 결합 (nonspecific binding, NSB)은 clonazepam (1 uM, final concentration)을 이용하여 그 값을 결정하였고, Binding displacement 값 (%)은 아래 식(1)과 같이 계산하였다.

식(1)

Binding displacement(%)=[1 - ((시료의 DPM - NSB DPM)/(TB DPM - NSB DPM))]×100

(DPM: disintegrations per minute, TB: total binding, NSB: nonspecific binding)

3가지의 용액(water, 0.5% CMC-식염수, 10% DMSO)를 10 mL/kg의 농도로 경구투여(p.o.)한 후 펜토바비탈(pentobarbital) 45 mg/kg을 복강주사(i.p.)하여 수면을 유도한 결과, 3가지 용액 모두 입면시간(sleep latency)과 수면시간(sleep duration)의 유의적인 차이는 나타나지 않았다(data not shown).

이러한 결과를 통해 3가지 용액 중 어떤 것을 선택하여도 진정 또는 수면 유도 동물실험에 영향을 미치지 않는 것을 확인할 수 있었으며, 본 연구에서 in vivo 실험에 사용된 용매는 0.5% CMC-식염수를 선택하였다.

제조예 1: 패류 물 추출물의 제조

참고예 1의 [표 2]에 나타낸 국내에서 많이 소비되고 있는 다소비 패류 10개(동죽(MV), 개조개(SP), 가리비(AN), 고둥(NC), 바지락(RV), 키조개(AP), 백합(MS), 꼬막(TG), 가무락(CS), 홍합(ME))를 서울 가락시장에서 구매하여 사용하였다.

모두 껍질을 제거한 후 물에 깨끗이 씻어 3 내지 5 조각으로 균등하게 분쇄하였다. 원료 100 g당 증류수를 5배(v/w) 가하여 95℃에서 6시간 동안 가열하였다. 모든 추출물은 여과 및 감압농축을 거쳐 동결건조한 후 분말화하여 실험에 사용하였다.

실험예 1: 패류 추출물의 GABA _A - 벤조다이아제핀 수용체 결합 활성 탐색

상기 제조예 1의 동죽(MV), 개조개(SP), 가리비(AN), 고둥(NC), 바지락(RV), 키조개(AP), 백합(MS), 꼬막(TG), 가무락(CS), 홍합(ME) 물 추출물을 이용하여 이들의 in vivo 진정 또는 수면 유도 효과를 알아보았다. 선택된 10개의 후보소재를 1,000 mg/kg의 단일 농도로 경구투여(p.o.)한 후 pentobarbital (45 mg/kg, i.p.)을 복강 주사하여 진정 또는 수면 유도 효과를 비교하여 [도 2a] 및 [도 2b]에 나타내었다.

실험결과, 입면시간에서는 10개의 후보소재 중 백합(MS), 꼬막(TG), 가무락(CS) 및 홍합(ME)에서 유의적으로 감소(p<0.01)하는 경향을 나타냈다.

한편 수면시간에서는 백합(MS), 꼬막(TG) 및 홍합(ME)에서 p<0.01 수준으로 증가되었음을 알 수 있었다.

홍합(ME)은 따듯한 성질을 지닌 패류로써, 허약함을 보하고 기운을 증강시키며, 내장을 조절하여 소화기능을 증진시킨다. 또한, 허리와 각기병을 치료하며 배의 냉기를 몰아내 양기를 증강시키는 보양 효능이 있다[J. Ease Asian Soc. Dietary Life 14, 187-195. Baek and Choi, 2004]. 국내 패류 중 홍합은 생산량이 높고 단가가 저렴하여 다소비 식품으로 애용하고 있으며, 국민 식생활과 밀접한 관련이 많을 뿐만 아니라 본 연구사업에서 밝혀진 진정 및 수면증진효과는 세계적으로 처음 발견한 것으로 새로운 기능성 소재로서 충분한 가치가 있다고 여겨지므로, 이하 실험에서는 홍합(ME)을 선택하여 세부적인 연구를 진행하였다.

실험예 2: 펜토바비탈에 의해 유도된 쥐에서 홍합 물 추출물의 진정 또는 수면 유도 효과

1) 실험재료

펜토바비탈(Pentobarbital)은 한림 제약회사에서 구입하였고, GABA_A-벤조다이아제핀 수용체의 길항제인 디아제팜(diazepam, DZP)은 잘 알려진 수면제 중의 하나로서 진정 및 수면 유도 효과의 양성 대조군으로 사용하였다.

