WO2014030972A1 - 항암용 조성물 - Google Patents

항암용 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2014030972A1
WO2014030972A1 PCT/KR2013/007591 KR2013007591W WO2014030972A1 WO 2014030972 A1 WO2014030972 A1 WO 2014030972A1 KR 2013007591 W KR2013007591 W KR 2013007591W WO 2014030972 A1 WO2014030972 A1 WO 2014030972A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
combination
hmf
phe
effect
met
Prior art date
Application number
PCT/KR2013/007591
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
서성은
김선화
박유진
양혜영
Original Assignee
주식회사 노암
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 노암 filed Critical 주식회사 노암
Publication of WO2014030972A1 publication Critical patent/WO2014030972A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/155—Amidines (), e.g. guanidine (H2N—C(=NH)—NH2), isourea (N=C(OH)—NH2), isothiourea (—N=C(SH)—NH2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/34—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having five-membered rings with one oxygen as the only ring hetero atom, e.g. isosorbide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention (1) biguanide compound (biguanide) compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof; (2) 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And (3) 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and / or citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. It relates to a food composition for the prevention or amelioration of cancer, and a method for preventing or treating cancer comprising administering the anticancer composition to a subject.
  • cancer treatment which accounts for most of the causes of death, includes surgery, radiation therapy, biotherapy and chemotherapy.
  • chemotherapy using anticancer agents is currently used for cancer treatment and is one of well-established treatment methods.
  • anticancer agents intervene in the metabolic pathways of cancer cells to block the replication, transcription, and translation processes of DNA, interfere with the synthesis of nucleic acid precursors, and inhibit cell division by direct interaction with DNA.
  • the anticancer agent causes fatal damage to normal cells, such as leukopenia, platelets, erythrocytes caused by bone marrow destruction; Hair loss due to hair follicle destruction; Side effects on the ovaries and testes, causing menstrual irregularities and male infertility; Side effects from the destruction of mucous membrane cells of the digestive system, including stomatitis, nausea and vomiting and digestive disorders; Diarrhea symptoms; Nephrotoxicity due to tubular necrosis; Peripheral neuritis and weakness caused by nervous system disorders; Vascular disorders such as vascular pain and rash; Various side effects occur, including skin and nail discoloration. Therefore, research to increase the therapeutic effect while minimizing the side effects caused by anticancer drugs is urgently needed.
  • the anti-cancer drug is effective initially, but gradually develops drug resistance, and the immunity is extremely deteriorated. Therefore, there is a need for a method for improving the efficacy of cancer treatment without increasing the toxicity of the drug.
  • the combination of anticancer drugs can be used in one way to enhance the efficacy of anticancer drugs.
  • combining anticancer drugs is not expected to be synergistic, and finding a combination of drugs that have a synergistic effect is very unlikely. It is difficult. Therefore, it is urgent to develop an anticancer combination agent that can maximize the anticancer effect while minimizing the side effects of the anticancer agent.
  • the present inventors have made diligent efforts to find anti-cancer substances that have no side effects on the human body by minimizing the concentration of the cancer while maximizing the therapeutic effect of cancer, and have developed a combination formulation showing anti-cancer synergistic effects through the combination of specific compounds.
  • the present invention was completed by confirming that the combination preparation inhibited the cell cycle even at low concentrations of the compound and activated AMPK (AMP-activated kinase) to effectively kill cancer cells.
  • AMPK AMP-activated kinase
  • One object of the present invention is to provide an anticancer composition that can effectively treat cancer in a small amount, and exhibits a specific toxic effect on cancer cells, thereby reducing side effects.
  • Another object of the present invention is to provide a food composition for the prevention or improvement of cancer.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating cancer, comprising administering the anticancer composition to an individual in need thereof.
  • the anticancer composition of the present invention exhibits a synergistic anticancer effect through a combination of specific drugs that must be used in an excessive amount, thereby activating AMPK (AMP-activated kinase) in a small amount, thereby effectively inhibiting cancer cell death and cell cycle, thereby effectively treating cancer.
  • AMPK AMP-activated kinase
  • the anticancer composition of the present invention may be useful as an anticancer agent because it exhibits toxic effects specifically to cancer cells without showing toxicity to normal cells, and can kill cancer cells without side effects.
  • Figure 1 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of treatment of each single agent and combination of HMF, MET, 2DG and CT by concentration to HepG2 cell line, a cancer cell derived from human liver, by concentration to be.
  • the vertical bar at each point represents the standard error.
  • FIG. 2 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of treatment with HMF, MET, 2DG and CT by dose for HepG2 cell line.
  • the vertical bar of each bar represents the standard error (t-test of experimental and control groups: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001. T-test between combination groups: ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 3 is a Fa-CI graph showing the combination index (CI) for Fa (Fraction Affected) when HMF, MET, 2DG and CT were combined for HepG2 cell lines (4 combination groups (HMF / MET / 2DG /). T-test with CT): * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.Two combinations (MET / 2DG) and three combinations (HMF / MET / 2DG, MET / 2DG T-test between (CT): ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 4 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of treatment with concentrations of each single and combination of HMF, PHE, 2DG and CT against HepG2 cell lines. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • FIG. 5 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of treatment with HMF, PHE, 2DG and CT by dose for HepG2 cell line.
  • the vertical bar of each bar represents the standard error (t-test of experimental and control groups: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001. T-test between combination groups: ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 6 shows dose-treated HMF, PHE, 2DG and CT for HepG2 cell lines, showing how much lower drug toxicity of PHE corresponding to 50% cancer inhibition rate in single and combination compositions by MTT assay after 48 hours. Concentration comparison graph.
  • FIG. 7 is a Fa-CI graph showing the Combination Index (CI) for Fa (Fraction Affected) when HMF, PHE, 2DG and CT were combined for HepG2 cell lines (4 combination groups (HMF / PHE / 2DG /). T-test with CT): * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.Two combination groups (PHE / 2DG) and three combination groups (HMF / PHE / 2DG, PHE / 2DG T-test between (CT): ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 8 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours by treating concentrations of single and combination agents of HMF, MET, 2DG, and CT with respect to A549 cell line, which is a cancer cell derived from human lung. to be.
  • the vertical bar at each point represents the standard error.
  • FIG. 9 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of HMF, MET, 2DG and CT treatment for A549 cell line.
  • the vertical bar of each bar represents the standard error (t-test of experimental and control groups: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001. T-test between combination groups: ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 10 is a Fa-CI graph showing the Combination Index (CI) for Fa (Fraction Affected) when HMF, MET, 2DG, and CT were combined for the A549 cell line (4 combination groups (HMF / MET / 2DG /). T-test with CT): * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.Two combinations (MET / 2DG) and three combinations (HMF / MET / 2DG, MET / 2DG T-test between (CT): ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 11 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of treatment with concentrations of each single formulation and combination formulation of HMF, PHE, 2DG and CT against A549 cell line. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • FIG. 12 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of HMF, PHE, 2DG and CT treatment for A549 cell line.
  • the vertical bar of each bar represents the standard error (t-test of experimental and control groups: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001. T-test between combination groups: ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 13 shows dose-treated HMF, PHE, 2DG and CT for A549 cell line, showing how much lower drug toxicity of PHE corresponding to 50% cancer inhibition rate in single and combination compositions by MTT assay after 48 hours. Concentration comparison graph.
  • FIG. 14 is a Fa-CI graph showing the Combination Index (CI) for Fa (Fraction Affected) when HMF, PHE, 2DG and CT were combined for the A549 cell line (4 combination groups (HMF / PHE / 2DG /). T-test with CT): * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.Two combination groups (PHE / 2DG) and three combination groups (HMF / PHE / 2DG, PHE / 2DG T-test between (CT): ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 15 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of treatment of each single agent and combination agent of HMF, MET, 2DG and CT by concentration with respect to AGS cell line, which is a cancer cell derived from the human stomach. .
  • the vertical bar at each point represents the standard error.
  • FIG. 16 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of HGS, MET, 2DG and CT treatment for AGS cell lines.
  • the vertical bar of each bar represents the standard error (t-test of experimental and control groups: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001. T-test between combination groups: ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 17 is a Fa-CI graph showing the combination index (CI) for Fa (Fraction Affected) when HMF, MET, 2DG, and CT were combined for AGS cell lines (4 combination groups (HMF / MET / 2DG /). T-test with CT): * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.Two combinations (MET / 2DG) and three combinations (HMF / MET / 2DG, MET / 2DG T-test between (CT): ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 18 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of treatment with concentrations of each single and combination formulation of HMF, PHE, 2DG and CT against AGS cell lines. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • FIG. 19 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours with HMF, PHE, 2DG and CT for AGS cell lines.
  • the vertical bar of each bar represents the standard error (t-test of experimental and control groups: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001. T-test between combination groups: ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 20 shows dose-treated HMF, PHE, 2DG and CT for AGS cell lines, showing how much lower drug toxicity of PHE corresponding to 50% cancer inhibition rate in single and combination compositions by MTT assay after 48 hours. Concentration comparison graph.
  • FIG. 21 is a Fa-CI graph showing the Combination Index (CI) for Fa (Fraction Affected) when HMF, PHE, 2DG and CT were combined for AGS cell lines (4 combination groups (HMF / PHE / 2DG /). T-test with CT): * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.Two combination groups (PHE / 2DG) and three combination groups (HMF / PHE / 2DG, PHE / 2DG T-test between (CT): ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 22 shows the percentage of cell viability by MTT assay in 48 hours after treatment with concentrations of single and combination agents of HMF, MET, 2DG, and CT for capan-2 cell line, which is a cancer cell derived from human pancreas.
  • FIG. 23 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of HMF, MET, 2DG and CT treatment for Capan-2 cell lines.
  • the vertical bar of each bar represents the standard error (t-test of experimental and control groups: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001. T-test between combination groups: ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 24 is a Fa-CI graph showing the Combination Index (CI) for Fa (Fraction Affected) when HMF, MET, 2DG, and CT were combined for Capan-2 cell lines (4 combination groups (HMF / MET / T-test with 2DG / CT): * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.Two combinations (MET / 2DG) and three combinations (HMF / MET / 2DG, MET T-test between 2DG / CT): ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • CI Combination Index
  • FIG. 25 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of treatment with concentrations of each single and combination of HMF, PHE, 2DG and CT against Capan-2 cell lines. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • FIG. 26 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of HMF, PHE, 2DG, and CT treatment for each Capan-2 cell line.
  • the vertical bar of each bar represents the standard error (t-test of experimental and control groups: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001. T-test between combination groups: ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 27 shows dose-dependent treatment of HMF, PHE, 2DG and CT for Capan-2 cell lines to lower the drug toxicity of PHE corresponding to 50% cancer inhibition rate in single and combination compositions by MTT assay after 48 hours. It is a concentration comparison graph showing whether there is.
  • FIG. 28 is a Fa-CI graph showing the Combination Index (CI) for Fa (Fraction Affected) when HMF, PHE, 2DG, and CT were combined for Capan-2 cell lines (4 combination groups (HMF / PHE / T-test with 2DG / CT): * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.Two combination groups (PHE / 2DG) and three combination groups (HMF / PHE / 2DG, PHE) T-test between 2DG / CT): ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 29 shows the percentage of cell viability by MTT assay in 48 hours after treatment with concentrations of single and combination agents of HMF, MET, 2DG and CT for DLD-1 cell line, which is a cancer cell derived from human colon, by concentration.
  • FIG. 30 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of treatment with HMF, MET, 2DG and CT for each DLD-1 cell line by dose.
  • the vertical bar of each bar represents the standard error (t-test of experimental and control groups: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001. T-test between combination groups: ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 31 is a Fa-CI graph showing the Combination Index (CI) for Fa (Fraction Affected) when HMF, MET, 2DG, and CT were combined for the DLD-1 cell line (4 combination groups (HMF / MET / T-test with 2DG / CT): * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.Two combinations (MET / 2DG) and three combinations (HMF / MET / 2DG, MET T-test between 2DG / CT): ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • CI Combination Index
  • FIG. 32 is a graph showing the percentage cell viability by MTT assay after 48 hours of treatment with concentrations of each single and combination of HMF, PHE, 2DG and CT against DLD-1 cell lines. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • FIG. 33 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of treatment with HMF, PHE, 2DG and CT for each DLD-1 cell line.
  • the vertical bar of each bar represents the standard error (t-test of experimental and control groups: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001. T-test between combination groups: ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 34 shows the dose-dependent treatment of HMF, PHE, 2DG and CT for DLD-1 cell lines to lower the drug toxicity of PHE corresponding to 50% cancer inhibition rate in single and combination compositions by MTT assay after 48 hours. It is a concentration comparison graph showing whether there is.
  • FIG. 35 is a Fa-CI graph showing the Combination Index (CI) for Fa (Fraction Affected) when HMF, PHE, 2DG, and CT were combined for DLD-1 cell line (4 combination groups (HMF / PHE / T-test with 2DG / CT): * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.Two combination groups (PHE / 2DG) and three combination groups (HMF / PHE / 2DG, PHE) T-test between 2DG / CT): ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • HeLa cell line which is a cancer cell derived from the human cervix. It is a graph. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • FIG. 37 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of treatment with HMF, MET, 2DG and CT for each dose of HeLa cell line.
  • the vertical bar of each bar represents the standard error (t-test of experimental and control groups: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001. T-test between combination groups: ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 38 is a Fa-CI graph showing the combination index (CI) for Fa (Fraction Affected) when HMF, MET, 2DG, and CT were combined for HeLa cell lines (4 combination groups (HMF / MET / 2DG / T-test with CT): * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.Two combinations (MET / 2DG) and three combinations (HMF / MET / 2DG, MET / 2DG T-test between (CT): ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 39 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours with HeLa cell lines treated with concentrations of each single formulation and combination of HMF, PHE, 2DG and CT. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • FIG. 40 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of treatment with HMF, PHE, 2DG and CT for each dose of HeLa cell line.
  • the vertical bar of each bar represents the standard error (t-test of experimental and control groups: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001. T-test between combination groups: ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 41 shows how dose-treated HMF, PHE, 2DG and CT for HeLa cell lines can be used to lower drug toxicity of PHE corresponding to 50% cancer inhibition rate in single and combination compositions by MTT assay after 48 hours. Concentration comparison graph.
  • FIG. 42 is a Fa-CI graph showing the Combination Index (CI) for Fa (Fraction Affected) when HMF, PHE, 2DG and CT were combined for HeLa cell lines (4 combination groups (HMF / PHE / 2DG /). T-test with CT): * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.Two combination groups (PHE / 2DG) and three combination groups (HMF / PHE / 2DG, PHE / 2DG T-test between (CT): ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • MCF7 cell line which is a cancer cell derived from human breast. to be.
  • the vertical bar at each point represents the standard error.
  • FIG 44 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of HMF, MET, 2DG and CT treatment for MCF7 cell line.
  • the vertical bar of each bar represents the standard error (t-test of experimental and control groups: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001. T-test between combination groups: ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 45 is a Fa-CI graph showing the Combination Index (CI) for Fa (Fraction Affected) when HMF, MET, 2DG, and CT were combined for the MCF7 cell line (4 combination groups (HMF / MET / 2DG / T-test with CT): * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.Two combinations (MET / 2DG) and three combinations (HMF / MET / 2DG, MET / 2DG T-test between (CT): ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • CI Combination Index
  • FIG. 46 is a graph showing the percentage cell viability by MTT assay after 48 hours of treatment of each single formulation and combination formulation of HMF, PHE, 2DG and CT against the MCF7 cell line by concentration. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • 47 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of HMF, PHE, 2DG and CT treatment for MCF7 cell line.
  • the vertical bar of each bar represents the standard error (t-test of experimental and control groups: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001. T-test between combination groups: ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 48 shows dose-treated HMF, PHE, 2DG and CT for MCF7 cell line, showing how much lower drug toxicity of PHE corresponding to 50% cancer inhibition rate in single and combination compositions by MTT assay after 48 hours. Concentration comparison graph.
  • FIG. 49 is a Fa-CI graph showing the Combination Index (CI) for Fa (Fraction Affected) when HMF, PHE, 2DG, and CT were combined for MCF7 cell line (4 combination groups (HMF / PHE / 2DG /). T-test with CT): * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.Two combination groups (PHE / 2DG) and three combination groups (HMF / PHE / 2DG, PHE / 2DG T-test between (CT): ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 50 shows the percentage of cell viability by MTT assay in 48 hours after treatment with concentrations of single and combined formulations of HMF, MET, 2DG and CT for PC-3 cell line, a cancer cell derived from human prostate. The graph shown. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • FIG. 51 is a graph showing the percentage cell viability by MTT assay after 48 hours of HMF, MET, 2DG and CT treatment for PC-3 cell lines.
  • the vertical bar of each bar represents the standard error (t-test of experimental and control groups: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001. T-test between combination groups: ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 52 is a Fa-CI graph showing the Combination Index (CI) for Fa (Fraction Affected) when HMF, MET, 2DG, and CT were combined for the PC-3 cell line (4 combination groups (HMF / MET / T-test with 2DG / CT): * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.Two combinations (MET / 2DG) and three combinations (HMF / MET / 2DG, MET T-test between 2DG / CT): ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • CI Combination Index
  • FIG. 53 is a graph showing the percentage cell viability by MTT assay after 48 hours of treatment of each single formulation and combination formulation of HMF, PHE, 2DG, and CT against the PC-3 cell line by concentration. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • FIG. 54 is a graph showing the percentage cell viability by MTT assay after 48 hours of HMF, PHE, 2DG and CT treatment for PC-3 cell line.
  • the vertical bar of each bar represents the standard error (t-test of experimental and control groups: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001. T-test between combination groups: ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 55 shows dose-dependent treatment of HMF, PHE, 2DG and CT for PC-3 cell lines to lower drug toxicity of PHE corresponding to 50% cancer inhibition rate in single and combination compositions by MTT assay after 48 hours. It is a concentration comparison graph showing whether there is.
  • FIG. 56 is a Fa-CI graph showing the Combination Index (CI) for Fa (Fraction Affected) when HMF, PHE, 2DG, and CT were combined for the PC-3 cell line (4 combination groups (HMF / PHE / T-test with 2DG / CT): * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.Two combination groups (PHE / 2DG) and three combination groups (HMF / PHE / 2DG, PHE) T-test between 2DG / CT): ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 57 shows the cell survival rate by MTT assay after 48 hours by treating each single agent and combination agent of HMF, MET, 2DG and CT by concentration with respect to SK-OV-3 cell line, which is a cancer cell derived from human ovary. It is a graph expressed as a percentage. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • FIG. 58 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of treatment with HMF, MET, 2DG, and CT for each SK-OV-3 cell line.
  • the vertical bar of each bar represents the standard error (t-test of experimental and control groups: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001. T-test between combination groups: ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 59 is a Fa-CI graph showing a combination index (CI) for Fa (Fraction Affected) when HMF, MET, 2DG, and CT were combined with SK-OV-3 cell line (4 combination groups (HMF / T-test with MET / 2DG / CT): * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.Two combination groups (MET / 2DG) and three combination groups (HMF / MET / 2DG , MET / 2DG / CT): ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 60 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of treatment of each single agent and combination of HMF, PHE, 2DG and CT for each SK-OV-3 cell line by concentration.
  • the vertical bar at each point represents the standard error.
  • FIG. 61 is a graph showing the percentage of cell survival by MTT assay after 48 hours with HMF, PHE, 2DG, and CT treatment by dose for SK-OV-3 cell line.
  • the vertical bar of each bar represents the standard error (t-test of experimental and control groups: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001. T-test between combination groups: ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001)
  • FIG. 62 shows the drug toxicity of PHE corresponding to 50% cancer inhibition rate in single and combination compositions by MTT assay after 48 hours by HMF, PHE, 2DG and CT treatment dose-wise for SK-OV-3 cell line. It is a concentration comparison graph that shows if it can be lowered.
  • FIG. 63 is a Fa-CI graph showing the Combination Index (CI) for Fa (Fraction Affected) when HMF, PHE, 2DG and CT were combined for SK-OV-3 cell line (4 combination groups (HMF / T-test with PHE / 2DG / CT): * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.Two combination groups (PHE / 2DG) and three combination groups (HMF / PHE / 2DG T-test between PHE / 2DG / CT): ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 64 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of treatment of T24 cell line, which is a cancer cell derived from human bladder, with concentrations of each single agent and combination agent of HMF, MET, 2DG and CT by concentration. to be. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • FIG. 65 is a graph showing the percentage of cell viability by MTT assay after 48 hours of treatment with HMF, MET, 2DG and CT for each T24 cell line.
  • the vertical bar of each bar represents the standard error (t-test of experimental and control groups: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001. T-test between combination groups: ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 66 is a Fa-CI graph showing the Combination Index (CI) for Fa (Fraction Affected) when HMF, MET, 2DG, and CT were combined for a T24 cell line (4 combination groups (HMF / MET / 2DG /). T-test with CT): * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.Two combinations (MET / 2DG) and three combinations (HMF / MET / 2DG, MET / 2DG T-test between (CT): ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 67 is a graph showing percent cell viability by MTT assay after 48 hours of treatment with concentrations of single and combined formulations of HMF, PHE, 2DG and CT for T24 cell lines, respectively. The vertical bar at each point represents the standard error.
  • FIG. 68 is a graph showing the percentage cell viability by MTT assay after 48 hours of treatment with HMF, PHE, 2DG and CT for T24 cell lines by dose.
  • the vertical bar of each bar represents the standard error (t-test of experimental and control groups: * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001. T-test between combination groups: ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 69 shows how dose-treated HMF, PHE, 2DG and CT were treated for T24 cell lines to lower drug toxicity of PHE corresponding to 50% cancer inhibition rate in single and combination compositions by MTT assay after 48 hours. Concentration comparison graph.
  • FIG. 70 is a Fa-CI graph showing the Combination Index (CI) for Fa (Fraction Affected) when HMF, PHE, 2DG and CT were combined for T24 cell line (4 combination groups (HMF / PHE / 2DG / T-test with CT): * p ⁇ 0.05; ** p ⁇ 0.01; *** p ⁇ 0.001.Two combination groups (PHE / 2DG) and three combination groups (HMF / PHE / 2DG, PHE / 2DG T-test between (CT): ⁇ p ⁇ 0.05; ⁇ p ⁇ 0.01; ⁇ p ⁇ 0.001).
  • FIG. 71 shows proliferation of HepG2 cells when HMF, MET, 2DG and CT were treated for 24, 48 and 72 hours with each single agent and combination agent at a concentration of 3.5: 25: 1: 3 mM for HepG2 cell line. It is a graph showing the effect. The vertical bar on each bar represents the standard error.
  • FIG. 72 shows the proliferation of HepG2 cells when HMF, PHE, 2DG and CT were treated for 24, 48 and 72 hours at a concentration of 3.5: 0.8: 1: 3 mM for each HepG2 cell line. It is a graph showing the effect. The vertical bar on each bar represents the standard error.
  • 73 is a graph showing the cell cycle distribution by flow cytometry after incubating the HepG2 cells with the HMF, MET, 2DG, and CT combination preparations for 24 hours and the control cells without the HepG2 cell line.
  • the vertical bar on each bar represents the standard error.
  • FIG. 74 shows HMF, MET, 2DG, and CT for HepG2 cell lines treated with each single agent and combination formulation for 36 hours of incubation followed by cell lysate and which proteins were affected. will be.
  • FIG. 75 shows the cell survival after treatment of HMF, MET, 2DG, and CT combinations with normal hepatocyte CHANG and hepatocellular HepG2 for 48 hours at 50% cancer suppression concentration for HepG2 cell line.
  • the vertical bar on each bar represents the standard error.
  • FIG. 76 shows the cell viability after treatment of HMF, PHE, 2DG, and CT combinations with normal hepatocyte CHANG and hepatocellular HepG2 48 hours at 50% cancer suppression concentration for HepG2 cell line.
  • the vertical bar on each bar represents the standard error.
  • FIG. 77 is a graph measuring the degree of AMPK activation after 36 hours of incubation of HMF, MET, 2DG, and CT for each HepG2 cell line treated with a single formulation and a combination formulation.
  • the vertical bar on each bar represents the standard error.
  • FIG. 78 is a graph measuring the degree of AMPK activation after 36 hours of incubation of HMF, PHE, 2DG, and CT for each HepG2 cell line treated with a single formulation and a combination formulation.
  • the vertical bar on each bar represents the standard error.
  • the present invention is (1) biguanide compound (biguanide) compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof; (2) 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And (3) 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and / or citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a composition comprising: (1) a biguanide compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof; (2) 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And (3) 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and / or citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. Or it provides a food composition for improvement.
  • the present invention provides a composition
  • a composition comprising: (1) a biguanide compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof; (2) 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And (3) 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and / or citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. It is about.
  • biguanide compound biguanide compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof
  • 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof
  • 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof and / or a combination formulation comprising Citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • Combination formulations of the present invention may use less amount of individual compounds included in the combination formulation than when treated with a single compound, thereby significantly reducing the risk and / or severity of side effects and significantly reducing the overall effect of the treatment. There is an advantage to increase.
  • 5-hydroxymethylfurfural is a food additive added as a flavoring agent in fruit juice, food, and liquor processing, and is a decomposition product easily made from polysaccharides such as sugar in the food manufacturing process step. It is a commonly consumed substance.
  • 5-hydroxymethylfurfural has the structure of Formula 1.
  • 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof is a biguanide compound (methformin or phenformin) or a pharmaceutically acceptable salt thereof, 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutical thereof. It has been found that the combination of an acceptable salt, and / or citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof effectively induces death of cancer cells.
  • 5-hydroxymethylfurfural is a very safe compound (National Technical Information Service). Vol. OTS0544683).
  • biguanide-based compound metformin or phenformin is known as a diabetes treatment (Table 1), which is represented by the following formula (2).
  • metformin When oral administration of metformin to rats, LD 50 was 1,450 mg / kg, indicating that metformin was a very safe compound (Gekkan Yakuji.Pharmaceuticals Monthly.Vol. 9, Pg. 759, 1967). .
  • phenformin was developed in the late 1950s as an oral diabetic drug, and was intended to be used for the treatment of insulin-independent diabetes (type 2 diabetes). Prohibited.
  • the present invention relates to 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof, in phenformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and And / or a composition comprising three or more compounds combining citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, wherein the composition is a phenformin single agent or a combination of two compounds, phenformin and 2-deoxy- It has been shown that even at a much lower concentration than the composition containing D-glucose, it has a high anticancer effect, effectively reducing the side effects of phenformin (FIGS. 6, 13, 20, 27, 34, 41, and 41). 48, 55, 62, 69).
  • 2-deoxy-D-glucose (2-deoxy-D-glucose) can be used as an inhibitor of glycolysis, which has a structure represented by the formula (3).
  • 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof is 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof and biguanide compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Possible salts, and / or combinations with citric acid or its pharmaceutically acceptable salts have been shown to exhibit high anticancer effects at low concentrations.
  • 2-deoxy-D-glucose is a derivative of glucose that prevents glycolysis in glucose metabolism and inhibits glycosylation of proteins in the endoplasmic reticulum and induces vesicle stress.
  • 2-deoxy-D-glucose an inhibitor of glucose degradation, did not appear to kill cancer cells by itself, but it has been shown to be very useful in anti-cancer cancer because of its sensitizing effect on cancer cells.
  • citric acid (citric acid) can be used as an inhibitor of glycolysis, which has a structure represented by the formula (4).
  • Citric acid or pharmaceutically acceptable salts thereof biguanide compounds or pharmaceutically acceptable salts thereof and 2-deoxy-D-glucose or pharmaceutically acceptable salts thereof, and / or 5
  • a high anticancer effect was seen even at low concentrations.
  • citric acid was found to be a very safe compound (Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics.Vol. 94, Pg. 65, 1948.).
  • 5-hydroxymethylfurfural, biguanide-based compound, 2-deoxy-D-glucose and citric acid may each be present in the form of a pharmaceutically acceptable salt.
  • salts are acid addition salts formed with pharmaceutically acceptable free acids.
  • a "pharmaceutically acceptable salt” is a concentration that has a relatively nontoxic and harmless effective action in a patient, and the side effects resulting from this salt are 5-hydroxymethylfurfural, biguanide-based compounds, 2 Any organic or inorganic addition salt that does not degrade the beneficial efficacy of deoxy-D-glucose and citric acid.
  • Acid addition salts are prepared by conventional methods, for example by dissolving a compound in an excess of aqueous acid solution and precipitating the salt using a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile. Equivalent molar amounts of the compound and acid or alcohol (eg, glycol monomethyl ether) in water can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered.
  • a water miscible organic solvent such as methanol, ethanol, acetone or acetonitrile.
  • Equivalent molar amounts of the compound and acid or alcohol (eg, glycol monomethyl ether) in water can be heated and the mixture can then be evaporated to dryness or the precipitated salts can be suction filtered.
  • an organic acid and an inorganic acid may be used as the free acid, and hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, nitric acid, tartaric acid, and the like may be used as the inorganic acid, and methanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, acetic acid, and trifluoroacetic acid may be used as the organic acid.
  • Bases can also be used to make pharmaceutically acceptable metal salts.
  • Alkali metal salts or alkaline earth metal salts are obtained, for example, by dissolving a compound in an excess of alkali metal hydroxide or alkaline earth metal hydroxide solution, filtering the insoluble compound salt, and then evaporating and drying the filtrate.
  • the metal salt it is particularly suitable to prepare sodium, potassium or calcium salt, but is not limited thereto.
  • Corresponding silver salts may also be obtained by reacting alkali or alkaline earth metal salts with a suitable silver salt (eg, silver nitrate).
  • pharmaceutically acceptable salts may include sodium, calcium and potassium salts of the hydroxy group
  • other pharmaceutically acceptable salts of the amino group include hydrobromide, sulfate, hydrogen sulphate, phosphate, Hydrogen phosphate, dihydrogen phosphate, acetate, succinate, citrate, tartrate, lactate, mandelate, methanesulfonate (mesylate) and p-toluenesulfonate (tosylate) salts and the like, and are known in the art. It may be prepared through a method for preparing a salt.
  • metformin hydrochloride metformin succinate, metformin citrate or phenformin hydrochloride, penformin succinate, phenformin citric acid and the like are possible, but are not limited thereto.
  • the citrate salt of the present invention is a pharmaceutically acceptable salt, any citric acid salt exhibiting an anticancer effect equivalent to citric acid can be used, preferably sodium citrate, potassium citrate, calcium citrate, ammonium citrate, magnesium citrate, etc. However, it is not limited thereto.
  • the 5-hydroxymethylfurfural, biguanide-based compound, 2-deoxy-D-glucose, and citric acid of the present invention also include derivatives thereof.
  • derivatives refers to a compound prepared by chemically changing a part of the compound, for example, introducing, replacing, or deleting a functional group, so long as the anticancer activity of the compound does not change. May be included.
  • One embodiment of the preferred anticancer composition in the present invention is 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof, 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and biguanide-based compound or A composition comprising a pharmaceutically acceptable salt thereof;
  • a composition comprising 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof, citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and a biguanide compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof;
  • 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof, citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and biguanide-based compound or thereof It may be a composition comprising a pharmaceutically acceptable salt.
  • the biguanide-based compound may be metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof, or phenformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the anticancer composition of the present invention is 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof, 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a composition comprising a possible salt, and metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof;
  • a composition comprising 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof, citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and metformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof;
  • 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof, citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and metformin or a pharmaceutical thereof It may be a composition comprising an acceptable salt.
  • the anticancer composition of the present invention is 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof, 5-hydroxymethylfurfural or its A composition comprising a pharmaceutically acceptable salt and phenformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof; A composition comprising 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof, citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and phenformin or a pharmaceutically acceptable salt thereof; 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof, citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and phenformin or its It may be a composition comprising a pharmaceutically acceptable salt.
  • the anticancer composition of the present invention is 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof, citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof, 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • a composition comprising an acceptable salt and a biguanide compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • biguanide compounds biguanide compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof
  • 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof
  • 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof and / or a combination of three or more compounds consisting of Citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the agent can inhibit cell proliferation by reducing cell proliferation of cancer cell lines, inhibiting G1 / S and G2 / M cell cycle progression, and inhibiting DNA synthesis of cancer cells (Example 2- 2).
  • biguanide compounds or pharmaceutically acceptable salts thereof (2) 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And (3) 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and / or a combination of three or more compounds consisting of Citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • synergistic anti-cancer effect was observed due to the combination of the compounds, and the 50% cancer suppression concentration was decreased, indicating that the drug reduction index of each compound was significantly reduced (Example 1).
  • each of 5-hydroxymethylfurfural, biguanide-based compound, 2-deoxy-D-glucose and citric acid should be used in excess due to insufficient anticancer effect when used as a single agent.
  • a combination preparation in combination it was confirmed that cancer cells can be effectively killed even in a small amount.
  • the combination preparation of 5-hydroxymethylfurfural / metformin / 2-deoxy-D-glucose is 50% cancer inhibitory than the single preparation of each compound, the combination preparation containing two compounds and the combination preparation of 5-hydroxymethylfurfural / methformin / citric acid. The reduction effect of was high.
  • a combination preparation of 5-hydroxymethylfurfural / phenformin / 2-deoxy-D-glucose a combination preparation of phenformin / 2-deoxy-D-glucose / citric acid, 5-hydroxymethylfur Combination formulations of fural / phenformin / 2-deoxy-D-glucose / citric acid are more effective than single formulations, combination formulations containing two compounds and combination formulations of 5-hydroxymethylfurfural / phenformin / citric acid.
  • the effect of reducing 50% cancer suppression concentration was high.
  • the combination molar ratio of each compound is not particularly limited.
  • Acceptable salts The combined molar ratio of citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof may range from 1: 2 (0.05 as phenformin) to 0.05: 0.3 to 1:30 (1.5 as phenformin): 3: 5
  • the combination molar ratio may vary depending on the type of cancer being treated. (The values in parentheses below are the molar ratios of phenformin or their pharmaceutically acceptable salts.)
  • 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof metformin, phenformin, or a pharmaceutically acceptable salt thereof: 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof
  • Possible salts The combined molar ratio of citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof is 1: 3 (0.05): 0.1: 0.4 to 1:14 (0.5): 0.6: 2, preferably 1: 7 (0.2): in liver cancer cell lines.
  • the combination index molar ratio of the combination index of metformin or phenformin, 2-deoxy-D-glucose and citric acid is higher than the 5-hydroxymethylfurfural concentration, the synergistic effect increases, but a high concentration of metformin or phenformin, 2-deoxy It is preferable to determine the combination index molar ratio in consideration of the toxicity by -D-glucose and citric acid.
  • Combination formulations of 5-hydroxymethylfurfural, metformin or phenformin, 2-deoxy-D-glucose and citric acid at these combination molar ratios show a combination index (CI) corresponding to a synergistic effect and much higher than a single formulation. Low drug reduction index.
  • cancer refers to a disease associated with cell death control, and refers to a disease caused by excessive proliferation of cells when a normal apoptotic balance is broken. These abnormally overproliferating cells sometimes invade surrounding tissues and organs to form masses and destroy or modify the normal structure of the body, which is called cancer.
  • tumor refers to a mass grown abnormally by autonomous overgrowth of body tissues, and may be classified into a benign tumor and a malignant tumor. Malignant tumors grow much faster than benign tumors, and metastasis occurs as they infiltrate surrounding tissues, thereby threatening life.
  • malignant tumors are commonly referred to as 'cancer', and the types of cancer are cerebral spinal cord tumor, brain cancer, head and neck cancer, lung cancer, breast cancer, thymic tumor, esophageal cancer, cancer, colon cancer, liver cancer, pancreatic cancer, biliary tract cancer and kidney cancer.
  • the anticancer composition of the present invention can be used without limitation to the type of cancer, but for the purposes of the present invention selected from the group consisting of liver cancer, lung cancer, stomach cancer, pancreatic cancer, colon cancer, cervical cancer, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer and bladder cancer It can be usefully used for the prevention or treatment of cancer.
  • the term "prophylaxis or treatment” means (1) biguanide compounds or pharmaceutically acceptable salts thereof; (2) 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And (3) 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and / or citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • treatment means (1) biguanide compounds or pharmaceutically acceptable salts thereof; (2) 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And (3) 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and / or citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the scope of the present invention includes administering the anticancer composition according to the present invention to a subject in need of preventing or treating cancer, and includes a method for preventing or treating cancer.
  • the anticancer composition of the present invention may further include a chemotherapeutic agent for cancer treatment, if necessary, in addition to the above-mentioned effective ingredient.
  • the anticancer composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier.
  • a pharmaceutically acceptable carrier such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, external forms such as sterile injectable solutions, ointments, etc.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in such compositions may include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, Gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, mineral oil and the like.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which may contain at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, or the like. Mix and formulate. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, liquids, emulsions, and syrups, and various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin, may be used. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • Bases for injectables may include conventional additives such as solubilizers, isotonic agents, suspending agents, emulsifiers, stabilizers and preservatives.
  • composition of the present invention can be administered using a variety of methods such as oral, intravenous, subcutaneous, intradermal, intranasal, intraperitoneal, intramuscular, transdermal, the dosage may vary depending on the age, sex, and weight of the patient It can be easily determined by those skilled in the art.
  • the dosage of the composition according to the present invention can be increased or decreased depending on the route of administration, the severity of the disease, sex, weight, age, etc.
