WO2012060482A1 - Ｃｄｋ를 저해하는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이를 유효성분으로 함유하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Ｃｄｋ를 저해하는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이를 유효성분으로 함유하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

Info

Publication number
WO2012060482A1
WO2012060482A1 PCT/KR2010/007650 KR2010007650W WO2012060482A1 WO 2012060482 A1 WO2012060482 A1 WO 2012060482A1 KR 2010007650 W KR2010007650 W KR 2010007650W WO 2012060482 A1 WO2012060482 A1 WO 2012060482A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
compound
formula
carboxamide derivative
bromo
pyrrolo
Prior art date
Application number
PCT/KR2010/007650
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이승기
김병문
조승주
김영종
Original Assignee
서울대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교 산학협력단 filed Critical 서울대학교 산학협력단
Priority to EP10859285.8A priority Critical patent/EP2636677B1/en
Priority to PCT/KR2010/007650 priority patent/WO2012060482A1/ko
Priority to US13/882,955 priority patent/US9062088B2/en
Publication of WO2012060482A1 publication Critical patent/WO2012060482A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/14—Pyrrolo-pyrimidine radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7068—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines having oxo groups directly attached to the pyrimidine ring, e.g. cytidine, cytidylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H1/00—Processes for the preparation of sugar derivatives

