KR20220075624A

KR20220075624A - 항산화 활성, 항염 활성, 피부 미백 활성, 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 항혈전 활성을 가지는 락토바실러스 펜토서스 okbl-l.pe 1 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220075624A
Application number: KR1020200163909A
Authority: KR
Inventors: 옥민; 김정욱; 민경곤; 이성은; 강민정; 김현성; 이선주; 김소현; 심소연
Original assignee: 나눔제약 주식회사
Priority date: 2020-11-30
Filing date: 2020-11-30
Publication date: 2022-06-08
Also published as: KR102424598B1

Abstract

본 발명은 항산화 활성, 항염 활성, 피부 미백 활성, 항균 활성 및 항혈전 활성을 가지는 기탁번호가 KCCM12791P인 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

항산화 활성, 항염 활성, 피부 미백 활성, 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 항혈전 활성을 가지는 락토바실러스 펜토서스 OKBL-L.PE 1 균주 및 이의 용도{Lactobacillus pentosus OKBL-L.PE 1 strain having antioxidant activity, anti-inflammatory activity, skin whitening activity, antimicrobial activity against pathogenic microorganism and anti-thrombotic activity and uses thereof}

본 발명은 항산화 활성, 항염 활성, 피부 미백 활성, 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 항혈전 활성을 가지는 락토바실러스 펜토서스 OKBL-L.PE 1 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

유산균(Lactic acid bacteria)은 다양한 식품의 발효에 관여하여 독특한 풍미를 부여할 뿐 아니라, 항균성 물질을 생산하여 식품의 저장성 및 안정성을 증대시킨다. 이러한 유산균이 생성하는 항균성 물질로는 젖산 등의 유기산 이외에 디아세틸 및 박테리오신 등이 알려져 있다.

프로바이오틱스(probiotics)는 섭취되어 장에 도달하였을 때에 장내 환경에 유익한 작용을 하는 균주를 말하는 것으로, 건조 세포나 발효산물 형태로 사람이나 동물에 공급되어 장내 균총을 개선한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균이며 주로 락토바실러스(Lactobacillus) 속 균주를 이용하여 만들어진 발효유, 과립 또는 분말 등의 형태로 이용되고 있다. 유산균을 비롯한 균주들이 프로바이오틱스로 사용되기 위해서는 위산과 담즙산에서 살아남아 장까지 도달하여 증식 및 정착해야 하고 독성이 없으며 비병원성이어야 한다. 최근에는 기본적인 유산균의 특성 뿐만 아니라 다양한 유용 활성을 가지는 새로운 균주가 분리, 동정되어 보고되고 있다.

한편, 한국등록특허 제1088685호에서는 '락토바실러스 펜토서스를 포함하는 면역조절작용을 갖는 조성물'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1073791호에서는 '장내효소활성, 내산성, 내담즙성이 우수한 신규 락토바실러스 펜토서스 PL-11 균주와 이를 이용한 어류용 프로바이오틱스'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '항산화 활성, 항염 활성, 피부 미백 활성, 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 항혈전 활성을 가지는 락토바실러스 펜토서스 OKBL-L.PE 1 균주 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 깍두기 김치로부터 락토바실러스 펜토서스 OKBL-L.PE 균주(기탁번호 : KCCM12791P)를 분리하였고, 상기 분리된 균주의 우수한 항산화 활성, 항염 활성, 피부 미백 활성, 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 항혈전 활성을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 항산화 활성, 항염 활성, 피부 미백 활성, 항균 활성 및 항혈전 활성을 가지는 기탁번호가 KCCM12791P인 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 그람 음성균에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 발효식품 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 균주 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 균주 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 균주 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제 조성물을 제공한다.