  • 5-hydroxymethylfurfural is used per day 2 to 60 mg / kg body weight, 5 to 80 mg / kg body weight per day if metformin is used as a biguanide compound, and 0.1 to 40 mg / kg body weight per day if phenformin is used ), 2-deoxy-D-glucose is between 0.1 and 40 mg / kg body weight per day and citric acid is between 1 and 200 mg / kg body weight per day.
  • the scope of the present invention is not limited by the above dosage.
  • the present invention is (1) biguanide compound (biguanide) compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof; (2) 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And (3) at least three compounds consisting of 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and / or citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof. It relates to a method of preventing or treating cancer by administration.
  • the term "administration” refers to the introduction of a predetermined substance to an individual in an appropriate manner and the route of administration of the composition may be administered via any general route as long as it can reach the desired tissue.
  • the term "individual” means any animal, including humans, which has or is likely to develop cancer.
  • the present invention provides a composition
  • a composition comprising: (1) a biguanide compound or a pharmaceutically acceptable salt thereof; (2) 2-deoxy-D-glucose or a pharmaceutically acceptable salt thereof; And (3) 5-hydroxymethylfurfural or a pharmaceutically acceptable salt thereof, and / or citric acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. Or it relates to a food composition for improvement.
  • the biguanide compound may be metformin (hereinafter MET) or phenformin (hereinafter PHE).
  • the composition may include a food supplement acceptable food additives in addition to the active ingredient.
  • food supplement used in the present invention means a component that can be added to food supplements, and can be appropriately selected and used by those skilled in the art as being added to prepare a health functional food of each formulation.
  • food additives include flavors such as various nutrients, vitamins, minerals (electrolytes), synthetic and natural flavors, colorants and fillers, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, Although pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like are included, the examples of the food additives of the present invention are not limited by the above examples.
  • the food composition of the present invention may include a health functional food.
  • a health functional food refers to a food prepared and processed in the form of tablets, capsules, powders, granules, liquids and pills using raw materials or ingredients having useful functions for the human body.
  • 'functional' means to obtain a useful effect for health purposes such as nutrient control or physiological action on the structure and function of the human body.
  • the health functional food of the present invention can be prepared by a method commonly used in the art, and the preparation can be prepared by adding raw materials and ingredients commonly added in the art.
  • the formulation of the health functional food can also be prepared without limitation as long as the formulation is recognized as a health functional food.
  • Food composition of the present invention can be prepared in various forms of formulation, unlike the general medicine has the advantage that there is no side effect that can occur when taking a long-term use of the drug as a raw material, and excellent portability, the present invention Dietary supplements are available as supplements to enhance the effectiveness of anticancer drugs.
  • sodium citrate, metformin hydrochloride and phenformin hydrochloride were used as examples of various pharmaceutically acceptable salts of metformin and phenformin as citric acid and biguanide compounds. It is not limited.
  • Human tumors such as liver cancer (HepG2), lung cancer (A549), stomach cancer (AGS), pancreatic cancer (Capan-2), colon cancer (DLD-1), cervical cancer (HeLa), breast cancer (MCF7), prostate cancer ( Cell lines derived from PC-3), ovarian cancer (SK-OV-3) and bladder cancer (T24) were cultured according to established conditions, and all cell lines were purchased from Korean cell line bank (Seoul, Korea). It was. Human normal hepatocytes (CHANG) were purchased from the American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, USA).
  • RPMI-1640 medium Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% (v / v) fetal bovine serum, 2 mM glutamine, 100 units / ml penicillin, and 100 ⁇ g / ml streptomycin. It was. All cells were fed at 37 ° C., 5% carbon and 95% oxygen using cell culture medium containing 10% fetal bovine serum (FBS), 100 units / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin in RPMI-1640 medium. Were incubated in a wet incubator.
  • FBS fetal bovine serum
  • the monolayers of the cells were washed with phosphate buffer and then subcultured with 0.25% trypsin (trypsin-2.65 mM EDTA), and the medium was changed every three days.
  • HMF 5-hydroxymethylfurfural
  • MET metformin HCl
  • PHE phenformin hydrochloride
  • 2DG 2-deoxy-D-glucose
  • CT sodium citrate
  • Yellow tetrazolium MTT (3- (4,5-dimethylthiazolyl-2) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay was performed according to Carmichael et al.
  • the MTT assay is a method of measuring the growth of living cells, and utilizes the principle that the dehydrogenase in the mitochondria of living cells produces purple formazan by MTT, which is a yellow water-soluble substance.
  • the production of purple formazan is known to be nearly proportional to the number of living cells that are metabolically active and can be used very effectively to measure cell growth and differentiation.
  • Each cultured cancer cell was added to a 96 well plate 200 ⁇ l of 2 ⁇ 10 4 cells / well per well and incubated in a wet incubator fed with 37 ° C., 5% carbon and 95% oxygen for 24 hours, Each single formulation and combination formulation were each treated with cancer cells using a combination index indicating the fraction affected for the concentration of drug corresponding to IC50. After 48 hours of incubation, 15 ⁇ l of MTT (5 mg / ml) dissolved in phosphate buffered saline (PBS) was added to each well, followed by further incubation for 4 hours.
  • PBS phosphate buffered saline
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Cells were seeded in 96 well plates at 2 ⁇ 10 4 cells / well and treated with HMF, MET or PHE, 2DG and CT as concentrations as a single agent drug to determine the concentration of drug corresponding to IC50.
  • the combination formulation drug was treated with a concentration of drug corresponding to the IC50 of the combination formulation composed of two or more compounds selected from the group consisting of HMF, MET or PHE, 2DG and CT. All cell lines were cultured for 48 hours at the concentration of single or combination preparations, and growth inhibition effect was measured by MTT assay.
  • Combination index calculations less than 0.9 are synergistic, with 1.1 or more being antagonistic, and a combination index greater than 0.9 and less than 1.1 corresponding to addition or additive action.
  • fa is the fraction of cells affected by drug concentration D (eg 0.9 if cell growth is inhibited by 90%), fu is the fraction unaffected as (1- fa ), m Is the slope coefficient of the S-sigmodicity of the concentration-effect curve, based on the slope of the curve for each drug in the combination, whether the drugs have mutually non-exclusive effects (eg, independent of action or Interaction mode), where the combination Index (CI) was determined using the following equation.
  • (D x ) 1 is the concentration of Drug 1 required to produce the x% effect of Drug 1 alone, and (D) 1 is the amount of Drug 1 required to produce the same x% effect in combination with (D) 2 .
  • the CI value can be obtained by the above equation for various values of fa .
  • a synergistic (or synergistic) effect is shown.
  • CI values greater than 1.1 indicate antagonism, indicating that the effects of the two drugs are canceled by each other.
  • a drug reduction index is a measure of how much the concentration of each single drug decreases in the effect of a given drug by the interaction of two or more drugs.
  • (DRI) 1 (D x ) 1 / (D) 1 and
  • (DRI) 2 (D x ) 2 / (D) 2 .
  • cells were diluted in medium supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) and aliquoted into 24 well plates. After 24 hours, the cells were cultured by exchanging medium containing HMF, MET or PHE, 2DG and CT in a medium containing 10% fetal bovine serum (FBS). Incubate the cells for 16 hours by adding a combination of HMF, MET or PHE, 2DG, and CT, and then treat the cells with trypsin-EDTA to collect the cells, and then use the cells with phosphate buffered saline (PBS). Rinse and fix cells with 70% ethanol.
  • FBS fetal bovine serum
  • the cells were stained by adding Guava cell cycle reagent containing propidium iodide.
  • Cells stained with propidium iodide were measured by flow cytometry using a flow cytometer (Guava EasyCyte: Guava Technologies, Inc., Hayward, Calif., USA). Analyzes were performed using Guava CytoSoft version 2.5 software (Guava Technologies).
  • Each cancer cell was incubated for 8, 16, 24, 40 hours by adding a combination of HMF, MET, 2DG and CT to the cell culture in the same manner as above in a 100 mm dish to make cell lysate.
  • PBS cold phosphate buffered saline
  • Protein concentration was measured using the BCA method (Pierce). 50 ⁇ g of total protein was loaded into SDS-polyacrylamide gel containing Tris-glycine elution buffer. These proteins were electrophoresed using a Mini-protein system (Bio-Rad) and a nitrocellulose membrane using a Mini Trans Blot electrophoresis transfer cell (Bio-Rad) for 1 hour at 100 V. : Bio-Rad). These nitrocellulose membranes were blocked for 30 minutes with Tween 20 TBS (TBST) containing 5% skimmed milk and 16 hours at 4 ° C. with the addition of the antibody to be measured in TBST containing 3% BSA. Or stirred at room temperature for 2 hours.
  • HRP horseradish peroxidase
  • Dako horseradish peroxidase
  • AMPK is a phosphoenzyme that plays a pivotal role in maintaining energy and regulating nutrient metabolism by increasing AMPK activity when energy for cancer cells is insufficient. Previous studies using fruit flies and cancer cells have shown that activating the function of the AMPK gene returns abnormal cancer cell structures to normal.
  • AMPK ⁇ (5'-AMP-activated protein kinase) using the AMPK ⁇ immunoassay kit (Invitrogen, catalog No.KHO0651) to investigate the effects of single and combination formulations of HMF, MET or PHE, 2DG and CT on AMPK activity in cancer cells alpha) the activation effect was confirmed.
  • HepG2 cells derived from human liver were incubated for 36 hours in a 100 mm dish with HMF, MET or PHE, 2DG, and CT in doses of each single and combination formulations in the cell culture medium in the same manner as above.
  • cell lysates were prepared by the method described in the instructions for use of the AMPK ⁇ immunoassay kit.
  • the degree of phosphorylation of threonine 172 residue (Thr172) of AMPK ⁇ was confirmed from the cell lysate according to the method described in the instruction manual of the AMPK ⁇ immunoassay kit (Fig. 77-78). ).
  • Ten cancer cells were used to compare the cell proliferation inhibitory effects of HMF, MET or a combination of PHE, 2DG and CT.
  • HepG2 cell line which is a cancer cell derived from human liver
  • the effect of inhibiting cell proliferation of a single agent of HMF, biguanide compound (MET or PHE), 2DG and CT, and two or more combination agents was compared.
  • Figure 1 shows a single agent of HMF, MET, 2DG and CT and two or more combination agents for 48 hours at different concentrations by doses indicated in the HepG2 cell line, a cancer cell derived from human liver, and then inhibited cancer cell viability. The effect is shown. The higher the number of combination preparations than the single preparation of HMF, MET, 2DG and CT, the higher the effect of inhibiting cancer cell survival.
  • FIG. 2 shows the effect of inhibiting cancer cell viability after providing a single dose of HMF, MET, 2DG and CT, and a combination of two or more combinations for 48 hours at specific doses to a HepG2 cell line, a cancer cell derived from human liver. It is.
  • the three combinations composed of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than the MET / 2DG combinations showing the highest cancer inhibition among the two combinations (respectively, respectively). p ⁇ 0.001).
  • four combinations composed of HMF / MET / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than three combinations composed of HMF / MET / CT (p ⁇ 0.001). It showed the highest cancer suppression rate among all the combination preparations.
  • Table 2 above shows Dm (or IC50), m (tilt), r (correlation coefficient) obtained by central-effect analysis using Calcusyn software for single and combination formulations of HMF, MET, 2DG and CT.
  • the r value ranged from 0.97 to 1.00, indicating a high correlation between dose and effect.
  • the m value ranged from 1.50 to 2.97, indicating that the dose-effect curve was nearly hyperbolic for the compounds used alone or in combination.
  • HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the MET / 2DG combination which showed the highest 50% cancer suppression among the two combinations.
  • 50 combinations of HMF / MET / 2DG / CT showed 50% lower cancer suppression effect than the three combinations of HMF / MET / CT. Among them, the highest 50% cancer suppression concentration was shown.
  • Table 3 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, and IC90 of the combination formulations containing two or more compounds according to the molar ratio of each drug in the HepG2 cell line, and the drug reduction index (DRI) of each single formulation.
  • the combination index consisting of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher combination index effects at 50-90% cancer inhibition than the MET / 2DG combination.
  • the combination index of HMF / MET / 2DG / CT was higher than the combination combination of HMF / MET / CT, and the combination index effect was higher at 50 to 90% cancer inhibition rate. It showed the highest combination index effect among all combination preparations.
  • the HMF / MET / 2DG / CT formulation the combination of the four compounds with the highest synergistic effects at 50-90% cancer inhibition, was 6.8-7.2 times HMF, 5.9-6.7 times MET, and 7.7-9.2 times CT. Had a drug reduction effect of 6.2 to 10.9 times, and the drug reduction index (DRI) was the highest.
  • FIG. 3 is a fractional effect-combination index (Fa-CI) graph of a HepG2 cell line treated for 48 hours with a combination formulation consisting of HMF, MET, 2DG and CT.
  • the combination index effect was higher in the three combination formulations consisting of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT than the MET / 2DG combination formulation showing the highest combination index according to the fraction effect among the two combination formulations. (P ⁇ 0.05, p ⁇ 0.01, respectively).
  • the combination index effect was higher in the four combination formulations consisting of HMF / MET / 2DG / CT than the three combination formulations consisting of HMF / MET / CT (p ⁇ 0.001).
  • FIG. 5 shows the effect of inhibiting cancer cell viability after providing a single dose of HMF, PHE, 2DG and CT, and a combination of two or more combinations for 48 hours at a specific dose to the HepG2 cell line, a cancer cell derived from human liver. It is.
  • the combination of HMF, PHE, 2DG, and CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival in combination.
  • the combination of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than the PHE / 2DG combination having the highest cancer suppression rate among the two combinations (respectively, respectively). p ⁇ 0.001).
  • four combinations composed of HMF / PHE / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than three combinations composed of HMF / PHE / CT (p ⁇ 0.001). It showed the highest cancer suppression rate among all the combination preparations.
  • Table 4 above shows Dm (or IC50), m (tilt), r (correlation coefficient) obtained by central-effect analysis using Calcusyn software for single and combination formulations of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the r value ranged from 0.97 to 1.00, indicating a high correlation between dose and effect.
  • the m value ranged from 1.60 to 2.97, indicating that the dose-effect curve was nearly hyperbolic for the compounds used alone or in combination.
  • the combination of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the PHE / 2DG combination which showed the highest 50% cancer suppression among the two combinations.
  • the four combinations composed of HMF / PHE / 2DG / CT showed a lower effect of 50% cancer suppression than the three combinations composed of HMF / PHE / CT.
  • it showed the highest reduction effect of 50% cancer suppression concentration.
  • Table 5 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, and IC90 of the combination formulation containing two or more compounds according to the molar ratio of each drug in the HepG2 cell line, and the drug reduction index (DRI) of each single formulation.
  • the combination index effect at 50 to 90% cancer inhibition rate was higher in the three combination formulations consisting of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT than the PHE / 2DG combination formulation showing the highest combination index among the two combination formulations.
  • the combination index of HMF / PHE / 2DG / CT was higher than the combination combination of HMF / PHE / CT and HMF / PHE / CT. It showed the highest combination index effect among all combination preparations.
  • the HMF / PHE / 2DG / CT formulation the combination of the four compounds with the highest synergistic effects at 50-90% cancer inhibition, was found to be 10.5 to 13.2 times HMF, 6.1 to 7.7 times PHE, 14.1 to 14.3 times 2DG, and CT. Had a drug reduction effect of 11.3 to 16.9 times, which was the highest in the drug reduction index (DRI).
  • DRI drug reduction index
  • FIG. 6 depicts 50% cancer inhibition concentration by PHE after single and combination preparations consisting of HMF, PHE, 2DG and CT were given for 48 hours at specific doses in HepG2 cell line, a cancer cell derived from human liver. It shows how much lower the drug toxicity of PHE can be. Among the PHE single formulations and two or more combination formulations, the four drug combinations of HMF, PHE, 2DG and CT showed the lowest drug toxicity.
  • the 50% cancer suppression concentration by PHE was lowered to reduce drug toxicity.
  • the combination of HMF / PHE / 2DG / CT showed the lowest 50% cancer suppression concentration by the PHE than the three combinations composed of HMF / PHE / CT.
  • the four combination formulations showed the highest effect among all combination formulations.
  • FIG. 7 shows a Fa-CI graph of HepG2 cell lines treated for 48 hours by HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the combination index according to the fractional effect showed synergistic effects with both low and high inhibition rates in the four combination formulations of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • FIG. 7 is a fractional effect-combination index (Fa-CI) graph of a HepG2 cell line treated for 48 hours with a combination formulation consisting of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the combination index effect was higher in the three combination formulations consisting of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT than the PHE / 2DG combination formulation showing the highest combination index according to the fraction effect among the two combination formulations. (P ⁇ 0.05, p ⁇ 0.001, respectively).
  • the combination index effect was higher in the four combination formulations composed of HMF / PHE / 2DG / CT than the three combination formulations composed of HMF / PHE / CT (p ⁇ 0.001).
  • A549 cell line a cancer cell derived from the human lung, a single agent and two or more combination agents of HMF, biguanide compound (MET or PHE), 2DG and CT, respectively The effect of inhibiting cell proliferation was compared.
  • FIG. 8 shows the inhibition of cancer cell viability after providing a single preparation of HMF, MET, 2DG and CT and two or more combination preparations by concentrations indicated by A549 cell line, which is a cancer cell derived from human lung, for 48 hours. The effect is shown. The higher the number of combination preparations than the single preparation of HMF, MET, 2DG and CT, the higher the effect of inhibiting cancer cell survival.
  • FIG. 9 shows the effect of inhibiting cancer cell viability after providing a single dose of HMF, MET, 2DG and CT, and a combination of two or more combination agents for 48 hours at a specific dose to A549 cell line, a cancer cell derived from human lung. It is.
  • the three combinations composed of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival than the MET / 2DG combination having the highest cancer suppression rate among the two combinations (respectively, respectively). p ⁇ 0.001).
  • four combinations composed of HMF / MET / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than three combinations composed of HMF / MET / CT (p ⁇ 0.001). It showed the highest cancer suppression rate among all the combination preparations.
  • Table 6 above shows Dm (or IC50), m (tilt), r (correlation coefficient) obtained by central-effect analysis using Calcusyn software for single and combination formulations of HMF, MET, 2DG.
  • the r value ranged from 0.90 to 1.00, indicating a high correlation between dose and effect.
  • the m value ranged from 1.84 to 2.80, indicating that the dose-effect curve was nearly hyperbolic for the compounds used alone or in combination.
  • HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the MET / 2DG combination which showed the highest 50% cancer suppression among the two combinations.
  • 50 combinations of HMF / MET / 2DG / CT showed 50% lower cancer suppression effect than the three combinations of HMF / MET / CT. Among them, the highest 50% cancer suppression concentration was shown.
  • Table 7 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, and IC90 and the drug reduction index (DRI) of each single formulation of the combination formulation containing two or more compounds according to the molar ratio of each drug in the A549 cell line.
  • the combination index consisting of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher combination index effects at 50-90% cancer inhibition than the MET / 2DG combination.
  • the combination index of HMF / MET / 2DG / CT was higher than the combination combination of HMF / MET / CT, and the combination index effect was higher at 50 to 90% cancer inhibition rate. It showed the highest combination index effect among all combination preparations.
  • the HMF / MET / 2DG / CT formulation the combination of the four compounds with the highest synergistic effects at 50-90% cancer inhibition, was 14.2 to 16.0 times HMF, 7.3 to 8.1 times MET, 14.5 to 14.6 times 2DG, and CT. Had a drug reduction effect of 7.8 ⁇ 10.8 times, which was the highest drug reduction index (DRI).
  • DRI drug reduction index
  • FIG. 10 shows a Fa-CI graph of an A549 cell line treated for 48 hours with a combination formulation consisting of HMF, MET, 2DG and CT.
  • the combination index effect was higher in the three combination formulations consisting of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT than the MET / 2DG combination formulation showing the highest combination index according to the fraction effect among the two combination formulations. (P ⁇ 0.001, respectively).
  • the combination index effect was higher in the four combination formulations consisting of HMF / MET / 2DG / CT than the three combination formulations consisting of HMF / MET / CT (p ⁇ 0.001). Among the highest combination index effect.
  • FIG. 11 shows the concentration of each single agent of HMF, PHE, 2DG and CT and two or more combination agents by doses indicated in the A549 cell line, a cancer cell derived from human lungs, and FIG. 12 by 48 doses indicated. After providing for time, the effect of inhibiting cancer cell viability is shown. Among the combination of HMF, PHE, 2DG and CT and four combinations of two or more combinations, the effect of inhibiting cancer cell survival was highest.
  • FIG. 12 shows the effect of inhibiting cancer cell viability after providing a single dose of HMF, PHE, 2DG and CT, and a combination of two or more combination agents for 48 hours at a specific dose to A549 cell line, a cancer cell derived from human lung. It is.
  • the combination of HMF, PHE, 2DG, and CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival in combination.
  • the three combination formulations composed of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than the PHE / 2DG combination formulations showing the highest cancer inhibition rates among the two combination formulations (respectively, respectively). p ⁇ 0.001).
  • four combinations composed of HMF / PHE / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than three combinations composed of HMF / PHE / CT (p ⁇ 0.001). It showed the highest cancer suppression rate among all the combination preparations.
  • Table 8 above shows Dm (or IC50), m (tilt), r (correlation coefficient) obtained by central-effect analysis using Calcusyn software for single and combination formulations of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the r value ranged from 0.90 to 1.00, indicating a high correlation between dose and effect.
  • the m value ranged from 1.61 to 2.80, indicating that the dose-effect curve was nearly hyperbolic for the compounds used alone or in combination.
  • the combination of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the PHE / 2DG combination which showed the highest 50% cancer suppression among the two combinations.
  • the four combinations composed of HMF / PHE / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the three combinations composed of HMF / PHE / CT. Among them, the highest 50% cancer suppression concentration was shown.
  • Table 9 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, and IC90 and the drug reduction index (DRI) of each single formulation of the combination formulations containing two or more compounds according to the molar ratio of each drug in the A549 cell line.
  • the combination index effect at 50 to 90% cancer inhibition rate was higher in the three combination formulations consisting of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT than the PHE / 2DG combination formulation showing the highest combination index among the two combination formulations.
  • the combination index of HMF / PHE / 2DG / CT was higher than the combination combination of HMF / PHE / CT and HMF / PHE / CT. It showed the highest combination index effect among all combination preparations.
  • the HMF / PHE / 2DG / CT formulation the combination of the four compounds with the highest synergistic effects at 50-90% cancer inhibition, was 15.3 to 19.2 times HMF, 10.7 to 11.3 times PHE, 15.7 to 17.3 times CT, and 2DG. Had a drug reduction effect of 8.4 to 12.9 times, with the highest drug reduction index (DRI).
  • DRI drug reduction index
  • FIG. 13 shows 50% cancer suppression concentration by PHE after providing single and combination formulations consisting of HMF, PHE, 2DG and CT for 48 hours at specific doses to A549 cell line, a cancer cell derived from human lungs. It shows how much lower the drug toxicity of PHE can be. Among the PHE single formulations and two or more combination formulations, the four drug combinations of HMF, PHE, 2DG and CT showed the lowest drug toxicity.
  • the 50% cancer suppression concentration caused by PHE was lowered to reduce drug toxicity.
  • the 4% combination of HMF / PHE / 2DG / CT showed the lowest 50% cancer suppression concentration by PHE than the 3 combinations composed of HMF / PHE / CT.
  • the four combination formulations showed the highest effect among all combination formulations.
  • FIG. 14 shows Fa-CI graphs of A549 cell lines treated for 48 hours by HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the combination index according to the fractional effect showed synergistic effects with both low and high inhibition rates in the four combination formulations of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • FIG. 14 is a fractional effect-combination index (Fa-CI) graph of an A549 cell line treated for 48 hours with a combination formulation consisting of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the combination index effect was higher in the three combination formulations consisting of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT than the PHE / 2DG combination formulation showing the highest combination index according to the fraction effect among the two combination formulations. (P ⁇ 0.001, respectively).
  • the combination index effect was higher in the four combination formulations composed of HMF / PHE / 2DG / CT than the three combination formulations composed of HMF / PHE / CT (p ⁇ 0.001).
  • AGS cell line which is a cancer cell derived from human stomach
  • the effect of inhibiting cell proliferation of a single agent of HMF, biguanide-based compound (MET or PHE), 2DG and CT, and two or more combination agents was compared.
  • FIG. 15 shows the effect of inhibiting cancer cell viability after providing a single preparation of HMF, MET, 2DG and CT and two or more combination preparations by concentrations indicated by AGS cell lines, which are cancer cells derived from human stomach, for 48 hours. It is shown. The higher the number of combination preparations than the single preparation of HMF, MET, 2DG and CT, the higher the effect of inhibiting cancer cell survival.
  • Figure 16 shows the effect of inhibiting cancer cell viability after providing a single dose of HMF, MET, 2DG and CT, and a combination of two or more combinations for 48 hours at specific doses to AGS cell lines, which are cancer cells derived from the stomach of humans.
  • the three combination formulations composed of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than the MET / 2DG combination formulation having the highest cancer suppression rate among the two combination formulations (respectively, respectively). p ⁇ 0.001).
  • four combinations composed of HMF / MET / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than three combinations composed of HMF / MET / CT (p ⁇ 0.001). It showed the highest cancer suppression rate among all the combination preparations.
  • Table 10 above shows Dm (or IC50), m (tilt), r (correlation coefficient) obtained by central-effect analysis using Calcusyn software for single and combination formulations of HMF, MET, 2DG and CT.
  • the r value ranged from 0.97 to 1.00, indicating a high correlation between dose and effect.
  • the m value ranged from 1.54 to 1.88, indicating that the dose-effect curve was nearly hyperbolic for the compounds used alone or in combination.
  • HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the MET / 2DG combination which showed the highest 50% cancer suppression among the two combinations.
  • 50 combinations of HMF / MET / 2DG / CT showed 50% lower cancer suppression effect than the three combinations of HMF / MET / CT. Among them, the highest 50% cancer suppression concentration was shown.
  • Table 11 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, and IC90 and the drug reduction index (DRI) of each single formulation of the combination formulations comprising two or more compounds according to the molar ratio of each drug in the AGS cell line.
  • the combination index consisting of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher combination index effects at 50-90% cancer inhibition than the MET / 2DG combination.
  • the combination index of HMF / MET / 2DG / CT was higher than the combination combination of HMF / MET / CT, and the combination index effect was higher at 50 to 90% cancer inhibition rate. It showed the highest combination index effect among all combination preparations.
  • the HMF / MET / 2DG / CT formulation the combination of the four compounds with the highest synergistic effects at 50-90% cancer inhibition, was 9.1 to 11.0 times HMF, 6.3 to 6.9 times MET, 8.3 to 8.8 times 2DG, and CT. Had a drug reduction effect of 7.0 to 8.7 times, which was the highest drug reduction index (DRI).
  • DRI drug reduction index
  • FIG. 17 is a fractional effect-combination index (Fa-CI) graph of an AGS cell line treated for 48 hours with a combination formulation consisting of HMF, MET, 2DG and CT.
  • the combination index effect was higher in the three combination formulations consisting of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT than the MET / 2DG combination formulation showing the highest combination index according to the fraction effect among the two combination formulations. (P ⁇ 0.001, respectively).
  • the combination index effect was higher in the four combination formulations consisting of HMF / MET / 2DG / CT than the three combination formulations consisting of HMF / MET / CT (p ⁇ 0.001).
  • FIG. 18 shows the effect of inhibiting cancer cell survival after providing a single preparation of HMF, PHE, 2DG and CT and two or more combination preparations by concentrations indicated by AGS cell lines of cancer cells derived from human stomach for 48 hours. It is shown. The higher the number of combination preparations than the single preparations of HMF, PHE, 2DG and CT, the higher the effect of inhibiting cancer cell survival.
  • FIG. 19 shows the effect of inhibiting cancer cell viability after providing a single dose of HMF, PHE, 2DG and CT, and a combination of two or more combinations for 48 hours at specific doses to AGS cell lines of cancer cells derived from human stomach.
  • the combination of HMF, PHE, 2DG, and CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival in combination.
  • the combination of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than the PHE / 2DG combination having the highest cancer suppression rate among the two combinations (respectively, respectively). p ⁇ 0.001).
  • four combinations composed of HMF / PHE / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than three combinations composed of HMF / PHE / CT (p ⁇ 0.001). It showed the highest cancer suppression rate among all the combination preparations.
  • Table 12 above shows Dm (or IC50), m (tilt), r (correlation coefficient) obtained by central-effect analysis using Calcusyn software for single and combination formulations of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the r value ranged from 0.96 to 1.00, indicating a high correlation between dose and effect.
  • the m value ranged from 1.48 to 2.57, indicating that the dose-effect curve was nearly hyperbolic for the compounds used alone or in combination.
  • the combination of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the PHE / 2DG combination which showed the highest 50% cancer suppression among the two combinations.
  • the four combinations composed of HMF / PHE / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the three combinations composed of HMF / PHE / CT. Among them, the highest 50% cancer suppression concentration was shown.
  • Table 13 shows the Combination Index (CI) at IC50, IC75, IC90 and Combination Index (DRI) of each single formulation of a combination formulation comprising two or more compounds according to the molar ratio of each drug in the AGS cell line.
  • the combination index effect at 50 to 90% cancer inhibition rate was higher in the three combination formulations consisting of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT than the PHE / 2DG combination formulation showing the highest combination index among the two combination formulations.
  • the combination index of HMF / PHE / 2DG / CT was higher than the combination combination of HMF / PHE / CT and HMF / PHE / CT. It showed the highest combination index effect among all combination preparations.
  • the HMF / PHE / 2DG / CT formulation the combination of the four compounds with the highest synergistic effects at 50-90% cancer inhibition, was 11.5 to 12.0 times HMF, 8.6 to 12.5 times PHE, 9.6 to 10.6 times CT, and 2DG. Showed a drug reduction effect of 8.9-9.5 times, with the highest drug reduction index (DRI).
  • DRI drug reduction index
  • FIG. 20 depicts 50% cancer suppression concentration by PHE after providing single and combination formulations consisting of HMF, PHE, 2DG and CT for 48 hours at specific doses in AGS cell lines, cancer cells derived from human stomach. It shows how much lower the drug toxicity of PHE can be. Among the PHE single formulations and two or more combination formulations, the four drug combinations of HMF, PHE, 2DG and CT showed the lowest drug toxicity.
  • the 50% cancer suppression concentration caused by PHE was lowered to reduce drug toxicity.
  • the 4% combination of HMF / PHE / 2DG / CT showed the lowest 50% cancer suppression concentration by PHE than the 3 combinations composed of HMF / PHE / CT.
  • the four combination formulations showed the highest effect among all combination formulations.
  • Figure 21 shows Fa-CI graphs of AGS cell lines treated for 48 hours by HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the combination index according to the fractional effect showed synergistic effects with both low and high inhibition rates in the four combination formulations of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • FIG. 21 is a fractional effect-combination index (Fa-CI) graph of AGS cell lines treated for 48 hours with a combination formulation consisting of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the combination index effect was higher in the three combination formulations consisting of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT than the PHE / 2DG combination formulation showing the highest combination index according to the fraction effect among the two combination formulations. (P ⁇ 0.001, respectively).
  • the combination index effect was higher in the four combination formulations composed of HMF / PHE / 2DG / CT than the three combination formulations composed of HMF / PHE / CT (p ⁇ 0.001).
  • Capan-2 cell line which is a cancer cell derived from the human pancreas
  • FIG. 22 shows cancer cells after providing a single preparation of HMF, MET, 2DG, and CT and two or more combination preparations for 48 hours by concentration at the dose indicated in the Capan-2 cell line, a cancer cell derived from the human pancreas. It shows the effect of suppressing survival rate.
  • FIG. 23 shows the effect of inhibiting cancer cell viability after providing a single dose of HMF, MET, 2DG, and CT and two or more combinations for 48 hours at a specific dose to Capan-2 cell line, a cancer cell derived from human pancreas. It is shown.
  • the combination of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival than the MET / 2DG combination having the highest cancer suppression rate among the two combinations (respectively, respectively). p ⁇ 0.001).
  • four combinations composed of HMF / MET / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than three combinations composed of HMF / MET / CT (p ⁇ 0.001). It showed the highest cancer suppression rate among all the combination preparations.
  • Table 14 above shows Dm (or IC50), m (tilt), r (correlation coefficient) obtained by central-effect analysis using Calcusyn software for single and combination formulations of HMF, MET, 2DG and CT.
  • the r value ranged from 0.95 to 1.00, indicating a high correlation between dose and effect.
  • the m value ranged from 1.99 to 3.04, indicating that the dose-effect curve was nearly hyperbolic for the compounds used alone or in combination.
  • HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the MET / 2DG combination which showed the highest 50% cancer suppression among the two combinations.
  • 50 combinations of HMF / MET / 2DG / CT showed 50% lower cancer suppression effect than the three combinations of HMF / MET / CT. Among them, the highest 50% cancer suppression concentration was shown.
  • Table 15 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, and IC90 of the combination formulations containing two or more compounds according to the molar ratio of each drug in the Capan-2 cell line, and the drug reduction index (DRI) of each single formulation. .
  • the combination index consisting of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher combination index effects at 50-90% cancer inhibition than the MET / 2DG combination.
  • the combination index of HMF / MET / 2DG / CT was higher than the combination combination of HMF / MET / CT, and the combination index effect was higher at 50 to 90% cancer inhibition rate. It showed the highest combination index effect among all combination preparations.
  • the HMF / MET / 2DG / CT formulation the combination of the four compounds with the highest synergistic effects at 50-90% cancer inhibition, was 7.9-10.1 times HMF, 5.9-6.9 times MET, 8.9-9.5 times 2DG, and CT. Showed a drug reduction effect of 7.5 to 9.1 times, and the drug reduction index (DRI) was the highest.
  • FIG. 24 is a fractional effect-combination index (Fa-CI) graph of a Capan-2 cell line treated for 48 hours with a combination formulation consisting of HMF, MET, 2DG and CT.
  • the combination index effect was higher in the three combination formulations consisting of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT than the MET / 2DG combination formulation showing the highest combination index according to the fraction effect among the two combination formulations. (P ⁇ 0.001, respectively).
  • the combination index effect was higher in the four combination formulations consisting of HMF / MET / 2DG / CT than the three combination formulations consisting of HMF / MET / CT (p ⁇ 0.001).
  • FIG. 25 shows a single agent of HMF, PHE, 2DG and CT and two or more combination agents for 48 hours at different concentrations by doses indicated in the Capan-2 cell line, a cancer cell derived from the human pancreas. It shows the effect of suppressing survival rate.
  • FIG. 26 shows the effect of inhibiting cancer cell viability after providing a single dose of HMF, PHE, 2DG and CT, and a combination of two or more combinations for 48 hours at a specific dose to Capan-2 cell line, which is a cancer cell derived from the human pancreas. It is shown.
  • the combination of HMF, PHE, 2DG, and CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival in combination.
  • the combination of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the PHE / 2DG combination which showed the highest 50% cancer suppression among the two combinations.
  • the four combinations composed of HMF / PHE / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the three combinations composed of HMF / PHE / CT. Among them, the highest 50% cancer suppression concentration was shown.
  • Table 17 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, and IC90 of the combination formulations containing two or more compounds according to the molar ratio of each drug in the Capan-2 cell line, and the drug reduction index (DRI) of each single formulation. .
  • the combination index effect at 50 to 90% cancer inhibition rate was higher in the three combination formulations consisting of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT than the PHE / 2DG combination formulation showing the highest combination index among the two combination formulations.
  • the combination index of HMF / PHE / 2DG / CT was higher than the combination combination of HMF / PHE / CT and HMF / PHE / CT. It showed the highest combination index effect among all combination preparations.
  • HMF / PHE / 2DG / CT preparation the combination of four compounds with the highest synergistic effect at 50-90% cancer inhibition rate, 7.8-9.7 times HMF, 7.0- 8.4 times PHE, 8.6-9.4 times 2DG, CT
  • the drug reduction index (DRI) was the highest with 7.4 ⁇ 8.8 fold reduction.
  • Figure 27 shows a single and combination formulation consisting of HMF, PHE, 2DG and CT for 48 hours at a specific dose in Capan-2 cell line, a cancer cell derived from human pancreas, and then 50% cancer suppression concentration by PHE.
  • the figure shows how low the drug toxicity of PHE can be.
  • the four drug combinations of HMF, PHE, 2DG and CT showed the lowest drug toxicity.
  • the 50% cancer suppression concentration caused by PHE was lowered to reduce drug toxicity.
  • the 4% combination of HMF / PHE / 2DG / CT showed the lowest 50% cancer suppression concentration by PHE than the 3 combinations composed of HMF / PHE / CT.
  • the four combination formulations showed the highest effect among all combination formulations.
  • FIG. 28 is a Fa-CI graph of Capan-2 cell lines treated for 48 hours by HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the combination index according to the fractional effect (Fraction Affected) showed synergistic effects with both low and high inhibition rates in the four combination formulations of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • FIG. 28 is a fractional effect-combination index (Fa-CI) graph of a Capan-2 cell line treated for 48 hours with a combination formulation consisting of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the combination index effect was higher in the three combination formulations consisting of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT than the PHE / 2DG combination formulation showing the highest combination index according to the fraction effect among the two combination formulations. (P ⁇ 0.001, respectively).
  • the combination index effect was higher in the four combination formulations composed of HMF / PHE / 2DG / CT than the three combination formulations composed of HMF / PHE / CT (p ⁇ 0.001).
  • DLD-1 cell line which is a cancer cell derived from human colon
  • MET or PHE biguanide compound
  • 2DG 2DG
  • CT 2DG
  • FIG. 29 shows cancer cells after providing a single preparation of HMF, MET, 2DG, and CT and two or more combination preparations by concentrations indicated by DLD-1 cell line, which is a cancer cell derived from the human colon, for 48 hours by concentration. It shows the effect of suppressing survival rate.
  • DLD-1 cell line which is a cancer cell derived from the human colon
  • FIG. 30 shows the effect of inhibiting cancer cell viability after providing a single dose of HMF, MET, 2DG and CT, and a combination of two or more combinations for 48 hours at a specific dose to the DLD-1 cell line, which is a cancer cell derived from the human large intestine. It is shown.
  • the combination of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than the MET / 2DG combination having the highest cancer suppression rate among the two combinations (respectively, respectively). p ⁇ 0.001).
  • four combinations composed of HMF / MET / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than three combinations composed of HMF / MET / CT (p ⁇ 0.001). It showed the highest cancer suppression rate among all the combination preparations.
  • Table 18 above shows Dm (or IC50), m (tilt), r (correlation coefficient) obtained by central-effect analysis using Calcusyn software for single and combination formulations of HMF, MET, 2DG and CT.
  • the r value ranged from 0.99 to 1.00, indicating a high correlation between dose and effect.
  • the m value ranged from 1.06 to 2.64, indicating that the dose-effect curve was nearly hyperbolic for the compounds used alone or in combination.
  • HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the MET / 2DG combination which showed the highest 50% cancer suppression among the two combinations.
  • 50 combinations of HMF / MET / 2DG / CT showed 50% lower cancer suppression effect than the three combinations of HMF / MET / CT. Among them, the highest 50% cancer suppression concentration was shown.
  • Table 19 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, and IC90 of the combination formulations containing two or more compounds according to the molar ratio of each drug in the DLD-1 cell line, and the drug reduction index (DRI) of each single formulation. .
  • the combination index consisting of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher combination index effects at 50-90% cancer inhibition than the MET / 2DG combination.
  • the combination index of HMF / MET / 2DG / CT was higher than the combination combination of HMF / MET / CT, and the combination index effect was higher at 50 to 90% cancer inhibition rate. It showed the highest combination index effect among all combination preparations.
  • HMF / MET / 2DG / CT preparations the combination of four compounds with the highest synergistic effects at 50-90% cancer inhibition, were 7.0 to 10.6 times HMF, 6.3 to 6.4 times MET, 10.5 to 22.4 times CT, and 2DG. Showed a drug reduction effect of 7.0 to 11.3 times, and the drug reduction index (DRI) was the highest.
  • DRI drug reduction index
  • FIG. 31 is a fractional effect-combination index (Fa-CI) graph of a DLD-1 cell line treated for 48 hours with a combination formulation consisting of HMF, MET, 2DG and CT.
  • the combination index effect was higher in the three combination formulations consisting of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT than the MET / 2DG combination formulation showing the highest combination index according to the fraction effect among the two combination formulations. (P ⁇ 0.05, p ⁇ 0.001, respectively).
  • the combination index effect was higher in the four combination formulations consisting of HMF / MET / 2DG / CT than the three combination formulations consisting of HMF / MET / CT (p ⁇ 0.001).