ICR mouse (18-22 g, male) 및 C57BL/6N mouse (28-30 g, male)는 (주)코아텍에서 분양받아 실험동물용 사육상자에 일주일간 적응된 후 실험에 사용되었다. 동물의 사육은 온도 23±1℃, 습도 55± 5%, lightdark cycle (light on from 09:00 to 21:00), 조도 3000 Lux의 조건하에 이루어졌으며, 사료 및 음수는 자유 급여하였다. 모든 동물들은 KFRI-IACUC (Korea Food Research Institute, Institutional Animal Care and Use Committee)의 실험동물 사용지침에 의해 관리되었다.

2) 실험방법

수면유도 실험은 오후 1시에서 5시 사이의 일정한 시간 내에 진행되었다. 그룹 당 10마리(n=10)의 mouse를 사용하였으며, 실험 전 24 hr 동안 mouse를 절식시켜 사용하였다. 모든 시료는 0.5% CMC-식염수 용액을 이용하여 제조되었으며, pentobarbital 투여 45분 전에 경구투여(p.o.)되었다. 일반 대조군(control)은 0.5% CMC-식염수 수용액을 10 mg/kg의 농도로 처리하였으며, 디아제팜(Diazepam)은 대표적인 수면제 중 하나로 추출물의 수면증진 효과를 비교하기 위하여 양성대조군 약물로 사용하였다. 펜토바비탈(Pentobarbital)은 실험디자인에 따라 sub-hypnotic dosage 30 mg/kg, hypnotic dosage 45 mg/kg을 복강 주사한 후 45 mg/kg (hypnotic dosage)의 농도로 복강주사(i.p.)를 통해 사용되었다. 펜토바비탈 처리 후 각각의 개체를 독립된 공간에 옮겨서 sleep latency(입면시간)와 duration(수면시간)을 측정하였다. 입면시간은 펜토바비탈을 복강주사한 후 정반사(righting reflex)를 1 min 이상 상실할 때까지의 경과시간으로 간주하였고, 수면시간은 다시 정반사를 회복할 때까지의 시간으로 설정하였다. 펜토바비탈 투여 후 10분이 지나도 수면행동을 보이지 않은 mouse는 실험에서 제외되었다. sub-hypnotic dosage of pentobarbital-treated 실험에서 수면개시율(sleep onset) 계산 방법은 아래 식(2)와 같다.

식(2)

수면개시율(sleep onset, %)=(No.falling asleep)/(Total No.)×100

3) 펜토바비탈 수면( hypnotic )용량 투여 시 실험결과

제조예 1의 홍합(ME) 물 추출물 125, 250, 500, 1,000 mg/kg의 농도로 경구투여(p.o.)한 후 펜토바비탈 45 mg/kg 복강 주사에 의한 진정 또는 수면 유도 효과를 [도 3a] 및 [도 3b]에 나타내었다.

홍합 물 추출물은 유의적으로 입면시간을 감소(p<0.01)시켰으며, 500, 1,000 mg/kg의 농도에서 수면시간을 유의적으로 증가(p<0.01)시켜 수면증진 효과를 나타내었다.

4) 펜토바비탈 서브-수면(sub- hypnotic )용량 투여 시 실험결과

제조예 1의 홍합(ME) 물 추출물을 125, 250, 500, 1,000 mg/kg의 농도로 경구투여(p.o.)한 후 펜토바비탈 30 mg/kg 복강 주사하여 수면개시율(sleep onset)과 수면시간(sleep duration) 결과를 각각 [도 4a] 및 [도 4b]에 나타내었다.

실험결과, sub-hypnotic 농도의 펜토바비탈 유도실험에서 control 그룹은 수면개시율이 30 %대로 100 % 수면을 유도하지 못한 반면에 양성 대조군인 DZP (2 mg/kg)을 투여한 그룹은 100 % 모두 수면이 유도되었다.

홍합(ME) 물 추출물 또한 용량 의존적으로 수면개시율과 수면시간을 증가시키는 결과를 나타냈고, 특히 500 및 1,000 mg/kg의 농도에서는 수면유도율이 각각 90 %로 높게 나타났으며, 수면시간도 각각 46.3 ± 4.9 min과 58.3 ± 2.0 min으로 유의적인 증가(p<0.05)를 나타냈다.