본 발명의 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주는 항산화 활성, 항염 활성, 피부 미백 활성, 항균 활성 및 항혈전 활성이 우수하므로 항균용 조성물, 발효식품 제조용 스타터, 프로바이오틱, 혈전증의 예방용 조성물, 피부 미백용 조성물 및 사료첨가제 등으로 활용 가능하므로, 관련 산업 분야에 매우 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 분리한 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주의 DPPH 자유 라디칼 소거 활성을 측정한 결과이다. 0.05% BHT는 양성 대조군으로 사용한 합성 항산화제인 뷰틸레이트하이드록시톨루엔(Butylated hydroxytoluene)이고, MRSB는 음성 대조군으로 사용한 MRS 배지이고, L.FE_O 및 L.PL_O는 비교군으로 사용한 각각 락토바실러스 퍼멘텀 및 락토바실러스 플란타룸의 배양액이며, L.PE_O는 본 발명의 균주 배양액을 의미하고, L.PE_I는 본 발명의 균주의 균체를 의미하며, L.PE_A는 본 발명의 균주 배양액+균체를 의미한다.
도 2는 본 발명에서 분리한 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주의 리폭시게나아제 저해 활성을 측정한 결과이다. 0.1% IDM은 양성 대조군으로 사용한 인도메타신(indomethacin)이고, MRSB는 음성 대조군으로 사용한 MRS 배지이고, L.FE_O 및 L.PL_O는 비교군으로 사용한 각각 락토바실러스 퍼멘텀 및 락토바실러스 플란타룸의 배양액이며, L.PE_O는 본 발명의 균주 배양액을 의미하고, L.PE_I는 본 발명의 균주의 균체를 의미하며, L.PE_A는 본 발명의 균주 배양액+균체를 의미한다.
도 3은 본 발명에서 분리한 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주의 NO 생성 억제능을 측정한 결과이다. C는 증류수이고, LPS는 lipopolysaccharide이고, L.FE_O 및 L.PL_O는 비교군으로 사용한 각각 락토바실러스 퍼멘텀 및 락토바실러스 플란타룸의 배양액이며, L.PE_O는 본 발명의 균주 배양액을 의미한다.
도 4는 본 발명에서 분리한 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주의 티로시나아제 저해 활성을 분석한 결과이다. 0.05% Arbutin은 양성 대조군으로 사용한 티로시나아제 저해제이고, L.FE_O 및 L.PL_O는 비교군으로 사용한 각각 락토바실러스 퍼멘텀 및 락토바실러스 플란타룸의 배양액이며, L.PE_O는 본 발명의 균주 배양액을 의미한다.
도 5는 본 발명에서 분리한 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주의 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)에 대한 항균 활성을 측정한 결과이다. MRSB는 음성 대조군으로 사용한 MRS 배지이고, L.FE_O 및 L.PL_O는 비교군으로 사용한 각각 락토바실러스 퍼멘텀 및 락토바실러스 플란타룸의 배양액이며, L.PE_O는 본 발명의 균주 배양액을 의미한다.
도 6은 본 발명에서 분리한 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주의 항혈전 활성을 측정한 결과이다. MRSB는 음성 대조군으로 사용한 MRS 배지이고, L.FE_O 및 L.PL_O는 비교군으로 사용한 각각 락토바실러스 퍼멘텀 및 락토바실러스 플란타룸의 배양액이며, L.PE_O는 본 발명의 균주 배양액을 의미한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항산화 활성, 항염 활성, 피부 미백 활성, 항균 활성 및 항혈전 활성을 가지는 기탁번호가 KCCM12791P인 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주를 제공한다.

본 발명에서는 깍두기 김치로부터 항산화 활성, 항염 활성, 피부 미백 활성, 항균 활성 및 항혈전 활성을 가지는 균주를 분리하였으며, 최종 선별된 균주의 16S rRNA 염기서열 분석을 통해 동정한 결과, 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) 균주임을 확인하였다. 본 발명자는 상기 최종 선별된 균주를 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주로 명명하고 한국미생물보존센터(KCCM)에 2020년 9월 18일자로 기탁하였다(수탁번호: KCCM12791P).