  • FIG. 32 shows a single agent of HMF, PHE, 2DG, and CT and two or more combination agents for 48 hours at different concentrations by doses indicated in DLD-1 cell lines, cancer cells derived from the human colon It shows the effect of suppressing survival rate.
  • FIG. 33 shows the effect of inhibiting cancer cell viability after providing a single dose of HMF, PHE, 2DG, and CT and two or more combinations for 48 hours at a specific dose to the DLD-1 cell line, a cancer cell derived from the human colon. It is shown.
  • the combination of HMF, PHE, 2DG, and CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival in combination.
  • the combination of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than the PHE / 2DG combination having the highest cancer inhibition among the two combinations (respectively, respectively). p ⁇ 0.001).
  • four combinations composed of HMF / PHE / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than three combinations composed of HMF / PHE / CT (p ⁇ 0.001). It showed the highest cancer suppression rate among all the combination preparations.
  • Table 20 above shows Dm (or IC50), m (tilt), r (correlation coefficient) obtained by central-effect analysis using Calcusyn software for single and combination formulations of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the r value ranged from 0.99 to 1.00, indicating a high correlation between dose and effect.
  • the m value ranged from 1.06 to 2.64, indicating that the dose-effect curve was nearly hyperbolic for the compounds used alone or in combination.
  • the combination of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the PHE / 2DG combination which showed the highest 50% cancer suppression among the two combinations.
  • the four combinations composed of HMF / PHE / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the three combinations composed of HMF / PHE / CT. Among them, the highest 50% cancer suppression concentration was shown.
  • Table 21 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, and IC90 of the combination formulations containing two or more compounds according to the molar ratio of each drug in the DLD-1 cell line, and the drug reduction index (DRI) of each single formulation. .
  • the combination index effect at 50 to 90% cancer inhibition rate was higher in the three combination formulations consisting of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT than the PHE / 2DG combination formulation showing the highest combination index among the two combination formulations.
  • the combination index of HMF / PHE / 2DG / CT was higher than the combination combination of HMF / PHE / CT and HMF / PHE / CT. It showed the highest combination index effect among all combination preparations.
  • HMF / PHE / 2DG / CT preparations the combination of four compounds with the highest synergistic effects at 50-90% cancer inhibition, were 6.9 to 10.6 times HMF, 7.6 to 7.8 times PHE, 10.5 to 22.2 times 2DG, and CT. Showed a drug reduction effect of 6.9 to 11.4 times, with the highest drug reduction index (DRI).
  • DRI drug reduction index
  • Figure 34 shows a single and combination formulation consisting of HMF, PHE, 2DG and CT for 48 hours at a specific dose in DLD-1 cell line, a cancer cell derived from the human large intestine, followed by 50% cancer suppression concentration by PHE.
  • the figure shows how low the drug toxicity of PHE can be.
  • the four drug combinations of HMF, PHE, 2DG and CT showed the lowest drug toxicity.
  • the 50% cancer suppression concentration caused by PHE was lowered to reduce drug toxicity.
  • the 4% combination of HMF / PHE / 2DG / CT showed the lowest 50% cancer suppression concentration by PHE than the 3 combinations composed of HMF / PHE / CT.
  • the four combination formulations showed the highest effect among all combination formulations.
  • FIG. 35 is a fractional effect-combination index (Fa-CI) graph of a DLD-1 cell line treated for 48 hours with a combination formulation consisting of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the combination index effect was higher in the three combination formulations consisting of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT than the PHE / 2DG combination formulation showing the highest combination index according to the fraction effect among the two combination formulations. (P ⁇ 0.01 each).
  • the combination index effect was higher in the four combination formulations composed of HMF / PHE / 2DG / CT than the three combination formulations composed of HMF / PHE / CT (p ⁇ 0.001). Among the highest combination index effect.
  • HeLa cell line which is a cancer cell derived from the human cervix
  • the effect of inhibiting cell proliferation of a single agent of HMF, a biguanide compound (MET or PHE), 2DG, and CT and two or more combination agents was compared.
  • FIG. 36 shows cancer cell viability after providing a single formulation of HMF, MET, 2DG and CT and two or more combinations for 48 hours at different concentrations by doses indicated in HeLa cell lines of cancer cells derived from the human cervix. Inhibitory effect is shown. The higher the number of combination preparations than the single preparation of HMF, MET, 2DG and CT, the higher the effect of inhibiting cancer cell survival.
  • HMF, MET, 2DG and CT show the effect of inhibiting cancer cell viability after providing a single dose of HMF, MET, 2DG and CT, and a combination of two or more combinations for 48 hours at a specific dose to HeLa cell lines, which are cancer cells derived from the human cervix. It is shown.
  • the combination of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than the MET / 2DG combination having the highest cancer suppression rate among the two combinations (respectively, respectively). p ⁇ 0.001).
  • four combinations composed of HMF / MET / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than three combinations composed of HMF / MET / CT (p ⁇ 0.001). It showed the highest cancer suppression rate among all the combination preparations.
  • Table 22 above shows Dm (or IC50), m (tilt), r (correlation coefficient) obtained by central-effect analysis using Calcusyn software for single and combination formulations of HMF, MET, 2DG and CT.
  • the r value ranged from 0.93 to 1.00, indicating a high correlation between dose and effect.
  • the m value ranged from 1.92 to 2.51, indicating that the dose-effect curves were nearly hyperbolic for the compounds used alone or in combination.
  • HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the MET / 2DG combination which showed the highest 50% cancer suppression among the two combinations.
  • 50 combinations of HMF / MET / 2DG / CT showed 50% lower cancer suppression effect than the three combinations of HMF / MET / CT. Among them, the highest 50% cancer suppression concentration was shown.
  • Table 23 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, and IC90 and the drug reduction index (DRI) of each single formulation of the combination formulations comprising two or more compounds according to the molar ratio of each drug in the HeLa cell line.
  • the combination index consisting of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher combination index effects at 50-90% cancer inhibition than the MET / 2DG combination.
  • the combination index of HMF / MET / 2DG / CT was higher than the combination combination of HMF / MET / CT, and the combination index effect was higher at 50 to 90% cancer inhibition rate. It showed the highest combination index effect among all combination preparations.
  • FIG. 38 is a fractional effect-combination index (Fa-CI) graph of a HeLa cell line treated for 48 hours with a combination formulation consisting of HMF, MET, 2DG and CT.
  • the combination index effect was higher in the three combination formulations consisting of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT than the MET / 2DG combination formulation showing the highest combination index according to the fraction effect among the two combination formulations. (P ⁇ 0.001, respectively).
  • the combination index effect was higher in the four combination formulations consisting of HMF / MET / 2DG / CT than the three combination formulations consisting of HMF / MET / CT (p ⁇ 0.001).
  • FIG. 39 shows cancer cell viability after providing a single formulation of HMF, PHE, 2DG, and CT and two or more combinations for 48 hours by concentration at doses indicated in HeLa cell lines of cancer cells derived from the human cervix. Inhibitory effect is shown. The higher the number of combination preparations than the single preparations of HMF, PHE, 2DG and CT, the higher the effect of inhibiting cancer cell survival.
  • HMF HMF
  • PHE PHE
  • 2DG CT
  • CT a combination of two or more combinations for 48 hours at a specific dose to HeLa cell lines, which are cancer cells derived from the human cervix. It is shown.
  • the combination of HMF, PHE, 2DG, and CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival in combination.
  • the combination of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than the PHE / 2DG combination having the highest cancer suppression rate among the two combinations (respectively, respectively). p ⁇ 0.001).
  • four combinations composed of HMF / PHE / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than three combinations composed of HMF / PHE / CT (p ⁇ 0.001). It showed the highest cancer suppression rate among all the combination preparations.
  • Table 24 above shows Dm (or IC50), m (tilt), r (correlation coefficient) obtained by central-effect analysis using Calcusyn software for single and combination formulations of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the r value ranged from 0.93 to 1.00, indicating a high correlation between dose and effect.
  • the m value ranged from 1.82 to 2.88, indicating that the dose-effect curve was nearly hyperbolic for the compounds used alone or in combination.
  • the combination of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the PHE / 2DG combination which showed the highest 50% cancer suppression among the two combinations.
  • the four combinations composed of HMF / PHE / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the three combinations composed of HMF / PHE / CT. Among them, the highest 50% cancer suppression concentration was shown.
  • Table 25 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, and IC90 and the drug reduction index (DRI) of each single formulation of the combination formulations comprising two or more compounds according to the molar ratio of each drug in the HeLa cell line.
  • the combination index effect at 50 to 90% cancer inhibition rate was higher in the three combination formulations consisting of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT than the PHE / 2DG combination formulation showing the highest combination index among the two combination formulations.
  • the combination index of HMF / PHE / 2DG / CT was higher than the combination combination of HMF / PHE / CT and HMF / PHE / CT. It showed the highest combination index effect among all combination preparations.
  • the HMF / PHE / 2DG / CT formulation the combination of the four compounds with the highest synergistic effects at 50-90% cancer inhibition, was found to be 9.8 to 10.5 times HMF, 7.4 to 10.1 times PHE, 12.2 to 13.1 times CT, and 2DG. Had a drug reduction effect of 8.3 to 9.8 times, and the drug reduction index (DRI) was the highest.
  • FIG. 41 shows 50% cancer inhibition concentration by PHE after providing single and combination formulations consisting of HMF, PHE, 2DG and CT for 48 hours at specific doses in HeLa cell lines, cancer cells derived from human cervix.
  • One example is how much lower the drug toxicity of PHE can be.
  • the four drug combinations of HMF, PHE, 2DG and CT showed the lowest drug toxicity.
  • the 50% cancer suppression concentration caused by PHE was lowered to reduce drug toxicity.
  • the 4% combination of HMF / PHE / 2DG / CT showed the lowest 50% cancer suppression concentration by PHE than the 3 combinations composed of HMF / PHE / CT.
  • the four combination formulations showed the highest effect among all combination formulations.
  • FIG. 42 is a fractional effect-combination index (Fa-CI) graph of a HeLa cell line treated for 48 hours with a combination formulation consisting of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the combination index effect was higher in the three combination formulations consisting of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT than the PHE / 2DG combination formulation showing the highest combination index according to the fraction effect among the two combination formulations. (P ⁇ 0.01 each).
  • the combination index effect was higher in the four combination formulations composed of HMF / PHE / 2DG / CT than the three combination formulations composed of HMF / PHE / CT (p ⁇ 0.001). Among the highest combination index effect.
  • Example 1-7 Survival Inhibitory Effect of Breast Cancer Cell Line (MCF7)
  • MCF7 cell line which is a cancer cell derived from human breast
  • the effect of inhibiting cell proliferation of a single agent of HMF, biguanide-based compound (MET or PHE), 2DG and CT, and two or more combination agents was compared.
  • the combination of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival than the MET / 2DG combination having the highest cancer inhibition among the two combinations (respectively, respectively). p ⁇ 0.001).
  • four combinations composed of HMF / MET / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than three combinations composed of HMF / MET / CT (p ⁇ 0.001). It showed the highest cancer suppression rate among all the combination preparations.
  • Table 26 above shows Dm (or IC50), m (tilt), r (correlation coefficient) obtained by central-effect analysis using Calcusyn software for single and combination formulations of HMF, MET, 2DG and CT.
  • the r value ranged from 0.95 to 1.00, indicating a high correlation between dose and effect.
  • the m value ranged from 11.47 to 2.67, indicating that the dose-effect curve was nearly hyperbolic for the compounds used alone or in combination.
  • HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the MET / 2DG combination which showed the highest 50% cancer suppression among the two combinations.
  • 50 combinations of HMF / MET / 2DG / CT showed 50% lower cancer suppression effect than the three combinations of HMF / MET / CT. Among them, the highest 50% cancer suppression concentration was shown.
  • Table 27 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, and IC90 and the drug reduction index (DRI) of each single formulation of the combination formulations containing two or more compounds according to the molar ratio of each drug in the MCF7 cell line.
  • the combination index consisting of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher combination index effects at 50-90% cancer inhibition than the MET / 2DG combination.
  • the combination index effect at 50 to 90% cancer inhibition rate was higher in the four combination formulations composed of HMF / MET / 2DG / CT than the three combination formulations composed of HMF / MET / CT. It showed the highest combination index effect among all combination preparations.
  • the HMF / MET / 2DG / CT formulation the combination of the four compounds with the highest synergistic effects at 50-90% cancer inhibition, was 6.1-7.7 times HMF, 5.5-6.7 times MET, 11.8-17.2 times 2DG, and CT. Had a drug reduction effect of 6.9 to 9.3 times, with the highest drug reduction index (DRI).
  • DRI drug reduction index
  • FIG. 45 is a fractional effect-combination index (Fa-CI) graph of MCF7 cell line treated for 48 hours with a combination formulation consisting of HMF, MET, 2DG and CT.
  • the combination index effect was higher in the three combination formulations consisting of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT than the MET / 2DG combination formulation showing the highest combination index according to the fraction effect among the two combination formulations. (P ⁇ 0.001, respectively).
  • the combination index effect was higher in the four combination formulations consisting of HMF / MET / 2DG / CT than the three combination formulations consisting of HMF / MET / CT (p ⁇ 0.001).
  • FIG. 46 shows inhibition of cancer cell viability after providing a single preparation of HMF, PHE, 2DG and CT and two or more combination preparations by concentrations indicated in MCF7 cell line, a cancer cell derived from human breast, for 48 hours by concentration. The effect is shown. The higher the number of combination preparations than the single preparations of HMF, PHE, 2DG and CT, the higher the effect of inhibiting cancer cell survival.
  • Table 28 above shows Dm (or IC50), m (tilt), r (correlation coefficient) obtained by central-effect analysis using Calcusyn software for single and combination formulations of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the r value ranged from 0.95 to 1.00, indicating a high correlation between dose and effect.
  • the m value ranged from 1.47 to 2.67, indicating that the dose-effect curve was nearly hyperbolic for the compounds used alone or in combination.
  • the combination of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the PHE / 2DG combination which showed the highest 50% cancer suppression among the two combinations.
  • the four combinations composed of HMF / PHE / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the three combinations composed of HMF / PHE / CT. Among them, the highest 50% cancer suppression concentration was shown.
  • Table 29 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, and IC90 of the combination formulations containing two or more compounds according to the molar ratio of each drug in the MCF7 cell line and the drug reduction index (DRI) of each single formulation.
  • the combination index effect at 50 to 90% cancer inhibition rate was higher in the three combination formulations consisting of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT than the PHE / 2DG combination formulation showing the highest combination index among the two combination formulations.
  • the combination index of HMF / PHE / 2DG / CT was higher than the combination combination of HMF / PHE / CT and HMF / PHE / CT. It showed the highest combination index effect among all combination preparations.
  • the HMF / PHE / 2DG / CT formulation the combination of the four compounds with the highest synergistic effects at 50-90% cancer inhibition, was 5.5-7.0 times HMF, 5.7-5.9 times PHA, 10.7-15.3 times 2DG, and CT. Had a drug reduction effect of 6.1 to 8.4 times, which was the highest in the drug reduction index (DRI).
  • DRI drug reduction index
  • FIG. 48 depicts 50% cancer suppression concentration by PHE after single and combination formulations consisting of HMF, PHE, 2DG and CT were given for 48 hours at specific doses to MCF7 cell line, a cancer cell derived from human breast. It shows how much lower the drug toxicity of PHE can be. Among the PHE single formulations and two or more combination formulations, the four drug combinations of HMF, PHE, 2DG and CT showed the lowest drug toxicity.
  • FIG. 49 is a Fa-CI graph of MCF7 cell lines treated for 48 hours by HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the combination index according to the fractional effect (Fraction Affected) showed synergistic effects with both low and high inhibition rates in the four combination formulations of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • FIG. 49 is a fractional effect-combination index (Fa-CI) graph of MCF7 cell line treated with a combination formulation consisting of HMF, PHE, 2DG and CT for 48 hours.
  • the combination index effect was higher in the three combination formulations consisting of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT than the PHE / 2DG combination formulation showing the highest combination index according to the fraction effect among the two combination formulations. (P ⁇ 0.001, respectively).
  • the combination index effect was higher in the four combination formulations composed of HMF / PHE / 2DG / CT than the three combination formulations composed of HMF / PHE / CT (p ⁇ 0.001).
  • Example 1-8 Survival Inhibitory Effect of Prostate Cancer Cell Line (PC-3)
  • PC-3 cell line which is a cancer cell derived from human prostate
  • FIG. 50 shows cancer cells after concentration of each single agent of HMF, MET, 2DG and CT and two or more combinations for 48 hours by concentrations indicated in PC-3 cell line, a cancer cell derived from human prostate It shows the effect of suppressing survival rate.
  • FIG. 51 shows the effect of inhibiting cancer cell viability after providing a single dose of HMF, MET, 2DG and CT, and a combination of two or more combinations for 48 hours at a specific dose to PC-3 cell lines, which are cancer cells derived from human prostate. It is shown.
  • the combination of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than the MET / 2DG combination having the highest cancer suppression rate among the two combinations (respectively, respectively). p ⁇ 0.001).
  • four combinations composed of HMF / MET / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than three combinations composed of HMF / MET / CT (p ⁇ 0.001). It showed the highest cancer suppression rate among all the combination preparations.
  • Table 30 shows Dm (or IC50), m (tilt), r (correlation coefficient) obtained by central-effect analysis using Calcusyn software for single and combination formulations of HMF, MET, 2DG and CT.
  • the r value ranged from 0.96 to 1.00, indicating a high correlation between dose and effect.
  • the m value ranged from 1.49 to 2.87, indicating that the dose-effect curve was nearly hyperbolic for the compounds used alone or in combination.
  • HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the MET / 2DG combination which showed the highest 50% cancer suppression among the two combinations.
  • 50 combinations of HMF / MET / 2DG / CT showed 50% lower cancer suppression effect than the three combinations of HMF / MET / CT. Among them, the highest 50% cancer suppression concentration was shown.
  • Table 31 shows the Combination Index (CI) at IC50, IC75, and IC90 and the Drug Reduction Index (DRI) for each single agent for combination formulations containing two or more compounds according to the molar ratio of each drug in the PC-3 cell line. .
  • the combination index consisting of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher combination index effects at 50-90% cancer inhibition than the MET / 2DG combination.
  • the combination index of HMF / MET / 2DG / CT was higher than the combination combination of HMF / MET / CT, and the combination index effect was higher at 50 to 90% cancer inhibition rate. It showed the highest combination index effect among all combination preparations.
  • FIG. 52 is a fractional effect-combination index (Fa-CI) graph of PC-3 cell lines treated with a combination formulation consisting of HMF, MET, 2DG and CT for 48 hours.
  • the combination index effect was higher in the three combination formulations consisting of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT than the MET / 2DG combination formulation showing the highest combination index according to the fraction effect among the two combination formulations. (P ⁇ 0.01, p ⁇ 0.05, respectively).
  • the combination index effect was higher in the four combination formulations consisting of HMF / MET / 2DG / CT than the three combination formulations consisting of HMF / MET / CT (p ⁇ 0.001).
  • FIG. 53 shows cancer cells after providing a single preparation of HMF, PHE, 2DG, and CT and two or more combinations for 48 hours at different concentrations by doses indicated in PC-3 cell lines, cancer cells derived from human prostate; It shows the effect of suppressing survival rate.
  • FIG. 54 shows the effect of inhibiting cancer cell viability after providing a single dose of HMF, PHE, 2DG, and CT and two or more combinations for 48 hours at a specific dose to PC-3 cell line, which is a cancer cell derived from human prostate. It is shown.
  • the combination of HMF, PHE, 2DG, and CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival in combination.
  • the three combination formulations composed of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than the PHE / 2DG combination formulations showing the highest cancer inhibition rates among the two combination formulations (respectively, respectively).
  • four combinations composed of HMF / PHE / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than three combinations composed of HMF / PHE / CT (p ⁇ 0.001). It showed the highest cancer suppression rate among all the combination preparations.
  • Table 32 above shows Dm (or IC50), m (tilt), r (correlation coefficient) obtained by central-effect analysis using Calcusyn software for single and combination formulations of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the r value ranged from 0.96 to 1.00, indicating a high correlation between dose and effect.
  • the m value ranged from 1.55 to 2.87, indicating that the dose-effect curve was nearly hyperbolic for the compounds used alone or in combination.
  • the combination of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the PHE / 2DG combination which showed the highest 50% cancer suppression among the two combinations.
  • the four combinations composed of HMF / PHE / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the three combinations composed of HMF / PHE / CT. Among them, the highest 50% cancer suppression concentration was shown.
  • Table 33 shows the Combination Index (CI) at IC50, IC75, IC90 and Combination Reduction (DRI) for each single agent of combination formulations containing two or more compounds according to the molar ratio of each drug in the PC-3 cell line. .
  • the combination index effect at 50 to 90% cancer inhibition rate was higher in the three combination formulations consisting of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT than the PHE / 2DG combination formulation showing the highest combination index among the two combination formulations.
  • the combination index of HMF / PHE / 2DG / CT was higher than the combination combination of HMF / PHE / CT and HMF / PHE / CT. It showed the highest combination index effect among all combination preparations.
  • the HMF / PHE / 2DG / CT formulation the combination of the four compounds with the highest synergistic effects at 50-90% cancer inhibition, was 5.4-7.1 times HMF, 4.8-6.1 times PHE, 8.8-12.8 times 2DG, and CT. Showed a drug reduction effect of 4.7 to 5.3 times, the highest drug reduction index (DRI).
  • FIG. 55 shows the 50% cancer suppression concentration by PHE after providing single and combination formulations consisting of HMF, PHE, 2DG and CT for 48 hours at specific doses in PC-3 cell line, a cancer cell derived from human prostate The figure shows how low the drug toxicity of PHE can be.
  • the four drug combinations of HMF, PHE, 2DG and CT showed the lowest drug toxicity.
  • the 50% cancer suppression concentration caused by PHE was lowered to reduce drug toxicity.
  • the 4% combination of HMF / PHE / 2DG / CT showed the lowest 50% cancer suppression concentration by PHE than the 3 combinations composed of HMF / PHE / CT.
  • the four combination formulations showed the highest effect among all combination formulations.
  • Figure 56 is a Fa-CI graph of PC-3 cell lines treated for 48 hours by HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the combination index according to the fractional effect (Fraction Affected) showed synergistic effects with both low and high inhibition rates in the four combination formulations of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • FIG. 56 is a fractional effect-combination index (Fa-CI) graph of PC-3 cell lines treated with a combination formulation consisting of HMF, PHE, 2DG and CT for 48 hours.
  • the combination index effect was higher in the three combination formulations consisting of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT than the PHE / 2DG combination formulation showing the highest combination index according to the fraction effect among the two combination formulations. (P ⁇ 0.001, respectively).
  • the combination index effect was higher in the four combination formulations composed of HMF / PHE / 2DG / CT than the three combination formulations composed of HMF / PHE / CT (p ⁇ 0.001).
  • Example 1-9 Inhibitory Effect of Survival of Ovarian Cancer Cell Line (SK-OV-3)
  • SK-OV-3 cell line which is a cancer cell derived from human ovary
  • cell proliferation inhibitory effects of HMF, biguanide compounds (MET or PHE), 2DG and CT, and two or more combination agents, respectively, were compared.
  • FIG. 57 shows each single agent of HMF, MET, 2DG, and CT and two or more combinations for 48 hours at different concentrations by doses indicated in SK-OV-3 cell line, a cancer cell derived from human ovary. The effect of inhibiting cancer cell survival rate is shown. The higher the number of combination preparations than the single preparation of HMF, MET, 2DG and CT, the higher the effect of inhibiting cancer cell survival.
  • FIG. 58 shows cancer cell viability after providing a single dose of HMF, MET, 2DG, and CT and two or more combinations for 48 hours at specific doses to SK-OV-3 cell line, a cancer cell derived from human ovary. Inhibitory effect is shown. The combination of HMF, MET, 2DG and CT, rather than a single formulation, showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival.
  • the three combination formulations composed of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than the MET / 2DG combination formulation showing the highest cancer inhibition among the two combination formulations (respectively, respectively). p ⁇ 0.001).
  • four combinations composed of HMF / MET / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than three combinations composed of HMF / MET / CT (p ⁇ 0.001). It showed the highest cancer suppression rate among all the combination preparations.
  • Table 34 above shows Dm (or IC50), m (tilt), r (correlation coefficient) obtained by central-effect analysis using Calcusyn software for single and combination formulations of HMF, MET, 2DG and CT.
  • the r value ranged from 0.97 to 1.00, indicating a high correlation between dose and effect.
  • the m value ranged from 1.25 to 1.87, indicating that the dose-effect curve was nearly hyperbolic for the compounds used alone or in combination.
  • HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the MET / 2DG combination which showed the highest 50% cancer suppression among the two combinations.
  • 50 combinations of HMF / MET / 2DG / CT showed 50% lower cancer suppression effect than the three combinations of HMF / MET / CT. Among them, the highest 50% cancer suppression concentration was shown.
  • Table 35 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, and IC90 of the combination formulations containing two or more compounds according to the molar ratio of each drug in the SK-OV-3 cell line and the drug reduction index (DRI) of each single formulation. Indicated.
  • the combination index consisting of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher combination index effects at 50-90% cancer inhibition than the MET / 2DG combination.
  • the combination index of HMF / MET / 2DG / CT was higher than the combination combination of HMF / MET / CT, and the combination index effect was higher at 50 to 90% cancer inhibition rate. It showed the highest combination index effect among all combination preparations.
  • the HMF / MET / 2DG / CT formulation the combination of the four compounds with the highest synergistic effects at 50-90% cancer inhibition, was 5.3-5.8 times HMF, 5.6-6.7 times MET, 10.7-14.9 times 2DG, and CT. Had a drug reduction effect of 7.3 to 9.4 times, with the highest drug reduction index (DRI).
  • DRI drug reduction index
  • FIG. 59 is a fractional effect-combination index (Fa-CI) graph of a SK-OV-3 cell line treated with a combination formulation consisting of HMF, MET, 2DG and CT for 48 hours.
  • the combination index effect was higher in the three combination formulations consisting of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT than the MET / 2DG combination formulation showing the highest combination index according to the fraction effect among the two combination formulations. (P ⁇ 0.05, p ⁇ 0.001, respectively).
  • the combination index effect was higher in the four combination formulations consisting of HMF / MET / 2DG / CT than the three combination formulations consisting of HMF / MET / CT (p ⁇ 0.001).
  • FIG. 60 shows each single agent of HMF, PHE, 2DG, and CT and two or more combinations for 48 hours at different concentrations by doses indicated in SK-OV-3 cell line, a cancer cell derived from human ovary. The effect of inhibiting cancer cell survival rate is shown. The higher the number of combination preparations than the single preparations of HMF, PHE, 2DG and CT, the higher the effect of inhibiting cancer cell survival.
  • FIG. 61 shows cancer cell viability after a single dose of HMF, PHE, 2DG and CT, and each combination of two or more combinations were given to the SK-OV-3 cell line, a cancer cell derived from human ovary, for a specific dose for 48 hours. Inhibitory effect is shown. The combination of HMF, PHE, 2DG, and CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival in combination.
  • Table 36 above shows Dm (or IC50), m (tilt), r (correlation coefficient) obtained by central-effect analysis using Calcusyn software for single and combination formulations of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the r value ranged from 0.90 to 1.00, indicating a high correlation between dose and effect.
  • the m value ranged from 1.25 to 1.87, indicating that the dose-effect curve was nearly hyperbolic for the compounds used alone or in combination.
  • the combination of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the PHE / 2DG combination which showed the highest 50% cancer suppression among the two combinations.
  • the four combinations composed of HMF / PHE / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the three combinations composed of HMF / PHE / CT. Among them, the highest 50% cancer suppression concentration was shown.
  • Table 37 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, and IC90 of the combination formulations containing two or more compounds according to the molar ratio of each drug in the SK-OV-3 cell line and the drug reduction index (DRI) of each single formulation. Indicated.
  • the combination index effect at 50 to 90% cancer inhibition rate was higher in the three combination formulations consisting of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT than the PHE / 2DG combination formulation showing the highest combination index among the two combination formulations.
  • the combination index of HMF / PHE / 2DG / CT was higher than the combination combination of HMF / PHE / CT and HMF / PHE / CT. It showed the highest combination index effect among all combination preparations.
  • HMF / PHE / 2DG / CT preparations the combination of four compounds with the highest synergistic effects at 50-90% cancer inhibition, were 5.4-6.4 times HMF, 4.9-6.5 times PHE, 11.8-15.0 times CT, and 2DG. Showed a drug reduction effect of 7.4 to 10.3 times, with the highest drug reduction index (DRI).
  • DRI drug reduction index
  • FIG. 62 shows a single and combination formulation consisting of HMF, PHE, 2DG and CT for 48 hours at specific doses in SK-OV-3 cell line, a cancer cell derived from human ovary, and then 50% cancer suppression by PHE.
  • the concentration plot shows how much lower the drug toxicity of PHE can be.
  • the four drug combinations of HMF, PHE, 2DG and CT showed the lowest drug toxicity.
  • the 50% cancer suppression concentration caused by PHE was lowered to reduce drug toxicity.
  • the 4% combination of HMF / PHE / 2DG / CT showed the lowest 50% cancer suppression concentration by PHE than the 3 combinations composed of HMF / PHE / CT.
  • the four combination formulations showed the highest effect among all combination formulations.
  • FIG. 63 is a Fa-CI graph of SK-OV-3 cell lines treated for 48 hours by HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the combination index according to the fractional effect (Fraction Affected) showed synergistic effects with both low and high inhibition rates in the four combination formulations of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • FIG. 63 is a fractional effect-combination index (Fa-CI) graph of a SK-OV-3 cell line treated with a combination formulation consisting of HMF, PHE, 2DG and CT for 48 hours.
  • the combination index effect was higher in the three combination formulations consisting of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT than the PHE / 2DG combination formulation showing the highest combination index according to the fraction effect among the two combination formulations. (P ⁇ 0.001, respectively).
  • the combination index effect was higher in the four combination formulations composed of HMF / PHE / 2DG / CT than the three combination formulations composed of HMF / PHE / CT (p ⁇ 0.001).
  • Example 1-10 Inhibitory Effect of Survival of Bladder Cancer Cell Line (T24)
  • T24 cell line which is a cancer cell derived from human bladder
  • the effect of inhibiting cell proliferation of a single agent of HMF, biguanide-based compound (MET or PHE), 2DG and CT, and two or more combination agents was compared.
  • FIG. 64 shows inhibition of cancer cell viability after providing a single preparation of HMF, MET, 2DG and CT and two or more combination preparations by concentrations indicated in T24 cell line, which is a cancer cell derived from human bladder, for 48 hours by concentration. The effect is shown. The higher the number of combination preparations than the single preparation of HMF, MET, 2DG and CT, the higher the effect of inhibiting cancer cell survival.
  • FIG. 65 shows the effect of inhibiting cancer cell viability after providing a single dose of HMF, MET, 2DG, and CT and two or more combinations for 48 hours at specific doses to T24 cell lines, which are cancer cells derived from human bladder. It is.
  • the combination of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than the MET / 2DG combination, which showed the highest cancer inhibition among the two combinations (respectively, respectively). p ⁇ 0.001).
  • four combinations composed of HMF / MET / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than three combinations composed of HMF / MET / CT (p ⁇ 0.001). It showed the highest cancer suppression rate among all the combination preparations.
  • Table 38 above shows Dm (or IC50), m (tilt), r (correlation coefficient) obtained by central-effect analysis using Calcusyn software for single and combination formulations of HMF, MET, 2DG and CT.
  • the r value ranged from 0.98 to 1.00, indicating a high correlation between dose and effect.
  • the m value ranged from 1.19 to 2.22, indicating that the dose-effect curve was nearly hyperbolic for the compounds used alone or in combination.
  • HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the MET / 2DG combination which showed the highest 50% cancer suppression among the two combinations.
  • 50 combinations of HMF / MET / 2DG / CT showed 50% lower cancer suppression effect than the three combinations of HMF / MET / CT. Among them, the highest 50% cancer suppression concentration was shown.
  • Table 39 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, and IC90 and the drug reduction index (DRI) of each single formulation of the combination formulations containing two or more compounds according to the molar ratio of each drug in the T24 cell line.
  • the combination index consisting of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT showed higher combination index effects at 50-90% cancer inhibition than the MET / 2DG combination.
  • the combination index of HMF / MET / 2DG / CT was higher than the combination combination of HMF / MET / CT, and the combination index effect was higher at 50 to 90% cancer inhibition rate. It showed the highest combination index effect among all combination preparations.
  • HMF / MET / 2DG / CT preparations the combination of four compounds with the highest synergistic effects at 50-90% cancer inhibition, were 6.1-7.7 times HMF, 6.0-7.4 times MET, 14.1--25.5 times 2DG, and CT. Had a drug reduction effect of 6.9 to 9.1 times, with the highest drug reduction index (DRI).
  • DRI drug reduction index
  • FIG. 66 is a fractional effect-combination index (Fa-CI) graph of a T24 cell line treated for 48 hours with a combination formulation consisting of HMF, MET, 2DG and CT.
  • the combination index effect was higher in the three combination formulations consisting of HMF / MET / 2DG or MET / 2DG / CT than the MET / 2DG combination formulation showing the highest combination index according to the fraction effect among the two combination formulations. (P ⁇ 0.01, p ⁇ 0.001, respectively).
  • the combination index effect was higher in the four combination formulations consisting of HMF / MET / 2DG / CT than the three combination formulations consisting of HMF / MET / CT (p ⁇ 0.001).
  • 67 shows inhibition of cancer cell viability after providing a single preparation of HMF, PHE, 2DG and CT and two or more combinations for 48 hours at different concentrations by doses indicated in T24 cell lines, which are cancer cells derived from human bladder. The effect is shown. The higher the number of combination preparations than the single preparations of HMF, PHE, 2DG and CT, the higher the effect of inhibiting cancer cell survival.
  • FIG. 68 shows the effect of inhibiting cancer cell viability after providing a single dose of HMF, PHE, 2DG, and CT and two or more combinations for 48 hours at specific doses to T24 cell lines, which are cancer cells derived from human bladder. It is.
  • the combination of HMF, PHE, 2DG, and CT showed a higher effect of inhibiting cancer cell survival in combination.
  • the combination of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than the PHE / 2DG combination having the highest cancer inhibition among the two combinations (respectively, respectively). p ⁇ 0.001).
  • four combinations composed of HMF / PHE / 2DG / CT showed higher effects of inhibiting cancer cell survival than three combinations composed of HMF / PHE / CT (p ⁇ 0.001). It showed the highest cancer suppression rate among all the combination preparations.
  • Table 40 above shows Dm (or IC50), m (tilt), r (correlation coefficient) obtained by central-effect analysis using Calcusyn software for single and combination formulations of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the r value ranged from 0.98 to 1.00, indicating a high correlation between dose and effect.
  • the m value ranged from 1.19 to 2.72, indicating that the dose-effect curve was nearly hyperbolic for the compounds used alone or in combination.
  • the combination of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the PHE / 2DG combination which showed the highest 50% cancer suppression among the two combinations.
  • the four combinations composed of HMF / PHE / 2DG / CT showed higher reduction of 50% cancer suppression than the three combinations composed of HMF / PHE / CT. Among them, the highest 50% cancer suppression concentration was shown.
  • Table 41 shows the combination index (CI) at IC50, IC75, and IC90 of the combination formulations containing two or more compounds according to the molar ratio of each drug in the T24 cell line and the drug reduction index (DRI) of each single formulation.
  • the combination index effect at 50 to 90% cancer inhibition rate was higher in the three combination formulations consisting of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT than the PHE / 2DG combination formulation showing the highest combination index among the two combination formulations.
  • the four combinations composed of HMF / PHE / 2DG / CT showed higher effects of 50-90% cancer inhibition rate and the cancer inhibition rate index than the three combinations composed of HMF / PHE / CT. It showed the highest combination index effect among all combination preparations.
  • the HMF / PHE / 2DG / CT formulation the combination of the four compounds with the highest synergistic effects at 50-90% cancer inhibition, was found to be 7.6 to 8.6 fold, 4.3 to 5.9 fold for PHE, 15.6 to 31.9 fold for 2DG, and CT. Showed a drug reduction effect of 8.7 to 10.1 times, and the drug reduction index (DRI) was the highest.
  • FIG. 69 shows 50% cancer inhibition concentration by PHE after single and combination preparations consisting of HMF, PHE, 2DG and CT were given for 48 hours at specific doses in T24 cell line, a cancer cell derived from human bladder. It shows how much lower the drug toxicity of PHE can be. Among the PHE single formulations and two or more combination formulations, the four drug combinations of HMF, PHE, 2DG and CT showed the lowest drug toxicity.
  • the 50% cancer suppression concentration by PHE was lowered to reduce drug toxicity.
  • the four combinations consisting of HMF / PHE / 2DG / CT showed the lowest 50% cancer suppression concentration by PHE than the three combinations consisting of HMF / PHE / CT.
  • the four combination formulations showed the highest effect among all combination formulations.
  • FIG. 70 shows a Fa-CI graph of T24 cell lines treated for 48 hours by HMF, PHE, 2DG and CT.
  • the combination index according to the fractional effect showed synergistic effects with both low and high inhibition rates in the four combination formulations of HMF, PHE, 2DG and CT.
  • FIG. 70 is a fractional effect-combination index (Fa-CI) graph of a T24 cell line treated with a combination formulation consisting of HMF, PHE, 2DG and CT for 48 hours.
  • the combination index effect was higher in the three combination formulations consisting of HMF / PHE / 2DG or PHE / 2DG / CT than the PHE / 2DG combination formulation showing the highest combination index according to the fraction effect among the two combination formulations. (P ⁇ 0.001, respectively).
  • the combination index effect was higher in the four combination formulations composed of HMF / PHE / 2DG / CT than the three combination formulations composed of HMF / PHE / CT (p ⁇ 0.001).
  • HMF HMF
  • MET MET
  • 2DG a cancer cell derived from human liver.
  • Each drug used at this time was used within a range not exceeding up to 40 mM.
  • Example 2-1 Effect of HMF, MET or PHE, 2DG and CT on the Proliferation of HepG2 Cells
  • HMF, MET or PHE, 2DG and CT were 3.5: 25 (0.8 for PHE) in the cell culture:
  • the experimental group to which the combination preparation containing 1: 3 mM concentration ratio and the control group which did not add it were incubated for 24, 48, 72 hours, and the MTT assay was performed and the number of living cells was measured.
  • Delay in cell cycle progression is one of the methods of inhibiting the proliferation of cancer cells.
  • Cells that enter apoptosis appear less to the left than G0 / G1 cells in the histogram when stained with PI solution because the amount of DNA is less than that of G0 / G1 cells, which is called Sub-G1.
  • the amount of DNA was calculated as the cell group%.
  • PI penetrates the cell membrane and stains DNA in the nucleus, so that not only early apoptotic cells but also late apoptotic cells and necrotic cells can be stained.
  • Sub-G1 cells increased over time. As a result, the number of cells staying in sub-G1 increased significantly as the number of combination preparations in the cell culture rather than a single preparation of HMF, MET, 2DG and CT increased (FIG. 73).
  • Low phosphorylated Rb a cell cycle regulator
  • E2F a cell cycle regulator
  • CDK4 cyclin dependent kinase
  • Cyclin has also been found to interact with cell division cycle genes in the G1 and G2 phases of the cell cycle and to regulate cell cycle, and has been reported to be overexpressed in cancer cells.
  • Protein expression of cyclin D1 was most decreased in four combination formulations of a single formulation of HMF, MET and CT and two or more combination formulations.
  • the experimental results showed the greatest increase in four combination formulations of a single formulation of HMF, MET, 2DG and CT and two or more combination formulations (FIG. 74).
  • Example 2-4 Effect of Combination Formulation of HMF, MET or PHE, 2DG and CT on Normal Cells at 50% Cancer Inhibitory Concentration
  • HepG2 was 1.90 times higher than normal cells when HMF, MET, 2DG and CT of the combination formulation were 50% cancer inhibiting concentration, HMF, PHE of the combination formulation.
  • HMF, MET, 2DG and CT HepG2 was observed to increase the cytotoxicity 1.86 times than normal cells, the toxicity of the combination preparations in the liver cancer cells than the normal hepatocytes.
  • Example 2-5 Effect of Combination Formulation of HMF, MET or PHE, 2DG and CT on AMPK Activity of HepG2 Cells
  • AMPK is an enzyme that attaches phosphates to proteins, regulates sugar and lipid metabolism, and controls enzymes involved in energy production. Incorrect function of AMPK can lead to problems with metabolic processes and can lead to diseases such as diabetes and cancer.
  • Table 42 shows the phosphorylated degree of threonine 172 residue (Thr172) of AMPK ⁇ .
  • HMF / MET / 2DG / CT a combination of four compounds in a single formulation of HMF, MET, 2DG and CT and two or more combinations, was 28.3 times when treated with HMF alone, 3.1 times when MET, 12.0 times when 2DG, and CT A 17.7-fold increase in value indicated the highest degree of AMPK activation.
  • HMF / PHE / 2DG / CT which is a combination of four compounds in a single formulation of HMF, PHE, 2DG and CT and two or more combination formulations, was 25.8 times higher than HMF alone, 3.0 times PHE, and 11.0 times 2DG.
  • CT showed a 16.2-fold increase, indicating the highest degree of AMPK activation (Table 43).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