Definitions

  • the present invention relates to a pyrrolopyrimidinone carboxamide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof that inhibits CDV, and a pharmaceutical composition for preventing or treating hepatocellular carcinoma containing the same as an active ingredient.
  • Hepatocellular carcinoma is the most fatal disease in patients with cirrhosis. Hepatocellular carcinoma is also the sixth highest incidence in the world and the third most common among cancers. In the United States, the disease occurred in 1.3 cases per 100,000 people between 1978 and 1980 and then increased to 3.3 cases per 100,000 people from 1998 to 2001. This increase in incidence continues year after year, and decades ago, hepatitis C virus (HCV) was the most common cause of infection, but since then, hepatitis B virus (HBV) has been reported worldwide. Infections have become widespread and HBV hepatitis is the leading cause of hepatocellular carcinoma worldwide. In addition, the prevalence rate is higher in Asia and Africa than in the West.
  • HCV hepatitis C virus
  • hepatocellular carcinoma expresses resistance genes of various drugs and has low sensitivity to chemotherapy.
  • Cdk cyclin dependent kinase
  • Such hepatocellular carcinoma has been maintained at a very high activity of Cdk (cyclin dependent kinase) in tissues and cells. This is because intracellular Cdk inhibitors (p16Ink4, p21Waf1, p27Kip1, etc.) are inhibited or cyclins complexed with Cdk have abnormal activity.
  • inhibitors of Cdks may be good candidates for the treatment of hepatocellular carcinoma, and some of these inhibitors (flavopiridol and roscovitine, etc.) are already in clinical trials. Do.
  • Molecules that inhibit Cdks in cells play an important role in regulating the cell cycle by participating in critical checkpoints in the cell cycle.
  • Already reported division of G1 / S or G2 / M checkpoints in the cell cycle can cause cells to become uncontrolled, leading to cancer or apoptosis. Therefore, studying the mechanism of action through Cdk inhibitor is very important for the treatment of cancer.
  • Cdks regulate two parts essential for the growth of cancer cells: cell cycle progression and gene transcription.
  • Cdks regulate entry into each phase of the cell cycle by phosphorylating molecules important in the cell cycle, such as the Rb protein.
  • Cdks form heterodimers with cyclins to form complexes with new activity.
  • Cdk2 / cyclin E is essential to enter the S phase
  • Cdk2 / cyclin A is essential just before moving from the S phase to the G2 phase.
  • Cdks also regulate gene transcription by phosphorylating the carboxyl-terminal domain of the RNA polymerase II large subnuit.
  • RNA polymerase II contains a 52-time repeating sequence in the form of heptapeptide (YSPTSPS) that can be well phosphorylated.
  • YSPTSPS heptapeptide
  • Cdks are known to phosphorylate these parts. Among them are Cdk7 / cyclin H / Mat1, a part of the TFIIH complex that induces transcriptional initiation, and Cdk9 / cyclin T, called P-TEFb, which is involved in transcriptional elongation in transcription.
  • the present inventors are studying to synthesize a new Cdk inhibitor compound, and synthesize pyrrolopyrimidinone carboxamide derivatives, and the pyrrolopyrimidinone carboxamide derivatives are used in vitro experiments and animal models. Experiments showed excellent Cdk inhibitory effect and confirmed that it can be usefully used for the prevention or treatment of hepatocellular carcinoma and completed the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing the pyrrolopyrimidinone carboxamide derivative.
  • Still another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating hepatocellular carcinoma containing the pyrrolopyrimidinone carboxamide derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention provides a pyrrolopyrimidinone carboxamide derivative represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • R 1 and R 2 are as defined herein.
  • the present invention also provides a method for preparing the pyrrolopyrimidinone carboxamide derivative.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating hepatocellular carcinoma containing the pyrrolopyrimidinone carboxamide derivative, or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • composition containing the pyrrolopyrimidinone carboxamide derivative according to the present invention inhibits the cell growth of SNU-354 cells, a human liver cancer cell line by inhibiting Cdk1 and Cdk2, and SNU, a human liver cancer cell line by inhibiting Cdk7 and Cdk9.
  • Induction of apoptosis of -354 cells may be useful for the prevention or treatment of hepatocellular carcinoma.
  • 1 is a view showing the results of electrophoresis of the degree of phosphorylation of Cdk1 and Cdk2 of the compound according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a graph showing the quantification of the results of electrophoresis of the degree of phosphorylation of Cdk1 and Cdk2 of the compound according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 3 is an electrophoresis of Western blot analysis of the phosphorylation degree of Cdk1 and pdk2 phosphorylation of Cdk2 for p-nucleoline of the compound according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 4 is a graph showing the quantification of the electrophoresis results of Western blot analysis of the phosphorylation degree of Cdk1 and pdk2 phosphorylation of Cdk2 of the compound according to an embodiment of the present invention.
  • 5 is a view showing the results of electrophoresis of Cdk7 activity of the compound according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 6 is a graph showing the quantification of the electrophoresis results of Cdk7 activity of the compound according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a view showing the results of electrophoresis of Cdk9 activity of the compound according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 8 is a graph showing quantitative electrophoresis results of Cdk9 activity of a compound according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 9 is a diagram showing a result of Western blot analysis of Cdk7 activity of a compound according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 10 is a graph showing the quantification of Western blot analysis of the Cdk7 activity of the compound according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 is a view showing the result of Western blot analysis of Cdk9 activity of the compound according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 12 is a graph showing the quantification of Western blot analysis of the Cdk9 activity of the compound according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 13 is a view showing the results of Western blot analysis for the amount of Mcl-1, survivin, XIAP protein of the compound according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of PCR analysis for the amount of Mcl-1, survivin, XIAP protein of the compound according to an embodiment of the present invention.
  • 15 is a view showing the results of MTT analysis of the cell viability of the compound according to an embodiment of the present invention.
  • 16 is a view showing the results of 3 H-thymidine incorporation analysis on the cell viability of the compound according to an embodiment of the present invention.
  • 17 is a view showing the effect of PARP cleavage by the compound according to an embodiment of the present invention through Western blot analysis.
  • FIG. 18 is a view showing the results of measuring the activity of caspase-3 according to the concentration change of the compound according to an embodiment of the present invention.
  • 19 is a view showing the results of FACS analysis of the change in the sub G1 ratio of SNU-354 cells according to the concentration change of the compound according to an embodiment of the present invention.
  • 20 is a view showing the results of FACS analysis of the change in the sub G1 ratio of SNU-354 cells with time variation of the compound according to an embodiment of the present invention.
  • 21 is a view showing a change in weight of the animal by the concentration of the compound according to an embodiment of the present invention.
  • 22 is a view showing the growth of xenograft cancer in the administration group of the compound according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 23 is a diagram illustrating H & E staining, TUNEL analysis, and broken caspase-3 expression levels in xenograft cancer and liver tissue administered with a compound according to an embodiment of the present invention.
  • 24 is a diagram showing the result of Sub G1 analysis after treating the compounds according to an embodiment of the present invention in SNU-354 cells.
  • FIG. 25 shows the results of caspase-3 activity analysis after treatment of compounds according to one embodiment of the present invention to SNU-354 cells.
  • the present invention provides a compound pyrrolopyrimidinone carboxamide derivative represented by Chemical Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • R 1 is hydrogen or R 3 C ( ⁇ O);
  • R 3 is C 1 to C 6 straight or branched alkyl, C 3 to C 8 cycloalkyl or phenyl;
  • R 2 is hydrogen or an acetyl group.
  • R 3 is methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, t-butyl, cyclopentyl, cyclohexyl or phenyl.
  • the pyrrolopyrimidinone carboxamide derivative represented by Formula 1 of the present invention may be used in the form of a pharmaceutically acceptable salt, and the salt may be an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid. This is useful.
  • the expression pharmaceutically acceptable salt is a concentration that has a relatively nontoxic and harmless effect on the patient and that any side effects due to the salt do not degrade the beneficial efficacy of the base compound of formula 1, or Means inorganic addition salts.
  • These salts may include inorganic acids and organic acids as free acids, hydrochloric acid, bromic acid, nitric acid, sulfuric acid, perchloric acid, phosphoric acid, and the like, and citric acid, acetic acid, lactic acid, maleic acid, and fumarine as organic acids.
  • Acids Gluconic Acid, Methanesulfonic Acid, Glyconic Acid, Succinic Acid, Tartaric Acid, Galluturonic Acid, Embonic Acid, Glutamic Acid, Aspartic Acid, Oxalic Acid, (D) or (L) Malic Acid, Maleic Acid, Methanesulphonic Acid, Ethene Sulfur Phonic acid, 4-toluenesulfonic acid, salicylic acid, citric acid, benzoic acid or malonic acid and the like can be used.
  • These salts also include alkali metal salts (sodium salts, potassium salts, and the like), alkaline earth metal salts (calcium salts, magnesium salts, and the like) and the like.
  • acid addition salts include acetates, aspartates, benzates, besylates, bicarbonates / carbonates, bisulfates / sulfates, borates, camsylates, citrates, disylates, ecylates, formates, fumarates, Gluceptate, Gluconate, Glucuronate, Hexafluorophosphate, Hibenzate, Hydrochloride / Chloride, Hydrobromide / Bromide, Hydroiodide / Iodide, Isetionate, Lactate, Maleate, Mali Eate, malonate, mesylate, methylsulfate, naphthylate, 2-naphsylate, nicotinate, nitrate, orotate, oxalate, palmitate, pamoate, phosphate / hydrogen phosphate / dihydrogen phosphate, saccha Laterate, stearate, succinate, tartrate, tosy
  • the pyrrolopyrimidinone carboxamide derivative represented by Formula 1 of the present invention is not only a pharmaceutically acceptable salt, but also all salts, isomers, hydrates, and solvates that can be prepared by conventional methods. Include.
  • the addition salt according to the present invention can be prepared by a conventional method, for example, by dissolving the compound of Formula 1 in a water miscible organic solvent such as acetone, methanol, ethanol, or acetonitrile and adding an excess of an organic acid or an inorganic acid. It can be prepared by adding an aqueous acid solution of, followed by precipitation or crystallization. The solvent or excess acid may then be evaporated and dried in this mixture to obtain an addition salt or the precipitated salt may be prepared by suction filtration.
  • a water miscible organic solvent such as acetone, methanol, ethanol, or acetonitrile
  • step 1 Adding BSA to the compound of Formula 2 and reacting with the compound of Formula 3 in the presence of TMSOTf to prepare a compound of Formula 4 (step 1);
  • a method for preparing pyrrolopyrimidinone carboxamide derivative comprising the step (step 3) of preparing a compound of Formula 1a by adding hydrogen peroxide to the compound of Formula 5.
  • Step 1 according to the present invention is a step of preparing a compound of Formula 4 by reacting a compound of Formula 2 as a starting material with BSA in a solvent and then reacting with a compound of Formula 3.
  • reaction is generally widely known in the field of organic chemistry, and reaction conditions such as a reaction solvent, a reaction temperature, and a reaction time may be appropriately selected in consideration of a reactant, a product, and the like.
  • reaction solvent was DCE and toluene, and reacted at 80 ° C. to obtain the compound of Formula 4.
  • Step 2 according to the present invention is a step of preparing a compound of formula 5 by reacting the compound of formula 4 prepared in step 1 in a solvent.
  • Step 3 is a step of preparing a compound of Formula 1a by directly proceeding with a reaction without separating the compound of Formula 5 prepared in Step 2.
  • the present invention may further comprise the step (step 4) of preparing a compound of Formula 1 through esterification of the compound of Formula 1a, as shown in Scheme 2 below.
  • R 1 and R 2 are the same as defined in Chemical Formula 1, except that R 1 excludes H.
  • Step 4 according to the present invention is a step of preparing a compound of Formula 1 by esterifying or protecting a secondary hydroxyl group of the terminal primary hydroxyl group of the compound of Formula 1a.
  • It may be prepared by adding a compound of formula (7) by adding triethylol phosphomate and ammonia water (step 2).