본 발명은 또한, 상기 기탁번호가 KCCM12791P인 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 그람 음성균에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 그람 음성균은 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 "항균(antimicrobial)"의 의미는 어떤 농도에서 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다.

본 발명의 "항균용 조성물"은 세균과 같은 미생물의 생육을 저해하는 활성을 가진 조성물로서, 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항균 효과가 요구되는 다양한 분야에 사용되는 모든 형태가 포함될 수 있으며, 예를 들어, 의약품, 의약외품, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제 등의 형태일 수 있다.

본 발명의 항균용 조성물은 상기 균주 또는 상기 균주의 배양액 또는 상기 균주의 배양액의 농축액 그 자체일 수 있고, 제형화에 필요한 부형제나 희석제 등의 통상적으로 사용되는 첨가제가 더 포함될 수 있으며, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액 이외의 다른 항균 물질을 더 포함할 수도 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 항균용 조성물에 포함되는 본 발명의 균주 또는 상기 균주의 배양액 또는 상기 균주의 배양액의 농축액의 함량은 사용목적 및 사용방법 등을 고려하여 적절하게 선택될 수 있으며, 예를 들어 전체 조성물을 기준으로 1 ~ 100중량%, 바람직하게는 10 ~ 100중량%, 더욱 바람직하게는 50 ~ 100중량%일 수 있다.

본 발명의 "배양액"은 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액) 등의 배양액 자체로부터 파생되는 가공물을 포함한다. 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거칠 수 있으며, 이러한 단계는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있다. 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다.

본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 상기 기탁번호가 KCCM12791P인 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 발효식품 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 발효식품 제조용 스타터(starter)란 발효식품 제조를 위해 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 발효식품 제조 시에 첨가함으로써 발효된 식품에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 발효식품 제조용 스타터를 사용하여 식품을 제조하는 경우, 상기 발효식품 제조용 스타터에 포함된 미생물에 의하여, 식품의 품질을 일정하게 조절하거나, 특정한 목적을 달성할 수 있다. 본 발명에서는 락토바실러스 펜토서스 OKBL-L.PE 1 균주 또는 이의 배양액을 스타터 균주로 이용함으로써, 항산화 활성, 항염 활성, 피부 미백 활성, 항균 활성 및 항혈전 활성이 있는 발효식품을 제조할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 발효식품 제조용 스타터 조성물에서, 상기 발효식품은 전통 김치류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 상기 기탁번호가 KCCM12791P인 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱(probiotic) 조성물을 제공한다.

본 발명의 프로바이오틱 조성물은 상기 유효성분 외에 통상적인 약학적 담체 및 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 조성물은 통상적인 프로바이오틱 조성물 제조방법에 따라 열건조 또는 동결-건조하여 생균제 형태로 제조하여 이용할 수 있다.

본 발명의 균주는 상기 전술한 바와 같이 다양한 활성을 가지고 있으므로 식품, 의약품, 화장품, 건강식품 등의 프로바이오틱 조성물 제조에 이용될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 기탁번호가 KCCM12791P인 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 용어, "혈전증"이란, 혈전에 의해 발생되는 질환으로, 혈전색전증이라고도 하며, 특히 혈전에 의해 혈관이 막힌 질환을 일컫는다.

용어 "혈전"은 주로 혈소판과 세포성분을 둘러싼 섬유소로 구성된 혈액성분의 응집을 말하며, 혈액의 기타 형성된 혈액 요소와 뒤섞인 것으로 주로 혈소판 및 피브린의 응집물로 이루어진다.