본 발명은 (1) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; (2) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 (3) 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및/또는 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물, 암의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물, 및 상기 항암용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 항암용 조성물은 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural), 메트포르민, 펜포르민, 2-데옥시-D-글루코스 및 구연산의 상승적 조합 제제로서 각각의 단일 제제보다 적은 양으로 암세포의 생존을 억제할 수 있으며, 정상세포에는 독성을 나타내지 않으면서 암세포의 세포주기를 선택적으로 억제하여, 이의 사멸을 유도할 수 있으므로, 부작용 없는 항암제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

항암용 조성물
본 발명은 (1) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; (2) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 (3) 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및/또는 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물, 암의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물, 및 상기 항암용 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
최근 전체 사망원인 중 암에 의한 사망은 4명 중 1명꼴로, 이는 계속 증가하는 추세에 있다. 이와 같이 사망원인의 대부분을 차지하는 암의 치료방법으로는 외과수술, 방사선 요법, 생물요법 및 화학요법 등이 있다. 이 중에서 항암제를 이용한 화학요법은 현재 암 치료를 위해 많이 사용되고 있으며, 잘 확립된 치료방법 중 하나이다. 이러한 항암제는 암세포의 대사경로에 개입하여 DNA와의 직접적인 상호 작용에 의해 DNA의 복제, 전사, 번역과정을 차단하거나, 핵산 전구체의 합성을 방해하고, 세포의 분열을 저해함으로써 세포에 대한 독성을 나타낸다. 이에 따라, 항암제는 정상세포에도 치명적인 손상을 주어 골수 파괴로 인한 백혈구, 혈소판, 적혈구 등의 혈구 감소증; 모낭세포 파괴로 인한 탈모증상; 난소와 고환에 대한 부작용으로 월경불순 및 남성불임의 원인; 소화기의 점막 세포 파괴로 인한 부작용으로 구내염, 오심구토 및 음식 연하장애와 소화 장애; 설사증상; 세뇨관 괴사에 의한 신장독성; 신경계 장애로 발생하는 말초 신경염과 쇠약감; 혈관통증 및 발진 등의 혈관장애; 피부 및 손발톱 변색 등의 다양한 부작용이 나타난다. 따라서 항암제에 의한 부작용을 최소화하면서 치료 효과를 상승시키기 위한 연구가 절실하다.
또한 항암 치료가 실패하는 주요 원인은 항암제가 초기에는 효과를 나타내지만 점차 약제 내성이 발현되고, 면역력이 극도로 악화되기 때문이다. 따라서 약제의 독성을 증가시키지 않으면서 암 치료 효능을 개선시키는 방법이 필요하다. 항암제의 효능을 향상시키는 한 방식으로 항암제를 조합하여 사용할 수 있는데, 불행하게도, 항암효과가 있는 약물을 조합한다고 해서 모두 상승효과를 나타낸다고 기대할 수 없으며, 상승효과를 갖는 약물의 조합을 발견하는 것은 매우 어려운 일이다. 따라서 항암제의 부작용을 최소화하면서, 항암효과가 최대로 발휘될 수 있는 항암 조합 제제의 개발이 시급한 실정이다.
본 발명자들은 암의 치료효과가 최대로 발휘될 수 있으면서, 사용 농도를 최소로 하여 인체에 부작용이 없는 항암물질을 찾기 위해 예의 노력한 결과, 특정 화합물의 조합을 통해서 항암 상승효과를 보이는 조합 제제를 개발하였으며, 상기 조합 제제가 화합물의 저농도의 조합으로도 세포주기를 억제하고, AMPK(AMP-activated kinase)를 활성화시켜 효과적으로 암세포를 사멸시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 하나의 목적은 소량으로도 암을 효과적으로 치료할 수 있으며, 암세포 특이적으로 독성효과를 나타내어, 부작용이 감소된 항암용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 암의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항암용 조성물을, 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 항암용 조성물은 과량으로 사용해야만 하는 특정 약물들의 조합을 통해 상승적 항암효과를 나타내어 적은 양으로도 AMPK(AMP-activated kinase)를 활성화시켜 암세포의 사멸과 세포주기를 억제함으로써 효과적으로 암을 치료할 수 있다. 또한 본 발명의 항암용 조성물은 정상세포에는 독성을 나타내지 않으면서 암세포 특이적으로 독성효과를 나타내어, 부작용없이 암세포를 사멸시킬 수 있으므로 항암제로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은, 인간의 간에서 유래한 암세포인 HepG2 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 농도별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 2는, HepG2 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다(실험군과 대조군의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 조합군 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 3은, HepG2 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 조합하였을 때 Fa(Fraction Affected)에 대한 조합지수(CI)를 나타내는 Fa-CI 그래프이다(4종 조합군(HMF/MET/2DG/CT)과의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 2종 조합군(MET/2DG)과 3종 조합군(HMF/MET/2DG, MET/2DG/CT) 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 4는, HepG2 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 농도별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 5는, HepG2 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다(실험군과 대조군의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 조합군 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 6은, HepG2 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여, 48시간 후 MTT 분석법에 의한 단일 및 조합 조성물에서 50% 암억제율에 해당하는 PHE의 약물 독성을 얼마나 낮출 수 있는가를 보여주는 농도비교 그래프이다.
도 7은, HepG2 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 조합하였을 때 Fa(Fraction Affected)에 대한 조합지수(CI)를 나타내는 Fa-CI 그래프이다(4종 조합군(HMF/PHE/2DG/CT)과의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 2종 조합군(PHE/2DG)과 3종 조합군(HMF/PHE/2DG, PHE/2DG/CT) 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 8은, 인간의 폐에서 유래한 암세포인 A549 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 농도별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 9는, A549 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다(실험군과 대조군의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 조합군 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 10은, A549 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 조합하였을 때 Fa(Fraction Affected)에 대한 조합지수(CI)를 나타내는 Fa-CI 그래프이다(4종 조합군(HMF/MET/2DG/CT)과의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 2종 조합군(MET/2DG)과 3종 조합군(HMF/MET/2DG, MET/2DG/CT) 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 11은, A549 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 농도별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 12는, A549 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다(실험군과 대조군의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 조합군 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 13은, A549 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여, 48시간 후 MTT 분석법에 의한 단일 및 조합 조성물에서 50% 암억제율에 해당하는 PHE의 약물 독성을 얼마나 낮출 수 있는가를 보여주는 농도비교 그래프이다.
도 14는, A549 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 조합하였을 때 Fa(Fraction Affected)에 대한 조합지수(CI)를 나타내는 Fa-CI 그래프이다(4종 조합군(HMF/PHE/2DG/CT)과의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 2종 조합군(PHE/2DG)과 3종 조합군(HMF/PHE/2DG, PHE/2DG/CT) 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 15는, 인간의 위에서 유래한 암세포인 AGS 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 농도별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 16은, AGS 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다(실험군과 대조군의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 조합군 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 17은, AGS 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 조합하였을 때 Fa(Fraction Affected)에 대한 조합지수(CI)를 나타내는 Fa-CI 그래프이다(4종 조합군(HMF/MET/2DG/CT)과의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 2종 조합군(MET/2DG)과 3종 조합군(HMF/MET/2DG, MET/2DG/CT) 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 18은, AGS 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 농도별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 19는, AGS 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다(실험군과 대조군의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 조합군 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 20은, AGS 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여, 48시간 후 MTT 분석법에 의한 단일 및 조합 조성물에서 50% 암억제율에 해당하는 PHE의 약물 독성을 얼마나 낮출 수 있는가를 보여주는 농도비교 그래프이다.
도 21은, AGS 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 조합하였을 때 Fa(Fraction Affected)에 대한 조합지수(CI)를 나타내는 Fa-CI 그래프이다(4종 조합군(HMF/PHE/2DG/CT)과의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 2종 조합군(PHE/2DG)과 3종 조합군(HMF/PHE/2DG, PHE/2DG/CT) 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 22는, 인간의 췌장에서 유래한 암세포인 Capan-2 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 농도별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 23은, Capan-2 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다(실험군과 대조군의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 조합군 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 24는, Capan-2 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 조합하였을 때 Fa(Fraction Affected)에 대한 조합지수(CI)를 나타내는 Fa-CI 그래프이다(4종 조합군(HMF/MET/2DG/CT)과의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 2종 조합군(MET/2DG)과 3종 조합군(HMF/MET/2DG, MET/2DG/CT) 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 25는, Capan-2 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 농도별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 26은, Capan-2 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다(실험군과 대조군의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 조합군 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 27은, Capan-2 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여, 48시간 후 MTT 분석법에 의한 단일 및 조합 조성물에서 50% 암억제율에 해당하는 PHE의 약물 독성을 얼마나 낮출 수 있는가를 보여주는 농도비교 그래프이다.
도 28은, Capan-2 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 조합하였을 때 Fa(Fraction Affected)에 대한 조합지수(CI)를 나타내는 Fa-CI 그래프이다(4종 조합군(HMF/PHE/2DG/CT)과의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 2종 조합군(PHE/2DG)과 3종 조합군(HMF/PHE/2DG, PHE/2DG/CT) 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 29는, 인간의 대장에서 유래한 암세포인 DLD-1 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 농도별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 30은, DLD-1 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다(실험군과 대조군의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 조합군 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 31은, DLD-1 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 조합하였을 때 Fa(Fraction Affected)에 대한 조합지수(CI)를 나타내는 Fa-CI 그래프이다(4종 조합군(HMF/MET/2DG/CT)과의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 2종 조합군(MET/2DG)과 3종 조합군(HMF/MET/2DG, MET/2DG/CT) 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 32는, DLD-1 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 농도별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 33은, DLD-1 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다(실험군과 대조군의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 조합군 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 34는, DLD-1 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여, 48시간 후 MTT 분석법에 의한 단일 및 조합 조성물에서 50% 암억제율에 해당하는 PHE의 약물 독성을 얼마나 낮출 수 있는가를 보여주는 농도비교 그래프이다.
도 35는, DLD-1 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 조합하였을 때 Fa(Fraction Affected)에 대한 조합지수(CI)를 나타내는 Fa-CI 그래프이다(4종 조합군(HMF/PHE/2DG/CT)과의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 2종 조합군(PHE/2DG)과 3종 조합군(HMF/PHE/2DG, PHE/2DG/CT) 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 36은, 인간의 자궁 경부에서 유래한 암세포인 HeLa 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 농도별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 37은, HeLa 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다(실험군과 대조군의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 조합군 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 38은, HeLa 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 조합하였을 때 Fa(Fraction Affected)에 대한 조합지수(CI)를 나타내는 Fa-CI 그래프이다(4종 조합군(HMF/MET/2DG/CT)과의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 2종 조합군(MET/2DG)과 3종 조합군(HMF/MET/2DG, MET/2DG/CT) 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 39는, HeLa 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 농도별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 40은, HeLa 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다(실험군과 대조군의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 조합군 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 41은, HeLa 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여, 48시간 후 MTT 분석법에 의한 단일 및 조합 조성물에서 50% 암억제율에 해당하는 PHE의 약물 독성을 얼마나 낮출 수 있는가를 보여주는 농도비교 그래프이다.
도 42는, HeLa 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 조합하였을 때 Fa(Fraction Affected)에 대한 조합지수(CI)를 나타내는 Fa-CI 그래프이다(4종 조합군(HMF/PHE/2DG/CT)과의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 2종 조합군(PHE/2DG)과 3종 조합군(HMF/PHE/2DG, PHE/2DG/CT) 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 43은, 인간의 유방에서 유래한 암세포인 MCF7 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 농도별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 44는, MCF7 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다(실험군과 대조군의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 조합군 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 45는, MCF7 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 조합하였을 때 Fa(Fraction Affected)에 대한 조합지수(CI)를 나타내는 Fa-CI 그래프이다(4종 조합군(HMF/MET/2DG/CT)과의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 2종 조합군(MET/2DG)과 3종 조합군(HMF/MET/2DG, MET/2DG/CT) 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 46은, MCF7 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 농도별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 47은, MCF7 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다(실험군과 대조군의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 조합군 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 48은, MCF7 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여, 48시간 후 MTT 분석법에 의한 단일 및 조합 조성물에서 50% 암억제율에 해당하는 PHE의 약물 독성을 얼마나 낮출 수 있는가를 보여주는 농도비교 그래프이다.
도 49는, MCF7 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 조합하였을 때 Fa(Fraction Affected)에 대한 조합지수(CI)를 나타내는 Fa-CI 그래프이다(4종 조합군(HMF/PHE/2DG/CT)과의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 2종 조합군(PHE/2DG)과 3종 조합군(HMF/PHE/2DG, PHE/2DG/CT) 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 50은, 인간의 전립선에서 유래한 암세포인 PC-3 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 농도별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 51은, PC-3 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다(실험군과 대조군의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 조합군 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 52는, PC-3 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 조합하였을 때 Fa(Fraction Affected)에 대한 조합지수(CI)를 나타내는 Fa-CI 그래프이다(4종 조합군(HMF/MET/2DG/CT)과의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 2종 조합군(MET/2DG)과 3종 조합군(HMF/MET/2DG, MET/2DG/CT) 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 53은, PC-3 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 농도별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 54는, PC-3 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다(실험군과 대조군의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 조합군 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 55는, PC-3 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여, 48시간 후 MTT 분석법에 의한 단일 및 조합 조성물에서 50% 암억제율에 해당하는 PHE의 약물 독성을 얼마나 낮출 수 있는가를 보여주는 농도비교 그래프이다.
도 56은, PC-3 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 조합하였을 때 Fa(Fraction Affected)에 대한 조합지수(CI)를 나타내는 Fa-CI 그래프이다(4종 조합군(HMF/PHE/2DG/CT)과의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 2종 조합군(PHE/2DG)과 3종 조합군(HMF/PHE/2DG, PHE/2DG/CT) 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 57은, 인간의 난소에서 유래한 암세포인 SK-OV-3 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 농도별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 58은, SK-OV-3 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다(실험군과 대조군의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 조합군 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 59는, SK-OV-3 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 조합하였을 때 Fa(Fraction Affected)에 대한 조합지수(CI)를 나타내는 Fa-CI 그래프이다(4종 조합군(HMF/MET/2DG/CT)과의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 2종 조합군(MET/2DG)과 3종 조합군(HMF/MET/2DG, MET/2DG/CT) 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 60은, SK-OV-3 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 농도별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 61은, SK-OV-3 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다(실험군과 대조군의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 조합군 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001)
도 62는, SK-OV-3 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여, 48시간 후 MTT 분석법에 의한 단일 및 조합 조성물에서 50% 암억제율에 해당하는 PHE의 약물 독성을 얼마나 낮출 수 있는가를 보여주는 농도비교 그래프이다.
도 63은, SK-OV-3 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 조합하였을 때 Fa(Fraction Affected)에 대한 조합지수(CI)를 나타내는 Fa-CI 그래프이다(4종 조합군(HMF/PHE/2DG/CT)과의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 2종 조합군(PHE/2DG)과 3종 조합군(HMF/PHE/2DG, PHE/2DG/CT) 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 64는, 인간의 방광에서 유래한 암세포인 T24 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 농도별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 65는, T24 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다(실험군과 대조군의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 조합군 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 66은, T24 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 조합하였을 때 Fa(Fraction Affected)에 대한 조합지수(CI)를 나타내는 Fa-CI 그래프이다(4종 조합군(HMF/MET/2DG/CT)과의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 2종 조합군(MET/2DG)과 3종 조합군(HMF/MET/2DG, MET/2DG/CT) 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 67은, T24 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 농도별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 점의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 68은, T24 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여 48시간 후 MTT 분석법에 의한 세포 생존율을 백분율로 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다(실험군과 대조군의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 조합군 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 69는, T24 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 용량별로 처리하여, 48시간 후 MTT 분석법에 의한 단일 및 조합 조성물에서 50% 암억제율에 해당하는 PHE의 약물 독성을 얼마나 낮출 수 있는가를 보여주는 농도비교 그래프이다.
도 70은, T24 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 조합하였을 때 Fa(Fraction Affected)에 대한 조합지수(CI)를 나타내는 Fa-CI 그래프이다(4종 조합군(HMF/PHE/2DG/CT)과의 t-검정: * p<0.05; ** p<0.01; *** p<0.001. 2종 조합군(PHE/2DG)과 3종 조합군(HMF/PHE/2DG, PHE/2DG/CT) 사이의 t-검정: † p<0.05; †† p<0.01; ††† p<0.001).
도 71은, HepG2 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 3.5:25:1:3 mM 비율의 농도로 24, 48, 72시간 처리한 경우 HepG2 세포의 증식에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 72는, HepG2 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 3.5:0.8:1:3 mM 비율의 농도로 24, 48, 72시간 처리한 경우 HepG2 세포의 증식에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 73은, HepG2 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT 조합 제제를 첨가한 HepG2 세포와 첨가하지 않은 대조군 세포를 24시간 배양한 후, 유세포 분석에 의한 세포주기 분포를 나타낸 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 74는, HepG2 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 용량별로 처리하여 36시간 배양한 후 세포용해질(cell lysate)을 취해 어떤 단백질에 영향을 미치는지를 도시한 것이다.
도 75는, HepG2 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT 조합제제를 50% 암억제 농도로 정상 간세포 CHANG과 간암세포 HepG2에 48시간 처리한 후, 세포생존율을 도시한 것이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 76은, HepG2 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT 조합제제를 50% 암억제 농도로 정상 간세포 CHANG과 간암세포 HepG2에 48시간 처리한 후, 세포생존율을 도시한 것이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 77은, HepG2 세포주에 대해 HMF, MET, 2DG 및 CT를 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 용량별로 처리하여 36시간 배양한 후 AMPK 활성화 정도를 측정한 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
도 78은, HepG2 세포주에 대해 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 용량별로 처리하여 36시간 배양한 후 AMPK 활성화 정도를 측정한 그래프이다. 각 막대의 세로막대는 표준오차를 나타낸다.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 (1) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; (2) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 (3) 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및/또는 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.
다른 양태로서, 본 발명은 (1) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; (2) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 (3) 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및/또는 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 (1) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; (2) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 (3) 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및/또는 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서는 (1) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; (2) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 (3) 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및/또는 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 조합 제제를 제조함으로써, 부작용이 적으면서 소량으로도 암을 효과적으로 치료할 수 있는 항암제를 개발하였다.
본 발명의 조합 제제는 단일 화합물로 치료하는 경우보다 조합 제제에 포함되는 개별 화합물의 양을 더 적게 사용할 수 있으며, 이로 인해 부작용의 위험 및/또는 심각성은 상당 수준 낮추면서 치료의 전체적 효과는 유의미하게 높일 수 있는 장점이 있다.
본 발명에서, 5-하이드록시메틸푸르푸랄은 과일즙, 식품, 술 가공 시 향료로서 첨가되는 식품 첨가제이며, 식품 제조공정 단계에서 설탕 등의 다당류로부터 쉽게 만들어지는 분해산물로서 일상생활에서 음식물을 통하여 흔히 섭취되는 물질이다. 5-하이드록시메틸푸르푸랄은 하기 화학식 1의 구조를 갖는다.
화학식 1
Figure PCTKR2013007591-appb-C000001
본 발명에서는 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 비구아나이드계 화합물(메트포르민 또는 펜포르민) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 2-데옥시-D-글루코스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및/또는 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 조합함으로써 효과적으로 암세포의 사멸을 유도함을 확인하였다. 랫트(rat)에 5-하이드록시메틸푸르푸랄을 경구 투여 시, LD50이 2,500 mg/kg으로서, 5-하이드록시메틸푸르푸랄은 매우 안전성이 확보된 화합물이라는 것을 알 수 있었다(National Technical Information Service. Vol. OTS0544683).
본 발명에서, 비구아나이드계 화합물인 메트포르민(metformin) 또는 펜포르민(Phenformin)은 당뇨병 치료제로 알려져 있으며(표 1), 이는 하기 화학식 2로 표시된다.
화학식 2
Figure PCTKR2013007591-appb-C000002
표 1
비구아나이드계 R1 R2 R3 R4
메트포르민 H H CH3 CH3
펜포르민 H H H
Figure PCTKR2013007591-appb-I000001
본 발명에서는 메트포르민 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 펜포르민 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염과 2-데옥시-D-글루코스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및/또는 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 조합함으로써, 적은 농도에서도 높은 항암효과가 나타남을 확인하였다. 비구아나이드 계열 약물들은 세포 내 에너지 밸런스 및 영양분 대사 조절에 중추적인 역할을 하고 있는 AMPK(AMP-activated kinase)라는 효소를 활성화시켜 항암작용을 하는 것으로 알려졌다. 랫트(rat)에 메트포르민을 경구 투여 시, LD50이 1,450 mg/kg으로서, 메트포르민은 매우 안전성이 확보된 화합물이라는 것을 알 수 있었다(Gekkan Yakuji. Pharmaceuticals Monthly. Vol. 9, Pg. 759, 1967). 그러나 펜포르민은 경구용 당뇨병 치료제로 1950년 후반에 개발되어 인슐린 비의존형 당뇨병(제2형 당뇨병)의 치료에 사용되고자 하였으나, 유산산증(Lactic acidosis)이라는 심각한 부작용으로 인해 1970년대 후반 사용이 전면 금지되었다. 이에 본 발명에서는 펜포르민 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 2-데옥시-D-글루코스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및/또는 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 조합한 3종 이상의 화합물이 포함된 조성물을 제조하고, 상기 조성물이 펜포르민 단일 제제 또는 2종 화합물의 조합인 펜포르민과 2-데옥시-D-글루코스을 포함하는 조성물보다 훨씬 낮은 농도에서도 높은 항암효과를 나타내어 펜포르민이 가지고 있는 부작용을 효과적으로 낮출 수 있음을 확인하였다(도 6, 도 13, 도 20, 도 27, 도 34, 도 41, 도 48, 도 55, 도 62, 도 69).
본 발명에서, 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose)는 해당작용의 억제제로 사용될 수 있으며, 이는 화학식 3으로 표시되는 구조를 갖는다.
화학식 3
Figure PCTKR2013007591-appb-C000003
본 발명에서는 2-데옥시-D-글루코스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염에 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및/또는 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과의 조합에 의해 적은 농도에서도 높은 항암효과가 나타남을 확인하였다. 2-데옥시-D-글루코스는 포도당의 유도체로써 포도당 대사과정에 있어서 해당작용(glycolysis)을 막고, 소포체 내 단백질의 당화(glycosylation)를 저해하여 소포체 스트레스를 유도하게 된다. 이처럼 포도당 분해 억제제인 2-데옥시-D-글루코스는 단독으로는 암세포를 죽이지는 못하는 것으로 나타났지만, 암세포가 다른 약물치료에 대해 민감하게 하는 약효를 보여 항암에 상당히 유용한 결과를 보여 주었다.
본 발명에서, 구연산(Citric acid)은 해당작용의 억제제로 사용될 수 있으며, 이는 화학식 4로 표시되는 구조를 갖는다.
화학식 4
Figure PCTKR2013007591-appb-C000004
본 발명에서는 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 2-데옥시-D-글루코스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및/또는 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 조합함으로써 낮은 농도에서도 높은 항암효과가 나타남을 확인하였다. 또한 랫트(rat)에 구연산을 경구 투여 시, LD50이 1,548 mg/kg으로서, 구연산은 각각 매우 안전성이 확보된 화합물이라는 것을 알 수 있었다(Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. Vol. 94, Pg. 65, 1948.).
본 발명에서 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 비구아나이드계 화합물, 2-데옥시-D-글루코스 및 구연산 각각은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 존재할 수 있다. 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 "약학적으로 허용 가능한 염"이란 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 비구아나이드계 화합, 2-데옥시-D-글루코스 및 구연산의 이로운 효능을 저하시키지 않는 임의의 모든 유기 또는 무기 부가염을 의미한다.
산부가염은 통상의 방법, 예를 들어 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 수혼화성 유기 용매, 예를 들어 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴을 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동 몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고, 이어서 상기 혼합물을 증발시켜 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 아세트산, 트라이플루오로아세트산, 말레인산(maleic acid), 석신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산(fumaric acid), 만데르산, 프로피온산(propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르브산, 카본산, 바닐릭산, 요오드화수소산(hydroiodic acid) 등을 사용할 수 있으며, 이들에 제한되지 않는다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속염 또는 알칼리 토금속염은, 예를 들어 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해시키고, 비용해 화합물 염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하나 이들에 제한되는 것은 아니다. 또한, 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻을 수 있다.
5-하이드록시메틸푸르푸랄, 비구아나이드계 화합물(메트포르민 또는 펜포르민), 2-데옥시-D-글루코스 및 구연산 각각의 약학적으로 허용가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 비구아나이드계 화합물(메트포르민 또는 펜포르민), 2-데옥시-D-글루코스 및 구연산 각각에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성 기의 염을 포함한다. 예를 들어, 약학적으로 허용가능한 염으로는 하이드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염 등이 포함될 수 있고, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 하이드로 브롬화물, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 석시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염 등이 있으며, 당업계에 알려진 염의 제조방법을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 비구아나이드계 화합물(메트포르민 또는 펜포르민)의 염으로는 약학적으로 허용가능한 염으로서, 메트포르민 또는 펜포르민과 동등한 항암효과를 나타내는 메트포르민 또는 펜포르민 염이라면 모두 사용가능하며, 바람직하게는 염산메트포르민, 숙신산메트포르민, 구연산메트포르민 또는 염산펜포르민, 숙신산펜포르민, 구연산펜포르민 등이 가능하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구연산 염으로는 약학적으로 허용가능한 염으로서, 구연산과 동등한 항암효과를 나타내는 구연산 염이라면 모두 사용가능하며, 바람직하게는 구연산나트륨, 구연산칼륨, 구연산칼슘, 구연산암모늄, 구연산마그네슘 등이 가능하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 비구아나이드계 화합물, 2-데옥시-D-글루코스, 및 구연산은 각각 이들의 유도체도 포함한다. 상기 “유도체”란 상기 화합물의 항암 활성이 변하지 않는 한도 내에서 상기 화합물의 일부를 화학적으로 변화, 예를 들어, 작용기의 도입, 치환, 결실시켜 제조한 화합물을 의미하는 것으로, 본 발명에 제한없이 포함될 수 있다.
각각 항암 효과가 알려진 2종 이상의 약물을 조합한다고 해서, 조합된 약물이 서로 상승효과(시너지 효과)를 나타낸다고 기대할 수 없으며, 오히려, 조합에 의해 약물의 기능이 상쇄되는 경우가 있어, 상승 효과를 갖는 약물의 조합을 발견하는 것은 매우 어려운 일이다. 본 발명에서는 항암제의 최소 농도 사용으로 부작용을 최소화하면서 항암 효과는 최대한 발휘할 수 있는 항암 조합 제제를 개발하였다.
본 발명에서 바람직한 항암 조성물의 하나의 양태는 2-데옥시-D-글루코스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 비구아나이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물; 2-데옥시-D-글루코스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 비구아나이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물; 2-데옥시-D-글루코스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 비구아나이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물일 수 있다.
본 발명에서 상기 비구아나이드계 화합물로서는 메트포르민 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 펜포르민 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염일 수 있다.
비구아나이드계 화합물로서는 메트포르민을 중심으로 한 조성물을 살펴보면, 본 발명의 항암 조성물은 2-데옥시-D-글루코스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 메트포르민 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물; 2-데옥시-D-글루코스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 메트포르민 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물; 2-데옥시-D-글루코스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 메트포르민 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물일 수 있다.
또 다른 비구아나이드계 화합물로서는 펜포르민을 중심으로 한 조성물을 살펴보면, 본 발명의 항암 조성물은 2-데옥시-D-글루코스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 펜포르민 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물; 2-데옥시-D-글루코스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 펜포르민 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물; 2-데옥시-D-글루코스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 펜포르민 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물일 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 항암 조성물은 2-데옥시-D-글루코스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 비구아나이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 조성물이다.
본 발명의 일 실시예에서는, (1) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; (2) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 (3) 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및/또는 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 3종 이상의 화합물로 이루어진 조합 제제가 암세포주의 세포 증식을 감소시키고, G1/S기, G2/M기 세포주기의 진행을 억제하며, 암세포의 DNA 합성을 방해함으로써, 세포 증식을 억제할 수 있음을 확인하였다(실시예 2-2).
또한, (1) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; (2) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 (3) 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및/또는 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 3종 이상의 화합물로 이루어진 조합 제제를 사용한 경우 화합물의 조합으로 인하여, 상승적 항암 효과가 나타났으며, 50% 암억제 농도가 감소되어 각 화합물의 약물 감소지수가 현저히 감소됨을 확인할 수 있었다(실시예 1).
즉, 본 발명에 따르면, 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 비구아나이드계 화합물, 2-데옥시-D-글루코스 및 구연산 각각은 단일 제제로 사용할 경우 항암 효과가 미비하여 과량으로 사용해야만 하나, 상기 화합물을 조합한 조합 제제로 사용하게 되면, 적은 양으로도 암세포를 효과적으로 사멸할 수 있음을 확인하였다.
특히, 5-하이드록시메틸푸르푸랄/메트포르민/2-데옥시-D-글루코스의 조합 제제, 메트포르민/2-데옥시-D-글루코스/구연산의 조합 제제, 5-하이드록시메틸푸르푸랄/메트포르민/2-데옥시-D-글루코스/구연산의 조합 제제는 각 화합물의 단일 제제, 2종의 화합물이 포함된 조합 제제 및 5-하이드록시메틸푸르푸랄/메트포르민/구연산의 조합 제제보다 50% 암 억제농도의 저감 효과가 높았다. 또한, 5-하이드록시메틸푸르푸랄/펜포르민/2-데옥시-D-글루코스의 조합 제제, 펜포르민/2-데옥시-D-글루코스/구연산의 조합 제제, 5-하이드록시메틸푸르푸랄/ 펜포르민/2-데옥시-D-글루코스/구연산의 조합 제제는 단일 제제, 2종의 화합물이 포함된 조합 제제 및 5-하이드록시메틸푸르푸랄/펜포르민/구연산의 조합 제제보다 50% 암 억제농도의 저감 효과가 높았다.
상기 조합 제제 중에서도 5-하이드록시메틸푸르푸랄/메트포르민/2-데옥시-D-글루코스/구연산과 5-하이드록시메틸푸르푸랄/펜포르민/2-데옥시-D-글루코스/구연산의 조합 제제가 50% 암 억제농도의 저감 효과 및 조합에 따른 각 화합물의 약물감소효과가 가장 높음을 확인하였다.
본 발명에 따른 각 조합 제제에서, 각 화합물의 조합 몰비는 특별히 제한되지 않는다.
예를 들어, 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염: 메트포르민(또는 펜포르민) 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염: 2-데옥시-D-글루코스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염: 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 조합 몰비가 1:2(펜포르민으로서는 0.05):0.05:0.3 내지 1:30(펜포르민으로서는 1.5):3:5의 범위일 수 있으며, 치료하는 암의 종류에 따라 조합 몰비는 달라질 수 있다. (이하 괄호 안의 수치는 펜포르민 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염의 몰비이다.)
바람직하게는, 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염: 메트포르민, 펜포르민, 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염: 2-데옥시-D-글루코스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염: 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 조합 몰비는 간암 세포주에서 1:3(0.05):0.1:0.4 내지 1:14(0.5):0.6:2, 바람직하게는 1:7(0.2):0.3:0.9, 폐암 세포주에서 1:5(0.05):0.2:1 내지 1:30(0.8):1:4, 바람직하게는 1:16(0.2):0.5:2.2, 위암 세포주에서 1:4(0.05):0.1:0.5 내지 1:20(0.5):0.8:3, 바람직하게는 1:10(0.2):0.3:1.3, 췌장암 세포주에서 1:2(0.05):0.1:0.3 내지 1:20(0.5):0.7:3, 바람직하게는 1:7(0.2):0.2:0.9, 대장암 세포주에서 1:3(0.05):0.4:0.4 내지 1:30(0.7):3.8:3, 바람직하게는 1:11(0.2):1.3:1, 자궁경부암 세포주에서 1:3(0.05):0.1:1 내지 1:30(0.5):0.1:5, 바람직하게는 1:10(0.2):0.3:2.3, 유방암 세포주에서 1:2(0.05):0.3:0.3 내지 1:18(0.6):3.5:2.8, 바람직하게는 1:6(0.2):1:0.9, 전립선암 세포주에서 1:4(0.1):0.2:1 내지 1:40(0.1):2.5:5, 바람직하게는 1:13(0.5):0.7:2, 난소암 세포주에서 1:3(0.05):0.1:0.2 내지 1:30(0.6):0.8:2.5, 바람직하게는 1:10(0.2):0.2:0.6, 방광암 세포주에서 1:2(0.05):0.2:0.3 내지 1:20(0.6):2.4:2.5, 바람직하게는 1:5(0.2):0.6:0.8이다. 이때 5-하이드록시메틸푸르푸랄 농도에 비해 메트포르민 또는 펜포르민, 2-데옥시-D-글루코스 및 구연산의 조합지수 몰비가 클수록 상승효과가 커지나, 고농도의 메트포르민 또는 펜포르민, 2-데옥시-D-글루코스 및 구연산에 의한 독성을 고려하여 조합지수 몰비를 정하는 것이 바람직하다. 상기 조합 몰비에서 5-하이드록시메틸푸르푸랄, 메트포르민 또는 펜포르민, 2-데옥시-D-글루코스 및 구연산의 조합 제제는 상승효과에 해당하는 조합지수(CI)를 나타내며, 단일 제제에 비해 훨씬 낮은 약물 감소지수를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 용어 "암(cancer)"이란 세포의 사멸 조절과 관련된 질병으로서, 정상적인 아팝토시스 균형이 깨지는 경우 세포가 과다 증식하게 됨으로써 생기는 질병을 일컫는다. 이러한 비정상적 과다 증식 세포들은, 경우에 따라 주위 조직 및 장기에 침입하여 종괴를 형성하고, 체내의 정상적인 구조를 파괴하거나 변형시키게 되는데, 이러한 상태를 암이라고 한다. 일반적으로 종양(tumor)이라 하면 신체 조직의 자율적인 과잉성장에 의해 비정상적으로 자란 덩어리를 의미하며, 양성 종양(benign tumor)과 악성 종양(malignant)으로 구분할 수 있다. 악성 종양은 양성 종양에 비해 성장속도가 매우 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이(metastasis)가 일어나 생명을 위협하게 된다. 이러한 악성 종양을 통상적으로 '암 (cancer)'이라 부르며, 암의 종류로는 뇌척수종양, 뇌암, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 식도암, 취암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암 등이 있다. 본 발명의 항암용 조성물은 암의 종류에 제한없이 사용될 수 있으나, 본 발명의 목적상 간암, 폐암, 위암, 췌장암, 대장암, 자궁경부암, 유방암, 전립선암, 난소암 및 방광암으로 구성된 군으로부터 선택된 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방 또는 치료"란 (1) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; (2) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 (3) 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및/또는 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 이용함으로써 암의 발병을 억제하거나 발병을 지연하는 모든 행위를 말하며, 특히 '치료'란 상기 조성물을 사용하여 암을 호전시키거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미한다.
따라서, 본 발명의 범위에는 본 발명에 따른 항암용 조성물을 암의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하고, 암을 예방 또는 치료하는 방법이 포함된다.
본 발명의 항암용 조성물은 상기 언급한 유효성분 이외에 필요에 따라 암치료용 화학요법제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 항암용 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 각각의 사용 목적에 맞게, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 멸균 주사용액의 형태, 연고제 등의 외용제, 좌제 등으로 제형화하여 사용될 수 있으며, 이러한 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등을 들 수 있다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제형화 한다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크와 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 주사제의 기제로는 용해제, 등장화제, 현탁화제, 유화제, 안정화제 및 방부제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구, 정맥내, 피하, 피내, 비강내, 복강내, 근육내, 경피 등 다양한 방식을 이용하여 투여할 수 있으며, 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 투여 경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있는데, 바람직하게는 4종 화합물들의 조합 제제의 경우, 5-하이드록시메틸푸르푸랄은 1일당 2 내지 60 mg/kg(체중)이고, 비구아나이드계 화합물로서 메트포르민을 사용할 경우는 1일당 5 내지 80 mg/kg(체중), 펜포르민을 사용할 경우는 1일당 0.1 내지 40 mg/kg(체중)이고, 2-데옥시-D-글루코스은 1일당 0.1 내지 40 mg/kg(체중)이고, 구연산은 1일당 1 내지 200 mg/kg(체중)이다. 다만, 상기 투여량에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 (1) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; (2) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 (3) 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및/또는 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염으로 구성된 3종 이상의 화합물을 개체에 투여하여 암을 예방 또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는, 적절한 방법으로 개체에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 또한, 용어 "개체"는 암이 발병하였거나 발병할 가능성이 있는, 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.
또 하나의 양태로서 본 발명은 (1) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; (2) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및 (3) 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및/또는 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
상기 비구아나이드계 화합물은 메트포르민(이하 MET) 또는 펜포르민(이하 PHE)일 수 있다.
상기 조성물에는 유효성분 이외에 식품학적으로 허용가능한 식품보조첨가제가 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "식품보조첨가제"란 식품에 보조적으로 첨가될 수 있는 구성요소를 의미하며, 각 제형의 건강기능식품을 제조하는데 첨가되는 것으로서 당업자가 적절히 선택하여 사용할 수 있다. 식품보조첨가제의 예로는 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 충진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 포함되지만, 상기 예들에 의해 본 발명의 식품보조첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 식품 조성물에는 건강기능식품이 포함될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어 "건강기능식품"이란 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환 등의 형태로 제조 및 가공한 식품을 말한다. 여기서 '기능성'이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻는 것을 의미한다. 본 발명의 건강기능식품은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의하여 제조가능하며, 상기 제조시에는 당 업계에서 통상적으로 첨가하는 원료 및 성분을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한 상기 건강기능식품의 제형 또한 건강기능식품으로 인정되는 제형이면 제한없이 제조될 수 있다. 본 발명의 식품용 조성물은 다양한 형태의 제형으로 제조될 수 있으며, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있고, 휴대성이 뛰어나, 본 발명의 건강기능식품은 항암제의 효과를 증진시키기 위한 보조제로 섭취가 가능하다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
하기 실시예에서는 구연산, 비구아나이드계 화합물로서 메트포르민과 펜포르민의 약학적으로 허용가능한 여러 염의 형태 중에서 대표적으로 구연산나트륨, 염산메트포르민, 염산펜포르민을 사용하였으며, 이들의 염의 형태는 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
사용한 세포주
인간 종양, 예를 들어 간암(HepG2), 폐암(A549), 위암(AGS), 췌장암(Capan-2), 대장암(DLD-1), 자궁경부암(HeLa), 유방암(MCF7), 전립선암(PC-3), 난소암(SK-OV-3), 방광암(T24)으로부터 유래된 세포주를 확립된 조건에 따라 배양하였으며, 모든 세포주는 한국세포주은행(Korean cell line bank, Seoul, Korea)으로부터 구입하였다. 인간 정상 간세포(CHANG)는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, USA)에서 구입하여 사용하였다.
세포는 10%(v/v) 소 태아 혈청, 2 mM 글루타민, 100 단위/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지 또는 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)에서 단층으로 증식하였다. 모든 세포는 RPMI-1640 배지에 10% 소 태아 혈청(FBS), 100 단위/ml 페니실린과 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 첨가한 세포 배양액을 사용하여, 37 ℃, 탄소 5% 및 산소 95%가 공급되는 습윤한 인큐베이터에서 배양하였다. 세포가 플레이트에 80% 정도 차면 인산염 완충용액으로 세포의 단층을 씻어낸 후 0.25% 트립신(trypsin-2.65 mM EDTA)으로 처리하여 계대배양을 하였고, 배지는 3일마다 교환하였다.
사용한 약물
5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural, 이하 HMF), 염산메트포르민(Metformin HCl, 이하 MET), 염산펜포르민(Phenformin HCl, 이하 PHE), 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose, 이하 2DG), 구연산나트륨(Sodium Citrate, 이하 CT)은 시그마사(St. Louis, USA)에서 구입하였다. 본 발명에서 실험을 통하여 얻어진 결과를 정리한 표와 도면에서 사용한 모든 약물은 약어로서 표기하였다.
참조예 1: 시험관 내 세포성장 억제 분석 방법
각 암세포의 증식억제 효과를 측정하기 위해 Carmichael 등의 방법에 따라 황색 테트라졸륨 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸릴-2)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드) 분석법을 실시하였다. MTT 분석법은 살아있는 세포의 생육을 측정하는 방법으로서, 살아있는 세포의 미토콘드리아 내의 탈수소효소가 황색 수용성 물질인 MTT에 의해 보라색 포마잔(formazan)을 생성하는 원리를 이용한다. 보라색 포마잔(formazan)의 생산량은 대사적으로 활성이 있는 살아있는 세포수와 거의 비례하는 것으로 알려져 세포의 생육과 분화를 측정하는데 아주 효과적으로 사용될 수 있다.
배양된 각각의 암세포를 96 웰 플레이트에 웰 당 2×104 세포/웰이 되도록 200 ㎕씩 첨가하여 24시간 동안 37 ℃, 탄소 5% 및 산소 95%가 공급되는 습윤한 인큐베이터에서 배양한 후, 각 단일 제제 및 조합 제제를 각각 IC50에 해당하는 약물의 농도에 대하여 영향을 받은 분율을 나타내는 조합 지수를 사용하여 암세포에 처리하였다. 48시간 동안 배양한 후, 각 웰에 인산염 완충용액(phosphate buffered saline, PBS)에 녹인 MTT(5 mg/ml)용액을 15 ㎕씩 첨가하여 다시 4시간 동안 배양시켰다. 포마잔(formazan) 형성을 확인한 후 배지를 완전히 제거하고, 웰 바닥에 형성된 포마잔을 녹이기 위해 100 ㎕의 디메틸 설폭시드(DMSO)를 첨가하였다. 그런 후, 마이크로 플레이트리더(Powerwave XS, Biotek)를 이용하여 560 nm에서 흡광도를 측정하여 대조군 세포를 100%로 하였을 때의 상대적인 세포 증식 억제율을 산출하였다.