이러한 결과를 통해 홍합(ME) 물 추출물이 수면제인 diazepam과 마찬가지로 진정 또는 수면을 유도하는 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 3: 홍합 물 추출물의 생체 내 작용기작

1) 히스타민 수용체 길항제로서의 작용기작

히스타민 수용체 효능제인 2-피리딜에틸렌아민 디하이드로클로라이드(PD)를 이용한 동물실험을 수행하였다. 독세핀 하이드로클로라이드(DH) 30 mg/kg과 홍합 물 추출물(ME) 1500 mg/kg로 각각 경구투여하기 10 분전 150 mg/kg의 PD를 복강주사(i.p.)한 후 펜토바비탈(45 mg/kg, i.p.)로 수면을 유도하였다.

[도 5a] 및 [도 5b]에 따르면 대조군(CON)은 PD 투여에 의해 거의 영향을 받지 않는 것으로 나타났으며, histamine 1 receptor antagonist인 DH는 기대대로 PD에 의한 길항작용으로 인해 유의적으로 sleep latency가 증가(p<0.01)하였고 수면시간이 감소(p<0.01)하였다. 하지만, ME는 PD의 투여여부와 상관없이 유의적인 입면시간의 감소(p<0.01)와 수면시간의 증가(p<0.05)를 나타내었다. 결과적으로, 홍합 물 추출물(ME)은 히스타민 수용체(histamine 1 receptor)에 작용하지 않는 것으로 확인되었다.

2) GABA _A - 벤조다이아제핀 활성 효능제로서의 작용기작

GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 작용하여 진정 또는 수면증진 효과를 나타낼 것으로 기대되는 홍합 물 추출물(ME)과 GABA_A-벤조다이아제핀 활성 효능제(agonist)인 디아제팜(DZP)의 in vivo 작용기작을 알아보기 위해 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 길항제인 플루마제닐(FLU, flumazenil)을 이용한 동물실험을 수행하였다.

플루마제닐은 수용성 이미다조벤조디아제핀(imidazobenzodiazephine)으로 중추신경계의 GABA_A 수용체에 디아제팜과 함께 경쟁적으로 작용함으로써 길항 작용을 하게 되며, 디아제팜에 의한 부작용 발현 시 해독제로 사용되고 있다.

홍합 물 추출물(ME)를 1,500 mg/kg의 농도로 경구투여(p.o.) 하기 10 분전 8 mg/kg의 플루마제닐을 복강주사(i.p.)한 후 펜토바비탈(45 mg/kg, i.p.)로 수면을 유도하였다.

[도 6a] 및 [도 6b]에 따르면 대조군(CON)은 플루마제닐 투여에 의해 거의 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. DZP (2 mg/kg) 및 ME (1,500 mg/kg)는 기대대로 유의적인 입면시간의 감소(p<0.01)와 수면시간의 증가(p<0.01)를 나타내었다. 반면에 플루마제닐을 투여 한 DZP 및 ME는 플루마제닐에 의한 길항작용으로 인해 유의적으로 입면시간이 증가(p<0.01)하였고 수면시간이 감소(p<0.01)하였다.

이러한 결과를 종합해볼 때 ME는 DZP과 같이 GABA_A 수용체의 효능제(agonist)로 작용하는 성분들을 함유하고 있다는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 4: 홍합 물 추출물의 수면구조 분석

1) 실험방법

C57BL/6N mouse (28-30 g)를 1주일간 적응시킨 후 뇌파(Electroencephalogram, EEG) 및 근전도도(Electromyogram, EMG) 측정을 위해 전극 삽입 수술을 실시하였다. Mouse를 pentobarbital(50 mg/kg, i.p.)로 마취시키고 뇌정위기(stereotaxic instrument)에 두부를 고정시켰다. 두부 피하 결합조직을 절개한 후 EEG 및 EMG 측정을 위하여 Mouse EEG/EMG Headmount (Pinnacle Technology Inc, Oregon, USA)를 삽입하였다. 이후 치과용 dental cement로 고정시키고 봉합하였다. 수술부위의 소독 및 항생제 투여를 3일 동안 실시하여 수술로 인한 염증을 예방하였으며, 10일간 회복기간을 두었다. 측정환경에 적응시키기 위하여 측정 4일 전부터 control 실험군에 사용하는 0.5% CMC-saline 용액을 경구투여(p.o.)한 후 recording 장치를 연결하여 본 실험과정에 순응하도록 유도하였다(Fig. 3(B)). EEG 및 EMG는 시료 경구투여 후 5분간 안정화 시킨 다음 PAL-8200 series (Pinnacle Technology Inc, Oregon, USA)를 이용하여 17:00부터 24시간동안 측정하였다. EEG 및 EMG의 sampling rate는 200 Hz로 설정하고(epoch time: 10 s), EEG는 0.1-25 Hz, EMG는 10-100 Hz의 필터 영역을 설정하여 데이터를 기록하였다. 수면구조 분석은 fast Fourier transform (FFT) 알고리즘에 의해 수행되었으며, SleepSign 프로그램(Ver. 3.0, Kissei Comtec, Nagono, Japan)을 이용하였다. 분석결과는 wake, REM sleep (rapid eye movement, theta band: 6-10 Hz), NREM sleep (non-rapid eye movement, delta band: 0.65-4 Hz)으로 구분하여 나타내었다. Sleep latency(입면시간)는 10 s epoch 단위의 NREM 수면이 12번 이상 연속적으로 나타나는데 걸리는 시간으로 설정하였다.