본 발명의 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주, 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 항혈전 건강기능식품 조성물이 예방 또는 개선 효과를 가지는 질병은 다양하고, 예를 들어 고혈압, 심장병, 뇌졸증, 심근경색 등이 있으나, 이에 제한되지 않으며, 혈전 및 혈소판의 응집으로 유발되는 질병은 모두 이에 포함될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽, 발포정 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 그러나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 안전성 면에서 아무런 문제가 없는 범위의 양으로 사용될 수 있다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 기탁번호가 KCCM12791P인 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 피부 미백용 화장료 조성물에서, 상기 기탁번호가 KCCM12791P인 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주는 티로시나아제(tyrosinase) 저해 활성이 우수하므로, 피부 미백 효과가 있다.

상기 피부 미백은 티로시나아제를 저해하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 화장료 조성물에 있어서, 상기 피부 미백용 화장료 조성물은 스킨, 스킨 소프트너, 스킨 토너, 로션, 밀크로션, 모이스쳐로션, 영양로션, 마사지크림, 영양크림, 아이크림, 모이스쳐크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 클렌징폼, 클렌징워터, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌져, 비누 및 파우더 중에서 선택된 어느 하나의 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형으로 이루어진 화장료 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 피부 미백 활성 성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 피부 미백 활성 성분으로는 코지산 및 이의 유도체, 알부틴, 아스코르브산 및 이의 유도체, 하이드로퀴논 및 이의 유도체, 레조르시놀, 사이클로알카논, 메틸렌디옥시페닐 알칸올, 2,7-디니트로인다졸 또는 덩굴귤 추출물, 쌀 추출물, 감초 추출물과 같은 식물 추출물 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 아세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 기탁번호가 KCCM12791P인 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제 조성물을 제공한다.

상기 균주는 전술한 바와 같으며, 항산화, 항염, 항균 및 항혈전을 목적으로 사료첨가제 조성물로 첨가할 수 있다. 본 발명의 사료첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당한다.

본 발명의 사료첨가제 조성물은 사료에 첨가될 수 있으며, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분을 의미할 수 있다. 상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 유지류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 균주의 분리 및 동정

깍두기 시료를 생리식염수에 희석한 후 LB 배지(1% 수크로즈, 1% 효모 추출물 및 0.15% NaH₂PO₄)에 접종하고 배지가 든 플라스크를 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 이후, 배양액을 고체 배지에 도말하여 형성된 콜로니를 선별하여 순수 분리하였다. 선별 균주의 16S rRNA 유전자의 염기서열(서열번호 1)을 분석한 결과, 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus)로 판명되었으며, Lactobacillus pentosus OKBL-L.PE 1 균주로 명명하고 한국미생물보존센터(KCCM)에 2020년 9월 18일자로 기탁하였다(기탁번호 : KCCM12791P).

실시예 2. 선별 균주의 특성 분석

선별 균주를 MRS 액체 배지에 접종하여 37℃에서 18시간 동안 배양하고, 3,000 rpm으로 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 취하여 균주 배양액(L.PE_O)으로 명명하였고, 원심분리 후 얻어진 펠렛을 초음파 분해(sonication)하여 3,000 rpm으로 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 취하여 균체(L.PE_I)로 명명하였으며, 균주를 배양한 후 초음파 분해(sonication)하여 3,000 rpm으로 10분 동안 원심분리 후 상층액을 취하여 균주 배양액+균체(L.PE_A)로 명명하였다. 본 발명의 균주의 특성을 분석하기 위하여 균주 배양액(L.PE_O), 균체(L.PE_I) 및 균주 배양액+균체(L.PE_A)의 당도와 pH를 각각 측정하였다. 당도는 총 가용성 고형물(total soluble solids, Brix) 함량을 당도계(Hand refractormeter, Germany)로 측정하여 나타내었다. pH는 pH 미터기(SevenCompactTM pH/Ion S220, Switzerland)를 이용하여 3회 측정한 평균값으로 나타내었다.

그 결과, 본 발명의 락토바실러스 펜토서스 OKBL-L.PE 1 균주의 pH 및 당도는 대조군 대비 낮은 값을 나타내었고, 균주 배양액(L.PE_O), 균체(L.PE_I) 및 배양액+균체(L.PE_A)는 서로 다른 특성을 나타내는 것을 확인하였다(표 1).