참조예 2: 단일 제제 및 조합 제제 실험 방법
세포를 2×104 세포/웰로 96 웰 플레이트에 파종하고, 단일 제제 약물로서 HMF, MET 또는 PHE, 2DG 및 CT 각각을 농도별로 처리하여 IC50에 해당하는 약물의 농도를 확인하였다.
조합 제제 약물로서는 HMF, MET 또는 PHE, 2DG 및 CT로 구성된 군으로부터 선택된 2종 이상의 화합물로 구성된 조합 제제의 IC50에 해당하는 약물의 농도로 처리하였다. 모든 세포주는 단일 또는 조합 제제의 농도로 48시간 배양 후, 성장 억제 효과를 MTT 분석법으로 측정하였다.
동시 노출의 효과는 IC50에 해당하는 약물의 농도에 대하여 영향을 받은 분율을 나타내는 조합 지수를 사용하여 결정하였다. 0.9 미만의 조합 지수 계산치는 상승효과이며, 1.1 이상은 길항작용이고, 0.9 이상 1.1 미만의 조합지수는 부가 또는 상가작용에 해당한다.
참조예 3: 통계적 분석 및 상승 활성의 측정
약물 조합의 효과는 중간 효과 원리[(Chou and Talalay, Adv Enzyme Regul 22:27-55, 1984]에 기초하는 Chou 및 Talalay 방법을 사용하여 평가하였다. 이는 각각의 약물에 대하여, 그리고 다중 희석된 고정 비율의 조합에 대한 투여량-효과를 수학식 fa/fu = (D/Dm)m 을 사용하여 도시하였다. 상기 식에서 D 은 약물 농도이며, Dm 은 최대치의 절반 효과(즉, 세포 성장의 50% 억제)에 필요한 농도이며, fa 는 약물 농도 D 에 의하여 영향을 받는 세포 분율(예, 세포 성장이 90% 억제될 경우 0.9)이며, fu 는 (1 - fa) 로서 영향을 받지 않은 분율이며, m 은 농도-효과 곡선의 S-형 곡선(sigmodicity)의 기울기 계수이다. 조합에서의 각각의 약물에 대한 곡선의 기울기에 기초하여, 약물이 상호 비배타적 효과를 갖는지의 여부(예, 작용의 독립적 또는 상호작용 모드)를 결정할 수 있다. 여기서 조합 지수(CI)는 하기의 수학식을 사용하여 결정되었다.
수학식 1
Figure PCTKR2013007591-appb-M000001
상기 수학식에서, (Dx)1 은 약물 1 단독의 x % 효과를 생성하는데 필요한 약물 1의 농도이고, (D)1 은 (D)2 와 조합하여 동일한 x % 효과를 생성하는데 필요한 약물 1의 농도이다. α는 약물의 작용이 상호간에 유사성이 있는 경우는 α = 0, 그리고 없는 경우 α = 1로 가정하였다. CI 값은 fa 의 각종 값에 대하여 위의 수학식에 의해 구할 수 있다. 상기 식에서 두 약물의 상호작용에 의해 세포독성을 나타내는 CI 값이 0.9 미만일 때는 상승(또는 시너지)효과를 나타내며, 0.9 ~ 1.1 사이의 값은 부가(또는 상가)작용을 나타내어 두 약물의 상호작용에 의해 서로 그 효과가 없음을 나타낸다. 그러나 CI 값이 1.1보다 큰 값은 길항작용을 나타내어 두 약물의 상호작용에 의해 서로 그 효과가 상쇄되는 것을 나타낸다.
약물감소지수(DRI)는 두 약물 이상의 상호작용에 의해 주어진 약물의 효과에서 각각의 단독 약물의 농도가 어느 정도 감소하는지의 정도를 나타내는 것이다. (DRI)1 = (Dx)1/(D)1 이며, (DRI)2 = (Dx)2/(D)2 이다. 두 약물 사이의 DRI 와 CI 와의 관계는 CI = 1/(DRI)1 + 1/(DRI)2 로 표현될 수 있다.
데이터는 Calcusyn 소프트웨어(영국 케임브릿지에 소재하는 바이오소프트)에 대한 농도-효과 분석을 사용하여 분석하였다. 통계적 분석 및 그래프 Instat 및 Prism 소프트웨어(미국 샌디에고에 소재하는 그래프패드)를 사용하였다. 테스트한 약물 단독으로 또는 쌍을 이룬 조합에 대한 투여량-효과 관계를 중간-효과 플롯 분석으로 처리하여 각각의 세포주에서의 IC50, m 및 r 을 결정하였다. 상기에서 설명한 바와 같이, IC50 및 m 값은 각각 CI 방정식에 기초한 상승효과 및 길항작용을 계산하는데 사용하였다. 결과는 3번 이상의 반복실험을 2중으로 실시한 평균±표준 편차로 나타내었다. 각각의 실험에서, 세포는 상기에서 설명한 바와 같이 쌍을 이룬 조합에 48시간 동안 노출시켰다. 모든 통계처리는 미니탭(버전 16.0)을 이용하여 t-검정을 사용하였다.
참조예 4: 세포주기 측정
HMF, MET, 2DG 및 CT의 조합 제제가 각 암세포의 세포 주기 진행에 미치는 영향을 조사하기 위해 세포를 10% 소 태아 혈청(FBS)이 첨가된 배지로 희석하여 24 웰 플레이트에 분주하였다. 24시간이 지난 후 10% 소 태아 혈청(FBS)이 포함되어 있는 배지에 HMF, MET 또는 PHE, 2DG 및 CT의 조합 제제를 첨가한 배지로 교환하여 세포를 배양하였다. HMF, MET 또는 PHE, 2DG 및 CT의 조합 제제를 첨가하여 세포를 16시간 배양한 후 세포에 트립신(trypsin-EDTA)을 처리하여 세포를 수집한 후 인산염 완충용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 세포를 헹구고, 70% 에탄올로 세포를 고정하였다. 세포를 고정한 후 프로피디움 요오드화물(propidium iodide)을 함유하고 있는 고바 세포주기 시약(Guava cell cycle reagent)을 첨가하여 세포를 염색하였다. 프로피디움 요오드화물에 의해 염색된 세포를 유속세포분석기(Guava EasyCyte: Guava Technologies, Inc., Hayward, CA, USA)를 사용하여 유세포 분석(flow cytometry) 방법에 의해 세포주기를 측정하였고, 얻은 결과는 Guava CytoSoft version 2.5 software(Guava Technologies)를 사용하여 분석하였다.
참조예 5: 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)
각각의 암세포를 100 mm 디쉬에서 위와 동일한 방법으로 세포 배양액에 HMF, MET, 2DG 및 CT의 조합 제제를 첨가하여 8, 16, 24, 40시간 배양한 후 세포 용해물(cell lysate)를 만들었다. 세포 용해물을 만들기 위해 세포를 차가운 인산염 완충용액(phosphate buffered saline, PBS)으로 헹구고, 용해 완충액(lysis buffer - 20 mM Hepes, pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM 소디움 피로포스페이트(sodium pyrophosphate), 1 mM Na3VO4)을 첨가하여 4 ℃에서 40분간 교반하였다. 12,000 xg에서 30분간 원심 분리하여 침전물을 제거하고, 상층액을 취해 용해물로 사용하였다.
단백질 농도는 BCA 방법(Pierce)을 사용하여 측정하였다. 50 ㎍의 전체 단백질은 Tris-글리신 용리 완충액(elution buffer)을 포함하는 SDS-폴리아크릴아마이드 겔 내로 적하하였다. 이들 단백질은 Mini-단백질 시스템(Bio-Rad)을 이용하여 전기영동 처리하고 100 V에서 1시간 동안 Mini Trans Blot 전기영동 이전 셀(electrophoresis transfer cell: Bio-Rad)을 이용하여 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane: Bio-Rad)으로 이전하였다. 이들 니트로셀룰로오스 막은 5% 탈지 우유(skimmed milk)를 포함하는 Tween 20 TBS(TBST)로 30분 동안 차단하고, 3% BSA를 포함하는 TBST 내에서 측정하고자 하는 항체를 각각 첨가하여 4℃에서 16시간 또는 상온에서 2시간 동안 교반하였다. 양고추냉이 과산화효소(HRP, horseradish peroxidase, Dako)를 첨가하여 1시간 교반하였다. 그 다음, 이들 막은 실온에서 매 5분간 TBST로 3 회 세척하고 ECL 웨스턴 블랏팅 화학발광 시스템(Western blotting chemiluminescence system: Amersham/ Pharmacia)으로 진전시키고, 이후 방사선사진촬영 필름(autoradiographic film: Hyperfilm ECL, Amersham)에 노출시켰다.
참조예 6: HMF, MET 또는 PHE, 2DG 및 CT의 조합 제제의 AMPK 활성화 능력 시험
AMPK란 암세포의 생존에 필요한 에너지가 부족해지면 AMPK의 활성이 증가해 에너지를 유지하고 영양분 대사 조절에 중추적인 역할을 하는 인산화 효소이다. 초파리와 암세포를 이용한 이전 연구에서, AMPK 유전자의 기능을 활성화하면 비정상적인 암세포 구조가 정상으로 돌아온다는 사실이 밝혀진 바 있다.
HMF, MET 또는 PHE, 2DG 및 CT의 단일 및 조합 제제가 암세포의 AMPK 활성에 미치는 영향을 조사하기 위해 AMPKα immunoassay kit(Invitrogen, catalog No.KHO0651)를 이용하여 AMPKα(5’-AMP-activated protein kinase alpha) 활성화 효과를 확인하였다.
인간의 간에서 유래한 HepG2 세포를 100 mm 디쉬에서 위와 동일한 방법으로 세포 배양액에 HMF, MET 또는 PHE, 2DG 및 CT를 각각의 단일 제제 및 조합 제제를 용량별로 처리하여 36시간 배양한 후 세포용해질 배양한 후 AMPKα immunoassay kit의 사용 설명에서 제시하는 방법으로 세포 용해물(cell lysate)을 만들었다. 세포 용해물을 수득한 후, 상기 AMPKα immunoassay kit의 사용설명서에 개시된 방법에 따라 상기 세포 용해물로부터 AMPKα의 트레오닌 172 잔기(Thr172)의 인산화 된 정도를 확인하여 그 결과를 기재하였다(도77-78).
<실시예 1> HMF, MET 또는 2DG 및 CT의 단일 제제 및 이들의 조합 제제 실험
10종의 암세포를 사용하여 HMF, MET 또는 PHE, 2DG 및 CT의 조합 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
실시예 1-1: 간암 세포주(HepG2)의 생존율 억제 효과
인간의 간에서 유래한 암세포인 HepG2 세포주에서 HMF, 비구아나이드계 화합물(MET 또는 PHE), 2DG 및 CT 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
(1) HMF, MET, 2DG, CT의 단일 제제 및 조합 제제
도 1은 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 간에서 유래한 암세포인 HepG2 세포주에 지시된 용량에 의해 농도별로 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 나타낸 것이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제의 수가 많을수록 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 2는 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 간에서 유래한 암세포인 HepG2 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 2에서 2종 조합 제제 중에서 가장 높은 암 억제율을 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 암 억제율을 나타내었다.
표 2
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 2.99 1.60 0.98
MET 18.53 1.52 0.98
2DG 1.16 1.95 0.97
CT 4.13 2.97 0.98
HMF/CT 1.63/1.40 1.75 1.00
MET/2DG 9.03/0.36 1.50 1.00
HMF/MET/2DG 0.78/5.58/0.22 1.52 1.00
HMF/MET/CT 0.87/6.21/0.75 1.55 1.00
MET/2DG/CT 5.38/0.22/0.65 1.64 1.00
HMF/MET/2DG/CT 0.44/3.16/0.13/0.38 1.64 1.00
상기 표 2는 HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 및 조합 제제에 있어서 Calcusyn 소프트웨어를 이용하여 중앙-효과 분석으로 얻어진 Dm(또는 IC50), m(기울기), r(상관계수)를 나타낸 것이다. r 값은 0.97 ~ 1.00으로 용량과 효과간의 상관성이 높게 나타났으며, m 값은 1.50 ~ 2.97로 단독 또는 조합에서 사용된 화합물들에 있어서 용량-효과 곡선이 거의 하이퍼볼릭한 반응을 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 50% 암 억제농도를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 50% 암 억제농도의 저감 효과를 나타내었다.
표 3
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET 2DG CT
HMF/CT 3.5:3 50 0.88(상승효과) 1.83 - - 2.96
75 0.95(부가작용) 1.94 - - 2.29
90 1.05(부가작용) 2.06 - - 1.77
MET/2DG 25:1 50 0.80(상승효과) - 2.05 3.22 -
75 0.86(상승효과) - 2.03 2.72 -
90 0.93(부가작용) - 2.01 2.31 -
HMF/MET/2DG 3.5:25:1 50 0.76(상승효과) 3.82 3.32 5.21 -
75 0.80(상승효과) 3.67 3.31 4.44 -
90 0.85(상승효과) 3.53 3.30 3.79 -
HMF/MET/CT 3.5:25:3 50 0.81(상승효과) 3.43 2.98 - 5.54
75 0.88(상승효과) 3.35 3.02 - 3.95
90 0.99(부가작용) 3.27 3.05 - 2.81
MET/2DG/CT 25:1:3 50 0.63(상승효과) - 3.44 5.40 6.40
75 0.69(상승효과) - 3.63 4.87 4.75
90 0.77(상승효과) - 3.83 4.39 3.52
HMF/MET/2DG/CT 3.5:25:1:3 50 0.52(상승효과) 6.75 5.86 9.20 10.89
75 0.54(상승효과) 6.98 6.28 8.43 8.22
90 0.58(상승효과) 7.21 6.73 7.73 6.20
표 3에서는 HepG2 세포주에서 각 약물의 몰비에 따른 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제의 IC50, IC75, IC90 에서의 조합지수(CI)와 각 단일 제제의 약물감소지수(DRI)를 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 조합지수를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
50 ~ 90% 암 억제율에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 4종 화합물의 조합인 HMF/MET/2DG/CT 제제에서 HMF는 6.8 ~ 7.2배, MET는 5.9 ~ 6.7배, 2DG는 7.7 ~ 9.2배, CT는 6.2 ~ 10.9배의 약물 감소 효과를 나타내어 약물감소지수(DRI)도 가장 높았다.
도 3은 HMF, MET, 2DG 및 CT로 구성된 조합 제제를 48시간 동안 처리한 HepG2 세포주를 분획효과-조합지수(Fa-CI) 그래프로 분석한 것이다. 2종 조합 제제 중에서 분획효과(Fraction Affected)에 따른 가장 높은 조합지수를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.05, p < 0.01). 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
(2) HMF, PHE, 2DG, CT의 단일 제제 및 조합 제제
도 4는 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 간에서 유래한 암세포인 HepG2 세포주에 지시된 용량에 의해 농도별로 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제의 수가 많을수록 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 5는 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를인간의 간에서 유래한 암세포인 HepG2 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 5에서 2종 조합 제제 중에서 가장 높은 암억제율을 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 암 억제율을 나타내었다.
표 4
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 2.99 1.60 0.98
PHE 0.50 2.42 0.98
2DG 1.16 1.95 0.97
CT 4.13 2.97 0.98
PHE/2DG 0.24/0.30 1.95 1.00
HMF/PHE/2DG 0.67/0.15/0.19 1.79 1.00
HMF/PHE/CT 0.76/0.17/0.65 1.96 1.00
PHE/2DG/CT 0.15/0.19/0.56 2.01 1.00
HMF/PHE/2DG/CT 0.28/0.07/0.08/0.24 1.93 1.00
상기 표 4는 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 및 조합 제제에 있어서 Calcusyn 소프트웨어를 이용하여 중앙-효과 분석으로 얻어진 Dm(또는 IC50), m(기울기), r(상관계수)를 나타낸 것이다. r 값은 0.97 ~ 1.00으로 용량과 효과간의 상관성이 높게 나타났으며, m 값은 1.60 ~ 2.97로 단독 또는 조합에서 사용된 화합물들에 있어서 용량-효과 곡선이 거의 하이퍼볼릭한 반응을 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 50% 암 억제농도를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저 감효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 50% 암 억제농도의 저감 효과를 나타내었다.
표 5
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF PHE 2DG CT
PHE/2DG 0.8:1 50 0.74(상승효과) - 2.09 3.87 -
75 0.79(상승효과) - 1.87 3.87 -
90 0.86(상승효과) - 1.68 3.87 -
HMF/PHE/2DG 3.5:0.8:1 50 0.69(상승효과) 4.46 3.28 6.08 -
75 0.74(상승효과) 4.80 2.80 5.80 -
90 0.79(상승효과) 5.16 2.40 5.53 -
HMF/PHE/CT 3.5:0.8:3 50 0.76(상승효과) 3.93 2.89 - 6.34
75 0.80(상승효과) 4.44 2.60 - 5.24
90 0.86(상승효과) 5.03 2.34 - 4.33
PHE/2DG/CT 0.8:1:3 50 0.59(상승효과) - 3.38 6.26 7.41
75 0.64(상승효과) - 3.08 6.36 6.20
90 0.70(상승효과) - 2.80 6.47 5.19
HMF/PHE/2DG/CT 3.5:0.8:1:3 50 0.35(상승효과) 10.48 7.71 14.28 16.92
75 0.37(상승효과) 11.75 6.87 14.20 13.85
90 0.40(상승효과) 13.17 6.12 14.12 11.33
표 5에서는 HepG2 세포주에서 각 약물의 몰비에 따른 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제의 IC50, IC75, IC90 에서의 조합지수(CI)와 각 단일 제제의 약물감소지수(DRI)를 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 조합지수를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
50 ~ 90% 암 억제율에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 4종 화합물의 조합인 HMF/PHE/2DG/CT 제제에서 HMF는 10.5 ~ 13.2배, PHE는 6.1 ~ 7.7배, 2DG는 14.1 ~ 14.3배, CT는 11.3 ~ 16.9배의 약물 감소 효과를 나타내어 약물감소지수(DRI)도 가장 높았다.
도 6은 HMF, PHE, 2DG 및 CT로 구성된 단일 및 조합 제제를 인간의 간에서 유래한 암세포인 HepG2 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, PHE에 의한 50% 암 억제 농도를 도시한 것으로 PHE의 약물 독성을 얼마나 낮출 수 있는가를 보여주는 것이다. PHE 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제 중 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 4종 조합 제제에서 약물 독성이 가장 낮게 나타났다.
PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 PHE에 의한 50% 암 억제 농도가 낮게 나타남으로 약물 독성 감소효과가 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 PHE에 의한 50% 암 억제 농도가 가장 낮게 나타남으로 약물 독성 감소효과가 크게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 효과를 나타내었다.
도 7은 HMF, PHE, 2DG 및 CT에 의해 48시간 동안 처리된 HepG2 세포주를 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다. 분획효과(Fraction Affected)에 따른 조합지수는 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 4종 조합 제제에서 낮은 억제율과 높은 억제율 모두 상승효과를 나타내었다.
도 7은 HMF, PHE, 2DG 및 CT로 구성된 조합 제제를 48시간 동안 처리한 HepG2 세포주를 분획효과-조합지수(Fa-CI) 그래프로 분석한 것이다. 2종 조합 제제 중에서 분획효과(Fraction Affected)에 따른 가장 높은 조합지수를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.05, p < 0.001). 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
실시예 1-2: 폐암 세포주(A549)의 생존율 억제 효과
인간의 폐에서 유래한 암세포인 A549 세포주에서, HMF, 비구아나이드계 화합물(MET 또는 PHE), 2DG 및 CT 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
(1) HMF, MET, 2DG, CT의 단일 제제 및 조합 제제
도 8는 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 폐에서 유래한 암세포인 A549 세포주에 지시된 용량에 의해 농도별로 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제의 수가 많을수록 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 9는 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를인간의 폐에서 유래한 암세포인 A549 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 9에서 2종 조합 제제 중에서 가장 높은 암억제율을 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 암 억제율을 나타내었다.
표 6
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 4.22 2.23 0.99
MET 34.26 2.20 0.97
2DG 1.83 1.98 0.90
CT 6.23 2.80 0.98
HMF/CT 1.64/3.61 2.04 1.00
MET/2DG 18.08/0.54 1.92 1.00
HMF/MET/2DG 0.57/9.18/0.28 1.84 1.00
HMF/MET/CT 0.71/11.32/1.56 1.91 1.00
MET/2DG/CT 10.07/0.30/1.38 2.01 1.00
HMF/MET/2DG/CT 0.27/4.31/0.13/0.59 1.99 1.00
상기 표 6은 HMF, MET, 2DG의 단일 및 조합 제제에 있어서 Calcusyn 소프트웨어를 이용하여 중앙-효과 분석으로 얻어진 Dm(또는 IC50), m(기울기), r(상관계수)를 나타낸 것이다. r 값은 0.90 ~ 1.00으로 용량과 효과간의 상관성이 높게 나타났으며, m 값은 1.84 ~ 2.80으로 단독 또는 조합에서 사용된 화합물들에 있어서 용량-효과 곡선이 거의 하이퍼볼릭한 반응을 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 50% 암 억제농도를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 50% 암 억제농도의 저감 효과를 나타내었다.
표 7
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET 2DG CT
HMF/CT 2.5:5.5 50 0.97(부가작용) 2.57 - - 1.73
75 1.08(부가작용) 2.46 - - 1.49
90 1.20(길항작용) 2.35 - - 1.29
MET/2DG 40:1.2 50 0.82(상승효과) - 1.90 3.38 -
75 0.87(상승효과) - 1.76 3.32 -
90 0.92(부가작용) - 1.64 3.26 -
HMF/MET/2DG 2.5:40:1.2 50 0.55(상승효과) 7.36 3.73 6.65 -
75 0.60(상승효과) 6.63 3.39 6.38 -
90 0.66(상승효과) 5.98 3.08 6.12 -
HMF/MET/CT 2.5:40:5.5 50 0.75(상승효과) 5.97 3.03 - 4.00
75 0.84(상승효과) 5.49 2.81 - 3.33
90 0.94(부가작용) 5.06 2.60 - 2.78
MET/2DG/CT 0:1.2:5.5 50 0.68(상승효과) - 3.40 6.06 4.50
75 0.73(상승효과) - 3.25 6.11 3.86
90 0.79(상승효과) - 3.10 6.16 3.30
HMF/MET/2DG/CT 2.5:40:1.2:5.5 50 0.35(상승효과) 16.03 8.13 14.49 10.76
75 0.37(상승효과) 15.11 7.72 14.54 9.17
90 0.40(상승효과) 14.24 7.33 14.58 7.82
표 7에서는 A549 세포주에서 각 약물의 몰비에 따른 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제의 IC50, IC75, IC90 에서의 조합지수(CI)와 각 단일 제제의 약물감소지수(DRI)를 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 조합지수를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
50 ~ 90% 암 억제율에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 4종 화합물의 조합인 HMF/MET/2DG/CT 제제에서 HMF는 14.2 ~ 16.0배, MET는 7.3 ~ 8.1배, 2DG는 14.5 ~ 14.6배, CT는 7.8 ~ 10.8배의 약물 감소 효과를 나타내어 약물감소지수(DRI)도 가장 높았다.
도 10은 HMF, MET, 2DG 및 CT로 구성된 조합 제제를 48시간 동안 처리한 A549 세포주를 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다. 2종 조합 제제 중에서 분획효과(Fraction Affected)에 따른 가장 높은 조합지수를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
(2) HMF, PHE, 2DG, CT의 단일 제제 및 조합 제제
도 11은 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 폐에서 유래한 암세포인 A549 세포주에 지시된 용량에 의해 농도별로, 도 12는 지시된 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제 중 4종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 가장 높게 나타났다.
도 12는 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를인간의 폐에서 유래한 암세포인 A549 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 12에서 2종 조합 제제 중에서 가장 높은 암억제율을 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 암 억제율을 나타내었다.
표 8
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 4.22 2.23 0.99
PHE 0.57 1.74 1.00
2DG 1.83 1.98 0.90
CT 6.23 2.80 0.98
PHE/2DG 0.27/0.54 1.61 1.00
HMF/PHE/2DG 0.66/0.16/0.32 1.63 1.00
HMF/PHE/CT 0.74/0.18/1.64 1.96 1.00
PHE/2DG/CT 0.13/0.27/1.22 1.70 1.00
HMF/PHE/2DG/CT 0.22/0.05/0.11/0.48 1.81 1.00
상기 표 8은 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 및 조합 제제에 있어서 Calcusyn 소프트웨어를 이용하여 중앙-효과 분석으로 얻어진 Dm(또는 IC50), m(기울기), r(상관계수)를 나타낸 것이다. r 값은 0.90 ~ 1.00으로 용량과 효과간의 상관성이 높게 나타났으며, m 값은 1.61 ~ 2.80으로 단독 또는 조합에서 사용된 화합물들에 있어서 용량-효과 곡선이 거의 하이퍼볼릭한 반응을 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 50% 암 억제농도를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 50% 암 억제농도의 저감 효과를 나타내었다.
표 9
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF PHE 2DG CT
PHE/2DG 0.6:1.2 50 0.77(상승효과) - 2.11 3.40 -
75 0.83(상승효과) - 2.00 2.99 -
90 0.91(부가작용) - 1.90 2.63 -
HMF/PHE/2DG 2.5:0.6:1.2 50 0.61(상승효과) 6.35 3.56 5.74 -
75 0.68(상승효과) 5.31 3.41 5.11 -
90 0.75(상승효과) 4.44 3.27 4.54 -
HMF/PHE/CT 2.5:0.6:5.5 50 0.75(상승효과) 5.67 3.18 - 3.81
75 0.79(상승효과) 5.31 3.41 - 3.22
90 0.84(상승효과) 4.97 3.66 - 2.73
PHE/2DG/CT 0.6:1.2:5.5 50 0.58(상승효과) - 4.26 6.88 5.10
75 0.65(상승효과) - 4.19 6.27 3.96
90 0.74(상승효과) - 4.12 5.72 3.07
HMF/PHE/2DG/CT 2.5:0.6:1.2:5.5 50 0.28(상승효과) 19.15 10.73 17.32 12.85
75 0.31(상승효과) 17.12 11.01 16.47 10.39
90 0.34(상승효과) 15.31 11.29 15.67 8.40
표 9에서는 A549 세포주에서 각 약물의 몰비에 따른 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제의 IC50, IC75, IC90 에서의 조합지수(CI)와 각 단일 제제의 약물감소지수(DRI)를 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 조합지수를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
50 ~ 90% 암 억제율에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 4종 화합물의 조합인HMF/PHE/2DG/CT 제제에서 HMF는 15.3 ~ 19.2배, PHE는 10.7 ~ 11.3배, 2DG는 15.7 ~ 17.3배, CT는 8.4 ~ 12.9배의 약물 감소 효과를 나타내어 약물감소지수(DRI)도 가장 높았다.
도 13은 HMF, PHE, 2DG 및 CT로 구성된 단일 및 조합 제제를 인간의 폐에서 유래한 암세포인 A549 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, PHE에 의한 50% 암억제 농도를 도시한 것으로 PHE의 약물 독성을 얼마나 낮출 수 있는가를 보여주는 것이다. PHE 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제 중 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 4종 조합 제제에서 약물 독성이 가장 낮게 나타났다.
PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 PHE에 의한 50% 암억제 농도가 낮게 나타남으로 약물 독성 감소효과가 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 PHE에 의한 50% 암억제 농도가 가장 낮게 나타남으로 약물 독성 감소효과가 크게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 효과를 나타내었다.
도 14는 HMF, PHE, 2DG 및 CT에 의해 48시간 동안 처리된 A549 세포주를 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다. 분획효과(Fraction Affected)에 따른 조합지수는 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 4종 조합 제제에서 낮은 억제율과 높은 억제율 모두 상승효과를 나타내었다.
도 14는 HMF, PHE, 2DG 및 CT로 구성된 조합 제제를 48시간 동안 처리한 A549 세포주를 분획효과-조합지수(Fa-CI) 그래프로 분석한 것이다. 2종 조합 제제 중에서 분획효과(Fraction Affected)에 따른 가장 높은 조합지수를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
실시예 1-3: 위암 세포주(AGS)의 생존율 억제 효과
인간의 위에서 유래한 암세포인 AGS 세포주에서 HMF, 비구아나이드계 화합물(MET 또는 PHE), 2DG 및 CT 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
(1) HMF, MET, 2DG, CT의 단일 제제 및 조합 제제
도 15는 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 위에서 유래한 암세포인 AGS 세포주에 지시된 용량에 의해 농도별로 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제의 수가 많을수록 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 16은 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 위에서 유래한 암세포인 AGS 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 16에서 2종 조합 제제 중에서 가장 높은 암억제율을 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 암 억제율을 나타내었다.
표 10
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 2.98 1.83 0.97
MET 20.14 1.69 0.99
2DG 0.68 1.65 0.99
CT 3.13 1.88 0.99
HMF/CT 1.14/1.50 1.62 1.00
MET/2DG 9.21/0.25 1.55 1.00
HMF/MET/2DG 0.53/5.64/0.15 1.55 1.00
HMF/MET/CT 0.62/6.60/0.81 1.57 1.00
MET/2DG/CT 4.99/0.13/0.62 1.54 1.00
HMF/MET/2DG/CT 0.27/2.90/0.08/0.37 1.58 1.00
상기 표 10은 HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 및 조합 제제에 있어서 Calcusyn 소프트웨어를 이용하여 중앙-효과 분석으로 얻어진 Dm(또는 IC50), m(기울기), r(상관계수)를 나타낸 것이다. r 값은 0.97 ~ 1.00으로 용량과 효과간의 상관성이 높게 나타났으며, m 값은 1.54 ~ 1.88로 단독 또는 조합에서 사용된 화합물들에 있어서 용량-효과 곡선이 거의 하이퍼볼릭한 반응을 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 50% 암 억제농도를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 50% 암 억제농도의 저감 효과를 나타내었다.
표 11
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET 2DG CT
HMF/CT 2.8:3.7 50 0.86(상승효과) 2.63 - - 2.08
75 0.94(부가작용) 2.43 - - 1.90
90 1.02(부가작용) 2.25 - - 1.73
MET/2DG 30:0.8 50 0.82(상승효과) - 2.19 2.78 -
75 0.86(상승효과) - 2.06 2.66 -
90 0.91(부가작용) - 1.93 2.55 -
HMF/MET/2DG 2.8:30:0.8 50 0.68(상승효과) 5.66 3.57 4.53 -
75 0.73(상승효과) 5.07 3.35 4.34 -
90 0.78(상승효과) 4.54 3.15 4.16 -
HMF/MET/CT 2.8:30:3.7 50 0.79(상승효과) 4.85 3.05 - 3.84
75 0.87(상승효과) 4.38 2.90 - 3.43
90 0.94(부가작용) 3.97 2.76 - 3.05
MET/2DG/CT 30:0.8:3.7 50 0.64(상승효과) - 4.03 5.11 5.07
75 0.69(상승효과) - 3.78 4.89 4.46
90 0.75(상승효과) - 3.54 4.67 3.93
HMF/MET/2DG/CT 2.8:30:0.8:3.7 50 0.46(상승효과) 11.01 6.94 8.80 8.73
75 0.50(상승효과) 9.99 6.61 8.55 7.81
90 0.53(상승효과) 9.07 6.30 8.31 6.98
표 11에서는 AGS 세포주에서 각 약물의 몰비에 따른 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제의 IC50, IC75, IC90 에서의 조합지수(CI)와 각 단일 제제의 약물감소지수(DRI)를 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 조합지수를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
50 ~ 90% 암 억제율에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 4종 화합물의 조합인 HMF/MET/2DG/CT 제제에서 HMF는 9.1 ~ 11.0배, MET는 6.3 ~ 6.9배, 2DG는 8.3 ~ 8.8배, CT는 7.0 ~ 8.7배의 약물 감소 효과를 나타내어 약물감소지수(DRI)도 가장 높았다.
도 17은 HMF, MET, 2DG 및 CT로 구성된 조합 제제를 48시간 동안 처리한 AGS 세포주를 분획효과-조합지수(Fa-CI) 그래프로 분석한 것이다. 2종 조합 제제 중에서 분획효과(Fraction Affected)에 따른 가장 높은 조합지수를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
(2) HMF, PHE, 2DG, CT의 단일 제제 및 조합 제제
도 18은 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 위에서 유래한 암세포인 AGS 세포주에 지시된 용량에 의해 농도별로 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제의 수가 많을수록 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 19는 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 위에서 유래한 암세포인 AGS 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 19에서 2종 조합 제제 중에서 가장 높은 암억제율을 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 암억제율을 나타내었다.
표 12
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 2.98 1.83 0.97
PHE 0.56 2.57 0.96
2DG 0.68 1.65 0.99
CT 3.13 1.88 0.99
PHE/2DG 0.16/0.25 1.55 1.00
HMF/PHE/2DG 0.47/0.08/0.13 1.49 1.00
HMF/PHE/CT 0.61/0.11/0.80 1.70 1.00
PHE/2DG/CT 0.07/0.11/0.52 1.48 1.00
HMF/PHE/2DG/CT 0.25/0.04/0.07/0.33 1.78 1.00
상기 표 12은 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 및 조합 제제에 있어서 Calcusyn 소프트웨어를 이용하여 중앙-효과 분석으로 얻어진 Dm(또는 IC50), m(기울기), r(상관계수)를 나타낸 것이다. r 값은 0.96 ~ 1.00으로 용량과 효과간의 상관성이 높게 나타났으며, m 값은 1.48 ~ 2.57로 단독 또는 조합에서 사용된 화합물들에 있어서 용량-효과 곡선이 거의 하이퍼볼릭한 반응을 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 50% 암 억제농도를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 50% 암 억제농도의 저감 효과를 나타내었다.
표 13
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF PHE 2DG CT
PHE/2DG 0.5:0.8 50 0.65(상승효과) - 3.54 2.70 -
75 0.76(상승효과) - 2.67 2.60 -
90 0.90(부가작용) - 2.02 2.49 -
HMF/PHE/2DG 2.8:0.5:0.8 50 0.50(상승효과) 6.36 6.65 5.08 -
75 0.60(상승효과) 5.55 4.89 4.75 -
90 0.71(상승효과) 4.85 3.59 4.44 -
HMF/PHE/CT 2.8:0.5:3.7 50 0.66(상승효과) 4.90 5.13 - 3.89
75 0.73(상승효과) 4.68 4.12 - 3.66
90 0.82(상승효과) 4.47 3.31 - 3.44
PHE/2DG/CT 0.5:0.8:3.7 50 0.46(상승효과) - 7.94 6.06 6.02
75 0.55(상승효과) - 5.78 5.62 5.13
90 0.66(상승효과) - 4.22 5.21 4.38
HMF/PHE/2DG/CT 2.8:0.5:0.8:3.7 50 0.37(상승효과) 11.98 12.54 9.58 9.50
75 0.39(상승효과) 11.76 10.36 10.06 9.19
90 0.41(상승효과) 11.54 8.56 10.57 8.88
표 13에서는 AGS 세포주에서 각 약물의 몰비에 따른 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제의 IC50, IC75, IC90 에서의 조합지수(CI)와 각 단일 제제의 약물감소지수(DRI)를 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 조합지수를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
50 ~ 90% 암 억제율에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 4종 화합물의 조합인 HMF/PHE/2DG/CT 제제에서 HMF는 11.5 ~ 12.0배, PHE는 8.6 ~ 12.5배, 2DG는 9.6 ~ 10.6배, CT는 8.9 ~ 9.5배의 약물 감소 효과를 나타내어 약물감소지수(DRI)도 가장 높았다.
도 20은 HMF, PHE, 2DG 및 CT로 구성된 단일 및 조합 제제를 인간의 위에서 유래한 암세포인 AGS 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, PHE에 의한 50% 암억제 농도를 도시한 것으로 PHE의 약물 독성을 얼마나 낮출 수 있는가를 보여주는 것이다. PHE 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제 중 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 4종 조합 제제에서 약물 독성이 가장 낮게 나타났다.
PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 PHE에 의한 50% 암억제 농도가 낮게 나타남으로 약물 독성 감소효과가 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 PHE에 의한 50% 암억제 농도가 가장 낮게 나타남으로 약물 독성 감소효과가 크게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 효과를 나타내었다.
도 21은 HMF, PHE, 2DG 및 CT에 의해 48시간 동안 처리된 AGS 세포주를 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다. 분획효과(Fraction Affected)에 따른 조합지수는 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 4종 조합 제제에서 낮은 억제율과 높은 억제율 모두 상승효과를 나타내었다.
도 21은 HMF, PHE, 2DG 및 CT로 구성된 조합 제제를 48시간 동안 처리한 AGS 세포주를 분획효과-조합지수(Fa-CI) 그래프로 분석한 것이다. 2종 조합 제제 중에서 분획효과(Fraction Affected)에 따른 가장 높은 조합지수를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
실시예 1-4: 췌장암 세포주(Capan-2)의 생존율 억제 효과
인간의 췌장에서 유래한 암세포인 Capan-2 세포주에서 HMF, 비구아나이드계 화합물(MET 또는 PHE), 2DG 및 CT 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
(1) HMF, MET, 2DG, CT의 단일 제제 및 조합 제제
도 22는 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 췌장에서 유래한 암세포인 Capan-2 세포주에 지시된 용량에 의해 농도별로 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제의 수가 많을수록 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 23은 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 췌장에서 유래한 암세포인 Capan-2 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 23에서 2종 조합 제제 중에서 가장 높은 암억제율을 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 암억제율을 나타내었다.
표 14
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 5.97 3.04 0.98
MET 27.34 2.73 0.96
2DG 1.17 2.13 0.95
CT 4.77 2.85 0.99
HMF/CT 2.66/2.37 2.51 1.00
MET/2DG 10.94/0.36 1.99 1.00
HMF/MET/2DG 1.03/6.85/0.23 2.13 1.00
HMF/MET/CT 1.33/8.90/1.19 2.41 1.00
MET/2DG/CT 6.55/0.22/0.87 2.11 1.00
HMF/MET/2DG/CT 0.59/3.95/0.13/0.53 2.28 1.00
상기 표 14는 HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 및 조합 제제에 있어서 Calcusyn 소프트웨어를 이용하여 중앙-효과 분석으로 얻어진 Dm(또는 IC50), m(기울기), r(상관계수)를 나타낸 것이다. r 값은 0.95 ~ 1.00으로 용량과 효과간의 상관성이 높게 나타났으며, m 값은 1.99 ~ 3.04로 단독 또는 조합에서 사용된 화합물들에 있어서 용량-효과 곡선이 거의 하이퍼볼릭한 반응을 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 50% 암 억제농도를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 50% 암 억제농도의 저감 효과를 나타내었다.
표 15
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET 2DG CT
HMF/CT 4.5:4 50 0.94(부가작용) 2.24 - - 2.01
75 1.00(부가작용) 2.08 - - 1.91
90 1.07(부가작용) 1.93 - - 1.82
MET/2DG 30:1 50 0.71(상승효과) - 2.50 3.21 -
75 0.79(상승효과) - 2.15 3.10 -
90 0.87(상승효과) - 1.86 2.99 -
HMF/MET/2DG 4.5:30:1 50 0.62(상승효과) 5.81 3.99 5.13 -
75 0.68(상승효과) 4.98 3.57 5.13 -
90 0.74(상승효과) 4.28 3.19 5.13 -
HMF/MET/CT 4.5:30:4 50 0.80(상승효과) 4.48 3.07 - 4.02
75 0.86(상승효과) 4.07 2.91 - 3.75
90 0.92(부가작용) 3.71 2.76 - 3.49
MET/2DG/CT 30:1:4 50 0.61(상승효과) - 4.18 5.37 5.46
75 0.67(상승효과) - 3.71 5.34 4.77
90 0.73(상승효과) - 3.30 5.31 4.17
HMF/MET/2DG/CT 4.5:30:1:4 50 0.47(상승효과) 10.08 6.92 8.90 9.05
75 0.50(상승효과) 8.95 6.40 9.21 8.23
90 0.53(상승효과) 7.94 5.92 9.53 7.48
표 15에서는 Capan-2 세포주에서 각 약물의 몰비에 따른 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제의 IC50, IC75, IC90 에서의 조합지수(CI)와 각 단일 제제의 약물감소지수(DRI)를 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 조합지수를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
50 ~ 90% 암 억제율에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 4종 화합물의 조합인 HMF/MET/2DG/CT 제제에서 HMF는 7.9 ~ 10.1배, MET는 5.9 ~ 6.9배, 2DG는 8.9 ~ 9.5배, CT는 7.5 ~ 9.1배의 약물 감소 효과를 나타내어 약물감소지수(DRI)도 가장 높았다.
도 24는 HMF, MET, 2DG 및 CT로 구성된 조합 제제를 48시간 동안 처리한 Capan-2 세포주를 분획효과-조합지수(Fa-CI) 그래프로 분석한 것이다. 2종 조합 제제 중에서 분획효과(Fraction Affected)에 따른 가장 높은 조합지수를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
(2) HMF, PHE, 2DG, CT의 단일 제제 및 조합 제제
도 25는 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 췌장에서 유래한 암세포인 Capan-2 세포주에 지시된 용량에 의해 농도별로48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제의 수가 많을수록 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 26은 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를인간의 췌장에서 유래한 암세포인 Capan-2 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 26에서 2종 조합 제제 중에서 가장 높은 암억제율을 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 암억제율을 나타내었다.
표 16
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 5.97 3.04 0.98
PHE 0.91 2.87 0.99
2DG 1.17 2.13 0.95
CT 4.77 2.85 0.99
PHE/2DG 0.34/0.42 2.06 1.00
HMF/PHE/2DG 1.05/0.19/0.23 2.11 1.00
HMF/PHE/CT 1.35/0.24/1.20 2.41 1.00
PHE/2DG/CT 0.17/0.21/0.84 2.09 1.00
HMF/PHE/2DG/CT 0.61/0.11/0.14/0.55 2.33 1.00
상기 표 16은 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 및 조합 제제에 있어서 Calcusyn 소프트웨어를 이용하여 중앙-효과 분석으로 얻어진 Dm(또는 IC50), m(기울기), r(상관계수)를 나타낸 것이다. r 값은 0.95 ~ 1.00으로 용량과 효과간의 상관성이 높게 나타났으며, m 값은 2.06 ~ 3.04로 단독 또는 조합에서 사용된 화합물들에 있어서 용량-효과 곡선이 거의 하이퍼볼릭한 반응을 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 50% 암 억제농도를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 50% 암 억제농도의 저감 효과를 나타내었다.
표 17
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF PHE 2DG CT
PHE/2DG 0.8:1 50 0.72(상승효과) - 2.72 2.80 -
75 0.79(상승효과) - 2.34 2.75 -
90 0.87(상승효과) - 2.01 2.70 -
HMF/PHE/2DG 4.5:0.8:1 50 0.58(상승효과) 5.67 4.86 5.01 -
75 0.64(상승효과) 4.83 4.24 4.98 -
90 0.72(상승효과) 4.12 3.69 4.95 -
HMF/PHE/CT 4.5:0.8:4 50 0.74(상승효과) 4.42 3.79 - 3.97
75 0.80(상승효과) 4.02 3.53 - 3.70
90 0.87(상승효과) 3.67 3.28 - 3.46
PHE/2DG/CT 0.8:1:4 50 0.54(상승효과) - 5.42 5.58 5.67
75 0.60(상승효과) - 4.71 5.53 4.94
90 0.66(상승효과) - 4.09 5.47 4.30
HMF/PHE/2DG/CT 4.5:0.8:1:4 50 0.45(상승효과) 9.74 8.36 8.60 8.75
75 0.48(상승효과) 8.73 7.65 8.99 8.03
90 0.51(상승효과) 7.82 7.01 9.38 7.37
표 17에서는 Capan-2 세포주에서 각 약물의 몰비에 따른 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제의 IC50, IC75, IC90 에서의 조합지수(CI)와 각 단일 제제의 약물감소지수(DRI)를 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 조합지수를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
50 ~ 90% 암 억제율에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 4종 화합물의 조합인 HMF/PHE/2DG/CT 제제에서 HMF는 7.8 ~ 9.7배, PHE는 7.0 ~ 8.4배, 2DG는 8.6 ~ 9.4배, CT는 7.4 ~ 8.8배의 약물 감소 효과를 나타내어 약물감소지수(DRI)도 가장 높았다.
도 27은 HMF, PHE, 2DG 및 CT로 구성된 단일 및 조합 제제를 인간의 췌장에서 유래한 암세포인 Capan-2 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, PHE에 의한 50% 암억제 농도를 도시한 것으로 PHE의 약물 독성을 얼마나 낮출 수 있는가를 보여주는 것이다. PHE 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제 중 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 4종 조합 제제에서 약물 독성이 가장 낮게 나타났다.
PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 PHE에 의한 50% 암억제 농도가 낮게 나타남으로 약물 독성 감소효과가 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 PHE에 의한 50% 암억제 농도가 가장 낮게 나타남으로 약물 독성 감소효과가 크게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 효과를 나타내었다.
도 28은 HMF, PHE, 2DG 및 CT에 의해 48시간 동안 처리된 Capan-2 세포주를 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다. 분획효과(Fraction Affected)에 따른 조합지수는 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 4종 조합 제제에서 낮은 억제율과 높은 억제율 모두 상승효과를 나타내었다.
도 28은 HMF, PHE, 2DG 및 CT로 구성된 조합 제제를 48시간 동안 처리한 Capan-2 세포주를 분획효과-조합지수(Fa-CI) 그래프로 분석한 것이다. 2종 조합 제제 중에서 분획효과(Fraction Affected)에 따른 가장 높은 조합지수를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
실시예 1-5: 대장암 세포주(DLD-1)의 생존율 억제 효과
인간의 대장에서 유래한 암세포인 DLD-1 세포주에서 HMF, 비구아나이드계 화합물(MET 또는 PHE), 2DG 및 CT 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
(1) HMF, MET, 2DG, CT의 단일 제제 및 조합 제제
도 29는 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 대장에서 유래한 암세포인 DLD-1 세포주에 지시된 용량에 의해 농도별로 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제의 수가 많을수록 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 30은 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 대장에서 유래한 암세포인 DLD-1 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 30에서 2종 조합 제제 중에서 가장 높은 암억제율을 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 암 억제율을 나타내었다.
표 18
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 4.29 2.43 0.99
MET 29.25 1.64 0.99
2DG 5.46 1.06 0.99
CT 4.59 2.64 0.99
HMF/CT 2.07/2.07 2.22 1.00
MET/2DG 14.00/1.57 1.30 1.00
HMF/MET/2DG 0.88/10.02/1.13 1.53 1.00
HMF/MET/CT 1.00/11.30/0.99 1.85 1.00
MET/2DG/CT 8.76/0.99/0.77 1.52 1.00
HMF/MET/2DG/CT 0.41/4.64/0.52/0.41 1.66 1.00
상기 표 18은 HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 및 조합 제제에 있어서 Calcusyn 소프트웨어를 이용하여 중앙-효과 분석으로 얻어진 Dm(또는 IC50), m(기울기), r(상관계수)를 나타낸 것이다. r 값은 0.99 ~ 1.00으로 용량과 효과간의 상관성이 높게 나타났으며, m 값은 1.06 ~ 2.64로 단독 또는 조합에서 사용된 화합물들에 있어서 용량-효과 곡선이 거의 하이퍼볼릭한 반응을 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 50% 암 억제농도를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 50% 암 억제농도의 저감 효과를 나타내었다.
표 19
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET 2DG CT
HMF/CT 3.5:3.5 50 0.94(부가작용) 2.07 - - 2.22
75 0.99(부가작용) 1.98 - - 2.05
90 1.05(부가작용) 1.90 - - 1.90
MET/2DG 40:4.5 50 0.77(상승효과) - 2.09 3.47 -
75 0.81(상승효과) - 1.75 4.20 -
90 0.88(상승효과) - 1.46 5.09 -
HMF/MET/2DG 3.5:40:4.5 50 0.75(상승효과) 4.89 2.92 4.84 -
75 0.78(상승효과) 3.74 2.78 6.68 -
90 0.84(상승효과) 2.86 2.65 9.21 -
HMF/MET/CT 3.5:40:3.5 50 0.83(상승효과) 4.34 2.59 - 4.64
75 0.88(상승효과) 3.77 2.80 - 3.90
90 0.94(부가작용) 3.27 3.02 - 3.27
MET/2DG/CT 40:4.5:3.5 50 0.65(상승효과) - 3.34 5.53 5.99
75 0.68(상승효과) - 3.16 7.60 4.40
90 0.74(상승효과) - 3.00 10.43 3.24
HMF/MET/2DG/CT 3.5:40:4.5:3.5 50 0.44(상승효과) 10.56 6.31 10.45 11.31
75 0.45(상승효과) 8.57 6.37 15.30 8.87
90 0.49(상승효과) 6.96 6.43 22.38 6.95
표 19에서는 DLD-1 세포주에서 각 약물의 몰비에 따른 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제의 IC50, IC75, IC90 에서의 조합지수(CI)와 각 단일 제제의 약물감소지수(DRI)를 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 조합지수를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
50 ~ 90% 암 억제율에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 4종 화합물의 조합인 HMF/MET/2DG/CT 제제에서 HMF는 7.0 ~ 10.6배, MET는 6.3 ~ 6.4배, 2DG는 10.5 ~ 22.4배, CT는 7.0 ~ 11.3배의 약물 감소 효과를 나타내어 약물감소지수(DRI)도 가장 높았다.
도 31은 HMF, MET, 2DG 및 CT로 구성된 조합 제제를 48시간 동안 처리한 DLD-1 세포주를 분획효과-조합지수(Fa-CI) 그래프로 분석한 것이다. 2종 조합 제제 중에서 분획효과(Fraction Affected)에 따른 가장 높은 조합지수를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.05, p < 0.001). 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
(2) HMF, PHE, 2DG, CT의 단일 제제 및 조합 제제
도 32는 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 대장에서 유래한 암세포인 DLD-1 세포주에 지시된 용량에 의해 농도별로 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제의 수가 많을수록 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 33은 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 대장에서 유래한 암세포인 DLD-1 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 33에서 2종 조합 제제 중에서 가장 높은 암 억제율을 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 암 억제율을 나타내었다.
표 20
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 4.29 2.43 0.99
PHE 0.72 1.69 0.99
2DG 5.46 1.06 0.99
CT 4.59 2.64 0.99
PHE/2DG 0.29/1.64 1.22 1.00
HMF/PHE/2DG 0.71/0.16/0.91 1.45 1.00
HMF/PHE/CT 0.96/0.22/0.96 1.90 1.00
PHE/2DG/CT 0.15/0.85/0.66 1.49 1.00
HMF/PHE/2DG/CT 0.40/0.09/0.52/0.40 1.65 1.00
상기 표 20은 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 및 조합 제제에 있어서 Calcusyn 소프트웨어를 이용하여 중앙-효과 분석으로 얻어진 Dm(또는 IC50), m(기울기), r(상관계수)를 나타낸 것이다. r 값은 0.99 ~ 1.00으로 용량과 효과간의 상관성이 높게 나타났으며, m 값은 1.06 ~ 2.64로 단독 또는 조합에서 사용된 화합물들에 있어서 용량-효과 곡선이 거의 하이퍼볼릭한 반응을 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 50% 암 억제농도를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 50% 암 억제농도의 저감 효과를 나타내었다.
표 21
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF PHE 2DG CT
PHE/2DG 0.8:4.5 50 0.70(상승효과) - 2.49 3.33 -
75 0.78(상승효과) - 1.93 3.82 -
90 0.90(부가작용) - 1.49 4.38 -
HMF/PHE/2DG 3.5:0.8:4.5 50 0.55(상승효과) 6.08 4.49 6.02 -
75 0.60(상승효과) 4.48 4.03 7.99 -
90 0.67(상승효과) 3.30 3.61 10.62 -
HMF/PHE/CT 3.5:0.8:3.5 50 0.74(상승효과) 4.45 3.29 - 4.77
75 0.78(상승효과) 3.93 3.53 - 4.06
90 0.84(상승효과) 3.46 3.79 - 3.46
PHE/2DG/CT 0.8:4.5:3.5 50 0.51(상승효과) - 4.80 6.43 6.96
75 0.54(상승효과) - 4.39 8.71 5.05
90 0.61(상승효과) - 4.01 11.79 3.66
HMF/PHE/2DG/CT 3.5:0.8:4.5:3.5 50 0.41(상승효과) 10.60 7.83 10.50 11.36
75 0.43(상승효과) 8.56 7.69 15.27 8.85
90 0.47(상승효과) 6.91 7.56 22.21 6.90
표 21에서는 DLD-1 세포주에서 각 약물의 몰비에 따른 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제의 IC50, IC75, IC90 에서의 조합지수(CI)와 각 단일 제제의 약물감소지수(DRI)를 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 조합지수를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
50 ~ 90% 암 억제율에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 4종 화합물의 조합인 HMF/PHE/2DG/CT 제제에서 HMF는 6.9 ~ 10.6배, PHE는 7.6 ~ 7.8배, 2DG는 10.5 ~ 22.2배, CT는 6.9 ~ 11.4배의 약물 감소 효과를 나타내어 약물감소지수(DRI)도 가장 높았다.
도 34는 HMF, PHE, 2DG 및 CT로 구성된 단일 및 조합 제제를 인간의 대장에서 유래한 암세포인 DLD-1 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, PHE에 의한 50% 암억제 농도를 도시한 것으로 PHE의 약물 독성을 얼마나 낮출 수 있는가를 보여주는 것이다. PHE 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제 중 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 4종 조합 제제에서 약물 독성이 가장 낮게 나타났다.
PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 PHE에 의한 50% 암억제 농도가 낮게 나타남으로 약물 독성 감소효과가 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 PHE에 의한 50% 암억제 농도가 가장 낮게 나타남으로 약물 독성 감소효과가 크게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 효과를 나타내었다.
도 35는 HMF, PHE, 2DG 및 CT에 의해 48시간 동안 처리된 DLD-1 세포주를 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다. 분획효과(Fraction Affected)에 따른 조합지수는 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 4종 조합 제제에서 낮은 억제율과 높은 억제율 모두 상승효과를 나타내었다.
도 35는 HMF, PHE, 2DG 및 CT로 구성된 조합 제제를 48시간 동안 처리한 DLD-1 세포주를 분획효과-조합지수(Fa-CI) 그래프로 분석한 것이다. 2종 조합 제제 중에서 분획효과(Fraction Affected)에 따른 가장 높은 조합지수를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.01). 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
실시예 1-6: 자궁경부암 세포주(HeLa)의 생존율 억제 효과
인간의 자궁 경부에서 유래한 암세포인 HeLa 세포주에서 HMF, 비구아나이드계 화합물(MET 또는 PHE), 2DG 및 CT 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
(1) HMF, MET, 2DG, CT의 단일 제제 및 조합 제제
도 36은 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 자궁 경부에서 유래한 암세포인 HeLa 세포주에 지시된 용량에 의해 농도별로 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제의 수가 많을수록 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 37은 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 자궁 경부에서 유래한 암세포인 HeLa 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 37에서 2종 조합 제제 중에서 가장 높은 암억제율을 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 암 억제율을 나타내었다.