2) 실험결과

홍합 물 추출물(ME)의 수면증진효과를 잘 알려진 수면제인 diazepam (DZP)과 비교하였다. DZP는 benzodiazepine (BZD)으로 GABA_A-BZD receptor에 작용한다[PNAS. 98, 6464-6469. Tobler et al,, 2001].

[도 7]에 나타낸 바와 같이, 홍합 물 추출물(ME)은 500 mg/kg 농도에서는 입면시간이 감소하지 않았으나 1000 mg/kg 및 1500 mg/kg 농도에서 입면시간이 유의적(p<0.05)으로 감소하였고 수면제인 DZP 6 mg/kg 농도에서도 유의적인(p<0.01) 입면시간의 감소가 나타났다.

또한 홍합 물 추출물(ME)의 논램수면시간은 DZP 6 mg/kg 만큼 증가하지는 않았지만 농도 의존적으로 증가하였으며 500 mg/kg 농도에서는 유의성이 나타나지 않았고 1000 mg/kg 및 1500 mg/kg 농도에서 각각 34.1% 및 32.9%의 유의적(p<0.05)인 증가를 나타내었다[도 8 참조].

홍합 열수 추출물(ME) 1,500 mg/kg 및 DZP 6 mg/kg을 각각 경구투여한 후 C57BL/6N mice의 뇌파를 측정하는 동안 매 시간별 논렘 수면시간의 변화를 [도 9a] 및 [도 9b]에 나타내었다. ME는 경구 투여 후 처음 1시간 동안 논렘 수면의 유의적인(p<0.05) 증가를 나타내었고, DZP은 대조군 보다 6시간 동안 논렘 수면의 유의적인 증가를 보였다. 이러한 결과를 볼 때 ME는 수면 초반에 수면증진효과를 나타낸 후 자연적인 수면을 유도한 반면 DZP은 수면 초반에 수면증진효과를 나타내었으나 그 효과가 지속되어 수면제의 전형적인 부작용을 확인 할 수 있었다.

홍합 열수 추출물의 수면증진효과를 더욱 잘 이해하기 위해 각 수면 단계의 평균 시간(mean duration)과 뇌파 파워 밀도(EEG power density)를 확인하였다.

[도 10a] 및 [도 10b]에 따르면 ME와 DZP는 각성(Wake) 상태의 평균 시간(mean duration)이 각각 47.6% 및 69.2% 감소하였지만 논렘 수면과 렘 수면은 변화가 없었다. ME가 논렘 수면과 렘 수면의 변화 없이 각성 상태의 평균 시간을 감소시키는 것은 ME가 각성상태가 지속되는 것을 감소시켰다고 할 수 있다[Mol. Nutr. Food Res. 56, 304-308. Masaki et al., 2012].

논렘 수면 중 델타 활성(delta activity)의 변화는 수면의 질과 깊이의 생리적인 지표라 할 수 있다[Behav. Brain Res. 210, 5456. Huang et al., 2010]. 또한 DZP는 논렘 수면을 증가시키고 논렘 수면 중의 델타 파워를 감소시킨다고보고된 바 있다[PNAS. 101, 3674-3679. Kopp et al., 2004]. 이러한 전형적인 DZP의 특성은 본 연구에서도 뚜렷하게 나타났다. 예상대로 DZP은 논렘 수면 중 델타 활성을 유의적(p<0.01)으로 감소시켰으며([도 11a] 참조), ME의 델타 활성은 유의적인 변화가 나타나지 않았다([도 11b] 참조). 이러한 결과는 ME가 생리적인 수면에 영향을 끼치지 않고 NREM 수면을 증가시킨다는 것을 의미한다. 이상적인 수면제는 입면시간이 빠르게 나타나고 수면유지가 지속되며 생리적인 수면에 변화를 주지 않는 특성을 가지는 약물이다[Sleep. 31, 259-270. Alexandre et al., 2008]. 따라서 본 발명의 홍합 물 추출물(ME)은 부작용이 있는 BDZ 및 non-BDZ 약물보다 더 안전하고 자연적인 수면을 증진 시킬 수 있으리라 판단된다.