락토바실러스 펜토서스 OKBL-L.PE 1 균주의 pH 및 당도

샘플			pH	당도
대조군	MRS 배지		6.69	5.7
비교군	락토바실러스 퍼멘텀(L.FE)		4.31	4.3
비교군	락토바실러스 플란타룸(L.PL)		3.77	4.9
실험군	락토바실러스 펜토서스 OKBL-L.PE 1	배양액(L.PE_O)	3.83	4.9
		균체(L.PE_I)	3.95	0.2
		배양액+균체(L.PE_A)	3.75	4.6

실시예 3. 항산화 활성 분석

락토바실러스 펜토서스 OKBL-L.PE 1 균주의 항산화 활성은 Blois 등의 방법에 따라 분석하였다. 에탄올 100 ㎖에 DPPH(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl) 16 ㎎을 녹인 후 증류수 100 ㎖을 혼합하여 와트만 필터 종이(Whatman filter paper) NO.2에 여과시켜 반응 용액을 만들었다. DPPH 자유 라디칼 소거 활성은 OKBL-L.PE 1 균주 배양액, 균체 또는 배양액+균체 0.4 ㎖에 상기 DPPH 반응 용액 4.6 ㎖을 넣어 잘 혼합한 후 암실에서 30분간 반응시켜 분광광도계(Hitachi U-2900, Japan)로 528 nm에서 흡광도를 측정한 후 아래 식에 대입하여 산출하였다. 이때 활성 비교를 위하여 항산화제로 주로 사용되고 있는 합성 항산화제 BHT(Butylated hydroxytoluene)를 0.05% 농도로 첨가하여 시료와 동일한 방법으로 흡광도를 측정하여 양성 대조군으로 이용하였다.

DPPH 자유 라디칼 소거 활성(%)=[1-(A/B)x100]

A : 528 nm에서 시료 첨가된 DPPH 용액의 흡광도

B : 528 nm에서 시료 무첨가 DPPH 용액의 흡광도

실험으로부터 얻어진 결과는 one-way ANOVA 검정에 의한 평균치와 표준 오차(mean±SE)로 표시하였고, 각 실험 군 간의 유의성 검증은 던칸 다중검정(Duncan's multiple range tes)을 통해 분석하였다.

그 결과, 본 발명의 락토바실러스 펜토서스 OKBL-L.PE 1 균주는 음성 대조군(MRS 배지) 대비 우수한 항산화 활성을 가지고 있음을 확인하였으며, 균주 배양액(L.PE_O) 및 배양액+균체(L.PE_A)가 균주의 균체(L.PE_I)보다 항산화 활성이 우수한 것을 확인하였다(도 1).

실시예 4. 항염 활성 분석

(1) 리폭시게나아제 저해 활성 측정

리폭시게나아제(lipoxygenase)는 정상적인 세포에서는 활성이 미비하지만, 염증이 유발되면 류코트리엔(leukotrienes) 물질의 증가로 인해 활성이 증가한다. OD₆₀₀=1.0의 균주 배양액 100 ㎕에 200 mM 보레이트 완충액(borate buffer, pH 9.0) 1 ㎖을 넣은 후, 기질인 리놀렌산(linoleic acid, 0.6 mM/㎖ in ethanol) 2 ㎖을 추가하여 혼합한 후 234 nm에서 보정값을 측정하였다. 이후, 상기 혼합물에 10,000 unit/㎖의 리폭시게나아제 100 ㎕를 넣고 상온에서 10분간 반응시킨 후 234 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군은 인도메타신(indomethacin, IDM)을 0.1%(w/v)로 에탄올에 녹여서 사용하였다. 리폭시게나아제 억제 활성(%)은 다음과 같은 식에 의해 산출되었다.