표 22
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 3.74 2.19 0.99
MET 30.91 2.51 0.95
2DG 1.45 1.92 0.93
CT 8.11 2.41 0.98
HMF/CT 1.67/3.89 2.04 1.00
MET/2DG 14.30/0.48 2.02 1.00
HMF/MET/2DG 0.84/8.44/0.28 1.93 1.00
HMF/MET/CT 0.91/9.10/2.12 2.04 1.00
MET/2DG/CT 7.68/0.26/1.79 1.99 1.00
HMF/MET/2DG/CT 0.38/3.78/0.13/0.88 1.99 1.00
상기 표 22는 HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 및 조합 제제에 있어서 Calcusyn 소프트웨어를 이용하여 중앙-효과 분석으로 얻어진 Dm(또는 IC50), m(기울기), r(상관계수)를 나타낸 것이다. r 값은 0.93 ~ 1.00으로 용량과 효과간의 상관성이 높게 나타났으며, m 값은 1.92 ~ 2.51로 단독 또는 조합에서 사용된 화합물들에 있어서 용량-효과 곡선이 거의 하이퍼볼릭한 반응을 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 50% 암 억제농도를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 50% 암 억제농도의 저감 효과를 나타내었다.
표 23
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET 2DG CT
HMF/CT 3:7 50 0.93(부가작용) 2.24 - - 2.09
75 0.98(부가작용) 2.16 - - 1.92
90 1.05(부가작용) 2.08 - - 1.77
MET/2DG 30:1 50 0.79(상승효과) - 2.16 3.04 -
75 0.84(상승효과) - 1.94 3.13 -
90 0.88(상승효과) - 1.74 3.23 -
HMF/MET/2DG 3:30:1 50 0.69(상승효과) 4.43 3.66 5.15 -
75 0.75(상승효과) 4.14 3.21 5.17 -
90 0.81(상승효과) 3.86 2.81 5.19 -
HMF/MET/CT 3:30:7 50 0.80(상승효과) 4.11 3.40 - 3.82
75 0.86(상승효과) 3.96 3.07 - 3.52
90 0.93(부가작용) 3.82 2.77 - 3.24
MET/2DG/CT 30:1:7 50 0.65(상승효과) - 4.02 5.66 4.53
75 0.70(상승효과) - 3.58 5.78 4.11
90 0.75(상승효과) - 3.19 5.91 3.73
HMF/MET/2DG/CT 3:30:1:7 50 0.42(상승효과) 9.91 8.19 11.52 9.21
75 0.45(상승효과) 9.41 7.29 11.76 8.35
90 0.48(상승효과) 8.93 6.49 12.01 7.57
표 23에서는 HeLa 세포주에서 각 약물의 몰비에 따른 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제의 IC50, IC75, IC90 에서의 조합지수(CI)와 각 단일 제제의 약물감소지수(DRI)를 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 조합지수를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
50 ~ 90% 암 억제율에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 4종 화합물의 조합인 HMF/MET/2DG/CT 제제에서 HMF는 8.9 ~ 9.9배, MET는 6.5 ~ 8.2배, 2DG는 11.5 ~ 12.0배, CT는 7.6 ~ 9.2배의 약물 감소 효과를 나타내어 약물감소지수(DRI)도 가장 높았다.
도 38은 HMF, MET, 2DG 및 CT로 구성된 조합 제제를 48시간 동안 처리한 HeLa 세포주를 분획효과-조합지수(Fa-CI) 그래프로 분석한 것이다. 2종 조합 제제 중에서 분획효과(Fraction Affected)에 따른 가장 높은 조합지수를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
(2) HMF, PHE, 2DG, CT의 단일 제제 및 조합 제제
도 39는 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 자궁 경부에서 유래한 암세포인 HeLa 세포주에 지시된 용량에 의해 농도별로 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제의 수가 많을수록 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 40은 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 자궁 경부에서 유래한 암세포인 HeLa 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 40에서 2종 조합 제제 중에서 가장 높은 암억제율을 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 암 억제율을 나타내었다.
표 24
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 3.74 2.19 0.99
PHE 0.60 2.88 0.98
2DG 1.45 1.92 0.93
CT 8.11 2.41 0.98
PHE/2DG 0.18/0.36 1.82 1.00
HMF/PHE/2DG 0.64/0.11/0.21 1.82 1.00
HMF/PHE/CT 0.81/0.14/1.90 2.02 1.00
PHE/2DG/CT 0.10/0.19/1.35 1.87 1.00
HMF/PHE/2DG/CT 0.36/0.06/0.12/0.83 2.04 1.00
상기 표 24는 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 및 조합 제제에 있어서 Calcusyn 소프트웨어를 이용하여 중앙-효과 분석으로 얻어진 Dm(또는 IC50), m(기울기), r(상관계수)를 나타낸 것이다. r 값은 0.93 ~ 1.00으로 용량과 효과간의 상관성이 높게 나타났으며, m 값은 1.82 ~ 2.88로 단독 또는 조합에서 사용된 화합물들에 있어서 용량-효과 곡선이 거의 하이퍼볼릭한 반응을 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 50% 암 억제농도를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 50% 암 억제농도의 저감 효과를 나타내었다.
표 25
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF PHE 2DG CT
PHE/2DG 0.5:1 50 0.55(상승효과) - 3.29 4.00 -
75 0.64(상승효과) - 2.63 3.87 -
90 0.74(상승효과) - 2.10 3.75 -
HMF/PHE/2DG 3:0.5:1 50 0.50(상승효과) 5.83 5.58 6.77 -
75 0.57(상승효과) 5.26 4.47 6.58 -
90 0.65(상승효과) 4.75 3.58 6.39 -
HMF/PHE/CT 3:0.5:7 50 0.68(상승효과) 4.60 4.40 - 4.27
75 0.75(상승효과) 4.40 3.74 - 3.91
90 0.83(상승효과) 4.21 3.17 - 3.57
PHE/2DG/CT 0.5:1:7 50 0.46(상승효과) - 6.18 7.50 6.00
75 0.52(상승효과) - 5.03 7.41 5.26
90 0.60(상승효과) - 4.10 7.32 4.62
HMF/PHE/2DG/CT 3:0.5:1:7 50 0.38(상승효과) 10.53 10.08 12.24 9.79
75 0.40(상승효과) 10.14 8.61 12.68 9.00
90 0.44(상승효과) 9.77 7.36 13.13 8.28
표 25에서는 HeLa 세포주에서 각 약물의 몰비에 따른 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제의 IC50, IC75, IC90 에서의 조합지수(CI)와 각 단일 제제의 약물감소지수(DRI)를 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 조합지수를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
50 ~ 90% 암 억제율에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 4종 화합물의 조합인 HMF/PHE/2DG/CT 제제에서 HMF는 9.8 ~ 10.5배, PHE는 7.4 ~ 10.1배, 2DG는 12.2 ~ 13.1배, CT는 8.3 ~ 9.8배의 약물 감소 효과를 나타내어 약물감소지수(DRI)도 가장 높았다.
도 41은 HMF, PHE, 2DG 및 CT로 구성된 단일 및 조합 제제를 인간의 자궁 경부에서 유래한 암세포인 HeLa 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, PHE에 의한 50% 암 억제 농도를 도시한 것으로 PHE의 약물 독성을 얼마나 낮출 수 있는가를 보여주는 것이다. PHE 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제 중 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 4종 조합 제제에서 약물 독성이 가장 낮게 나타났다.
PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 PHE에 의한 50% 암억제 농도가 낮게 나타남으로 약물 독성 감소효과가 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 PHE에 의한 50% 암억제 농도가 가장 낮게 나타남으로 약물 독성 감소효과가 크게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 효과를 나타내었다.
도 42는 HMF, PHE, 2DG 및 CT에 의해 48시간 동안 처리된 HeLa 세포주를 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다. 분획효과(Fraction Affected)에 따른 조합지수는 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 4종 조합 제제에서 낮은 억제율과 높은 억제율 모두 상승효과를 나타내었다.
도 42는 HMF, PHE, 2DG 및 CT로 구성된 조합 제제를 48시간 동안 처리한 HeLa 세포주를 분획효과-조합지수(Fa-CI) 그래프로 분석한 것이다. 2종 조합 제제 중에서 분획효과(Fraction Affected)에 따른 가장 높은 조합지수를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.01). 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
실시예 1-7: 유방암 세포주(MCF7)의 생존율 억제 효과
인간의 유방에서 유래한 암세포인 MCF7 세포주에서 HMF, 비구아나이드계 화합물(MET 또는 PHE), 2DG 및 CT 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
(1) HMF, MET, 2DG, CT의 단일 제제 및 조합 제제
도 43은 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 유방에서 유래한 암세포인 MCF7 세포주에 지시된 용량에 의해 농도별로 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제의 수가 많을수록 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 44는 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 유방에서 유래한 암세포인 MCF7 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 44에서 2종 조합 제제 중에서 가장 높은 암 억제율을 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 암 억제율을 나타내었다.
표 26
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 4.39 2.47 0.99
MET 21.15 2.36 0.97
2DG 6.85 1.47 0.95
CT 4.66 2.67 0.99
HMF/CT 2.23/1.98 2.25 1.00
MET/2DG 10.32/1.90 1.71 1.00
HMF/MET/2DG 0.91/5.06/0.93 1.65 1.00
HMF/MET/CT 1.18/6.57/1.05 2.10 1.00
MET/2DG/CT 5.54/1.02/0.89 1.73 1.00
HMF/MET/2DG/CT 0.57/3.14/0.58/0.50 1.95 1.00
상기 표 26은 HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 및 조합 제제에 있어서 Calcusyn 소프트웨어를 이용하여 중앙-효과 분석으로 얻어진 Dm(또는 IC50), m(기울기), r(상관계수)를 나타낸 것이다. r 값은 0.95 ~ 1.00으로 용량과 효과간의 상관성이 높게 나타났으며, m 값은 11.47 ~ 2.67로 단독 또는 조합에서 사용된 화합물들에 있어서 용량-효과 곡선이 거의 하이퍼볼릭한 반응을 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 50% 암 억제농도를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 50% 암 억제농도의 저감 효과를 나타내었다.
표 27
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET 2DG CT
HMF/CT 4.5:4 50 0.93(부가작용) 1.97 - - 2.35
75 0.99(부가작용) 1.89 - - 2.18
90 1.05(부가작용) 1.81 - - 2.02
MET/2DG 25:4.6 50 0.77(상승효과) - 2.05 3.61 -
75 0.83(상승효과) - 1.72 4.01 -
90 0.92(부가작용) - 1.44 4.45 -
HMF/MET/2DG 4.5:25:4.6 50 0.58(상승효과) 4.83 4.18 7.36 -
75 0.68(상승효과) 3.86 3.42 7.99 -
90 0.80(상승효과) 3.09 2.80 8.67 -
HMF/MET/CT 4.5:25:4 50 0.81(상승효과) 3.72 3.22 - 4.44
75 0.87(상승효과) 3.44 3.04 - 3.98
90 0.94(부가작용) 3.18 2.88 - 3.56
MET/2DG/CT 25:4.6:4 50 0.60(상승효과) - 3.82 6.72 5.26
75 0.68(상승효과) - 3.22 7.52 4.21
90 0.79(상승효과) - 2.71 8.42 3.36
HMF/MET/2DG/CT 4.5:25:4.6:4 50 0.47(상승효과) 7.76 6.73 11.84 9.27
75 0.51(상승효과) 6.89 6.10 14.25 7.97
90 0.55(상승효과) 6.12 5.53 17.16 6.85
표 27에서는 MCF7 세포주에서 각 약물의 몰비에 따른 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제의 IC50, IC75, IC90 에서의 조합지수(CI)와 각 단일 제제의 약물감소지수(DRI)를 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 조합지수를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
50 ~ 90% 암 억제율에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 4종 화합물의 조합인 HMF/MET/2DG/CT 제제에서 HMF는 6.1 ~ 7.8배, MET는 5.5 ~ 6.7배, 2DG는 11.8 ~ 17.2배, CT는 6.9 ~ 9.3배의 약물 감소 효과를 나타내어 약물감소지수(DRI)도 가장 높았다.
도 45는 HMF, MET, 2DG 및 CT로 구성된 조합 제제를 48시간 동안 처리한 MCF7 세포주를 분획효과-조합지수(Fa-CI) 그래프로 분석한 것이다. 2종 조합 제제 중에서 분획효과(Fraction Affected)에 따른 가장 높은 조합지수를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
(2) HMF, PHE, 2DG, CT의 단일 제제 및 조합 제제
도 46은 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 유방에서 유래한 암세포인 MCF7 세포주에 지시된 용량에 의해 농도별로 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제의 수가 많을수록 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 47은 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 유방에서 유래한 암세포인 MCF7 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 47에서 2종 조합 제제 중에서 가장 높은 암 억제율을 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 암 억제율을 나타내었다.
표 28
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 4.39 2.47 0.99
PHE 0.71 1.86 0.99
2DG 6.85 1.47 0.95
CT 4.66 2.67 0.99
PHE/2DG 0.40/2.06 1.58 1.00
HMF/PHE/2DG 1.11/0.22/1.13 1.69 1.00
HMF/PHE/CT 1.13/0.23/1.00 2.01 1.00
PHE/2DG/CT 0.24/1.25/1.09 1.73 1.00
HMF/PHE/2DG/CT 0.63/0.13/0.64/0.56 1.93 1.00
상기 표 28은 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 및 조합 제제에 있어서 Calcusyn 소프트웨어를 이용하여 중앙-효과 분석으로 얻어진 Dm(또는 IC50), m(기울기), r(상관계수)를 나타낸 것이다. r 값은 0.95 ~ 1.00으로 용량과 효과간의 상관성이 높게 나타났으며, m 값은 1.47 ~ 2.67로 단독 또는 조합에서 사용된 화합물들에 있어서 용량-효과 곡선이 거의 하이퍼볼릭한 반응을 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 50% 암 억제농도를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 50% 암 억제농도의 저감 효과를 나타내었다.
표 29
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF PHE 2DG CT
PHE/2DG 0.9:4.6 50 0.87(상승효과) - 1.76 3.33 -
75 0.92(부가작용) - 1.59 3.51 -
90 0.97(부가작용) - 1.43 3.70 -
HMF/PHE/2DG 4.5:0.9:4.6 50 0.73(상승효과) 3.97 3.20 6.05 -
75 0.79(상승효과) 3.22 3.01 6.67 -
90 0.87(상승효과) 2.62 2.84 7.35 -
HMF/PHE/CT 4.5:0.9:4 50 0.79(상승효과) 3.90 3.14 - 4.65
75 0.84(상승효과) 3.51 3.28 - 4.06
90 0.89(상승효과) 3.17 3.43 - 3.54
PHE/2DG/CT 0.9:4.6:4 50 0.76(상승효과) - 2.90 5.47 4.28
75 0.82(상승효과) - 2.77 6.13 3.43
90 0.89(상승효과) - 2.65 6.86 2.74
HMF/PHE/2DG/CT 4.5:0.9:4.6:4 50 0.53(상승효과) 7.01 5.65 10.69 8.37
75 0.55(상승효과) 6.19 5.79 12.80 7.16
90 0.58(상승효과) 5.47 5.93 15.34 6.13
표 29에서는 MCF7 세포주에서 각 약물의 몰비에 따른 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제의 IC50, IC75, IC90에서의 조합지수(CI)와 각 단일 제제의 약물감소지수(DRI)를 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 조합지수를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
50 ~ 90% 암 억제율에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 4종 화합물의 조합인 HMF/PHE/2DG/CT 제제에서 HMF는 5.5 ~ 7.0배, PHE는 5.7 ~ 5.9배, 2DG는 10.7 ~ 15.3배, CT는 6.1 ~ 8.4배의 약물 감소 효과를 나타내어 약물감소지수(DRI)도 가장 높았다.
도 48은 HMF, PHE, 2DG 및 CT로 구성된 단일 및 조합 제제를 인간의 유방에서 유래한 암세포인 MCF7 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, PHE에 의한 50% 암억제 농도를 도시한 것으로 PHE의 약물 독성을 얼마나 낮출 수 있는가를 보여주는 것이다. PHE 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제 중 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 4종 조합 제제에서 약물 독성이 가장 낮게 나타났다.
PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 PHE에 의한 50% 암억제 농도가 낮게 나타남으로 약물 독성 감소효과가 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 PHE에 의한 50% 암억제 농도가 가장 낮게 나타남으로 약물 독성 감소효과가 크게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 효과를 나타내었다
도 49는 HMF, PHE, 2DG 및 CT에 의해 48시간 동안 처리된 MCF7 세포주를 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다. 분획효과(Fraction Affected)에 따른 조합지수는 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 4종 조합 제제에서 낮은 억제율과 높은 억제율 모두 상승효과를 나타내었다.
도 49는 HMF, PHE, 2DG 및 CT로 구성된 조합 제제를 48시간 동안 처리한 MCF7 세포주를 분획효과-조합지수(Fa-CI) 그래프로 분석한 것이다. 2종 조합 제제 중에서 분획효과(Fraction Affected)에 따른 가장 높은 조합지수를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
실시예 1-8: 전립선암 세포주(PC-3)의 생존율 억제 효과
인간의 전립선에서 유래한 암세포인 PC-3 세포주에서 HMF, 비구아나이드계 화합물(MET 또는 PHE), 2DG 및 CT 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
(1) HMF, MET, 2DG, CT의 단일 제제 및 조합 제제
도 50은 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 전립선에서 유래한 암세포인 PC-3 세포주에 지시된 용량에 의해 농도별로 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제의 수가 많을수록 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 51은 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 전립선에서 유래한 암세포인 PC-3 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 51에서 2종 조합 제제 중에서 가장 높은 암억제율을 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 암 억제율을 나타내었다.
표 30
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 5.09 2.87 0.96
MET 31.24 1.65 0.99
2DG 4.59 1.55 0.97
CT 6.71 1.89 0.98
HMF/CT 1.90/3.75 1.98 1.00
MET/2DG 19.88/1.06 1.49 1.00
HMF/MET/2DG 0.95/12.98/0.69 1.71 1.00
HMF/MET/CT 0.93/12.74/1.84 1.78 1.00
MET/2DG/CT 13.04/0.70/1.88 1.58 1.00
HMF/MET/2DG/CT 0.54/7.37/0.39/1.07 1.78 1.00
상기 표 30은 HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 및 조합 제제에 있어서 Calcusyn 소프트웨어를 이용하여 중앙-효과 분석으로 얻어진 Dm(또는 IC50), m(기울기), r(상관계수)를 나타낸 것이다. r 값은 0.96 ~ 1.00으로 용량과 효과간의 상관성이 높게 나타났으며, m 값은 1.49 ~ 2.87로 단독 또는 조합에서 사용된 화합물들에 있어서 용량-효과 곡선이 거의 하이퍼볼릭한 반응을 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 50% 암 억제농도를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 50% 암 억제농도의 저감 효과를 나타내었다.
표 31
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET 2DG CT
HMF/CT 3.3:6.5 50 0.93(부가작용) 2.68 - - 1.79
75 0.99(부가작용) 2.25 - - 1.84
90 1.06(부가작용) 1.89 - - 1.88
MET/2DG 45:2.4 50 0.87(상승효과) - 1.57 4.33 -
75 0.92(부가작용) - 1.46 4.20 -
90 0.98(부가작용) - 1.36 4.07 -
HMF/MET/2DG 3.3:45:2.4 50 0.75(상승효과) 5.35 2.41 6.63 -
75 0.79(상승효과) 4.12 2.46 7.08 -
90 0.84(상승효과) 3.18 2.52 7.56 -
HMF/MET/CT 3.3:45:6.5 50 0.87(상승효과) 5.45 2.45 - 3.64
75 0.90(상승효과) 4.31 2.58 - 3.52
90 0.96(부가작용) 3.41 2.71 - 3.40
MET/2DG/CT 45:2.4:6.5 50 0.85(상승효과) - 2.40 6.60 3.56
75 0.90(부가작용) - 2.32 6.68 3.17
90 0.95(부가작용) - 2.25 6.76 2.82
HMF/MET/2DG/CT 3.3:45:2.4:6.5 50 0.59(상승효과) 9.42 4.24 11.68 6.30
75 0.60(상승효과) 7.46 4.46 12.81 6.08
90 0.62(상승효과) 5.90 4.69 14.06 5.87
표 31에서는 PC-3 세포주에서 각 약물의 몰비에 따른 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제의 IC50, IC75, IC90 에서의 조합지수(CI)와 각 단일 제제의 약물감소지수(DRI)를 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 조합지수를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
50 ~ 90% 암 억제율에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 4종 화합물의 조합인 HMF/MET/2DG/CT 제제에서 HMF는 5.9 ~ 9.4배, MET는 4.2 ~ 4.7배, 2DG는 11.7 ~ 14.1배, CT는 5.9 ~ 6.3배의 약물 감소 효과를 나타내어 약물감소지수(DRI)도 가장 높았다.
도 52는 HMF, MET, 2DG 및 CT로 구성된 조합 제제를 48시간 동안 처리한 PC-3 세포주를 분획효과-조합지수(Fa-CI) 그래프로 분석한 것이다. 2종 조합 제제 중에서 분획효과(Fraction Affected)에 따른 가장 높은 조합지수를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.01, p < 0.05). 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
(2) HMF, PHE, 2DG, CT의 단일 제제 및 조합 제제
도 53은 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 전립선에서 유래한 암세포인 PC-3 세포주에 지시된 용량에 의해 농도별로 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제의 수가 많을수록 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 54는 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 전립선에서 유래한 암세포인 PC-3 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 54에서 2종 조합 제제 중에서 가장 높은 암억제율을 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.01, p < 0.001). 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 암 억제율을 나타내었다.
표 32
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 5.09 2.87 0.96
PHE 2.11 2.74 0.98
2DG 4.59 1.55 0.97
CT 6.71 1.89 0.98
PHE/2DG 1.09/1.63 1.91 1.00
HMF/PHE/2DG 1.35/0.66/0.98 2.07 1.00
HMF/PHE/CT 1.22/0.59/2.39 2.20 1.00
PHE/2DG/CT 0.59/0.88/2.39 1.83 1.00
HMF/PHE/2DG/CT 0.72/0.35/0.52/1.42 2.11 1.00
상기 표 32는 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 및 조합 제제에 있어서 Calcusyn 소프트웨어를 이용하여 중앙-효과 분석으로 얻어진 Dm(또는 IC50), m(기울기), r(상관계수)를 나타낸 것이다. r 값은 0.96 ~ 1.00으로 용량과 효과간의 상관성이 높게 나타났으며, m 값은 1.55 ~ 2.87로 단독 또는 조합에서 사용된 화합물들에 있어서 용량-효과 곡선이 거의 하이퍼볼릭한 반응을 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 50% 암 억제농도를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 50% 암 억제농도의 저감 효과를 나타내었다.
표 33
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF PHE 2DG CT
PHE/2DG 1.6:2.4 50 0.87(상승효과) - 1.95 2.82 -
75 0.92(부가작용) - 1.63 3.22 -
90 1.00(부가작용) - 1.37 3.67 -
HMF/PHE/2DG 3.3:1.6:2.4 50 0.79(상승효과) 3.76 3.22 4.66 -
75 0.84(상승효과) 3.24 2.83 5.57 -
90 0.91(부가작용) 2.80 2.48 6.66 -
HMF/PHE/CT 3.3:1.6:6.5 50 0.88(상승효과) 4.19 3.58 - 2.80
75 0.91(부가작용) 3.73 3.25 - 3.04
90 0.95(부가작용) 3.31 2.94 - 3.29
PHE/2DG/CT 1.6:2.4:6.5 50 0.83(상승효과) - 3.59 5.21 2.81
75 0.88(상승효과) - 2.95 5.81 2.76
90 0.94(부가작용) - 2.42 6.48 2.71
HMF/PHE/2DG/CT 3.3:1.6:2.4:6.5 50 0.63(상승효과) 7.08 6.05 8.77 4.73
75 0.64(상승효과) 6.16 5.37 10.58 5.02
90 0.66(상승효과) 5.36 4.76 12.76 5.33
표 33에서는 PC-3 세포주에서 각 약물의 몰비에 따른 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제의 IC50, IC75, IC90 에서의 조합지수(CI)와 각 단일 제제의 약물감소지수(DRI)를 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 조합지수를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
50 ~ 90% 암 억제율에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 4종 화합물의 조합인 HMF/PHE/2DG/CT 제제에서 HMF는 5.4 ~ 7.1배, PHE는 4.8 ~ 6.1배, 2DG는 8.8 ~ 12.8배, CT는 4.7 ~ 5.3배의 약물 감소 효과를 나타내어 약물감소지수(DRI)도 가장 높았다.
도 55는 HMF, PHE, 2DG 및 CT로 구성된 단일 및 조합 제제를 인간의 전립선에서 유래한 암세포인 PC-3 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, PHE에 의한 50% 암억제 농도를 도시한 것으로 PHE의 약물 독성을 얼마나 낮출 수 있는가를 보여주는 것이다. PHE 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제 중 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 4종 조합 제제에서 약물 독성이 가장 낮게 나타났다.
PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 PHE에 의한 50% 암억제 농도가 낮게 나타남으로 약물 독성 감소효과가 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 PHE에 의한 50% 암억제 농도가 가장 낮게 나타남으로 약물 독성 감소효과가 크게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 효과를 나타내었다.
도 56은 HMF, PHE, 2DG 및 CT에 의해 48시간 동안 처리된 PC-3 세포주를 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다. 분획효과(Fraction Affected)에 따른 조합지수는 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 4종 조합 제제에서 낮은 억제율과 높은 억제율 모두 상승효과를 나타내었다.
도 56은 HMF, PHE, 2DG 및 CT로 구성된 조합 제제를 48시간 동안 처리한 PC-3 세포주를 분획효과-조합지수(Fa-CI) 그래프로 분석한 것이다. 2종 조합 제제 중에서 분획효과(Fraction Affected)에 따른 가장 높은 조합지수를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
실시예 1-9: 난소암 세포주(SK-OV-3)의 생존율 억제 효과
인간의 난소에서 유래한 암세포인 SK-OV-3 세포주에서 HMF, 비구아나이드계 화합물(MET 또는 PHE), 2DG 및 CT 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
(1) HMF, MET, 2DG, CT의 단일 제제 및 조합 제제
도 57은 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 난소에서 유래한 암세포인 SK-OV-3 세포주에 지시된 용량에 의해 농도별로 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제의 수가 많을수록 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 58은 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 난소에서 유래한 암세포인 SK-OV-3 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 58에서 2종 조합 제제 중에서 가장 높은 암 억제율을 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 암 억제율을 나타내었다.
표 34
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 2.64 1.65 0.99
MET 30.00 1.76 0.98
2DG 1.21 1.25 0.97
CT 2.64 1.87 0.97
HMF/CT 1.52/0.95 1.58 1.00
MET/2DG 15.28/0.38 1.39 1.00
HMF/MET/2DG 0.82/8.25/0.21 1.49 1.00
HMF/MET/CT 0.89/8.89/0.56 1.59 1.00
MET/2DG/CT 8.93/0.22/0.56 1.45 1.00
HMF/MET/2DG/CT 0.45/4.52/0.11/0.28 1.54 1.00
상기 표 34는 HMF, MET,2DG 및 CT의 단일 및 조합 제제에 있어서 Calcusyn 소프트웨어를 이용하여 중앙-효과 분석으로 얻어진 Dm(또는 IC50), m(기울기), r(상관계수)를 나타낸 것이다. r 값은 0.97 ~ 1.00으로 용량과 효과간의 상관성이 높게 나타났으며, m 값은 1.25 ~ 1.87로 단독 또는 조합에서 사용된 화합물들에 있어서 용량-효과 곡선이 거의 하이퍼볼릭한 반응을 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 50% 암 억제농도를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 50% 암 억제농도의 저감 효과를 나타내었다.
표 35
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET 2DG CT
HMF/CT 4:2.5 50 0.94(부가작용) 1.73 - - 2.77
75 0.99(부가작용) 1.69 - - 2.50
90 1.06(부가작용) 1.64 - - 2.25
MET/2DG 40:1 50 0.83(상승효과) - 1.96 3.17 -
75 0.89(상승효과) - 1.66 3.47 -
90 0.97(부가작용) - 1.41 3.78 -
HMF/MET/2DG 4:40:1 50 0.76(상승효과) 3.20 3.64 5.88 -
75 0.79(상승효과) 2.98 3.25 6.77 -
90 0.83(상승효과) 2.78 2.91 7.80 -
HMF/MET/CT 4:40:2.5 50 0.84(상승효과) 2.97 3.38 - 4.75
75 0.90(상승효과) 2.89 3.15 - 4.28
90 0.96(부가작용) 2.81 2.93 - 3.86
MET/2DG/CT 40:1:2.5 50 0.69(상승효과) - 3.36 5.43 4.73
75 0.76(상승효과) - 2.93 6.11 3.99
90 0.83(상승효과) - 2.56 6.87 3.37
HMF/MET/2DG/CT 4:40:1:2.5 50 0.52(상승효과) 5.84 6.65 10.74 9.35
75 0.55(상승효과) 5.57 6.07 12.64 8.26
90 0.57(상승효과) 5.31 5.55 14.88 7.29
표 35에서는 SK-OV-3 세포주에서 각 약물의 몰비에 따른 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제의 IC50, IC75, IC90 에서의 조합지수(CI)와 각 단일 제제의 약물감소지수(DRI)를 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 조합지수를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
50 ~ 90% 암 억제율에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 4종 화합물의 조합인 HMF/MET/2DG/CT 제제에서 HMF는 5.3 ~ 5.8배, MET는 5.6 ~ 6.7배, 2DG는 10.7 ~ 14.9배, CT는 7.3 ~ 9.4배의 약물 감소 효과를 나타내어 약물감소지수(DRI)도 가장 높았다.
도 59는 HMF, MET, 2DG 및 CT로 구성된 조합 제제를 48시간 동안 처리한 SK-OV-3 세포주를 분획효과-조합지수(Fa-CI) 그래프로 분석한 것이다. 2종 조합 제제 중에서 분획효과(Fraction Affected)에 따른 가장 높은 조합지수를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.05, p < 0.001). 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
(2) HMF, PHE, 2DG, CT의 단일 제제 및 조합 제제
도 60은 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 난소에서 유래한 암세포인 SK-OV-3 세포주에 지시된 용량에 의해 농도별로 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제의 수가 많을수록 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 61은 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 난소에서 유래한 암세포인 SK-OV-3 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 61에서 2종 조합 제제 중에서 가장 높은 암억제율을 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 암 억제율을 나타내었다.
표 36
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 2.64 1.65 0.99
PHE 0.54 1.80 0.90
2DG 1.21 1.25 0.97
CT 2.64 1.87 0.97
PHE/2DG 0.27/0.34 1.44 1.00
HMF/PHE/2DG 0.73/0.15/0.18 1.45 1.00
HMF/PHE/CT 0.79/0.16/0.50 1.57 1.00
PHE/2DG/CT 0.15/0.19/0.48 1.47 1.00
HMF/PHE/2DG/CT 0.41/0.08/0.10/0.26 1.46 1.00
상기 표 36은 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 및 조합 제제에 있어서 Calcusyn 소프트웨어를 이용하여 중앙-효과 분석으로 얻어진 Dm(또는 IC50), m(기울기), r(상관계수)를 나타낸 것이다. r 값은 0.90 ~ 1.00으로 용량과 효과간의 상관성이 높게 나타났으며, m 값은 1.25 ~ 1.87로 단독 또는 조합에서 사용된 화합물들에 있어서 용량-효과 곡선이 거의 하이퍼볼릭한 반응을 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 50% 암 억제농도를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 50% 암 억제농도의 저감 효과를 나타내었다.
표 37
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF PHE 2DG CT
PHE/2DG 0.8:1 50 0.79(상승효과) - 1.96 3.54 -
75 0.85(상승효과) - 1.68 3.95 -
90 0.92(부가작용) - 1.44 4.41 -
HMF/PHE/2DG 4:0.8:1 50 0.70(상승효과) 3.62 3.68 6.64 -
75 0.75(상승효과) 3.29 3.17 7.47 -
90 0.82(상승효과) 3.00 2.74 8.40 -
HMF/PHE/CT 4:0.8:2.5 50 0.78(상승효과) 3.33 3.39 - 5.32
75 0.84(상승효과) 3.22 3.10 - 4.77
90 0.91(상승효과) 3.11 2.84 - 4.28
PHE/2DG/CT 0.8:1:2.5 50 0.63(상승효과) - 3.51 6.32 5.50
75 0.68(상승효과) - 3.05 7.18 4.69
90 0.75(상승효과) - 2.65 8.15 3.99
HMF/PHE/2DG/CT 4:0.8:1:2.5 50 0.49(상승효과) 6.42 6.54 11.79 10.26
75 0.54(상승효과) 5.87 5.66 13.32 8.70
90 0.59(상승효과) 5.36 4.90 15.04 7.37
표 37에서는 SK-OV-3 세포주에서 각 약물의 몰비에 따른 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제의 IC50, IC75, IC90 에서의 조합지수(CI)와 각 단일 제제의 약물감소지수(DRI)를 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 조합지수를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
50 ~ 90% 암 억제율에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 4종 화합물의 조합인 HMF/PHE/2DG/CT 제제에서 HMF는 5.4 ~ 6.4배, PHE는 4.9 ~ 6.5배, 2DG는 11.8 ~ 15.0배, CT는 7.4 ~ 10.3배의 약물 감소 효과를 나타내어 약물감소지수(DRI)도 가장 높았다.
도 62는 HMF, PHE, 2DG 및 CT로 구성된 단일 및 조합 제제를 인간의 난소에서 유래한 암세포인 SK-OV-3 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, PHE에 의한 50% 암억제 농도를 도시한 것으로 PHE의 약물 독성을 얼마나 낮출 수 있는가를 보여주는 것이다. PHE 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제 중 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 4종 조합 제제에서 약물 독성이 가장 낮게 나타났다.
PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 PHE에 의한 50% 암억제 농도가 낮게 나타남으로 약물 독성 감소효과가 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 PHE에 의한 50% 암억제 농도가 가장 낮게 나타남으로 약물 독성 감소효과가 크게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 효과를 나타내었다.
도 63은 HMF, PHE, 2DG 및 CT에 의해 48시간 동안 처리된 SK-OV-3 세포주를 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다. 분획효과(Fraction Affected)에 따른 조합지수는 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 4종 조합 제제에서 낮은 억제율과 높은 억제율 모두 상승효과를 나타내었다.
도 63은 HMF, PHE, 2DG 및 CT로 구성된 조합 제제를 48시간 동안 처리한 SK-OV-3 세포주를 분획효과-조합지수(Fa-CI) 그래프로 분석한 것이다. 2종 조합 제제 중에서 분획효과(Fraction Affected)에 따른 가장 높은 조합지수를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
실시예 1-10: 방광암 세포주(T24)의 생존율 억제 효과
인간의 방광에서 유래한 암세포인 T24 세포주에서 HMF, 비구아나이드계 화합물(MET 또는 PHE), 2DG 및 CT 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제의 세포 증식 억제 효과를 비교하였다.
(1) HMF, MET, 2DG, CT의 단일 제제 및 조합 제제
도 64는 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 방광에서 유래한 암세포인 T24 세포주에 지시된 용량에 의해 농도별로 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제의 수가 많을수록 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 65는 HMF, MET, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 방광에서 유래한 암세포인 T24 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 65에서 2종 조합 제제 중에서 가장 높은 암 억제율을 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 암 억제율을 나타내었다.
표 38
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 3.52 2.16 0.98
MET 16.98 2.09 0.98
2DG 4.02 1.19 0.98
CT 3.11 2.22 1.00
HMF/CT 1.64/1.23 1.98 1.00
MET/2DG 7.77/0.97 1.51 1.00
HMF/MET/2DG 0.88/4.39/0.55 1.67 1.00
HMF/MET/CT 0.88/4.38/0.66 1.93 1.00
MET/2DG/CT 4.27/0.53/0.64 1.57 1.00
HMF/MET/2DG/CT 0.46/2.29/0.29/0.34 1.74 1.00
상기 표 38은 HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 및 조합 제제에 있어서 Calcusyn 소프트웨어를 이용하여 중앙-효과 분석으로 얻어진 Dm(또는 IC50), m(기울기), r(상관계수)를 나타낸 것이다. r 값은 0.98 ~ 1.00으로 용량과 효과간의 상관성이 높게 나타났으며, m 값은 1.19 ~ 2.22로 단독 또는 조합에서 사용된 화합물들에 있어서 용량-효과 곡선이 거의 하이퍼볼릭한 반응을 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 50% 암 억제농도를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 50% 암 억제농도의 저감 효과를 나타내었다.
표 39
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF MET 2DG CT
HMF/CT 4:3 50 0.86(상승효과) 2.14 - - 2.53
75 0.91(부가작용) 2.05 - - 2.38
90 0.96(부가작용) 1.96 - - 2.24
MET/2DG 20:2.5 50 0.70(상승효과) - 2.19 4.14 -
75 0.76(상승효과) - 1.79 5.06 -
90 0.85(상승효과) - 1.46 6.17 -
HMF/MET/2DG 4:20:2.5 50 0.65(상승효과) 4.01 3.87 7.33 -
75 0.69(상승효과) 3.46 3.40 9.60 -
90 0.75(상승효과) 2.99 2.98 12.58 -
MF/MET/CT 4:20:3 50 0.72(상승효과) 4.02 3.88 - 4.74
75 0.76(상승효과) 3.79 3.72 - 4.40
90 0.81(상승효과) 3.57 3.56 - 4.08
MET/2DG/CT 20:2.5:3 50 0.59(상승효과) - 3.98 7.53 4.85
75 0.66(상승효과) - 3.34 9.43 3.94
90 0.75(상승효과) - 2.80 11.81 3.21
HMF/MET/2DG/CT 4:20:2.5:3 50 0.45(상승효과) 7.70 7.43 14.07 9.06
75 0.48(상승효과) 6.82 6.70 18.93 7.92
90 0.52(상승효과) 6.05 6.04 25.46 6.91
표 39에서는 T24 세포주에서 각 약물의 몰비에 따른 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제의 IC50, IC75, IC90 에서의 조합지수(CI)와 각 단일 제제의 약물감소지수(DRI)를 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 조합지수를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
50 ~ 90% 암 억제율에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 4종 화합물의 조합인 HMF/MET/2DG/CT 제제에서 HMF는 6.1 ~ 7.7배, MET는 6.0 ~ 7.4배, 2DG는 14.1 ~ 25.5배, CT는 6.9 ~ 9.1배의 약물 감소 효과를 나타내어 약물감소지수(DRI)도 가장 높았다.
도 66은 HMF, MET, 2DG 및 CT로 구성된 조합 제제를 48시간 동안 처리한 T24 세포주를 분획효과-조합지수(Fa-CI) 그래프로 분석한 것이다. 2종 조합 제제 중에서 분획효과(Fraction Affected)에 따른 가장 높은 조합지수를 나타낸 MET/2DG 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG 또는 MET/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.01, p < 0.001). 또한 HMF/MET/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/MET/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
2) HMF, PHE, 2DG, CT의 단일 제제 및 조합 제제
도 67은 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 방광에서 유래한 암세포인 T24 세포주에 지시된 용량에 의해 농도별로 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제의 수가 많을수록 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 68은 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 각각의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 인간의 방광에서 유래한 암세포인 T24 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, 암세포 생존율 억제 효과를 도시한 것이다. HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 높게 나타났다.
도 68에서 2종 조합 제제 중에서 가장 높은 암 억제율을 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 암세포 생존을 억제하는 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 암 억제율을 나타내었다.
표 40
단일 및 조합 화합물 Parameters
Dm (mM) m r
HMF 3.52 2.16 0.98
PHE 0.49 2.72 0.99
2DG 4.02 1.19 0.98
CT 3.11 2.22 1.00
PHE/2DG 0.21/0.65 1.65 1.00
HMF/PHE/2DG 0.61/0.12/0.38 1.75 1.00
HMF/PHE/CT 0.70/0.14/0.53 1.94 1.00
PHE/2DG/CT 0.12/0.36/0.43 1.75 1.00
HMF/PHE/2DG/CT 0.41/0.08/0.26/0.31 1.93 1.00
상기 표 40은 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 및 조합 제제에 있어서 Calcusyn 소프트웨어를 이용하여 중앙-효과 분석으로 얻어진 Dm(또는 IC50), m(기울기), r(상관계수)를 나타낸 것이다. r 값은 0.98 ~ 1.00으로 용량과 효과간의 상관성이 높게 나타났으며, m 값은 1.19 ~ 2.72로 단독 또는 조합에서 사용된 화합물들에 있어서 용량-효과 곡선이 거의 하이퍼볼릭한 반응을 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 50% 암 억제농도를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50% 암 억제농도의 저감 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 50% 암 억제농도의 저감 효과를 나타내었다.
표 41
조합 화합물 몰비(mM) 억제율(%) 조합지수(CI) 약물감소지수(DRI)
HMF PHE 2DG CT
PHE/2DG 0.8:2.5 50 0.59(상승효과) - 2.34 6.19 -
75 0.68(상승효과) - 1.81 8.04 -
90 0.81(상승효과) - 1.39 10.44 -
HMF/PHE/2DG 4:0.8:2.5 50 0.52(상승효과) 5.78 4.00 10.57 -
75 0.58(상승효과) 5.15 3.21 14.27 -
90 0.66(상승효과) 4.58 2.57 19.28 -
HMF/PHE/CT 4:0.8:3 50 0.66(상승효과) 5.02 3.48 - 5.91
75 0.73(상승효과) 4.74 2.96 - 5.50
90 0.82(상승효과) 4.49 2.52 - 5.13
PHE/2DG/CT 0.8:2.5:3 50 0.47(상승효과) - 4.22 11.15 7.18
75 0.52(상승효과) - 3.38 15.04 6.29
90 0.60(상승효과) - 2.71 20.29 5.51
HMF/PHE/2DG/CT 4:0.8:2.5:3 50 0.45(상승효과) 8.56 5.93 15.64 10.07
75 0.48(상승효과) 8.05 5.02 22.34 9.34
90 0.51(상승효과) 7.58 4.26 31.91 8.66
표 41에서는 T24 세포주에서 각 약물의 몰비에 따른 2종 이상의 화합물을 포함하는 조합 제제의 IC50, IC75, IC90 에서의 조합지수(CI)와 각 단일 제제의 약물감소지수(DRI)를 나타내었다.
2종 조합 제제 중에서 가장 높은 조합지수를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율에서의 조합지수 효과가 더 높게 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 50 ~ 90% 암 억제율암 억제율합지수 효과가 더 높게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
50 ~ 90% 암 억제율에서 가장 높은 상승효과를 나타낸 4종 화합물의 조합인 HMF/PHE/2DG/CT 제제에서 HMF는 7.6 ~ 8.6배, PHE는 4.3 ~ 5.9배, 2DG는 15.6 ~ 31.9배, CT는 8.7 ~ 10.1배의 약물 감소 효과를 나타내어 약물감소지수(DRI)도 가장 높았다.
도 69는 HMF, PHE, 2DG 및 CT로 구성된 단일 및 조합 제제를 인간의 방광에서 유래한 암세포인 T24 세포주에 특정 용량에 의해 48시간 동안 제공한 후, PHE에 의한 50% 암 억제 농도를 도시한 것으로 PHE의 약물 독성을 얼마나 낮출 수 있는가를 보여주는 것이다. PHE 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제 중 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 4종 조합 제제에서 약물 독성이 가장 낮게 나타났다.
PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 PHE에 의한 50% 암 억제 농도가 낮게 나타남으로 약물 독성 감소효과가 나타났다. 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 PHE에 의한 50% 암 억제 농도가 가장 낮게 나타남으로 약물 독성 감소 효과가 크게 나타났으며, 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 효과를 나타내었다.
도 70은 HMF, PHE, 2DG 및 CT에 의해 48시간 동안 처리된 T24 세포주를 Fa-CI 그래프로 분석한 것이다. 분획효과(Fraction Affected)에 따른 조합지수는 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 4종 조합 제제에서 낮은 억제율과 높은 억제율 모두 상승효과를 나타내었다.
도 70은 HMF, PHE, 2DG 및 CT로 구성된 조합 제제를 48시간 동안 처리한 T24 세포주를 분획효과-조합지수(Fa-CI) 그래프로 분석한 것이다. 2종 조합 제제 중에서 분획효과(Fraction Affected)에 따른 가장 높은 조합지수를 나타낸 PHE/2DG 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG 또는 PHE/2DG/CT로 구성된 3종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났다(각각 p < 0.001). 또한 HMF/PHE/CT로 구성된 3종 조합 제제보다는 HMF/PHE/2DG/CT로 구성된 4종 조합 제제에서 조합지수 효과가 더 높게 나타났으며(p < 0.001), 4종 조합 제제는 전체 조합 제제 중에서도 가장 높은 조합지수 효과를 나타내었다.
<실시예 2> HMF, MET 또는 PHE, 2DG 및 CT의 조합 제제가 세포주기 진행과 세포사멸에 미치는 영향
인간의 간에서 유래한 암세포인 HepG2 세포주에서 HMF, MET 또는 PHE, 2DG 및 CT의 조합 제제가 세포증식, 세포주기 진행 및 세포사멸에 미치는 영향을 알아보았다. 이때 사용된 각 약물은 최대 40 mM을 초과하지 않는 범위 내에서 사용하였다.
실시예 2-1: HMF, MET 또는 PHE, 2DG 및 CT의 조합 제제의 HepG2 세포의 증 식에 미치는 영향
HMF, MET 또는 PHE, 2DG 및 CT의 조합 제제가 인간의 간암 HepG2 세포의 증식에 미치는 영향을 조사하기 위해, 세포 배양액에 HMF, MET 또는 PHE, 2DG 및 CT를 3.5:25(PHE로서는 0.8):1:3 mM 농도 비율로 포함하는 조합 제제를 첨가한 실험군과, 이를 첨가하지 않은 대조군을 24, 48, 72시간 배양한 후 MTT 분석법을 실시하여 살아있는 세포 수를 측정하였다.
HMF, MET, 2DG 및 CT를 조합 제제의 농도를 3.5:25:1:3 mM의 농도 비율로 조합한 후, 이를 24, 48, 72시간 처리한 경우, 처리 농도에 따라 유의적으로 세포 증식의 감소 효과가 나타났다(도 71). 조합 제제로 처리하여 24, 48, 72시간 배양한 경우, 처리하지 않은 대조군에 비해 각각 49.94%, 97.01%, 99.62% 세포 증식이 감소하였다.
또한 HMF, PHE, 2DG 및 CT를 조합 제제의 농도를 3.5:0.8:1:3 mM의 농도 비율로 조합한 후, 이를 24, 48, 72시간 처리한 경우, 처리 농도에 따라 유의적으로 세포 증식의 감소 효과가 나타났다(도 72). 조합 제제로 처리하여 24, 48, 72시간 배양한 경우, 처리하지 않은 대조군에 비해 각각 44.13%, 99.12%, 99.85% 세포 증식이 감소하였다.
실시예 2-2: HMF, MET, PHE, 2DG 및 CT의 조합 제제가 HepG2 세포의 세포주 기 진행과 세포사멸에 미치는 영향
세포주기 진행의 지연은 암세포의 증식을 억제하는 방법 중 하나이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 조합 제제가 인간의 간암세포인 HepG2 세포의 세포주기 진행에 미치는 영향을 조사하였다.
세포 배양액에 HMF, MET, 2DG 및 CT를 1.7:10:0.5:1.5 mM의 농도 비율로 포함하는 조합 제제를 첨가한 실험군과 첨가하지 않은 대조군을 24시간 배양한 후, 세포의 핵을 프로피디움 아이오다이드(PI; propidium iodide)로 염색하여 유세포 분석을 실시하였다.
아포토시스에 들어간 세포들은 DNA 양이 G0/G1기의 세포들보다 적으므로 PI 용액으로 염색했을 때 히스토그램에서 G0/G1기의 세포들보다 더 왼쪽에 나타나는데 이것을 Sub-G1이라 하고 이 Sub-G1 지역의 DNA 양을 세포군 %로 구하였다. PI는 세포막을 투과하며 핵내의 DNA에 염색되므로 조기 아포토시스 세포뿐만이 아니라 후기 아포토시스세포와 괴사세포도 모두 염색될 수 있으므로 시간이 지남에 따라 Sub-G1 세포가 증가하였다. 그 결과, 세포 배양액에 HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제보다는 조합 제제의 수가 많을수록 sub-G1에 머물고 있는 세포 수가 현저히 증가하였다(도 73). Sub-G1기 세포 비율이 증가한다는 것은 주어진 실험조건 하에서 아포토시스가 증가한다는 것을 알 수 있었다. 그리고 S기와 G2/M기에 머물고 있는 세포 수는 단일 제제보다는 조합 제제의 수가 많을수록 유의적으로 감소하였다. 상기 결과로부터 상기 4종 조합 제제에서 HepG2 세포의 S기와 G2/M기가 가장 높은 DNA 합성과 유사분열 과정을 방해함으로써 세포증식을 억제하는 것임을 알 수 있었다(도 73).
실시예 2-3: HMF, MET 또는 PHE, 2DG 및 CT의 조합 제제가 HepG2 세포의 단 백질 발현에 미치는 영향
HepG2 세포의 세포주기 진행을 억제한 조합 제제가 어떤 단백질에 영향을 미치는지를 조사하기 위해, HMF, MET, 2DG 및 CT를 4:5:0.5:3 mM의 농도 비율로 포함하는 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제를 세포에 처리하고, 36시간 동안 세포를 배양한 후 세포용해질(cell lysate)을 취해 웨스턴 블롯 분석(Western blot analysis)을 실시하였다.
세포주기 조절인자인 저인산화 Rb는 S주기 진입에 필요한 유전자들의 전사조절에 중요한 역할을 하는 E2F와 결합하여 E2F의 기능을 억제함으로써 세포주기를 G1에 정지시키는 핵심물질로 알려져 있다. 실험 결과 저인산화 Rb의 발현 정도는 HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제 중 4종 조합 제제에서 가장 많이 증가하였다. 저인산화 Rb가 증가된 것으로 보아 증가된 저인산화 Rb가 세포분화 유도에서 나타나는 G1 정지에 깊이 관여되는 것으로 나타났다(도 74).
또한, 세포주기의 진행은 세포질에 있는 단백질에 의해 조절되는데, 이러한 세포 주기 조절을 위해서는 많은 인자들이 필요하며, 그 중에 가장 중요한 역할을 담당하고 있는 것이 사이클린 의존성 키나제(cyclin dependent kinase: CDK)이다. 상기 실험 결과 HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제는 CDK4의 단백질 발현을 현저히 감소시켰으며, CDK4 단백질 발현 감소는 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제 중 4종 조합 제제에서 가장 많은 감소를 보였다.
또한 사이클린은 세포주기의 G1과 G2기에서 cell division cycle 유전자와 상호작용을 하면서 세포주기를 조절하는 물질로 밝혀지고 있으며, 암세포에서는 과잉 발현되는 것으로 보고되고 있다. 사이클린 D1의 단백질 발현은 HMF, MET 및 CT의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제 중 4종 조합 제제에서 가장 많이 감소하였다. G1기 세포 주기 저해의 주요한 전사인자인 p21과 p27의 단백질의 경우, 발현이 증가되면서 G1기에서 S기로의 전환을 억제한다. 상기 실험 결과 HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제 중 4종 조합 제제에서 가장 많이 증가하였다(도 74).
실시예 2-4: HMF, MET 또는 PHE, 2DG 및 CT의 조합 제제가 50% 암 억제 농도 에서 정상세포에 미치는 영향
HMF, MET 또는 PHE, 2DG 및 CT의 조합 제제가 정상세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 간세포주 CHANG과 간암세포주 HepG2에 50% 암 억제 농도로 상기 조합 제제를 처리하고 48시간 후에 MTT 분석법으로 세포독성을 조사하였다. 조합 제제의 간암세포에 대한 세포사멸을 정상 간세포와 비교한 결과, 상기 조합 제제의 HMF, MET, 2DG 및 CT가 50% 암 억제 농도인 경우 HepG2가 정상세포보다 1.90배, 조합 제제의 HMF, PHE, 2DG 및 CT 경우 HepG2가 정상세포보다 1.86배 세포 독성이 증가 되는 것으로 관찰되어, 정상 간세포에 비해 간암세포에서 상기 조합 제제의 독성이 더 크게 나타났다. 상기 실험결과, HMF, MET 또는 PHE, 2DG 및 CT의 조합 제제는 정상 간세포보다 암세포에 훨씬 민감하게 작용하는 것으로 나타났으며, 상기 4종 조합 제제에서 정상 간세포에 가장 낮은 독성을 나타내었다(도 75-76).
실시예 2-5: HMF, MET 또는 PHE, 2DG 및 CT의 조합 제제가 HepG2 세포의 AMPK 활성에 미치는 영향
AMPK는 단백질에 인산을 붙이는 역할을 하는 효소 중 하나로 당 및 지질대사를 조절하며, 에너지 생산에 관련된 효소를 컨트롤한다. AMPK의 기능이 잘못될 경우 대사 과정에 문제가 생기고, 당뇨 및 암과 같은 질병이 발생 될 수 있다.
표 42
단일 및 조합 화합물 농도(mM) pAMPKα (Unit/mL) 대조군 보정치 (pAMPKα)
대조군(Control) 0 5.15 ± 0.8 0
HMF 1.7 6.01 ± 0.9 0.86
MET 10.0 13.05 ± 1.7 7.90
2DG 0.5 7.17 ± 1.1 2.02
CT 1.5 6.52 ± 1.0 1.37
HMF/CT 1.7 : 1.5 11.23 ± 1.4 6.08
MET/2DG 10.0 : 0.5 18.53 ± 2.2 13.38
HMF/MET/2DG 1.7 : 10.0 : 0.5 19.87 ± 2.7 14.72
HMF/MET/CT 1.7 : 10.0 : 1.5 16.55 ± 2.0 11.40
MET/2DG/CT 10.0 : 0.5 : 1.5 20.03 ± 3.0 14.88
HMF/MET/2DG/CT 1.7 : 10.0 : 0.5 : 1.5 29.45 ± 3.7 24.30
상기 표 42는 AMPKα의 트레오닌 172 잔기(Thr172)의 인산화 된 정도를 나타낸 것이다. HMF, MET, 2DG 및 CT의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제 중에서 4종 화합물의 조합인 HMF/MET/2DG/CT는 HMF 단독 처리 시 28.3배, MET는 3.1배, 2DG는 12.0배, CT는 17.7배 증가한 값을 나타내어 가장 높은 AMPK 활성화 정도를 나타내었다.
표 43
단일 및 조합 화합물 농도(mM) pAMPKα (Unit/mL) 대조군 보정치 (pAMPKα)
대조군(Control) 0 5.15 ± 0.8 0
HMF 1.7 6.01 ± 0.9 0.86
PHE 0.4 12.44 ± 1.6 7.29
2DG 0.5 7.17 ± 1.1 2.02
CT 1.5 6.52 ± 1.0 1.37
HMF/CT 1.7 : 1.5 11.23 ± 1.4 6.08
PHE/2DG 0.4 : 0.5 17.87 ± 2.1 12.72
HMF/PHE/2DG 1.7 : 0.4 : 0.5 18.82 ± 2.5 13.67
HMF/PHE/CT 1.7 : 0.4 : 1.5 15.23 ± 1.9 10.08
PHE/2DG/CT 0.4 : 0.5 : 1.5 19.93 ± 2.8 14.78
HMF/PHE/2DG/CT 1.7 : 0.4 : 0.5 : 1.5 27.31 ± 3.4 22.16
또한 상기 HMF, PHE, 2DG 및 CT의 단일 제제와 2종 이상의 조합 제제 중에서 4종 화합물의 조합인 HMF/PHE/2DG/CT는 HMF 단독 처리 시 보다 25.8배, PHE는 3.0배, 2DG는 11.0배, CT는 16.2배 증가한 값을 나타내어 가장 높은 AMPK 활성화 정도를 나타내었다(표 43).
상기 실험결과, AMPK 활성화와 연관된 항암작용 기전은 병용 처리 시 각 약물의 상승작용으로 인해 더욱 증가된 항암 활성 효과를 보임을 확인할 수 있었다(도77-78).