실험예 5: 홍합 추출물 분획의 진정 또는 수면 유도 효과

1) 홍합 추출물 분획의 제조

홍합을 95℃의 물에서 6 시간에서 추출하였다. 상기 추출물을 여과하고, 남은 것을 동일한 방법으로 3회 더 추출하였다. 얻어진 여액을 모두 합쳐 감압 농축하여 물 추출물을 얻었고, 얻어진 물 추출물에 7 L의 H₂O을 더한 후 n-hexane (27 L × 2) / H₂O (27 L)로 분배 추출하였고, H₂O을 다시 EtOAc (27 L × 2)로 분배 추출 후, H₂O을 다시 n-BuOH (25 L × 2)로 분배 추출하였다. 각층을 감압 농축하여, 헥산 분획(ME-HX), 에틸아세테이트 분획(ME-EA)과 부탄올 분획(ME-BT) 및 물 분획(ME-DW)을 얻었다([도 12] 참조).

2) 홍합 추출물 분획의 진정 또는 수면 유도 효과 실험결과

상기 홍합 추출물 분획의 진정 또는 수면유도 증진효과를 확인하기 위하여 각각을 250 mg/kg의 농도로 경구투여(p.o.)한 후 펜토바비탈 45 mg/kg을 복강 주사하여 입면시간과 수면시간의 변화를 확인하였다.

[도 13a] 및 [도 13b]에 따르면, ME-DW 분획물에서는 진정 또는 수면증진 효과가 전혀 나타나지 않았으며, ME-DW 분획물을 제외한 분획물 ME-HX, ME-EA 및 ME-BT에서 유의적인 입면시간의 감소(p<0.01)가 나타났다. 수면시간에서는 ME-HX 및 ME-EA 분획물에서 수면증진 효과가 유의적으로 증가(p<0.01)한 결과를 나타났으며, ME-EA 분획물 보다는 ME-HX 분획물에서 진정 및 수면증진 효과가 높은 것으로 확인되었다.

실험예 6: 홍합 추출물 헥산 분획( ME - HX )의 in vivo 작용기작

홍합 헥산 분획물(ME-HX)의 수면 용량 펜토바비탈 유도 진정 및 수면증진 효과를 알아보기 위하여 ME-HX를 25, 50, 100, 250 mg/kg의 농도로 경구투여(p.o.)한 후 펜토바비탈(45 mg/kg, i.p.)에 의한 수면유도 효과를 [도 14a] 및 [도 14b]에 나타내었다.

[도 14a] 및 [도 14b]에 따르면, ME-HX 분획물 250 mg/kg에서 유의적인 입면시간 감소(p<0.01)와 수면시간 증가(p<0.01)가 나타났으며, 25, 50 및 100 mg/kg의 농도에서는 진정 및 수면증진 효과가 나타나지 않았다.

따라서 ME-HX 분획물은 250 mg/kg의 농도에서 진정 및 수면증진 효과를 나타내는 것으로 판단할 수 있었으며, 이에 따라 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체에 작용하여 수면증진 효과를 나타낼 것으로 기대되는 ME-HX 분획물과 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 효능제인 디아제팜(DZP)의 in vivo 작용기작을 알아보기 위해 GABA_A-벤조다이아제핀 수용체 길항체인 플루마제닐(FLU)를 이용하여 동물실험을 수행하였다.

ME-HX 분획물을 200 mg/kg의 농도로 경구투여(p.o.) 하기 10 분전 8 mg/kg의 플루마제닐을 복강주사(i.p.)한 후 펜토바비탈(45 mg/kg, i.p.)로 수면을 유도하였다. 실험결과 대조군(CON)은 플루마제닐 투여에 의해 거의 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. DZP (2 mg/kg) 및 ME-HX 분획물은 기대대로 유의적인 입면시간의 감소(p<0.01)와 수면시간 증가(p<0.01)를 나타내었다. 반면에 플루마제닐을 투여 한 DZP (2 mg/kg) 및 ME-HX 분획물에서는 플루마제닐에 의한 길항작용으로 인해 유의적으로 입면시간이 증가(p<0.01)하였고 수면시간이 감소(p<0.01)하였다([도 14a] 및 [도 14b] 참조).