  • It can be prepared by the step of reacting the L- xylose of formula (8) with boric acid and the reaction at high temperature by the addition of acetic acid and acetic anhydride.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating hepatocellular carcinoma containing a pyrrolopyrimidinone carboxamide derivative represented by Chemical Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the hepatocellular carcinoma refers to cancers that occur in hepatocytes and generally refers to hepatocellular carcinoma originating from hepatocytes.
  • the pyrrolopyrimidinone carboxamide derivative or pharmaceutically acceptable salt thereof has a Cdk inhibitory action, and preferably the Cdk comprises Cdk1, Cdk2, Cdk7 and Cdk9.
  • the pyrrolopyrimidinone carboxamide derivative according to the present invention inhibits cell growth of SNU-354 cells, which are human liver cancer cell lines, through inhibition of Cdk1 and Cdk2, and SNU-354, which is human liver cancer cell line, through inhibition of Cdk7 and Cdk9. It can be usefully used as a prophylactic or therapeutic agent for hepatocellular carcinoma by inducing apoptosis of cells.
  • the pharmaceutical composition containing the pyrrolopyrimidinone carboxamide derivative of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient may be prepared in various oral forms during clinical administration. Or may be formulated in a parenteral dosage form, but is not limited thereto.
  • Formulations for oral administration include, for example, tablets, pills, hard / soft capsules, solutions, suspensions, emulsifiers, syrups, granules, elixirs, and the like.
  • Rose sucrose, mannitol, sorbitol, cellulose and / or glycine
  • lubricants such as silica, talc, stearic acid and its magnesium or calcium salts and / or polyethylene glycols.
  • Tablets may also contain binders such as magnesium aluminum silicate, starch paste, gelatin, methylcellulose, sodium carboxymethylcellulose and / or polyvinylpyrrolidine, and optionally such as starch, agar, alginic acid or its sodium salt.
  • Disintegrant or boiling mixtures and / or absorbents, colorants, flavors, and sweeteners include, for example, tablets, pills, hard / soft capsules, solutions, suspensions, emulsifiers, syrups, granules, elixir
  • the pharmaceutical composition comprising the pyrrolopyrimidinone carboxamide derivative of Formula 1 as an active ingredient may be administered parenterally, and the parenteral administration may be performed by subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, or intrathoracic injection.
  • parenteral administration may be performed by subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, or intrathoracic injection.
  • the pyrrolopyrimidinone carboxamide derivative of Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is mixed with water with a stabilizer or a buffer to prepare a solution or suspension, and It may be prepared in ampule or vial unit dosage forms.
  • the compositions may contain sterile and / or preservatives, stabilizers, hydrating or emulsifying accelerators, auxiliaries such as salts and / or buffers for the control of osmotic pressure, and other therapeutically useful substances, and conventional methods of mixing, granulating It may be formulated according to the formulation or coating method.
  • the dosage of the compound of the present invention to the human body may vary depending on the age, weight, sex, dosage form, health condition and degree of disease of the patient, and generally based on an adult patient having a weight of 70 kg. It is 0.1-1,000 mg / day, Preferably it is 1-500 mg / day, It can also divide and administer once a day to several times at regular time intervals according to a decision of a doctor or a pharmacist.
  • Tetracyanoethylene (10.02 g, 78.23 mmol) was dissolved in a mixed solvent of acetone (60 ml) and ethyl acetate (120 ml), and then hydrogen bromide (33 wt%, 60 ml) dissolved in acetic acid at 0-5 ° C. Added. The yellow solid obtained by stirring for further 1 hour was separated using a filter. After washing twice with cold distilled water (100 ml) and dried in air to obtain the target product (11.02 g, 52.22 mmol, 66.8%).
  • Step 2 4-amino-6-bromo-7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidine-5-carbonitrile (4-Amino-6-bromo-7H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidine -5-carbonitrile) (4) Preparation of
  • step 1 The compound of formula 3 (10.57 g, 50.09 mmol) obtained in step 1 was suspended in distilled acetonitrile (170 mL). Triethylol phoformate (20.0 mL, 182 mmol) was added thereto, and the temperature was raised to a boiling point and heated for 4 hours. The dark brown solution is cooled to room temperature, and the remaining residue is filtered using a filter paper, and the acetonitrile is removed by vacuum to remove 2-bromo-5- (ethoxymethylene) iminopyrrole-3,4 as a brown solid. Obtained dicarbonitrile.
  • the brown solid was again dissolved in saturated ammonia water (100 mL), and the resulting solution was mixed with decolorized carbon (5.0 g), filtered through a pad of celite, and the process was repeated once more.
  • Acetic acid (80 mL) was slowly added until a white precipitate formed in the filtered yellow liquid.
  • the suspension was stored at ⁇ 5 ° C. for 8 hours and then filtered using a filter.
  • the filtered white solid was dried at 120 ° C. for 8 hours using a vacuum oven to obtain a target product (9.99 g, 41.97 mmol, 84%).
  • Example 1 4-Amino-6-bromo-1-((2S, 3R, 4R, 5S) -3,4-dihydroxy-5- (hydroxymethyl) -tetrahydrofuran-2-yl 1H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidine-5-carboxamide (4-amino-6-bromo-1-((2S, 3R, 4R, 5S) -3,4-dihydroxy-5- Preparation of (hydroxymethyl) -tetrahydrofuran-2-yl) -1H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidine-5-carboxamide) (1a)
  • Step 1 (2S, 3R, 4S, 5S) -2- (acetoxymethyl) -5- (4-amino-6-bromo-5-cyano-7H-pyrrolo [2,3-d] pyrid Midin-1-yl) tetrahydrofuran-3,4-diyl diacetate ((2S, 3R, 4S, 5S) -2- (Acetoxymethyl) -5- (4-amino-6-bromo-5-cyano-7H -pyrrolo [2,3-d] pyrimidin-1-yl) tetrahydrofuran-3,4-diyl diacetate) (6)
  • the compound of Chemical Formula 2 (552 mg, 2.3 mmol) obtained in Preparation Example 1 was suspended in distilled DCE (23 mL), and BSA (1.2 mL, 3.1 mmol) was added thereto, and the mixture was heated at 80 ° C. for 1 hour. When the suspension was clear, the solvent was removed using vacuum and the remaining material was dissolved again in distilled toluene (5 mL). Tetra-O-acetyl- ⁇ -d-xylpuranose (382 mg, 1.2 mmol) and TMSOTf (0.24 mL, 289 mg, 1.3 mmol) dissolved in toluene were added to the solution at 80 ° C. for one hour. Heated more.
  • Step 2 and Step 3 4-amino-6-bromo-1-((2S, 3S, 4S, 5S) -3,4-dihydroxy-5- (hydroxymethyl) tetrahydrofuran-2-yl ) -1H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidine-5-carboxamide (4-Amino-6-bromo-1-((2S, 3S, 4S, 5S) -3,4-dihydroxy-5 Preparation of-(hydroxymethyl) tetrahydrofuran-2-yl) -1H-pyrrolo [2,3-d] pyrimidine-5-carboxamide) (1a)
  • step 1 The compound of formula 4 (3.183 g, 6.41 mmol) obtained in step 1 was suspended in methanol, and then saturated ammonium hydroxide solution (25 mL) was added thereto, followed by stirring for about 30 minutes. The reaction was observed through thin layer chromatography (TLC), and it was confirmed that the compound of Formula 5 was formed as the starting material disappeared.
  • TLC thin layer chromatography
  • the ethyl acetate extract was washed with saturated sodium bicarbonate aqueous solution and brine, dried over magnesium sulfate and concentrated.
  • the target product (168 mg, 0.38 mmol, 35.8%) was isolated through flash chromatography.
  • SNU-354 cells a human hepatocellular carcinoma cell line, were obtained from the Center for Functional Analysis of Human Genome in Korea, and the conventional Cdk inhibitors olomausin and rosecobitin were cal It was purchased from Biobio (Calbiochem) company (San Diego, CA, USA), dissolved in 50 mM concentration in DMSO and stored at -20 °C.
  • SNU-354 cells were cultured at 37% in 5% CO 2 in a CO 2 incubator with 10% FBS (Invitrogen) and antibiotics (antibiotics / antimycotics (Invitrogen)) in RPMI 1640 medium (Invitrogen, CA, USA). . Iso-pyrrolopyrimidinone carboxamide was treated with SNU-354 cells at a concentration of 10-50 ⁇ M (final concentration) for 24 hours.
  • Kinase Assay Buffer 50 mM Tris pH 7.4), 10 mM Magnesium Chloride, 1 mM EGTA, 40 mM ⁇ -glycerophosphate, 0.1 mM Na 3 VO 4 , 1 mM DTT, 0.1 ⁇ g / ml Leupeptin, 0.1 ⁇ g / 5 ⁇ g histone H1 as substrate in ml pepstetin A, 0.1 ⁇ g / ml antipine and 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 20 ng Cdk1 / cyclin B as enzyme or 40 ng Cdk2 / cyclin Recombinant proteins (Upstate, NY, USA), 2.5 ⁇ Curie [ ⁇ -32P] ATP, 100 ⁇ M MgAc / ATP were added and the reaction volume was adjusted to 50 ⁇ l.
  • the kinase reaction was performed at 30 ° C. for 20 minutes. After the reaction was electrophoresed to 12% SDS-polyacrylamide gel, confirmed by radiographic photographing the degree of phosphorylation of Cdk1 and Cdk2 according to the concentration of the compound of Example 2 is shown in Figure 1, Figure 2 and Table 1 below. .
  • the phosphorylation degree of each of Cdk1 and Cdk2 when treated with 0 nM of the compound of Example 2 according to the present invention was regarded as 100%.
  • the degree of phosphorylation of Cdk1 histone H1 was 100% and 0 nM, but the phosphorylation degree of Cdk2 histone H1 decreased to 86.5% and the treatment concentration was increased to 20 nM. It was confirmed that the phosphorylation of Cdk1 and Cdk2 histone H1 was reduced to 92.2 and 75.0%, respectively.
  • the cell pellet was lysed (0.5% Triton X-100, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5), 2 mM magnesium chloride, 1 mM DTT. , 1 mM EGTA, 50 mM ⁇ -glycerophosphate, 25 mM sodium fluoride, 1 mM Na 3 VO 4 , 2 ⁇ g / ml leupetin, 2 ⁇ g / ml pepstetin A, 100 ⁇ g / ml phenylmethylsulfonyl Fluoride, 1 ⁇ g / ml antifine) was dissolved at 4 ° C. for 1 hour before protein quantification.
  • the compounds according to the present invention have been shown to strongly inhibit the activity of Cdk1 and Cdk2 through in vitro kinase assay and intracellular western blot analysis, and thus can be usefully used for the treatment or prevention of hepatocellular carcinoma.
  • RNA Pol II-CTD-GST protein (Jena Bioscience, Germany) as substrate in kinase assay buffer, Cdk9 / cyclin T1 or Cdk7 / cyclin H / MAT1 recombinant protein (Upstate) as enzyme, 2.5 ⁇ Ci [ ⁇ -32P] ATP
  • the reaction solution was adjusted to a total of 50ul by adding 100 ⁇ M of MgAc / ATP, and the kinase assay was performed at 30 ° C. for 20 minutes. After the reaction, the electrophoresis was performed on 8% SDS-polyacrylamide gel, and confirmed by radiographic photographing.
  • the degree of phosphorylation of Cdk7 and Cdk9 according to the compound concentrations of Examples 1 and 2 was shown in FIGS. 5 to 8 and Table 3 below. Indicated.
  • Table 3 shows the results of treatment of Cdk7 and Cdk9 with the compounds of Example 1 and Example 2, which are compounds according to the present invention, in which Rosecobitin, already known as an inhibitor of Cdk7 and Cdk9, was set as a comparative group.
  • Cdk7 activity of 92 ⁇ 17.4%, Cdk9 activity ranges from 55.6 to 42.2% when 10 ⁇ 1000 nM treatment of rose cobitin, known as Cdk inhibitor, decreases according to the present invention.
  • Cdk inhibitor 10 ⁇ 1000 nM treatment of rose cobitin, known as Cdk inhibitor.
  • the activity of Cdk7 decreased by 41.8-5.8%, and the activity of Cdk9 decreased by 15.8-0.1%, which is better than that of rosecobitin, a compound currently known as an inhibitor of Cdk. It was confirmed that it was shown.
  • Step 2 of Experimental Example 1 except that rabbit anti-phospho RNA Pol II (Ser5), and rabbit anti-phospho RNA Pol II (Ser2) (from Bethyl, TX, USA) were used as the primary antibody.
  • Ser5 rabbit anti-phospho RNA Pol II
  • Ser2 rabbit anti-phospho RNA Pol II
  • the control group rose corbitin decreased the concentration-dependent 50% decrease in Cdk7 activity as the treatment concentration was increased to 0 ⁇ 10 nM, the treatment concentration for the compound of Example 1 It was confirmed that the activity of Cdk7 decreased in a concentration-dependent manner as increasing to 0 ⁇ 50 nM, it was found that the activity of Cdk7 is reduced to almost close to the concentration of more than 10 nM.
  • the treatment concentration of the compound of Example 2 which is a compound according to the present invention, was increased from 0 to 50 nM, the activity of Cdk7 was reduced in a concentration-dependent manner, particularly from the concentration of 5 nM. You can check it. This means that the deactivation effect of Cdk7 by the compound of Example 2 is very excellent. As a result, it was confirmed that the compounds of Examples 1 and 2 according to the present invention had an effect of lowering the activity of Cdk7.
  • the Cdk activity decreased by 100-34.6% as the treatment concentration was increased from 0 to 10 nM, and the Cdk9 activity was 2.2% when treated at a high concentration of 50 nM. While almost disappearing, the compound of Example 2, which is a compound according to the present invention, decreases Cdk9 activity to 11% at a concentration of 1 nM and shows activity close to 0% when treated with 5 ⁇ M. You can see this almost disappears.
  • the compound according to the present invention can be usefully used for the treatment or prevention of hepatocellular carcinoma because it strongly inhibits the activity of Cdk7 and Cdk9 through in vitro kinase assay and intracellular western blot analysis.
  • 5′-GAA GGT GAA GGT CGG AGT-3 ′ was used as the forward primer for GAPDH
  • 5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3 ′ was used as the reverse primer
  • the primer was Bionics (Seoul, Republic of Korea).