Claims (10)

  1. (1) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;
    (2) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및
    (3) i) 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, ii) 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 iii) 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 비구아나이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 2-데옥시-D-글루코스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것인 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 : 비구아나이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 : 2-데옥시-D-글루코스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 : 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 조합 몰비가 1:0.05:0.2:1 내지 1:30:1:4의 범위인 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비구아나이드계 화합물은 메트포르민(metformin) 또는 펜포르민(Phenformin)인 것인 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 암은 간암, 폐암, 위암, 췌장암, 대장암, 자궁경부암, 유방암, 전립선암, 난소암 및 방광암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 조성물.
  7. (1) 비구아나이드계(biguanide) 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염;
    (2) 2-데옥시-D-글루코스(2-deoxy-D-glucose) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염; 및
    (3) i) 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, ii) 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 또는 iii) 5-하이드록시메틸푸르푸랄(5-hydroxymethylfurfural) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 구연산(Citric acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 5-하이드록시메틸푸르푸랄 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 비구아나이드계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 2-데옥시-D-글루코스 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 및 구연산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함하는 것인 조성물.
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 비구아나이드계 화합물은 메트포르민 또는 펜포르민인 것인 조성물.
  10. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을, 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 암을 예방 또는 치료하는 방법.
PCT/KR2013/007591 2012-08-24 2013-08-23 항암용 조성물 WO2014030972A1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120093327A KR101458061B1 (ko) 2012-08-24 2012-08-24 항암용 조성물
KR10-2012-0093327 2012-08-24