리폭시게나아제 억제 활성(%)={1-(b'-b)/(a'-a)}x100

a: 효소 무첨가군

a': 효소 첨가군

b: 효소 무첨가 및 시료 첨가군

b': 효소 및 시료 첨가군

그 결과, 본 발명의 락토바실러스 펜토서스 OKBL-L.PE 1 균주는 음성 대조군(MRS 배지) 대비 현저한 리폭시게나아제 저해 활성을 가지고 있음을 확인하였으며, 비교군인 락토바실러스 퍼멘텀 및 락토바실러스 플란타룸 배양액의 저해 활성보다도 우수함을 확인하였다(도 2).

(2) NO 생성 억제율 측정

락토바실러스 펜토서스 OKBL-L.PE 1 균주의 항염 활성을 분석하기 위하여 LPS(lipopolysaccharide)로 염증이 유도된 RAW 264.7 세포에서의 NO 생성 억제율을 측정하였다. RAW 264.7 세포는 한국세포주은행(KCLB, Korea)에서 구입하여 사용하였으며 10% FBS 및 페니실린-스트렙토마이신을 첨가한 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하여 이후 실험에 사용하였다. RAW 264.7 세포를 24웰 플레이트에 1x10⁴ 세포/웰로 24시간 동안 배양한 후, 본 발명의 균주 배양액(L.PE_O)을 10%로 전처리한 다음 LPS(1 ㎍/㎖)를 처리하고 24시간 동안 반응시켰다. 이후, 세포 배양액 100 ㎕를 취하여 그리스 시약(1% 설폰산, 0.1% N-1-나프틸 에틸렌 디아민이염산염, 2.5% 인산)과 반응시켜 마이크로플레이트 리더로 546 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 락토바실러스 펜토서스 OKBL-L.PE 1 균주 배양액(L.PE_O)은 LPS 처리에 의한 NO의 생성을 억제하는 효과가 있음을 확인하였다(도 3).

실시예 5. 피부 미백 활성 분석

락토바실러스 펜토서스 OKBL-L.PE 1 균주의 피부 미백 활성을 분석하기 위하여 in vitro 머쉬룸 티로시나아제(mushroom tyrosinase) 저해 활성을 측정하였다. 1.5 ㎖ 플라스틱 큐벳(plastic cuvette)에 2.5 mM L-DOPA(3,4-dihydroxyphenylalanine) 0.3㎖, 본 발명의 균주 배양액(L,PE_O) 0.1 ㎖ 및 0.1 M 인산완충용액(pH 6.8)을 혼합하여 25℃에서 반응시켰다. 이후, 1,380 units/㎖ 머쉬룸 티로시나아제(Sigma, USA) 0.05 ㎖을 넣고 25℃에서 2분간 반응시켜 분광광도계를 이용하여 470 nm에서 흡광도를 측정한 후 하기식에 대입하여 티로시나아제 저해 활성을 산출하였다. 대조구는 시료가 들어있지 않는 시료 용해 용액을 사용하였고, 양성 대조군으로는 티로시나아제 저해제로 알려진 0.05% 알부틴(Arbutin)을 사용하였다.

티로시나아제 저해 활성(%)=100-[(A-B)/A]x100

A : 시료가 들어있지 않은 반응액의 0.5~1분 사이의 흡광도 차이

B : 시료가 들어있는 반응액의 0.5~1분 사이의 흡광도 차이

그 결과, 본 발명의 락토바실러스 펜토서스 OKBL-L.PE 1 균주 배양액(L.PE_O)은 양성 대조군(0.05% 알부틴)보다 우수한 티로시나아제 저해 활성을 가지고 있음을 확인하였으며, 비교군인 락토바실러스 퍼멘텀 및 락토바실러스 플란타룸의 배양액보다도 티로시나아제 저해 활성이 우수함을 확인함으로써 락토바실러스 펜토서스 OKBL-L.PE 1 균주 배양액(L.PE_O)이 피부 미백 활성이 있음을 알 수 있었다(도 4).