  • the compound of Example 2 confirmed that the decrease in the amount of mRNA (inhibition of the transaction) of the protein amount of each of the molecules necessary for the survival of SNU-354 cells, Mcl-1, Survivin, XIAP Can be. This is a result of inducing apoptosis of SNU-354 cells, which is hepatocellular carcinoma, and means that the compound of Example 2 has hepatocellular carcinoma inhibitory activity.
  • the compound according to the present invention reduced the amount of Mcl-1, survivin, XIAP protein in SNU-354 cells, and the decrease in the amount of these intracellular proteins was found to reduce the amount of mRNA through the RT-PCR experiment of step 2.
  • Table 6 shows the viability of SNU-354 cells according to the concentrations of the compounds of Examples 1 and 2, which are compounds according to the present invention, including olomacin and rosecobitin, which are used as conventional Cdk inhibitors. It can be confirmed that cell growth is suppressed in a concentration-dependent manner as a whole. In the case of olomacin, the cell viability was found to be 96% at the maximum concentration, 61.4% for rosecobitin, 36.6% for the compound of Example 1 and 16.8% for the compound of Example 2 according to the present invention. The compounds according to the invention showed lower cell viability than olomacin and rosecobitin, which are used as conventional Cdk inhibitors. This means that the effect of inhibiting SNU-354 cell growth by the compound according to the present invention is more potent, and in particular, the compound of Example 2 exhibits the lowest cell survival rate of 16.8%, which most strongly inhibits SNU-354 cell growth. It turned out.
  • SNU-354 cells were dispensed in 6-well plates at a concentration of 5 ⁇ 10 4 cells / well, and after 24 hours of incubation in a medium without serum (FBS) for 24 hours, followed by the addition of serum and various concentrations of Example 1 and Examples.
  • the medium of Example 2 and 1 ⁇ Ci / ml tritiated thymidine ([ 3 H] dT) (GE Healthcare, UK) and serum were added. After 18-24 hours the cells were washed with cold PBS and fixed with cold 5% trichloroacetic acid followed by lysing DNA at 37 ° C. with 10.25 N sodium hydroxide for 1 hour.
  • Incorporated [ 3 H] dT was measured by liquid scintillation counting (LSC) method during DNA synthesis in cells. Cell viability was determined by the degree of DNA synthesis in the cells, and the results are shown in FIG. 16 and Table 7 below.
  • Table 7 shows the results of 3 H-thymidine incorporation according to the concentrations of the compounds of Examples 1 and 2, which are compounds according to the present invention, including olomacin and rosecobitin, which are used as conventional Cdk inhibitors.
  • Higher 3 H-thymidine incorporation means higher cell viability.
  • the greater the concentration of each compound the greater the effect of inhibiting cell growth.
  • all the Roman Woosin cases 3 H- thymidine in Corporation at maximum concentration appeared to 77.2%, rose Kobe tin cases when a compound of 47.2%, 15.8% in Example, when the compound of Example 1 2 8%.
  • the compounds of Examples 1 and 2 according to the present invention showed lower 3 H-thymidine incorporation, that is, lower cell viability than the olomacin and rosecobitin used as conventional Cdk inhibitors. It means that the effect of the SNU-354 cell growth inhibition by the compound according to.
  • the compound according to the present invention can be usefully used for the prevention or treatment of hepatocellular carcinoma because it inhibits the cell growth of SNU-354 cells more strongly than other conventional Cdk inhibitors.
  • FIG 17 shows the results obtained in the same manner as in Example 2, except that rabbit anti-PARP was used as the primary antibody.
  • both compounds of Example 1 and compounds of Example 2 induce apoptosis of SNU-354 cells through PARP cleavage confirmation.
  • the cleavage of the PARP can be confirmed after 6 hours after treatment, and in the case of the compound of Example 1, the cleavage of the PARP can be confirmed after 12 hours. It can be seen that the effect of apoptosis is greater.
  • SNU-354 cells treated with the compounds of Examples 1 and 2 were treated with Lysis buffer (0.5% Triton X-100, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5), 2 mM Magnesium Chloride, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM ⁇ -glycerophosphate, 25 mM sodium fluoride, 1 mM Na 3 VO 4 , 2 ⁇ g / ml leupetin, 2 ⁇ g / ml pepstetin A, 100 ⁇ g / ml phenylmethylsulfonyl fluorine Ride, 1 ⁇ g / ml antipine).
  • Lysis buffer 0.5% Triton X-100, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5
  • 2 mM Magnesium Chloride 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM ⁇ -glycerophosphate, 25 mM sodium fluoride
  • Table 8 shows the caspase-3 activity according to the concentration change of the compounds of Examples 1 and 2. Both compounds showed the highest caspase-3 activity at concentrations of 10.0 ⁇ M.
  • the compound of Example 1 began to show activity three times as much as the control from 1.0 ⁇ M and the compound of Example 2 began to show activity as seven times as the control from 0.5 ⁇ M and both compounds were caspase-3 active in a concentration dependent manner. This increased.
  • SNU-354 cells were seeded in a 90 mm dish and treated with appropriate concentrations of the compounds of Examples 1 and 2 for 24 hours. After the cells were collected and washed with cold PBS, 500 ⁇ l of cold 70% ethanol was reacted at 4 ° C. overnight to fix the cells. Cells were then washed three times with 500 ⁇ l of PBS, and 500 ⁇ l PBS with 50 ⁇ g / ml of propidium iodide (PI) and 50 ⁇ l of 1 mg / ml R & A A was added at room temperature for 30 minutes. Reaction in dark conditions.
  • PI propidium iodide
  • Fluorescence of PI-stained cells was used with a FACS caliber flow cytometer and a Cell Quest program (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, CA, USA).
  • FACS analysis was used to determine the change in the sub G1 ratio of HCC SNU-354 cells by the compounds of Examples 1 and 2. The results are shown in FIGS. 19, 20 and Table 9 and Table 10 below.
  • the compound of Example 1 shows a sharp increase in the ratio of sub G1 at a concentration of 5 ⁇ M and the compound of Example 2 shows a sharp increase in the ratio of sub G1 at a concentration of 0.5 ⁇ M. This indicates a sharp induction of death of SNU-354 cells from this concentration.
  • Table 10 shows the ratio of sub G1 over time when each of the compounds of Examples 1 and 2 was maintained at a concentration of 50 ⁇ M. Both compounds according to the present invention can be seen that the sub G1 ratio increases in a time-dependent manner, which means that cell death is induced in a time-dependent manner.
  • the compound according to the present invention can be usefully used for the prevention or treatment of hepatocellular carcinoma because it induces apoptosis of HCC SNU-354 cells.
  • FIG. 23-A shows that TUNEL positive spots and caspase-3 positive spots occurred more in the group administered with the compound of Example 2 than the control group, and also increased in the high concentration group (20 mg / kg). It can be seen that growth inhibition of xenograft cancer through compound administration is induced through cell death.
  • FIG. 23-B shows that TUNEL analysis and caspa as shown in FIG. 23-A were performed by extracting liver tissue from both the control group and the compound-administered group of Example 2 to confirm whether the compound of Example 2 affected normal liver tissue. This is the result of the third immunohistochemical analysis. The result of cell death could not be confirmed at all in the non-xenograft liver tissues, and thus, the compound of Example 2 only affected the xenograft cancers, not the normal liver tissues.
  • the compound according to the present invention can be usefully used for the prevention or treatment of hepatocellular carcinoma because it selectively acts only on liver tissue.
  • the control group and the compounds of Examples 2 to 6 were treated for 10 hours at 10 uM each. After the cells were collected and washed with cold PBS, 500 ⁇ l of cold 70% ethanol was reacted at 4 ° C. overnight to fix the cells. Cells were then washed three times with 500 ⁇ l of PBS and at room temperature in 500 ⁇ l of PBS with 50 ⁇ g / ml of propidium iodide (PI) and 50 ⁇ l of 1 mg / ml RNase A. And reacted in dark conditions for 30 minutes.
  • PI propidium iodide
  • Fluorescence of PI stained cells was measured using a FACS caliber flow cytometer and Cell Quest program (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, CA, USA).
  • FACS analysis determined the change in the sub G1 ratio of SNU-354 cells by the compounds. The results are shown in FIG. 24 and Table 11 below.
  • the compound according to the present invention has a very good cell death induction effect compared to the control.
  • the compounds of Examples 2, 5 and 6, which are the compounds according to the present invention exhibited a ratio change of 5.5 times or more, which shows that the apoptosis effect is more excellent.
  • the compound according to the present invention can be usefully used for the treatment or prevention of hepatocellular carcinoma because it has an excellent killing effect of SNU-354 cells.
  • Lysis buffer (0.5% Triton X-100, 20 mM Tris-HCl, pH 7.5
  • 2 mM Magnesium Chloride 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM ⁇ -glycerophosphate, 25 mM sodium
  • Protease assay buffer (20 mM HEPES (pH 7.5), 10% glycerol, 2 mM DTT) required for the reaction was mixed with 20 ⁇ M Ac-DEVD-AMC (BD Biosciences, CA, USA) and the cell solution as a substrate at 37 °C. Reaction was carried out for 1 hour. After the reaction, the results of measuring caspase-3 activity under the excitation wavelength of 380 nm and emission wavelength of 460 nm using a spectrofluorometer (TECAN, Switzerland) are shown in FIG. 25 and Table 12 below.
  • the compound according to the present invention inhibits SNU-354 cell activity and thus may be usefully used for the prevention or treatment of hepatocellular carcinoma.
  • the pyrrolopyrimidinone carboxamide derivative represented by the formula (1) according to the present invention can be formulated in various forms according to the purpose.
  • the following are some examples of formulation methods containing the compound represented by Formula 1 according to the present invention as an active ingredient, but the present invention is not limited thereto.
  • the above ingredients were mixed and filled in an airtight cloth to prepare a powder.
  • tablets are prepared by tableting according to a conventional method for preparing tablets.
  • the capsules are prepared by filling the gelatin capsules according to a conventional capsule production method.
  • the solution was filled into a 5 ml Type I ampoule made of clear glass, encapsulated under an upper grid of air by dissolving the glass, and sterilized by autoclaving at 120 ° C. for at least 15 minutes to prepare an injection solution.
  • each component is added to the purified water to dissolve, the lemon flavor is added appropriately, the above components are mixed, purified water is added, the whole is adjusted to 100 ml by the addition of purified water, and then filled into a brown bottle.
  • the liquid is prepared by sterilization.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이를 유효성분으로 함유하는 간세포암 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체를 함유하는 조성물은 Cdk1 및 Cdk2를 억제함으로써 인간 간암세포주인 SNU-354 세포의 세포성장을 억제하고, Cdk7 및 Cdk9를 억제함으로써 상기 세포의 세포사멸을 유도하므로 간세포암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＣＤＫ를 저해하는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이를 유효성분으로 함유하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 ＣＤＫ를 저해하는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이를 유효성분으로 함유하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
간세포암(hepatocellular carcinoma(HCC))은 간경변을 가지고 있는 환자들에게서 가장 사망률이 높은 질병이다. 또한 간세포암은 세계에서 여섯번째로 발병률이 높으며, 암 중에서도 사망률은 세번째에 이른다. 이 병은 미국에서 1978년부터 1980년 사이에 10만명 당 1.3명 발생하였다가 1998년부터 2001년에 이르기까지 10만명 당 3.3명으로 증가하였다. 이러한 발병률의 증가는 해가 거듭될 수록 계속되고 있으며, 수십년 전에는 원인으로 헤파티티스(hepatitis) C 바이러스(HCV)의 감염이 가장 크게 대두되었지만 그 후 세계적으로 HCV보단 hepatitis B virus(HBV)의 감염이 널리 퍼지게 되었고 최근에는 세계적으로 간세포암의 원인으로 HBV 간염이 가장 크게 대두되고 있다. 또한 현재는 서양보다 아시아나 아프리카에서 보다 높은 발병률을 나타내고 있다. 이러한 간세포암의 치료는 복합적으로 여전히 어려운 문제인데, 그 이유로는 간세포암은 다양한 약물의 내성 유전자를 발현하고 있고 화학요법치료에도 낮은 민감도를 나타내고 있기 때문이다. 이러한 간세포암은 조직 및 세포 내에 Cdk(cyclin dependent kinase)의 활성이 매우 높은 상태로 유지되고 있다. 이것은 세포내의 Cdk 억제제들(p16Ink4, p21Waf1, p27Kip1 등)의 활성이 억제되어 있거나 또는 Cdk와 복합체를 형성하는 싸이클린(cyclin)들이 비정상적인 활성을 가지고 있기 때문이다. 상기와 같은 이유로 Cdk의 억제제들은 간세포암의 치료에 좋은 후보군이 될 수 있고, 그 억제제들 중 일부(플라보피리돌(flavopiridol)과 로즈코비틴(roscovitine) 등)는 이미 임상시험에 적용 중이기도 하다.
세포내에서 Cdk를 억제하는 분자들(p16Ink4, p21Waf1, p27Kip1 등)은 세포주기(cell cycle)에서 매우 중요한 체크 포인트에 관여하여 세포주기를 조절하는 중요한 역할을 한다. 이미 보고된 내용에 따르면 세포주기에서 G1/S나 G2/M 체크 포인트의 분열은 세포를 성장이 조절되지 않는 상태로 변하게 함으로써 암을 유발하거나 혹은 세포사멸을 유도하도록 한다. 따라서 Cdk 억제제를 통한 작용기전을 연구하는 것은 암치료를 위해 매우 중요하다.
Cdk는 암세포의 성장에 필수적인 두 부분(세포 주기(cell cycle progression)와 유전자 전사(gene transcription))를 조절한다. Cdk는 Rb 단백질과 같은 세포주기에 중요한 분자들을 인산화시킴으로써 세포주기의 각 단계로 진입하는 것을 조절한다. Cdk는 사이클린과 헤테로다이머(heterodimers)를 형성하여 새로운 활성을 갖는 복합체를 형성하게 된다. 예를 들어, Cdk2/cyclin E는 S 단계(phase)로 진입하는데 필수적이며, Cdk2/cyclin A는 S 단계에서 G2 단계로 넘어가기 직전에 필수적이다. Cdks는 또한 RNA 폴리머라제 II 큰 부분(large subnuit)의 카르복실-터미날 도메인(carboxyl-terminal domain)을 인산화시킴으로써 유전자 전사를 조절한다. 인간에서, RNA 폴리머라제 II의 카르복실-터미날 도메인은 인산화가 잘 될 수 있는 헵타펩타이드(heptapeptide) (YSPTSPS) 형태의 서열이 52회 반복되는 부분이 포함되어 있다. 다양한 Cdk들이 이러한 부분을 인산화 시키는 것으로 알려져 있다. 그 중 대표적으로 전사 시작(transcriptional initiation)을 유도하는 TFIIH 복합체의 부분인 Cdk7/cyclin H/Mat1과 전사에서 신장(transcriptional elongation)에 관여하는 P-TEFb라 불리워지는 Cdk9/cyclin T가 있다.
이에 본 발명자는 새로운 Cdk 억제제 화합물을 합성하기 위하여 연구하던 중, 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체를 합성하고, 상기 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체가 생체외(in vitro) 실험 및 동물 모델 실험에서 우수한 Cdk 억제 효과를 나타내어 간세포암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2010007650-appb-I000001
(상기 화학식 1에서,
R1 및 R2는 본 명세서에서 정의된 바와 같다.)