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2014030972A1 true WO2014030972A1 (ko) 2014-02-27

Family

ID=50150184

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2013/007591 WO2014030972A1 (ko) 2012-08-24 2013-08-23 항암용 조성물

Country Status (2)

Country Link
KR (1) KR101458061B1 (ko)
WO (1) WO2014030972A1 (ko)

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109692171A (zh) * 2017-10-22 2019-04-30 海南医学院 一种治疗肝癌化合物
CN109692170A (zh) * 2017-10-22 2019-04-30 海南医学院 一种抗乳腺癌药物
CN113271976A (zh) * 2018-12-31 2021-08-17 诺阿姆公司 包含免疫检查点抑制剂的抗癌组合物
AU2019381050B2 (en) * 2018-11-12 2023-01-19 Noahm Inc. Anticancer composition
RU2789245C2 (ru) * 2018-11-12 2023-01-31 Ноам Инк. Противораковая композиция

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021100897A1 (ko) * 2019-11-19 2021-05-27 (주)프론트바이오 바이구아나이드 계열, 및 페로센 또는 페로센 유도체를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080194019A1 (en) * 2003-09-09 2008-08-14 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Tumor Suppressor Lkb1 Kinase Directly Activates Amp-Activated Kinase
KR20120050919A (ko) * 2010-11-11 2012-05-21 서성은 항암용 조성물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080194019A1 (en) * 2003-09-09 2008-08-14 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Tumor Suppressor Lkb1 Kinase Directly Activates Amp-Activated Kinase
KR20120050919A (ko) * 2010-11-11 2012-05-21 서성은 항암용 조성물

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MOTOO, Y. ET AL.: "Metabolic disorder, inflammation, and deregulated molecular pathways converging in pancreatic cancer development: implications for new therapeutic strategies", CANCERS, vol. 3, 2011, pages 446 - 460 *
PISTOLLATO, F. ET AL.: "Hypoxia and succinate antagonize 2-deoxyglucose effects on glioblastoma", BIOCHEMICAL PHARMACOLOGY, vol. 80, 2010, pages 1517 - 1527 *
SAHRA, I. B. ET AL.: "Targeting cancer cell metabolism: the combination of metformin and 2-deoxyglucose induces p53-dependent apoptosis in prostate cancer cells", CANCER RESEARCH, vol. 70, no. 6, 2010, pages 2465 - 2475 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109692171A (zh) * 2017-10-22 2019-04-30 海南医学院 一种治疗肝癌化合物
CN109692170A (zh) * 2017-10-22 2019-04-30 海南医学院 一种抗乳腺癌药物
AU2019381050B2 (en) * 2018-11-12 2023-01-19 Noahm Inc. Anticancer composition
RU2789245C2 (ru) * 2018-11-12 2023-01-31 Ноам Инк. Противораковая композиция
CN113271933B (zh) * 2018-11-12 2024-01-09 诺阿姆公司 抗癌组合物
CN113271976A (zh) * 2018-12-31 2021-08-17 诺阿姆公司 包含免疫检查点抑制剂的抗癌组合物

Also Published As

Publication number Publication date
KR101458061B1 (ko) 2014-11-05
KR20140026981A (ko) 2014-03-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2014030972A1 (ko) 항암용 조성물
WO2021162451A1 (ko) 담즙산 또는 이의 유도체, 바이구아나이드 계열 화합물 및 항바이러스제 중 2종 이상을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2021246797A1 (ko) 항바이러스제 및 항우울제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2018124508A1 (ko) 3,5-디카페오일퀴닉에시드 또는 국화 추출물을 함유하는 근육 질환 예방 및 치료용 또는 근 기능 개선용 조성물
WO2021177519A1 (ko) 바이구아나이드 계열 화합물 및 플라본, 하이드록시플라본, 플라바논, 플라본 유도체, 하이드록시플라본 유도체, 플라바논 유도체의 복합제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2022035115A1 (ko) 오리나무 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 골격근 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 이의 용도
WO2018004213A1 (ko) Smo 저해 활성을 갖는 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물
WO2017030410A1 (ko) 검정콩잎 추출물 및 이로부터 분리한 플라보놀배당체를 유효성분으로 함유하는 대사증후군의 예방 또는 치료용, 또는 항산화용 조성물
WO2018012907A1 (ko) Pi3k를 억제하는 신규한 퀴나졸리논 유도체 및 이를 포함하는 약학적 조성물
WO2019168237A1 (ko) 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 섬유증 또는 비알코올성 지방간염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2021230600A1 (ko) 대사항암제를 포함하는 항암용 조성물
WO2012074249A2 (ko) 신규한 퓨리닐피리디닐아미노-2,4-디플루오로페닐 설폰아미드 유도체, 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 Ｒａｆ키나제의 저해활성을 가지는 약학적 조성물
WO2013183920A1 (ko) 베르베논 유도체를 함유하는 퇴행성 뇌질환 치료 또는 예방용 약학 조성물
WO2012064159A2 (ko) 항암용 조성물
WO2014007447A1 (ko) 하이드록시 챨콘 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2019147089A1 (ko) 칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2018004263A1 (ko) 광학 활성 피라노크로메닐페놀 유도체 및 그를 포함하는 약학적 조성물
WO2019194583A1 (ko) 3-페닐-2,8-디히드로피라노[2,3-f]크로멘 유도체 및 이를 포함하는 약학적 조성물
WO2015102390A1 (ko) 신규한 아미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 통증의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2021230710A1 (ko) 신규 ido/tdo 억제제, 그의 항암 용도, 그의 항암 병용 요법
WO2022225259A1 (ko) 세포 노화 및 세포사멸을 유도하는 항암 조성물
WO2021101268A1 (ko) 벤즈아미드 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2012060482A1 (ko) Ｃｄｋ를 저해하는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이를 유효성분으로 함유하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2021100897A1 (ko) 바이구아나이드 계열, 및 페로센 또는 페로센 유도체를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2018217009A1 (ko) 신선초 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 함유하는 근육관련 질환의 예방 및 치료용 조성물 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 13830981

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 13830981

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1