이러한 결과를 종합해볼 때 ME-HX 분획물은 DZP과 같이 GABA_A 수용체의 효능제로 작용하는 성분들을 함유하고 있다는 것을 의미하며, 결과적으로 홍합의 헥산(n-hexane) 분획물의 활성성분들이 GABA_A 수용체의 효능제로 작용한다는 것을 확인 할 수 있었다.

실험예 7: 통계분석

모든 실험의 결과는 평균과 표준오차(means±SEM)으로 나타내었고, 각 군과 대조구의 통계적인 비교는 Dunnet's test에 의한 One-way-analysis of variance(ANOVA)를 통해서 평가하였다. 유의 수준의 표시는 p<0.05(*), P<0.01(**), p<0.001(***) 수준에서 유의성을 보이는 결과를 별표로 표시하였다. 두 그룹간의 데이터 비교는 Unpaired Student's t-test에 의해서 분석하였고, p<0.05(#), p<0.01(##), p<0.001(###) 수준에서 두 그룹간의에 통계적으로 유의적 차이가 있음을 표시하였다. 통계분석 프로그램은 Prism 5.0 소프트웨어를 사용하여 수행하였다.

하기에 본 발명의 추출물을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

제조예 1의 홍합 물 추출물(ME) 분말 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

제조예 1의 홍합 물 추출물(ME) 분말 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

제조예 1의 홍합 물 추출물(ME) 분말 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

제조예 1의 홍합 물 추출물(ME) 분말 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO_4,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플 당 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

제조예 1의 홍합 물 추출물(ME) 분말 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강기능식품의 제조

제조예 1의 홍합 물 추출물(ME) 분말 1,000 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 mg

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강기능식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강기능식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 기능성 음료의 제조

제조예 1의 홍합 물 추출물(ME) 분말 1,000 mg

구연산 1,000 mg

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 mL

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1 시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 기능성 음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

홍합(Mytilus edulis), 꼬막(Tegillarca granosa) 및 백합(Mercenaria stimpsoni) 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 패류의 추출물을 유효성분으로 하는 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 또는 불면증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 패류 추출물은 GABA(감마-아미노부티르산) A형-벤조다이아제핀 수용체를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 또는 불면증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 패류는 홍합(Mytilus edulis)인 것을 특징으로 하는 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 또는 불면증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 패류 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매에 의한 패류 추출물인 것을 특징으로 하는 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 또는 불면증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 패류 추출물은 40 ~ 100℃의 물로 2 ~ 48시간 동안 추출하여 제조하는 패류 물 추출물인 것을 특징으로 하는 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 또는 불면증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 패류 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매에 의한 패류 추출물을 유기용매로 재분획한 분획물인 것을 특징으로 하는 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 또는 불면증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 유기용매는 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 헥산, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 및 디에틸에테르로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 또는 불면증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 유기용매는 헥산 또는 에틸아세테이트인 것을 특징으로 하는 항불안, 항경련(anti-convulsant), 진정 또는 불면증 치료 또는 예방용 약학 조성물.
홍합(Mytilus edulis), 꼬막(Tegillarca granosa) 및 백합(Mercenaria stimpsoni) 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 패류의 추출물을 유효성분으로 하는 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 또는 수면 유도 또는 개선용 식품 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 패류 추출물은 GABA(감마-아미노부티르산) A형-벤조다이아제핀 수용체를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 또는 수면 유도 또는 개선용 식품 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 패류는 홍합(Mytilus edulis)인 것을 특징으로 하는 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 또는 수면 유도 또는 개선용 식품 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 패류 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매에 의한 패류 추출물인 것을 특징으로 하는 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 또는 수면 유도 또는 개선용 식품 조성물.
제 12 항에 있어서, 상기 패류 추출물은 40 ~ 100℃의 물로 2 ~ 48시간 동안 추출하여 제조하는 패류 물 추출물인 것을 특징으로 하는
제 12 항에 있어서, 상기 패류 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매에 의한 패류 추출물을 헥산 또는 에틸아세테이트로 재분획한 분획물인 것을 특징으로 하는 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 또는 수면 유도 또는 개선용 식품 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 조성물은 정제, 산제, 과립제 및 캅셀제 중에서 어느 하나의 형태로 제제화 된 건강기능식품인 것을 특징으로 하는 불안 완화, 경련 개선, 진정 작용, 또는 수면 유도 또는 개선용 식품 조성물.