또한, 본 발명은 상기 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체의 제조방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체를 함유하는 조성물은 Cdk1 및 Cdk2를 억제함으로써 인간 간암세포주인 SNU-354 세포의 세포성장을 억제하고, Cdk7 및 Cdk9를 억제함으로써 인간 간암세포주인 SNU-354 세포의 세포사멸을 유도하므로 간세포암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Cdk1 및 Cdk2의 인산화 정도의 전기영동 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Cdk1 및 Cdk2의 인산화 정도의 전기영동 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 p-뉴클레오린에 대한 Cdk1의 인산화 정도 및 p-Rb에 대한 Cdk2의 인산화 정도를 웨스턴 블랏 분석한 전기영동 도면이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 p-뉴클레오린에 대한 Cdk1의 인산화 정도 및 p-Rb에 대한 Cdk2의 인산화 정도를 웨스턴 블랏 분석한 전기영동 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Cdk7 활성도의 전기영동 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Cdk7 활성도의 전기영동 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Cdk9 활성도의 전기영동 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Cdk9 활성도의 전기영동 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Cdk7 활성도의 웨스턴 블랏 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Cdk7 활성도의 웨스턴 블랏 분석한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Cdk9 활성도의 웨스턴 블랏 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Cdk9 활성도의 웨스턴 블랏 분석한 결과를 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Mcl-1, survivin, XIAP 단백질 양 감소에 대한 웨스턴 블랏 분석결과를 나타낸 도면이다.
도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 Mcl-1, survivin, XIAP 단백질 양 감소에 대한 PCR 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 15는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 세포 생존력에 대한 MTT 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 16은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 세포 생존력에 대한 3H-티미딘 인코포레이션 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 17은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물에 의한 PARP 절단 확인 효과를 웨스턴 블랏 분석을 통해 나타낸 도면이다.
도 18은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 농도 변화에 따른 카스파제-3의 활성 측정 결과를 나타낸 도면이다.
도 19는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 농도 변화에 따른 SNU-354 세포의 sub G1 비율 변화의 FACS 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 20은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 시간 변화에 따른 SNU-354 세포의 sub G1 비율 변화의 FACS 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 21은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 투여 농도에 의한 동물의 무게 변화를 나타낸 도면이다.
도 22는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 투여군에서 이종이식 암의 성장을 나타낸 도면이다.
도 23은 본 발명의 일실시예에 따른 화합물의 투여군인 이종이식 암 및 간 조직에 H&E 염색, TUNEL 분석 및 끊어진 카스파제-3 발현 양을 측정한 도면이다.
도 24는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물들을 SNU-354 세포에 처리한 후 Sub G1 분석 결과를 나타낸 도면이다.
도 25는 본 발명의 일실시예에 따른 화합물들을 SNU-354 세포에 처리한 후 카스파제-3 활성 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다.
화학식 1
Figure PCTKR2010007650-appb-C000001
상기 화학식 1에서,
R1은 수소 또는 R3C(=O)이고;
R3은 C1~C6의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C3~C8의 시클로알킬 또는 페닐이고;
R2는 수소 또는 아세틸기이다.
더욱 바람직하게는, 상기 R3는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, t-부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 또는 페닐이다.
화학식 1로 표시되는 구체적인 화합물은 다음과 같다.
(1) 4-아미노-6-브로모-1-((2S,3R,4R,5S)-3,4-디하이드록시-5-(하이드록시메틸)-테트라하이드로퓨란-2-일)-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카복사마이드;
(2) ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 이소부티레이트;
(3) ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 피발레이트;
(4) (2S,3R,4S,5S)-2-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-5-(이소부티릴옥시메틸)-테트라하이드로퓨란-3,4-디일 디아세테이트;
(5) ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 벤조에이트;
(6) ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 프로피오네이트; 및
(7) ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 사이클로헥산카복실레이트.
본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 약학적으로 허용가능한 염이란 표현은 환자에게 비교적 비독성이고 무해한 유효작용을 갖는 농도로서 이 염에 기인한 부작용이 화학식 1의 염기 화합물의 이로운 효능을 떨어뜨리지 않는 화학식 1의 염기 화합물의 어떠한 유기 또는 무기 부가염을 의미한다. 이들 염은 유리산으로는 무기산과 유기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 브롬산, 질산, 황산, 과염소산, 인산 등을 사용할 수 있고, 유기산으로는 구연산, 초산, 젖산, 말레산, 푸마린산, 글루콘산, 메탄설폰산, 글리콘산, 숙신산, 타타르산, 갈룩투론산, 엠본산, 글루탐산, 아스파르트산, 옥살산, (D) 또는 (L) 말산, 말레산, 메테인설폰산, 에테인설폰산, 4-톨루엔술폰산, 살리실산, 시트르산, 벤조산 또는 말론산 등을 사용할 수 있다. 또한, 이들 염은 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등) 및 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염 등) 등을 포함한다. 예를 들면, 산부가염으로는 아세테이트, 아스파테이트, 벤즈에이트, 베실레이트, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포메이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루큐로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 하이벤제이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로요오디드/요오디드, 이세티오네이트, 락테이트, 말레이트, 말리에이트, 말로네이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프틸레이트, 2-나프실레이트, 니코티네이트, 나이트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/수소 포스페이트/이수소 포스페이트, 사카레이트, 스테아레이트, 석시네이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리플루오로아세테이트, 알루미늄, 알기닌, 벤자틴, 칼슘, 콜린, 디에틸아민, 디올아민, 글라이신, 라이신, 마그네슘, 메글루민, 올아민, 칼륨, 나트륨, 트로메타민, 아연염 등이 포함될 수 있으며, 이들 중 하이드로클로라이드 또는 트리플루오로아세테이트가 바람직하다.
또한, 본 발명의 상기 화학식 1로 표시되는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체는 약학적으로 허용되는 염뿐만 아니라, 통상의 방법에 의해 제조될 수 있는 모든 염, 이성질체, 수화물 및 용매화물을 모두 포함한다.
본 발명에 따른 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 화학식 1의 화합물을 수혼화성 유기용매, 예를 들면 아세톤, 메탄올, 에탄올, 또는 아세토니트릴 등에 녹이고 과량의 유기산을 가하거나 무기산의 산 수용액의 가한 후 침전시키거나 결정화시켜서 제조할 수 있다. 이어서 이 혼합물에서 용매나 과량의 산을 증발시킨 후 건조시켜서 부가염을 얻거나 또는 석출된 염을 흡인 여과시켜 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 반응식 1에 표시되는 바와 같이,
화학식 2의 화합물에 BSA를 가한 후 TMSOTf 존재하에 화학식 3의 화합물과 반응시켜 화학식 4의 화합물을 제조하는 단계(단계 1);
화학식 4의 화합물에 암모늄하이드록사이드 용액을 가하여 화학식 5의 화합물을 제조하는 단계(단계 2); 및
화학식 5의 화합물에 과산화수소를 가하여 화학식 1a의 화합물을 제조하는 단계(단계 3)를 포함하는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체의 제조방법을 제공한다.
[반응식 1]
Figure PCTKR2010007650-appb-I000002
(상기 반응식 1에서,
상기 화학식 1a는 상기 화학식 1에 포함된다.)
이하, 본 발명에 따른 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.
단계 1
본 발명에 따른 상기 단계 1은 출발물질인 화학식 2의 화합물을 용매 하에서 BSA와 반응시킨 후 화학식 3의 화합물과 반응시켜 화학식 4의 화합물을 제조하는 단계이다.
상기 반응은 유기화학 분야에서 통상적으로 널리 알려져 있으며, 반응 용매, 반응 온도, 반응 시간 등의 반응 조건은 반응물질, 생성물질 등을 고려하여 적절히 선택할 수 있다. 일례로 본 발명에서는 반응 용매는 DCE 및 톨루엔을 사용하였고 80 ℃에서 반응시켜 상기 화학식 4의 화합물을 수득하였다.
단계 2
본 발명에 따른 상기 단계 2는 상기 단계 1에서 제조된 화학식 4의 화합물을 용매하에 반응시켜 화학식 5의 화합물을 제조하는 단계이다.
구체적으로 상기 화학식 4의 화합물을 메탄올에 현탁시킨 후 상온에서 암모니아수를 가하고 교반하여 화학식 5의 화합물을 수득하였다.
단계 3
본 발명에 따른 상기 단계 3은 상기 단계 2에서 제조된 화학식 5의 화합물을 따로 분리하지 않고 바로 반응을 진행하여 화학식 1a의 화합물을 제조하는 단계이다.
구체적으로, 화학식 5의 화합물이 생성된 것을 확인한 후 바로 과산화수소를 가한 후 상온에서 8시간 교반하여 화학식 1a의 화합물을 수득하였다.
나아가, 본 발명은 하기 반응식 2에 나타낸 바와 같이 화학식 1a의 화합물을 에스터화 반응을 통해 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계(단계 4)를 더 포함할 수 있다.
[반응식 2]
Figure PCTKR2010007650-appb-I000003
(상기 반응식 2에서,
R1 및 R2는 상기 화학식 1에서 정의한 바와 같으나 단, R1은 H를 제외한다.)
단계 4
본 발명에 따른 상기 단계 4는 화학식 1a의 화합물의 말단 1급 하이드록시기에 에스터화하거나 또는 2급 하이드록시기를 보호하여 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계이다.
나아가, 상기 반응식 1의 출발물질인 화학식 2의 화합물은 하기 반응식 3에 나타난 바와 같이,
화학식 6의 화합물인 테트라시아노에틸렌을 아세톤과 에틸아세테이트 존재하에 하이드로겐브로마이드를 가하여 화학식 7의 화합물을 제조하는 단계(단계 1); 및
화학식 7의 화합물에 트리에틸올소포메이트 및 암모니아수를 가하여 화학식 2의 화합물을 제조하는 단계(단계 2)를 포함하여 제조할 수 있다.
[반응식 3]
Figure PCTKR2010007650-appb-I000004
또한, 상기 반응식 1의 화학식 3의 화합물은 하기 반응식 4에 나타난 바와 같이,
화학식 8의 L-자일로스를 붕산과 반응시킨 후 아세트산 및 무수 아세트산을 가하여 고온에서 반응시키는 단계를 포함하여 제조할 수 있다.
[반응식 4]
Figure PCTKR2010007650-appb-I000005
나아가, 본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 간세포암은 간세포에서 발생하는 암을 말하며 일반적으로 간암이라고 하면 대부분 간세포에서 기원하는 간세포암을 말한다.
상기 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 Cdk 저해작용을 가지며, 바람직하게 상기 Cdk는 Cdk1, Cdk2, Cdk7 및 Cdk9를 포함한다.
본 발명에 따른 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체는 Cdk1 및 Cdk2의 억제를 통해 인간 간암세포주인 SNU-354 세포의 세포 성장을 억제하고, Cdk7 및 Cdk9의 억제를 통해 인간 간암세포주인 SNU-354 세포의 세포사멸을 유도함으로써 간세포암의 예방 또는 치료제로서 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물을 의약품으로 사용하는 경우, 상기 화학식 1의 피롤로피리미디논 카복사미드유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 임상투여 시에 다양한 하기의 경구 또는 비경구 투여 형태로 제제화되어 투여될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/ 또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.
상기 화학식 1의 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체를 유효 성분으로 하는 약학 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다.
이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 화학식 1의 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.
또한, 본 발명의 화합물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 몸무게가 70 ㎏인 성인 환자를 기준으로 할 때, 일반적으로 0.1 ~ 1,000 ㎎/일이며, 바람직하게는 1 ~ 500 ㎎/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정시간 간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1> 4-아미노-6-브로모-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카보나이트릴 (4-Amino-6-bromo-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-5-carbonitrile) (4)의 제조
단계 1: 2-아미노-5-브로모-1H-피롤-3,4-디카보나이트릴 (2-Amino-5-bromo-1H-pyrrole-3,4-dicarbonitrile) (3)의 제조
테트라시아노에틸렌 (10.02 g, 78.23 mmol)을 아세톤(60 ml)과 에틸 아세테이트(120 ml)의 혼합용매에 녹인 후 0~5 ℃하에서 아세트산에 녹아있는 하이드로겐브로마이드(33wt%, 60 ml)를 가했다. 추가로 한 시간 정도 교반하여 얻어지는 노란색 고체는 필터를 이용하여 분리하였다. 차가운 증류수(100 ml)로 두 번 씻어준 뒤 공기 중에서 건조시켜 목적물(11.02 g, 52.22 mmol, 66.8%)을 얻었다.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δH) 12.3 (br s, 1, N-H); 6.46 (br s, 2, NH2).
mp > 210 ℃.
단계 2: 4-아미노-6-브로모-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카보나이트릴 (4-Amino-6-bromo-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-5-carbonitrile) (4)의 제조
상기 단계 1에서 수득한 화학식 3의 화합물(10.57 g, 50.09 mmol)을 증류된 아세토나이트릴(170 mL)에 현탁 시켰다. 여기에 트리에틸올소포메이트(20.0 mL, 182 mmol)를 가하고 끓는점까지 온도를 높여 4시간 동안 가열하였다. 흑갈색 용액을 상온으로 식힌 뒤 필터 용지를 이용해 남은 찌꺼기를 여과하고, 아세토나이트릴은 진공을 이용하여 제거하여 갈색 고체 형태의 2-브로모-5-(에톡시메틸렌)이미노피롤-3,4-디카보나이트릴을 얻었다. 상기 갈색 고체를 다시 포화 암모니아수(100 mL)에 녹이고 생성된 용액은 탈색용 카본(5.0 g)을 넣어 섞은 후 셀라이트 패드를 통과시켜 여과하고 이 과정을 한번 더 반복하였다. 여과된 노란색 액체에 흰 침전이 생길 때 까지 아세트산(80 mL)을 천천히 가하였다. 상기 현탁액은 -5 ℃의 온도에서 8 시간 동안 보관한 뒤 필터를 이용해서 여과하였다. 걸러낸 흰 고체를 진공오븐을 이용하여 120 ℃에서 8시간 동안 건조시켜 목적물(9.99 g, 41.97 mmol, 84%)을 얻었다.
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6, δH) 13.80 (bs, NH), 8.21 (s, H-2), 7.21(bs, NH2).
l3C-NMR (125 MHz, DMSO-d6, δC) 156.33, 150.36, 149.86, 125.33, 116.25, 103.99, 84.75.
HRMS (FAB+) Calcd for C7H5BrN5 (M+) 237.9728, Found 237.9722.
<제조예 2> 1,2,3,5-테트라-O-아세틸-L-자일로퓨라노스 (1,2,3,5-Tetra-O-acetyl-L-xylofuranose) (5)의 제조
화학식 10의 L-자일로스(5.00 g, 33.3 mmol)와 붕산(4.53 g, 73.3 mmol)을 아세트산(120 mL)에 녹인 뒤 1시간 동안 50 ℃로 가열하며 교반한 후 무수 아세트산(120 mL)을 가하였다. 반응 혼합물은 50 ℃에서 3일 동안 더 가열하고 상온으로 식힌 후 물(600 mL)과 에틸 아세테이트(3 × 300 mL)를 이용하여 추출하였다. 에틸 아세테이트 추출물은 포화 소듐바이카보네이트 수용액, 소금물로 씻어주고 마그네슘설페이트를 이용하여 용매에 남아 있는 물을 제거하였다. 농축시켜 시럽 형태의 자일로퓨라노스인 화학식 5의 화합물(10.45 g, 32.8 mmol, 99%, α : β = 1 : 1.8)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3, δH) 6.42 (d, 0.35 H, J 4.6 Hz), 6.10 (s, 0.65 H), 5.52 (dd, 0.35 H, J 6.5, 6.5 Hz), 5.36(dd, 0.65 H, J 1.7, 5.6 Hz), 5.30 (dd, 0.35 H, J 4.6, 6.2 Hz), 5.20 (d, 0.65 H, J 1.0 Hz), 4.67-4.60 (m, 1 H), 4.27-4.18 (m, 1.65 H), 4.12 (dd, 0.35 H, J 4.2, 12.2 Hz), 2.12 (s, 2H), 2.11 (s, 2 H), 2.09 (s, 3 H), 2.07 (s, 3 H), 2.06 (s, 2 H).
13C NMR (125 MHz, CDCl3, δC) 170.5, 170.3, 169.6, 169.5, 169.3, 169.2, 169.1, 98.8, 92.8, 79.9, 79.4, 75.3, 75.3, 74.3, 73.8, 62.3, 61.6, 21.0, 20.9, 20.8, 20.7, 20.6, 20.5, 20.4.
HRMS (ESI) calcd for (M + Na) C13H18O9: 341.0843, found 341.0845.
<실시예 1> 4-아미노-6-브로모-1-((2S,3R,4R,5S)-3,4-디하이드록시-5-(하이드록시메틸)-테트라하이드로퓨란-2-일)1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카복사미드 (4-amino-6-bromo-1-((2S,3R,4R,5S)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)-tetrahydrofuran-2-yl)-1H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-5-carboxamide) (1a)의 제조
단계 1: (2S, 3R, 4S, 5S)-2-(아세톡시메틸)-5-(4-아미노-6-브로모-5-시아노-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)테트라하이드로퓨란-3,4-디일 디아세테이트 ((2S,3R,4S,5S)-2-(Acetoxymethyl)-5-(4-amino-6-bromo-5-cyano-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-1-yl)tetrahydrofuran-3,4-diyl diacetate) (6)의 제조
상기 제조예 1에서 얻은 화학식 2의 화합물(552 mg, 2.3 mmol)을 증류된 DCE(23 mL)에 현탁시킨 후 BSA(1.2 mL, 3.1 mmol)을 넣고 80 ℃ 에서 한 시간 동안 가열하였다. 현탁액이 맑아지면 진공을 이용하여 용매를 제거하고 남아있는 물질을 증류된 톨루엔(5 mL)에 다시 녹였다. 상기 용액에 톨루엔에 녹인 화학식 3의 테트라-O-아세틸-β-d-자일로퓨라노즈(382 mg, 1.2 mmol)와 TMSOTf(0.24 mL, 289 mg, 1.3 mmol)를 가한 뒤 80 ℃에서 한 시간 정도 더 가열하였다. 반응이 끝난 뒤 상온으로 식히고 물(50 mL)을 가한 후 유기물은 에틸 아세테이트로 추출해 내고, 포화 소듐바이카보네이트 수용액과 소금물로 씻어주었다. 유기 추출물들은 소듐설파이트를 이용하여 남아있는 물을 제거하고 용매도 제거하였다. 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 분리한 노란빛을 띠는 고체 형태의 목적물(1.087 g, 2.2mmol, 94%)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3, δH) 8.46 (s, 1H), 6.54 (d, 1H), 6.14 (s, 2H), 5.50 (m, 1H), 5.44 (m, 1H), 4.72 (m, 1H), 4.40-4.50 (m, 2H), 2.21 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 2.04 (s, 3H).
13C NMR (125 MHz, CDCl3, δC) 170.6 169.0 155.0 145.75 140.6 134.6 116.3 106.1 91.1 85.3 80.5 79.7 74.2 61.0 21.0 20.9 20.7.
단계 2 및 단계 3: 4-아미노-6-브로모-1-((2S,3S,4S,5S)-3,4-디하이드록시-5-(하이드록시메틸)테트라하이드로퓨란-2-일)-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카르복스아미드 (4-Amino-6-bromo-1-((2S,3S,4S,5S)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)tetrahydrofuran-2-yl)-1H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidine-5-carboxamide) (1a)의 제조
단계 2
상기 단계 1에서 얻은 화학식 4의 화합물(3.183 g, 6.41 mmol)을 메탄올에 현탁시킨 뒤 포화 암모늄하이드록사이드 용액 (25 mL)을 가하여 30분 정도 교반시켰다. 반응은 씬레이어크로마토그라피(TLC)를 통해 관찰하였고 출발물질이 없어지는 것으로 화학식 5의 화합물이 형성됨을 확인하였다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, δH) 8.44 (s, 1H), 6.06 (s, 1H), 6.00 (dd, 1H), 5.42 (m, 1H), 4.85 (m, 1H), 4.29 (d, 1H), 4.24 (d, 1H), 3.95 (s, 1H), 3.77 (m, 2H).
단계 3
출발물질이 모두 없어진 후 30% 과산화수소 용액(12 mL)을 천천히 가하여 8시간 동안 교반하고 난 후 진공을 이용하여 용매를 제거하였다. 컬럼 크로마토그라피를 통해 물질을 분리해 낸 뒤 다시 뜨거운 물에 녹여서 4 ℃에서 4시간 동안 보관하였다. 생성된 침전물을 필터로 여과하고 진공 하에서 건조시켜 노란색 가루 형태의 화학식 1a의 화합물(1.421 g, 3.66 mmol, 57%)을 얻었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, δH) 9.98 (d, 1H), 8.40 (s, 1H), 8.26 (d, 1H), 7.65 (bs, 1H), 7.11 (bs, 1H), 6.03 (s, 1H), 5.97 (s, 1H), 5.70 (s, 1H), 4.88 (t, 1H), 4.25 (m, 2H) 3.97 (s, 1H), 3.73-3.81 (m, 2H).
HRMS (FAB) calcd for (M+H) C12H15BrN5O5: 388.0257, found 388.0262.
<실시예 2> ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 이소부티레이트 (((2S,3R,4R,5S)-5-(4-amino-6-bromo-5-carbamoyl-1H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxy-tetrahydrofuran-2-yl)methyl isobutyrate) (1b)의 제조
상기 실시예 1의 단계 3에서 얻은 화학식 1a의 화합물(452 mg, 1.16 mmol)을 피리딘(5.8 mL)에 녹인 뒤 온도를 -40 ℃로 낮추었다. 상기 용액에 시린지 펌프를 이용하여 한 시간에 걸쳐 이소프로필 무수물(193 ㎕, 1.16 mmol)을 천천히 가하였다. 반응물은 -40 ℃에서 6시간 더 교반 시킨 뒤 상온으로 가온시키고 반응 혼합물을 물(20 mL)과 에틸아세테이트(20 mL)로 세 번 추출 반복하였다. 에틸 아세테이트 추출물은 포화 소듐바이카보네이트 수용액, 소금물로 씻어주고 마그네슘설페이트를 이용하여 건조시킨 뒤 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그라피를 통하여 목적물인 화학식 1b의 화합물(215 mg, 0.47 mmol, 40%)을 분리하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3, δH) 10.54 (d, 1H), 8.15 (s, 1H), 7.16 (bs, 1H), 6.07 (d, 1H), 5.73 (s, 1H), 5.64 (bs, 1H), 4.79 (s, 1H), 4.64 (m, 1H), 4.50 (m, 1H), 4.41 (s, 1H) 4.31 (m, 1H), 4.27 (s, 1H), 2.59 (q, 1H), 1.17 (m, 6H).
<실시예 3> ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 피발레이트 (((2S,3R,4R,5S)-5-(4-amino-6-bromo-5-carbamoyl-1H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-1-yl)-3,4-dihydroxy-tetrahydrofuran-2-yl)methyl pivalate) (1c)의 제조
디메틸포름아미드(3 mL)에 피발로일 클로라이드(130 uL, 1.06 mmol)를 녹인 뒤 0 ℃에서 이미다졸(158mg, 2.32mmol)을 추가하였다. 0 ℃에서 2시간 정도 교반하고 피리딘(2 mL)에 녹아있는 상기 실시예 1에서 얻은 화학식 1a의 화합물(410 mg, 1.06 mmol)을 서서히 투입하였다. 반응물은 0 ℃에서 6시간 더 교반 시킨 뒤 상온으로 가온시키고 반응 혼합물을 물(20 mL)과 에틸아세테이트(20 mL)로 세 번 추출 반복하였다. 에틸 아세테이트 추출물은 포화 소듐바이카보네이트 수용액, 소금물로 씻어주고 마그네슘설페이트를 이용하여 건조시킨 뒤 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그라피를 통하여 목적물(168 mg, 0.38 mmol, 35.8%)을 분리하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3, δH) 9.98 (d, 1H), 8.41 (s, 1H), 8.27 (d, 1H), 7.65 (s, 1H), 7.10 (s, 1H), 6.05 (m, 2H), 5.95 (d, 1H), 4.40 (m, 3H), 4.30 (d, 1H), 4.01 (m, 1H) 1.15 (s, 9H).
<실시예 4> (2S,3S,4R,5S)-2-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-5-(이소부티릴옥시메틸)테트라하이드로퓨란-3,4-디일 디아세테이트 ((2S,3S,4R,5S)-2-(4-amino-6-bromo-5-carbamoyl-1H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-1-yl)-5-(isobutyryloxymethyl)tetrahydrofuran-3,4-diyl diacetate) (1d)의 제조
상기 실시예 1의 단계 1 및 단계 2와 동일한 방법으로 수행하여 얻은 화학식 1a의 화합물(257 mg, 0.56 mmol)을 피리딘(3 mL)에 녹인 뒤 무수 아세트산(317 uL, 3.36 mmol)을 가하였다. 상기 반응 혼합물을 40 ℃에서 6시간 동안 교반한 후 물(10 mL)과 에틸 아세테이트(3 × 10 mL)를 이용하여 추출한 후 추출해 낸 에틸 아세테이트층은 포화 소듐바이카보네이트 수용액과 소금물로 씻어준 뒤 마그네슘설페이트로 건조하고 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피를 이용해 목적물(247 mg, 0.45 mmol, 81%)을 분리하였다.
1H NMR (500 MHz, CDCl3, δH) 10.47 (s, 1H), 8.34 (d, 1H), 6.55 (s, 1H), 6.02 (d, 1H), 5.65 (s, 1H), 5.49 (d, 1H), 5.43 (m, 1H), 4.73 (m, 1H), 4.41 (m, 2H), 2.51 (m, H) 2.21 (d, 3H), 2.12 (d, 3H), 1.13 (m, 3H), 1.08 (m, 3H).
<실시예 5> ((2S,3S,4S,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)-3,4-디하이드록시테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 벤조에이트 (((2S,3S,4S,5S)-5-(4-amino-6-bromo-5-carbamoyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl benzoate) (1e)의 제조
디메틸포름아미드(2 mL)에 벤조일 클로라이드 (232 uL, 2.01 mmol)를 녹인 뒤 0 ℃에서 이미다졸(280 mg, 4.02 mmol)을 추가하였다. 0 ℃에서 2시간 정도 교반하고 피리딘(2 mL)에 녹아있는 상기 실시예 1에서 얻은 화학식 1a의 화합물(410 mg, 1.00 mmol)을 서서히 투입하였다. 상기 반응 혼합물을 40 ℃에서 몇 시간 동안 가열하고 상온으로 식힌 후 반응의 진행 정도를 HPLC를 통하여 확인하였다. 반응이 완료를 확인한 후 물(20 mL)과 에틸 아세테이트(3 × 20 mL)로 추출하였다. 추출해 낸 에틸 아세테이트 층은 포화 소듐바이카보네이트 수용액과 소금물로 씻어준 뒤 마그네슘설페이트로 건조하고 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피를 이용해 목적물(192 mg, 0.39 mmol)을 분리하였다.
1H NMR (500 MHz, Acetonitrile-d3, δH) 10.36 (s, 1H), 8.34 (s, 1H), 8.01 (d, 2H), 7.65 (m, 1H), 7.51 (m, 2H), 7.08 (s, 1H), 6.74 (s, 1H), 6.20 (s, 1H), 6.06 (d, 1H), 5.83 (s, 1H) 4.73 (m, 1H), 4.64 (m, 3H), 4.31 (s, 1H), 4.24 (d, 1H).
<실시예 6> ((2S,3S,4S,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)-3,4-디하이드록시테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 프로피오네이트 (((2S,3S,4S,5S)-5-(4-amino-6-bromo-5-carbamoyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl propionate) (1f)의 제조
프로피오닉산(83 uL, 1.10 mmol)을 피리딘(3 mL)에 녹인 후 0 ℃에서 카보닐디이미다졸(178 mg, 1.10 mmol)를 천천히 가하였다. 0 ℃에서 1.5시간 동안 교반하고 상기 실시예 1에서 얻은 화학식 1a의 화합물(388 mg, 1.00 mmol)을 피리딘(2 mL)에 녹인 용액에 상기 혼합물을 천천히 가하였고 반응의 진행 정도는 HPLC를 통하여 확인하였다. 반응이 완료된 후 물(20 mL)과 에틸 아세테이트(3 × 20 mL)로 추출하였다. 추출해 낸 에틸 아세테이트 층은 포화 소듐바이카보네이트 수용액과 소금물로 씻어준 뒤 마그네슘설페이트로 건조하고 농축시켰다. 플래시 크로마토그래피를 이용해 목적물(178 mg, 0.40 mmol)을 분리해 내었다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, δH) 9.98 (d, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.28 (d, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 6.08 (d, 1H), 6.04 (s, 1H), 5.98 (d, 1H), 4.41 (m, 3H), 4.31 (d, 1H), 4.03 (dd, 1H), 2.35 (m, 2H), 1.04 (t, 3H).
<실시예 7> ((2S,3S,4S,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)-3,4-디하이드록시테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 사이클로헥실레이트 (((2S,3S,4S,5S)-5-(4-amino-6-bromo-5-carbamoyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl)-3,4-dihydroxytetrahydrofuran-2-yl)methyl cyclohexylate) (1g)의 제조
디메틸포름아미드(1 mL)에 사이클로헥산카복시산 클로라이드 (136 uL, 1.06 mmol)를 녹인 뒤 0 ℃에서 이미다졸(150 mg, 2.20 mmol)을 추가하였다. 0 ℃에서 2시간 정도 교반하고 피리딘(5 mL)에 녹아있는 상기 실시예 1에서 얻은 화학식 1a의 화합물(388 mg, 1.00 mmol)을 서서히 투입하였다. 반응물은 0 ℃에서 6시간 더 교반 시킨 뒤 상온으로 가온시키고 반응 혼합물을 물(20 mL)과 에틸아세테이트(20 mL)로 세 번 추출 반복하였다. 에틸 아세테이트 추출물은 포화 소듐바이카보네이트 수용액, 소금물로 씻어주고 마그네슘설페이트를 이용하여 건조시킨 뒤 농축시켰다. 플래쉬 크로마토그라피를 통하여 목적물(184 mg, 0.37 mmol, 37%)을 분리하였다.
1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, δH) 9.98 (d, 1H), 8.42 (s, 1H), 8.27 (d, 1H), 7.64 (s, 1H), 7.11 (s, 1H), 6.08 (d, 1H), 6.04 (s, 1H), 5.99 (m, 1H), 4.40 (m, 2H), 4.32 (d, 1H), 4.02 (td, 1H), 1.25-1.82 (m, 10H).
<실험예 1> 생체외(in vitro) 키나아제 저해 활성 측정
<1-1> 세포 배양
인간의 간세포암(human hepatocellular carcinoma) 세포주인 SNU-354 세포는 한국의 인간유전체기능연구사업단(The Center for Functional Analysis of Human Genome)으로부터 구하였고 기존의 Cdk 억제제인 올로마우신 및 로즈코비틴은 칼바이오캠(Calbiochem) 회사(San Diego, CA, USA)로부터 구매하였으며, DMSO에 50 mM 농도로 녹여서 -20 ℃에 보관하였다.
SNU-354 세포는 RPMI 1640 배지(Invitrogen, CA, USA)에서 10% FBS(Invitrogen)와 항생제(antibiotics/antimycotics(Invitrogen))를 첨가하여 CO2 배양기에서 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다. 이소-피롤로피리미디논 카복사미드은 SNU-354 세포에 10 ~ 50μM(최종 농도)의 농도로 24시간 동안 처리하였다.
<1-2> Cdk1 및 Cdk2의 저해 활성 측정
본 발명에 따른 화합물이 Cdk 1 및 Cdk2의 활성을 억제하는지 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<1-2-1> 생체외 키나아제 분석
키나아제 분석 완충액(50 mM 트리스 (pH 7.4), 10 mM 마그네슘클로라이드, 1 mM EGTA, 40 mM β-글리세로포스페이트, 0.1 mM Na3VO4, 1 mM DTT, 0.1 μg/ml 류펩틴, 0.1 μg/ml 펩스테틴 A, 0.1 μg/ml 안티파인 및 1 mM 페닐메틸설포닐 플루오라이드)에 기질로써 5 μg의 히스톤 H1, 효소(enzyme)로써 20 ng의 Cdk1/cyclin B 또는 40 ng의 Cdk2/cyclin A 재조합 단백질(recombinant proteins)(Upstate, NY, USA), 2.5 μ 큐리(Ci)의 [γ-32P]ATP, 100 μM의 MgAc/ATP를 첨가하여 반응액(reaction volume)은 총 50 ㎕로 맞추고, 상기 실시예 2의 화합물을 넣은 후 키나아제 반응을 30 ℃에서 20분 동안 진행하였다. 반응 후 12%의 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 전기영동하고, 방사능사진촬영으로 확인하여 상기 실시예 2 화합물의 농도에 따른 Cdk1 및 Cdk2의 인산화 정도를 도 1, 도 2 및 하기 표 1에 나타내었다.
단, 실험 결과에서 밴드(bands)의 양(intensity)은 밀도측정(densitometry)(GS-800, Bio-Rad)으로 분석하였다.
표 1
실시예 농도 (nM) 인산화 정도(%)
Cdk1 Cdk2
실시예 2 0 100 100
10 99.4 86.5
20 92.2 75.0
40 74.1 59.0
50 50 50
60 41.6 43.0
80 15.3 39.2
100 4.3 4.5
도 1, 도 2 및 표 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 2의 화합물을 0 nM 처리하였을 때의 Cdk1 및 Cdk2 각각의 인산화 정도를 각각 100%로 간주하였다. 실시예 2의 화합물을 10 nM 처리하였을 때 Cdk1 히스톤 H1의 인산화 정도는 100%로 0 nM일 때와 변화가 없었지만 Cdk2 히스톤 H1의 경우 86.5%로 인산화 정도가 감소하였고, 처리 농도를 20 nM로 증가시켰을 때 Cdk1 및 Cdk2 히스톤 H1의 인산화 정도가 각각 92.2, 75.0%로 감소하는 것을 확인하였다. 실시예 2의 화합물의 처리 농도를 40 ~ 100 nM로 처리했을 때, Cdk1 히스톤 H1의 인산화 정도는 74.1~4.3%로 감소하는 것을 확인할 수 있고, Cdk2 히스톤 H1의 인산화 정도는 59.0~4.5%로 감소하는 것을 확인할 수 있다. 이는 실시예 2의 화합물 농도에 대해 Cdk1 및 Cdk2의 인산화가 의존적으로 억제된다는 것을 보여주며 이 때, Cdk1 및 Cdk2 각각의 IC50 값은 50 nM임을 확인할 수 있다. 상기 결과로부터 본 발명에 따른 화합물은 Cdk1 및 Cdk2의 활성을 유의적으로 억제하는 것을 알 수 있다.
<1-2-2> 웨스턴 블랏 분석
SNU-354 세포에 상기 실시예 2의 화합물을 처리한 후 세포 펠렛을 리시스(lysis) 완충액 (0.5% 트리톤 X-100, 20 mM 트리스-염산 (pH 7.5), 2 mM 마그네슘클로라이드, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM β-글리세로포스페이트, 25 mM 소듐플루오라이드, 1 mM Na3VO4, 2 μg/ml 류펩틴, 2 μg/ml 펩스테틴 A, 100 μg/ml 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 1 μg/ml 안티파인)으로 4 ℃에서 1시간 동안 용해(lysis)시킨 후에 단백질 정량을 한다. 적정량의 단백질을 SDS-PAGE 겔에 전기영동 한 후 폴리비닐리딘 디플루오라이드 막(Millipore Co., Bedford, MA)에 이동시켰다. 막을 억제 용액(포스페이트에 완충된 염분(PBS), 5% 스킴밀크, 0.1% 트윈-20)에 상온에서 1-2시간 동안 반응시킨 후 억제 용액에 1:1000으로 희석시킨 1차 항체(antibody)(goat anti-phospho-Rb, rabbit anti-nucleolin)를 막에 반응시킨 후 막을 세척완충액(PBST)으로 세척하고 적합한 2차 항체(horseradish peroxidase(HRP)가 결합한)를 상온에서 1시간 반응시키고, ECL(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) 용액을 이용하여 감광하여 그 결과를 도 3, 도 4 및 하기 표 2에 나타내었다.
표 2
항바이러스 실시예 2의 화합물 처리 후 시간 인산화 정도(%)
p-뉴클레오린(Cdk1) 0 100
6 96.9
12 11.7
18 3.1
24 3.0
p-Rb(Cdk2) 0 100
6 3.6
12 2.7
18 0.6
24 0.3
표 2에 나타난 바와 같이, p-뉴클레오린에 대한 Cdk1의 인산화 효과는 12시간 이후부터 급격한 감소를 나타내는 것을 확인할 수 있고, p-Rb에 대한 Cdk2의 인산화 효과는 6시간 이후로 급격히 감소하여 0%에 가까운 인산화 정도를 보임을 확인할 수 있다. 상기 결과로부터 본 발명에 따른 실시예 2의 화합물은 Cdk1 및 Cdk2의 활성을 저해함을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 화합물은 생체 외 키나아제 분석 및 세포 내 웨스턴 블랏 분석을 통해 Cdk1 및 Cdk2의 활성을 강력하게 억제하는 것을 확인하였고 그로 인해 간세포암의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
<1-3> Cdk7 및 Cdk9의 생체외 키나아제 분석
본 발명에 따른 화합물이 Cdk7 및 Cdk9활성을 억제하는지 확인하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<1-3-1> 생체외 키나아제 분석
키나아제 분석 완충액에 기질로써 RNA Pol II-CTD-GST protein(Jena Bioscience, Germany), 효소로써 Cdk9/cyclin T1 또는 Cdk7/cyclin H/MAT1 재조합 단백질(Upstate), 2.5μ Ci의 [γ-32P]ATP, 100μM의 MgAc/ATP를 첨가하여 반응액은 총 50ul 로 맞추었고, 키나아제 분석 반응은 30 ℃에서 20분 동안 진행되었다. 반응 후 8%의 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 전기영동하였고, 방사능 사진촬영으로 확인하였으며 결과인 실시예 1 및 2의 화합물 농도에 따른 Cdk7 및 Cdk9 인산화 정도를 도 5 내지 도 8 및 하기 표 3에 나타내었다.
단, 실험 결과에서 밴드(bands)의 양(intensity)은 밀도측정(densitometry)(GS-800, Bio-Rad)으로 분석하였다.
표 3
처리한 화합물 처리농도 (nM) Cdk7 활성 Cdk9 활성
비교군 로즈코비틴(Roscosvitine) 0 100 100
10 92.0 55.6
100 43.4 44.6
1000 17.4 42.2
처리군 실시예 1의 화합물 0 100 100
10 41.8 15.8
100 10.8 1.0
1000 5.8 0.1
실시예 2의 화합물 0 100 100
10 92.2 95.4
100 91.1 40.5
1000 6.5 3.3
표 3은 Cdk7 및 Cdk9의 억제제로 이미 알려져있는 로즈코비틴을 비교군으로 설정하고 본 발명에 따른 화합물인 실시예 1의 화합물 및 실시예 2의 화합물을 Cdk7, Cdk9 각각에 처리한 결과이다.
상기 표 3에 따르면, Cdk 억제제로 알려진 로즈코비틴을 10~1000 nM 처리했을 때의 Cdk7의 활성은 92~17.4%, Cdk9의 활성은 55.6~42.2% 범위를 나타내며 감소하는 것에 비해 본 발명에 따른 실시예 1의 화합물을 10~1000 nM 처리했을 때 Cdk7의 활성은 41.8~5.8%, Cdk9의 활성은 15.8~0.1%로 감소하는 것으로 나타나 현재 Cdk의 억제제로 알려진 화합물인 로즈코비틴보다 좋은 활성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 본 발명에 따른 실시예 2의 화합물을 10~1000 nM 처리했을 때 Cdk7의 활성은 92.2~6.5%,, Cdk9의 활성은 95.4~3.3% 범위를 나태내머 감소하는 것을 보면 로즈코비틴을 처리하였을 때보다 Cdk7 및 Cdk9 모두 좋은 활성을 가지는 것을 확인할 수 있다. 상기 결과를 통해 본 발명에 따른 화합물은 Cdk7 및 Cdk9의 활성을 강력히 억제한다는 것을 알 수 있다.
<1-3-2> 웨스턴 블랏 분석
1차 항체(antibody)로서 rabbit anti-phospho RNA Pol II (Ser5), and rabbit anti-phospho RNA Pol II (Ser2) (from Bethyl, TX, USA)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1의 단계 2와 동일한 방법으로 수행하여 얻은 결과를 도 9 내지 도 12 및 하기 표 4, 표 5에 나타내었다.
표 4
처리한 화합물 처리농도 (nM) Cdk7 활성
비교군 로즈코비틴(Roscosvitine) 0 100
0.1 96.0
0.5 73.1
1 51.5
5 51.6
10 49.9
50 4.0
처리군 실시예 1의 화합물 0 100
0.1 90.1
0.5 76.3
1 37.6
5 3.0
10 1.7
50 0.3
실시예 2의 화합물 0 100
0.1 88.4
0.5 44.0
1 12.7
5 3.3
10 1.6
50 0.6
표 4에 나타난 바와 같이, 비교군인 로즈코비틴은 처리농도를 0~10 nM로 증가시킴에 따라 Cdk7 활성을 저해시키는 정도가 농도 의존적으로 50% 감소한 것에 반해, 실시예 1의 화합물의 경우 처리 농도를 0~50 nM로 증가시킴에 따라 농도 의존적으로 Cdk7의 활성이 감소하는 것을 확인하였고, 10 nM의 농도 이상의 경우 Cdk7의 활성이 거의 0에 가깝게 줄어드는 것을 알 수 있었다. 또한, 본 발명에 의한 화합물인 실시예 2의 화합물의 처리 농도를 0~50 nM로 증가시킴에 따라 농도 의존적으로 Cdk7의 활성이 줄어들었으며, 특히 5 nM 의 농도부터는 0%에 가까운 활성도를 나타내는 것을 확인할 수 있다. 이는 실시예 2의 화합물에 의한 Cdk7의 활성저하 효과가 매우 뛰어나다는 것을 의미한다. 상기 결과로 인해 본 발명에 따른 실시예 1 및 2의 화합물은 Cdk7의 활성을 저하시키는 효과가 있음을 확인하였다.
표 5
처리한 화합물 처리농도 (nM) Cdk9 활성
비교군 로즈코비틴(Roscosvitine) 0 100
0.1 69.3
0.5 48.5
1 38.1
5 35.7
10 34.6
50 2.2
처리군 실시예 1의 화합물 0 100
0.1 90.4
0.5 87.0
1 46.1
5 1.9
10 1.3
50 0.2
실시예 2의 화합물 0 100
0.1 81.5
0.5 27.3
1 11.0
5 2.2
10 1.1
50 0.7
표 5에 나타난 바와 같이, 비교군인 로즈코비틴의 경우 처리농도를 0~10 nM까지 증가시킴에 따라 Cdk 활성도는 100~34.6% 감소하고 50 nM의 고농도로 처리하였을 때 Cdk9의 활성이 2.2%로 거의 사라짐을 확인할 수 있는 반면, 본 발명에 의한 화합물인 실시예 2의 화합물의 경우 1 nM의 농도로 Cdk9 활성도를 11%로 감소시키며 5 μM을 처리하였을 때엔 0%에 가까운 활성도를 보여 Cdk9 활성이 거의 사라짐을 확인할 수 있다. 이는 실시예 2의 화합물이 Cdk9 활성을 저해하는 효과가 뛰어난 것을 의미하며 실시예 1의 화합물의 경우에도 농도 의존적으로 Cdk9의 활성을 감소시키는 결과를 보였으며 특히 5 μM 이상 처리하였을 때엔 Cdk9의 활성이 거의 사라지는 것을 확인할 수 있다. 상기 결과로부터 본 발명에 다른 화합물은 Cdk 9의 활성을 억제하는 효과를 가지고 있음을 알 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 화합물은 생체 외 카나아제 분석 및 세포 내 웨스턴 블랏 분석을 통해 Cdk7 및 Cdk9의 활성을 강력하게 억제하므로 간세포암의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
<1-4> Mcl-1, survivin, XIAP의 mRNA 및 단백질의 양 측정
세포의 생존에 필수적인 분자들인 Mcl-1, survivin, XIAP의 mRNA 및 단백질의 양에 미치는 본 발명에 따른 화합물의 영향을 알아보기 위하여 하기와 같이 웨스턴 블랏 분석 및 RT-PCR 실험을 수행하였다.
<1-4-1> 웨스턴 블랏 분석
1차 항체(antibody)로서 rabbit anti-Mcl-1 (from Santa Cruz Biochemicals, CA, USA), rabbit anti-survivin, rabbit anti-XIAP (from Cell Signaling, MA, USA), rabbit anti-Actin (from Sigma, USA)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1의 단계 2와 동일한 방법으로 수행하여 얻은 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13에서는 실시예 2의 화합물이 SNU-354 세포의 생존에 필수적인 분자들인 Mcl-1, Survivin, XIAP 각각의 단백질 양을 감소시키는 것을 확인할 수 있다. 이는 곧 간세포암인 SNU-354 세포의 세포사멸을 유도하는 결과이며 실시예 2의 화합물이 간세포암 저해활성을 가지고 있다는 것을 의미하는 것이다.
<1-4-2> RT-PCR (역전사-PCR) 반응
정해진 방법으로 실시예 2의 화합물을 처리한 SNU-354 세포로부터 총 RNA(total RNA)를 추출하였다. 역전사 반응을 위해 5 μg의 추출한 RNA 및 M-MLV 역전사효소(Promega Corporation, WI, USA)를 사용하였다. 역전사 반응은 37 ℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 95 ℃에서 5분간 반응시켰다. PCR 반응을 위해, 주형(template)으로써 역전사 반응을 통해 획득한 cDNA 5 ㎕와 DNA 중합효소로써 Taq DNA 폴리머라제를 사용하였고, 50 ㎕의 반응부피로 진행하였다. PCR 조건에서, 변성반응을 미리 시키는 과정으로써 95 ℃에서 5분 동안 반응하고, 95 ℃에서 1분/ 56 ℃에서 1분/ 72 ℃에서 1분 반응을 30회 반복하였다. 마지막 합성으로써 72 ℃에서 10분간 반응하였다. PCR이 끝난 후 생성물(PCR products)을 1% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 분석한 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14의 PCR 검사에서 사용된 Mcl-1에 대한 정방향 프라이머는 5′- CGG TAA TCG GAC TCA ACC TC-3′ 및 역방향 프라이머는 5′-CCT CCT TCT CCG TAG CCA A-3′이고, XIAP에 대한 정방향 프라이머는 5′-AGT GGT AGT CCT GTT TCA GCA TCA-3′, 역방향 프라이머 5′-CCG CAC GGT ATC TCC TTC A-3′이며, survivin에 대한 정방향 프라이머는 5′-TGC CTG GCA GCC CTT TC-3′, 역방향프라이머는 5′-CCT CCA AGA AGG GCC AGT TC-3′이다. 또한, GAPDH에 대한 정방향 프라이머는 5′-GAA GGT GAA GGT CGG AGT-3′, 역방향 프라이머는 5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3′를 사용하였고, 프라이머는 ㈜바이오닉스(Seoul, Republic of Korea)에서 제공받았다.
도 14에서는 실시예 2의 화합물이 SNU-354 세포의 생존에 필수적인 분자들인 Mcl-1, Survivin, XIAP 각각의 단백질 양의 감소가 mRNA 양의 감소(트랜스크립션의 억제)에 의해 발생하는 것 확인할 수 있다. 이는 곧 간세포암인 SNU-354 세포의 세포사멸을 유도하는 결과이며 실시예 2의 화합물이 간세포암 저해활성을 가지고 있다는 것을 의미하는 것이다.
따라서, 본 발명에 따른 화합물은 SNU-354 세포에서 Mcl-1, survivin, XIAP의 단백질의 양을 감소시켰고 이러한 세포내의 단백질 양의 감소가 상기 단계 2의 RT-PCR 실험을 통해 mRNA양의 감소에 의해 발생하는 것으로 보아 간세포암인 SNU-354 세포에서 Cdk7 및 Cdk9의 활성을 억제시키고 이로 인해 RNA 폴리머라이제 2의 활성이 억제되며 그에 따른 세포 생존에 필수적인 분자들인 Mcl-1, survivin, XIAP의 전사를 억제되므로 간세포암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
<1-5> HCC 세포의 세포 성장 측정
본 발명에 따른 화합물이 HCC 세포 성장에 끼치는 영향을 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<1-5-1> MTT 분석
MTT 분석을 통해 세포의 생존력(cell viability)을 측정하였다. 세포의 성장곡선 중 로그 기(log phase) 상태에 있는 SNU-354 세포를 24-웰 플레이트에 2×104 세포/웰 농도로 분주하고 24시간 후에 약물(실시예 1의 화합물, 실시예 2의 화합물, 로즈코비틴 또는 올로마우신)을 다양한 농도로 처리하였다. 실험에 적합한 약물 반응시간 후 MTT 시약(PBS에 5 mg/ml의 MTT를 녹인)(Sigma-Aldrich, USA)을 각 웰에 첨가하고 37 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 그 후 상층액은 제거하고 침전된 포마잔 결정(formazan crystals)을 디메틸설폭사이드로 녹인 다음 바로 엘리사 플레이트 리더(ELISA plate reader)로 흡광도(absorbance)를 측정하여 도 15 및 하기 표 6에 나타내었다.
표 6
세포 생존력(%)
화합물 올로마우신 로즈코비틴 실시예 1의 화합물 실시예 2의 화합물
화합물 농도(μM) 0 100 100 100 100
0.5 98.9 95.9 96.4 86.3
1.0 99.9 92.5 84.3 75.5
2.0 99.9 94.5 74.0 64.7
5.0 98.5 87.9 68.0 47.6
10.0 101.4 84.7 55.6 35.4
50.0 96.0 61.4 36.6 16.8
표 6에서는, 기존 Cdk 저해제로 사용되고 있는 올로마우신 및 로즈코비틴을 비롯하여 본 발명에 따른 화합물인 실시예 1 및 실시예 2의 화합물의 농도에 따른 SNU-354 세포의 생존력을 나타내었다. 전체적으로 화합물의 농도 의존적으로 세포 성장을 억제하는 것을 확인할 수 있다. 올로마우신의 경우 최대 농도에서 세포 생존율은 96%로 나타났고, 로즈코비틴의 경우 61.4%, 본 발명에 따른 실시예 1의 화합물의 경우 36.6%, 실시예 2의 화합물 경우 16.8%로 나타나 본 발명에 따른 화합물이 기존 Cdk 저해제로 사용되고 있는 올로마우신 및 로즈코비틴보다 낮은 세포 생존력을 보였다. 이는 본 발명에 따른 화합물에 의한 SNU-354 세포 성장 억제효과가 더욱 강력하다는 것을 의미하며 특히, 실시예 2의 화합물 경우는 16.8%로 가장 낮은 세포 생존율을 나타내어 SNU-354 세포 성장을 가장 강력히 억제하는 것으로 밝혀졌다.
<1-5-2> 3H-티미딘 인코포레이션 분석
SNU-354 세포를 6-웰 플레이트에 5×104 세포/웰 농도로 분주하고 24시간 후 혈청(FBS)을 제거한 배지에 24시간 배양한 후 혈청이 첨가된 배지와 다양한 농도의 실시예 1 및 실시예 2의 화합물 및 1 μCi/ml 트리티에이티드 티미딘 ([3H]dT)(GE Healthcare, UK)과 혈청이 첨가된 배지로 교체하였다. 18 - 24시간 후 차가운 PBS로 세포를 세척하고 차가운 5% 트리클로로아세트산으로 고정한 후 10.25 N 소듐 하이드록사이드로 37 ℃에서 1시간 동안 DNA를 용해시켰다. 세포 내의 DNA 합성과정 동안 인코포레이션(incorporation) 된 [3H]dT을 LSC(liquid scintillation counting) 방법으로 측정하였다. 세포 내의 DNA 합성 정도를 통해 세포의 생존력(cell viability)을 파악하였고 그 결과를 도 16 및 하기 표 7에 나타내었다.
표 7
3H-티미딘 인코포레이션(%)
화합물 올로마우신 로즈코비틴 실시예 1의 화합물 실시예 2의 화합물
화합물 농도(μM) 0 100 100 100 100
5.0 99.7 98.2 84.0 50.7
10.0 96.3 91.0 35.2 20.4
50.0 77.2 47.2 15.8 8.0
표 7에서는, 기존 Cdk 저해제로 사용되고 있는 올로마우신 및 로즈코비틴을 비롯하여 본 발명에 따른 화합물인 실시예 1 및 실시예 2의 화합물의 농도에 따른 3H-티미딘 인코포레이션 결과를 나타내었다. 3H-티미딘 인코포레이션이 높을 수록 세포 생존율이 높은 것을 의미한다. 전반적으로 상기 화합물들의 경우 각각 화합물들의 농도가 높아질 수록 세포 성장을 억제하는 효과가 크게 나타남을 확인할 수 있다. 특히, 올로마우신의 경우 최대 농도에서 3H-티미딘 인코포레이션은 77.2%로 나타났고, 로즈코비틴의 경우 47.2%, 실시예 1의 화합물의 경우 15.8%, 실시예 2의 화합물의 경우는 8%로 나타났다. 이 때 기존 Cdk 저해제로 사용되고 있는 올로마우신 및 로즈코비틴 보다 본 발명에 따른 실시예 1 및 실시예 2의 화합물이 더욱 낮은 3H-티미딘 인코포레이션 즉, 낮은 세포 생존율을 보였다.이는 본 발명에 따른 화합물에 의한 SNU-354 세포 성장 억제효과가 더 큰 것을 의미한다.
따라서, 본 발명에 따른 화합물은 기존의 다른 Cdk 억제제들에 비해 더 강력히 SNU-354 세포의 세포성장을 억제하기 때문에 간세포암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
<1-6> HCC 세포의 세포사멸 효과 확인
본 발명에 따른 화합물이 HCC 세포의 세포사멸을 유도하는지 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<1-6-1> 웨스턴 블랏 분석
1차 항체(antibody)로서 rabbit anti-PARP를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 1의 단계 2와 동일한 방법으로 수행하여 얻은 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17에서는 PARP의 절단 확인을 통해 실시예 1의 화합물 및 실시예 2의 ㅎ화합물 모두 SNU-354 세포의 세포사멸을 유도한다는 것을 알 수 있다. 특히 실시예 2의 화합물의 경우, 처리한 후 6시간이 지나면서 PARP의 절단을 확인할 수 있고 실시예 1의 화합물의 경우, 12시간이 지나면서부터 PARP의 절단을 확인할 수 있어 실시예 2의 화합물에 의한 세포사멸 효과가 더 크다는 것을 알 수 있다.
<1-6-2> 카스파제-3(caspase-3)의 활성 측정
실시예 1 및 실시예 2의 화합물을 처리한 SNU-354 세포를 리시스(lysis) 완충액(0.5% 트리톤 X-100, 20 mM 트리스-염산 (pH 7.5), 2 mM 마그네슘 클로라이드, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM β-글리세로포스페이트, 25 mM 소듐플루오라이드, 1 mM Na3VO4, 2 μg/ml 류펩틴, 2 μg/ml 펩스테틴 A, 100 μg/ml 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 1 μg/ml 안티파인)으로 용해 하였다. 반응에 필요한 프로티아제 분석 완충액(20 mM HEPES (pH 7.5), 10% 글리세롤, 2 mM DTT)에 기질로써 20 μM Ac-DEVD-AMC (BD Biosciences, CA, USA)와 세포 용해물(lysates)을 혼합하여 37 ℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 분광형광계(spectrofluorometer)(TECAN, Switzerland)로 380 nm의 여기(excitation) 파장과 460 nm의 방출(emission) 파장 조건에서 카스파제-3(caspase-3)의 활성을 측정하여 도 18 및 하기 표 8에 나타내었다.
표 8
카스파제-3 활성
실시예 1의 화합물 실시예 2의 화합물
화합물 농도(μM) 0 1.0 1.0
0.1 1.0 0.9
0.5 1.0 7.0
1.0 3.3 10.4
5.0 8.2 11.1
10.0 11.4 11.6
50.0 8.0 6.5
표 8에서는, 실시예 1 및 실시예 2의 화합물의 농도 변화에 따른 카스파제-3 활성을 나타내었다. 두 가지 화합물 모두 10.0 μM의 농도에서 가장 높은 카스파제-3 활성을 보였다. 실시예 1의 화합물은 1.0 μM부터 대조군의 3배로 활성을 나타내기 시작하였고 실시예 2의 화합물은 0.5 μM 부터 대조군의 7배로 활성을 나타내기 시작했으며 두 화합물 모두 농도 의존적으로 카스파제-3의 활성이 증가함을 보였다.
<1-6-3> FACS 분석
SNU-354 세포를 90 mm 접시에 씨딩 후 적당한 농도의 실시예 1 및 실시예 2의 화합물을 24시간 동안 처리하였다. 세포를 모아서 차가운 PBS로 세척한 후 500 ㎕의 차가운 70% 에탄올을 4 ℃에서 밤샘 반응시켜 세포를 고정하였다. 그 후 세포를 500 ㎕의 PBS로 세 번 세척하고, 50 μg/ml의 프로피디움 아이오다이드(PI)와 50 ㎕의 1 mg/ml 알앤에이즈 A가 첨가된 500 ㎕의 PBS를 상온에서 30분 동안 어두운 조건에서 반응시켰다. PI가 염색된 세포의 형광을 FACS 칼리버 플로우 시토미터(caliber flow cytometer)와 세포 퀘스트 프로그램(Cell Quest program)(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, CA, USA)을 이용하였다. 또한, FACS 분석을 통해 실시예 1 및 실시예 2의 화합물에 의한 HCC SNU-354 세포의 sub G1 비율 변화를 측정하였다. 그 결과를 도 19, 도 20 및 하기 표 9, 표 10에 나타내었다.
표 9
sub G1 비율(%)
실시예 1의 화합물 실시예 2의 화합물
화합물 농도(μM) 0 3.0 3.0
0.1 2.7 3.8
0.5 3.2 39.6
1 3.5 52.0
5 28.1 69.8
10 64.2 72.6
50 71.1 73.1
표 9에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 화합물의 경우 5 μM의 농도에서 급격한 sub G1의 비율의 상승을 나타내고 실시예 2의 화합물의 경우 0.5 μM의 농도에서 급격한 sub G1의 비율의 상승을 보인다. 이는 상기 농도에서부터 SNU-354 세포의 사멸을 급격하게 유도하는 것을 나타낸다.
표 10
sub G1 비율(%)
실시예 1의 화합물 실시예 2의 화합물
시간(h) 0 10.3 10.3
6 29.1 51.6
12 51.8 67.6
18 71.7 72.3
24 78.1 81.2
표 10은 실시예 1 및 실시예 2의 화합물 각각을 50 μM 농도로 유지했을 때 시간에 따른 sub G1의 비율을 나타낸 것이다. 본 발명에 따른 두 가지의 화합물 모두 시간 의존적으로 sub G1 비율이 증가함을 확인할 수 있고 이는 시간 의존적으로 세포 사멸이 유도됨을 의미하는 것이다.
따라서, 본 발명에 따른 화합물은 HCC SNU-354 세포의 세포사멸을 유도하기 때문에 간세포암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
<실험예 2> 동물 실험
<2-1> SNU-354 암 이종이식(xenograft)
5-6주령 된 수컷 누드 쥐를 한국(Republic of Korea)의 ㈜중앙실험동물 회사로부터 구입하였고, 쥐는 서울대학교 약학대학 실험동물실에서 사육하였다. 모든 동물 실험은 서울대학교 실험동물자원관리원에서 정해놓은 방침에 따라 수행하였다. 인간 간세포암 세포주인 SNU-354 세포 1×107개를 PBS 200 ㎕에 혼합하여 쥐의 오른쪽 앞발 아랫부분에 피하주사법(subcutaneous injection)으로 주입하였고, 이종이식 암의 크기가 100 ± 30 mm3 될 때까지 관찰하였다. 적합한 크기로 암이 자란 쥐를 3그룹(n=8)으로 나누어, 한 그룹은 대조군(vehicle)으로 하였고 다른 두 그룹은 각각 실시예 2의 화합물을 4 mg/kg과 20 mg/kg씩 1회/일 3주 동안(5회/주) 복강내주사법(intraperitoneal injection)으로 투여하였다. 대조군은 5% 에탄올과 30% 폴리에틸렌 글라이콜 200(Fluka, Netherlands)을 처리하였다. 약물 투여일정은 데이터에 표시해 두었고, 암의 크기가 약 2000 mm3 될 때까지 매일 암의 크기 및 동물의 몸무게와 동물의 상태를 측정하였다. 암의 크기는 V = a×b×c×π/6 (a = tumor의 긴축, b = tumor의 짧은 축, c = tumor의 높이)로 계산하였다. 약물 투여 33일 후에 동물들을 안락사시켰고, 이종이식 암과 간을 적출하여 무게 및 크기를 측정한 결과를 도 21 및 도 22에 나타내었다. 이로 인해, 실시예 2의 화합물 농도에 의한 몸무게의 변화는 없음을 알 수 있었으나(도 21), 대조군(Vehicle 투여군)에 비하여 실시예 2의 화합물 투여군(4 mg/kg/day, 20 mg/kg/day)에서 이종이식 암의 성장이 급격히 감소하는 것을 확인할 수 있다(도 22). 특히, 실시예 2의 화합물을 4 mh/kg/day 농도로 투여한 그룹은 암의 성장이 대조군에 비해 평균 15% 감소하였고, 20 mg/kg/day 농도로 투여한 그룹은 대조군에 비해 평균 47% 감소하였다.
또한, 적출한 조직들을 이용하여 TUNEL 분석 및 면역조직화학(immunohistochemistry)을 수행하였다.
<2-2> 카스파제-3의 면역조직화학(immunohistochemistry) 및 TUNEL 분석
적출한 모든 이종이식 암과 간 조직을 36% 포름알데하이드 용액(Junsei Chemical Co., Ltd, Tokyo, JAPAN)으로 고정하고, 파라핀으로 임베딩(embedding)하였다. 5 μm 로 절단하여 절편을 만들고, 상기 절편을 이용하여 H&E 염색 및 세포사멸 현상을 위한 TUNEL 분석, 끊어진 카스파제-3(cleaved caspase-3) 단일항체(Cell Signaling, MA, USA)를 통해 조직 내의 끊어진 카스파제-3의 발현 양을 측정하였다. 면역학적 감광을 위해 ABC 퍼옥시다제(Dako Cytomation California, Inc., CA, USA) 레이블링(labeling)을 수행한 결과를 도 23에 나타내었다. 도 23-A에서는, TUNEL 양성 스팟과 카스파제-3 양성 스팟이 대조군보다 실시예 2의 화합물을 투여한 군에서 많이 발생하였고 또한 고농도 투여군(20 mg/kg)에서 더욱 증가함으로 인해 실시예 2의 화합물 투여를 통한 이종이식 암의 성장 억제가 세포 사멸을 통해 유도된다는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 23-B는 실시예 2의 화합물이 정상적인 간 조직에도 영향을 미쳤는지 확인하기 위해 대조군 및 실시예 2의 화합물 투여군 모두에서 간 조직을 적출하여 상기 도 23-A와 같이 TUNEL 분석 및 카스파제-3의 면역조직화학분석을 수행한 결과이다. 이종이식 암이 아닌 간 조직에서는 세포 사멸의 결과를 전혀 확인할 수 없었으며 이로 인해 실시예 2의 화합물은 정상적인 간 조직이 아닌 이종이식 암에만 영향을 미쳤음을 확인할 수 있었다.
따라서, 본 발명에 따른 화합물은 간 조직에만 선택적인 작용을 하기 때문에 간세포암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
<실험예 3> 플로우 시토메트리 분석
SNU-354 세포를 90 mm 접시에 씨딩 후 대조군 및 상기 실시예 2 내지 6의 화합물을 각각 10 uM씩 24시간 동안 처리하였다. 세포를 모아서 차가운 PBS로 세척한 후 500 ㎕의 차가운 70% 에탄올을 4 ℃에서 밤샘 반응시켜 세포를 고정하였다. 그 후 세포를 500 ㎕의 PBS로 세 번 세척하고, 50 μg/ml의 프로피디움 아이오다이드(PI)와 50 ㎕의 1 mg/ml 알앤에이즈(RNase) A가 첨가된 500 ㎕의 PBS에 상온 및 30분 동안 어두운 조건에서 반응시켰다. PI가 염색된 세포의 형광을 FACS caliber 플로우 시토미터 및 Cell Quest program(Becton Dickinson Immunocytometry Systems, CA, USA)을 이용하여 측정하였다. 또한, FACS 분석을 통해 상기 화합물들에 의한 SNU-354 세포의 sub G1 비율 변화를 측정하였다. 그 결과를 도 24 및 하기 표 11에 나타내었다.
표 11
화합물 sub G1 비율 변화
대조군 1.0
실시예 2의 화합물 5.9
실시예 3의 화합물 5.7
실시예 4의 화합물 5.5
실시예 5의 화합물 6.0
실시예 6의 화합물 5.9
표 11에서 나타난 바와 같이, 대조군에 비하여 본 발명에 따른 화합물은 세포 사멸 유도 효과가 매우 좋은 것을 확인할 수 있었다. 그 중에서 특히 본 발명에 따른 화합물인 실시예 2, 5 및 6의 화합물이 5.5배 이상의 비율 변화를 나타내어 세포사멸 효과가 보다 뛰어남을 보여준다.
따라서, 본 발명에 따른 화합물은 SNU-354 세포의 사멸 효과가 뛰어나므로 간세포암의 치료 또는 예방에 유용하게 사용될 수 있다.
<실험예 4> 카스파제-3 활성의 측정
실시예 1 내지 6의 화합물을 각각 처리한 SNU-354 세포를 리시스(lysis) 완충액(0.5% 트리톤 X-100, 20 mM 트리스-염산 (pH 7.5), 2 mM 마그네슘클로라이드, 1 mM DTT, 1 mM EGTA, 50 mM β-글리세로포스페이트, 25 mM 소듐플루오라이드, 1 mM Na3VO4, 2 μg/ml 류펩틴, 2 μg/ml 펨스테틴 A, 100 μg/ml 페닐메틸설포닐 플루오라이드, 1 μg/ml 안티파인)로 용해 하였다. 반응에 필요한 프로티아제 분석 완충액(20 mM HEPES (pH 7.5), 10% 글리세롤, 2 mM DTT)에 기질로써 20μM Ac-DEVD-AMC (BD Biosciences, CA, USA)와 셀 용액을 혼합하여 37 ℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 후 분광형광계(spectrofluorometer)(TECAN, Switzerland)로 380 nm의 excitation 파장과 460 nm의 emission 파장 조건에서 카스파제-3 활성을 측정한 결과를 도 25 및 하기 표 12에 나타내었다.
표 12
화합물 농도 (μM) 카스파제-3 활성
실시예 1의 화합물 5 8.4
10 8.1
실시예 2의 화합물 5 9.7
10 11.0
실시예 3의 화합물 5 8.2
10 7.8
실시예 4의 화합물 5 5.1
10 7.0
실시예 5의 화합물 5 9.0
10 10.3
실시예 6의 화합물 5 10.7
10 11.7
표 12에 나타난 바와 같이, 상기 화합물들의 농도를 5, 10 μM 씩 투여하였을 때 카스파제-3의 활성은 실시예 1의 화합물 및 실시예 3의 화합물을 제외하고는 농도를 증가시켰을 때 활성 또한 증가하였다. 특히, 실시예 2, 실시예 5 및 실시예 6의 화합물의 활성이 10 이상으로 나타나 뛰어난 것으로 확인되었다.
따라서, 본 발명에 따른 화합물은 SNU-354 세포 활성을 저해하므로 간세포암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체는 목적에 따라 여러 형태로 제제화가 가능하다. 하기는 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 활성성분으로 함유시킨 몇몇 제제화 방법을 예시한 것으로 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
<제제예 1> 약학적 제제의 제조
<1-1> 산제의 제조
피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 2 g
유당 1 g
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
<1-2> 정제의 제조
피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
<1-3> 캅셀제의 제조
피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 100 ㎎
옥수수전분 100 ㎎
유당 100 ㎎
스테아린산 마그네슘 2 ㎎
상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
<1-4> 주사제의 제조
피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 10 ㎍/㎖
묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지
주사용 염화나트륨 BP 최대 1 ㎖
적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명에 따른 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체를 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120 ℃에서 15분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.
<1-5> 액제의 제조
피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 100 ㎎
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬 향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색 병에 충진하여 멸균시켜 액체를 제조한다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2010007650-appb-I000006
    (상기 화학식 1에서,
    R1은 수소 또는 R3C(=O) 이고;
    R3은 C1~C6의 직쇄 또는 측쇄 알킬, C3~C8의 시클로알킬 또는 페닐이고;
    R2는 수소 또는 아세틸기이다.)
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 R3는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, t-부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실 또는 페닐인 것을 특징으로 하는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은
    (1) 4-아미노-6-브로모-1-((2S,3R,4R,5S)-3,4-디하이드록시-5-(하이드록시메틸)-테트라하이드로퓨란-2-일)-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-5-카복사마이드;
    (2) ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 이소부티레이트;
    (3) ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 피발레이트;
    (4) (2S,3R,4S,5S)-2-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-5-(이소부티릴옥시메틸)-테트라하이드로퓨란-3,4-디일 디아세테이트;
    (5) ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 벤조에이트;
    (6) ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 프로피오네이트; 및
    (7) ((2S,3R,4R,5S)-5-(4-아미노-6-브로모-5-카바모일-1H-피롤로[2,3-d]피리미딘-1-일)-3,4-디하이드록시-테트라하이드로퓨란-2-일)메틸 사이클로헥산카복실레이트로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염.
  4. 하기 반응식 1에 나타난 바와 같이,
    화학식 2의 화합물에 BSA를 가한 후 TMSOTf 존재하에 화학식 3의 화합물을 추가하여 화학식 4의 화합물을 제조하는 단계(단계 1);
    화학식 4의 화합물에 암모늄하이드록사이드 용액을 가하여 화학식 5의 화합물을 제조하는 단계(단계 2); 및
    화학식 5의 화합물에 과산화수소를 가하여 화학식 1a의 화합물을 제조하는 단계(단계 3)를 포함하는 제 1항의 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체의 제조방법:
    [반응식 1]
    Figure PCTKR2010007650-appb-I000007
  5. 제 4항에 있어서, 상기 화학식 1a의 화합물은 하기 반응식 2에 나타난 바와 같이,
    에스터화 반응을 통해 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계를 더 포함할 수 있는 제 1항의 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체의 제조방법:
    [반응식 2]
    Figure PCTKR2010007650-appb-I000008
    (상기 반응식 2에서,
    R1 및 R2는 제 1항에서 정의한 바와 같다.)
  6. 제 4항에 있어서, 상기 출발물질인 화학식 2의 화합물은 하기 반응식 3에 나타난 바와 같이,
    화학식 6의 화합물인 테트라시아노에틸렌을 아세톤과 에틸아세테이트 존재하에 하이드로겐브로마이드를 가하여 화학식 7의 화합물을 제조하는 단계(단계 1); 및
    화학식 7의 화합물에 트리에틸올소포메이트 및 암모니아수를 가하여 화학식 2의 화합물을 제조하는 단계(단계 2)를 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 제 1항의 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체의 제조방법:
    [반응식 3]
    Figure PCTKR2010007650-appb-I000009
  7. 제 4항에 있어서, 화학식 3의 화합물은 하기 반응식 3에 나타난 바와 같이,
    화학식 8의 L-자일로스를 붕산과 반응시킨 후 아세트산 및 무수 아세트산을 가하여 고온에서 반응시키는 단계를 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 제 1항의 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체의 제조방법:
    [반응식 4]
    Figure PCTKR2010007650-appb-I000010
  8. 제 1항의 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염은 Cdk 저해작용을 가지는 것을 특징으로 하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 Cdk는 Cdk1, Cdk2, Cdk7 및 Cdk9를 포함하는 것을 특징으로 하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
PCT/KR2010/007650 2010-11-02 2010-11-02 Ｃｄｋ를 저해하는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이를 유효성분으로 함유하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 WO2012060482A1 (ko)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP10859285.8A EP2636677B1 (en) 2010-11-02 2010-11-02 Cdk-inhibiting pyrrolopyrimidinone carboxamide derivative or pharmaceutically acceptable salt thereof, and pharmaceutical composition containing same as active ingredient for preventing or treating liver cell cancer
PCT/KR2010/007650 WO2012060482A1 (ko) 2010-11-02 2010-11-02 Ｃｄｋ를 저해하는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이를 유효성분으로 함유하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
US13/882,955 US9062088B2 (en) 2010-11-02 2010-11-02 CDK-inhibiting pyrrolopyrimidine carboxamide derivative or pharmaceutically acceptable salt thereof, and pharmaceutical composition containing the same as active ingredient for preventing or treating hepatocellular carcinoma

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/KR2010/007650 WO2012060482A1 (ko) 2010-11-02 2010-11-02 Ｃｄｋ를 저해하는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이를 유효성분으로 함유하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2012060482A1 true WO2012060482A1 (ko) 2012-05-10

Family

ID=46024590

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2010/007650 WO2012060482A1 (ko) 2010-11-02 2010-11-02 Ｃｄｋ를 저해하는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이를 유효성분으로 함유하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Country Status (3)

Country Link
US (1) US9062088B2 (ko)
EP (1) EP2636677B1 (ko)
WO (1) WO2012060482A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023219427A1 (ko) * 2022-05-13 2023-11-16 서울대학교산학협력단 Cdk를 저해하는 신규 피롤로피리미디논 카복사미드 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR122021004504B1 (pt) * 2017-03-10 2022-08-23 Lakewood Amedex, Inc. Uso de um composto antimicrobiano
EP3849537A4 (en) 2018-09-10 2022-06-29 Mirati Therapeutics, Inc. Combination therapies

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020035077A1 (en) * 1999-08-27 2002-03-21 Robert Tam Pyrrolo[2,3-d]pyrimidine nucleoside analogs
US20090117651A1 (en) * 2005-04-26 2009-05-07 Andrei Gartel Nucleoside compounds and methods of use thereof

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020035077A1 (en) * 1999-08-27 2002-03-21 Robert Tam Pyrrolo[2,3-d]pyrimidine nucleoside analogs
US20090117651A1 (en) * 2005-04-26 2009-05-07 Andrei Gartel Nucleoside compounds and methods of use thereof

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHO S.-J. ET AL.: "Xylocydine, a novel Cdk inhibitor, is an effective inducer of apoptosis in hepatocellular carcinoma cells in vitro and in vivo", CANCER LETTERS, vol. 287, 28 January 2010 (2010-01-28), pages 196 - 206, XP026824293 *
HAM Y.-M. ET AL.: "Xylocydine, a Novel Inhibitor of Cyclin-Dependent Kinases, Prevents the Tumor Necrosi: Factor-Related Apoptosis- Inducing Ligand-Induced Apoptotic Cell Death of SK-HEP-1 Cells", THE JOURNAL OF PHARMACOLOGY AND EXPERIMENTAL THERAPEUTICS, vol. 308, no. 2, 2004, pages 814 - 819, XP055089517 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023219427A1 (ko) * 2022-05-13 2023-11-16 서울대학교산학협력단 Cdk를 저해하는 신규 피롤로피리미디논 카복사미드 화합물, 이의 입체이성질체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염 및 이를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
US9062088B2 (en) 2015-06-23
EP2636677A4 (en) 2014-04-16
US20130237495A1 (en) 2013-09-12
EP2636677B1 (en) 2016-01-13
EP2636677A1 (en) 2013-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2019112344A1 (ko) 암세포 성장 억제 효과를 나타내는 신규한 피리미딘 유도체 및 그를 포함하는 약제학적 조성물
WO2018155947A1 (ko) 혈액 뇌관문을 통과할 수 있는 화합물을 유효성분으로 함유하는 뇌암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2011159137A2 (ko) 신규한 티오우레아 또는 우레아 유도체, 이의 제조방법 및 이를 유효성분으로 함유하는 ａｉｄｓ 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2018004258A1 (ko) 신규한 헤테로시클릭 유도체 화합물 및 이의 용도
WO2019168237A1 (ko) 신규 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 섬유증 또는 비알코올성 지방간염의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
WO2016032209A2 (ko) 야누스인산화효소 억제제로서의 치환된 n-(피롤리딘-3-일)-7h-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민
AU2017256488B2 (en) Quinazoline derivative or its salt and pharmaceutical composition comprising the same
WO2012060482A1 (ko) Ｃｄｋ를 저해하는 피롤로피리미디논 카복사미드 유도체 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 이를 유효성분으로 함유하는 간세포암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2015126129A2 (ko) C형 간염 바이러스의 게놈 복제의 선택적 저해 활성을 갖는 레스베라트롤 다량체 및 이의 용도
WO2014030972A1 (ko) 항암용 조성물
WO2015026172A1 (ko) 세포괴사 저해제로서의 인돌아미드 화합물
WO2011049274A1 (en) Imidazole derivatives and compositions for treating melanoma
WO2019147089A1 (ko) 칼슘 채널 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2019194583A1 (ko) 3-페닐-2,8-디히드로피라노[2,3-f]크로멘 유도체 및 이를 포함하는 약학적 조성물
WO2017115914A1 (ko) PPARγ 인산화 저해제 및 이를 포함하는 약학적 조성물
WO2020190073A1 (ko) 신규한 아졸로피리미딘 헤테로고리 화합물을 유효 성분으로 함유하는 약제학적 조성물
WO2021100897A1 (ko) 바이구아나이드 계열, 및 페로센 또는 페로센 유도체를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2020080742A1 (en) Novel (isopropyl-triazolyl)pyridinyl-substituted benzooxazinone or benzothiazinone derivatives and use thereof
WO2019231262A1 (ko) 신규 바이페닐 유도체 화합물 및 이의 용도
WO2019132610A1 (ko) Baf57 재조합 융합 단백질 및 이의 용도
WO2018131950A1 (ko) 카보사이클릭 뉴클레오사이드 유도체 및 이를 포함하는 항바이러스제
WO2022086260A1 (ko) 인돌리진 유도체를 유효성분으로 포함하는 인터페론 유전자 자극제 조성물
WO2019235894A1 (ko) Aimp2-dx2와 k-ras의 결합을 저해하는 화합물을 포함하는 고형암 예방 또는 치료용 조성물 및 aimp2-dx2와 k-ras의 결합을 저해하는 신규 화합물
WO2022177307A1 (ko) 벤즈이미다졸 유도체를 유효 성분으로 포함하는 인터페론 유전자 자극제 조성물
WO2015026170A1 (ko) 세포괴사 저해제로서의 인돌 화합물

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10859285

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010859285

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13882955

Country of ref document: US