실시예 6. 항균 활성 분석

본 발명의 락토바실러스 펜토서스 OKBL-L.PE 1 균주의 항균 활성을 분석하기 위하여 장출혈성 대장균인 에스케리키아 콜리(Escherichia coli, E.coli) O157:H7(ATCC 43894)를 American Type Culture Collection으로부터 분양받아 디스크 확산법을 이용하여 항균 활성을 측정하였다. E.coli를 LB(Luria-Bertani) 액체 배지에서 37℃, 24시간 동안 배양한 후, 배양액 200 ㎕를 LB 고체 배지에 도말하고 멸균된 10 ㎜ 페이퍼 디스크를 고체 배지위에 올려놓았다. 이후, 락토바실러스 펜토서스 OKBL-L.PE 1 균주 배양액(L.PE_O) 을 상기 페이퍼 디스크에 처리하고 37℃에서 24시간 동안 배양한 다음 페이퍼 디스크 주변의 억제환(clear zone)을 관찰하였다.

그 결과, 본 발명의 락토바실러스 펜토서스 OKBL-L.PE 1 균주 배양액(L.PE_O)은 비교군인 락토바실러스 퍼멘텀 및 락토바실러스 플란타룸의 배양액보다 E.coli에 대한 항균 활성이 우수한 것을 확인하였다(도 5).

실시예 7. 항혈전 활성 분석

본 발명의 락토바실러스 펜토서스 OKBL-L.PE 1 균주의 항혈전 활성을 분석하기 위하여 혈액을 응고시키는 피브린노겐(fibrinogen) 용해능을 측정하였다. 0.6% 피브리노겐(Sigma, USA)을 0.05 M 붕산나트륨(sodium borate) 버퍼(pH 7.5)에 첨가하여 37℃에서 1시간 동안 용해시킨 후 페트리 디쉬에 10 ㎖씩 분주하고, 1,000 units의 트롬빈(Sigma, USA)을 40 units/㎖의 농도로 희석한 후 총 20 unit이 되도록 페트리 디쉬에 처리하여 균일하게 혼합되도록 잘 흔들어주었다. 이후, 약 15분 동안 굳혀 피브린 응고물(fibrin clot)을 형성시켜 실험에 사용하였다. 상기 피브린 응고물이 형성된 페트리 디쉬에 페이퍼 디스크를 올려두고, OD₆₀₀=1.0의 균주 배양액(L.PE_O) 50 ㎕를 점적하여 37℃ 배양기에서 반응시킨 후 피브린이 용해되어 생기는 투명대(clear zone)을 관찰하였다.

그 결과, 본 발명의 락토바실러스 펜토서스 OKBL-L.PE 1 균주 배양액(L.PE_O)은 비교군인 락토바실러스 퍼멘텀 및 락토바실러스 플란타룸의 배양액보다 항혈전 활성이 우수한 것을 확인하였다(도 6).

한국미생물존센터(국외)

KCCM12791P

20200918

<110> OKBIOLAND Co., Ltd. <120> Lactobacillus pentosus OKBL-L.PE 1 strain having antioxidant activity, anti-inflammatory activity, skin whitening activity, antimicrobial activity against pathogenic microorganism and anti-thrombotic activity and uses thereof <130> PN20310 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1452 <212> DNA <213> Lactobacillus pentosus <400> 1 ccagcgctgc taactgcagt cgacgaactc tggtattgat tggtgcttgc tcatgattta 60 catttgagtg agtggcgaac tggtgagtaa cacgtgggaa acctgcccag aagcggggga 120 taacacctgg aaacagatgc taataccgca taacaacttg gaccgcatgg tccgagtttg 180 aaagatggct tcggctatca cttttggatg gtcccgcggc gtattagcta gatggtgggg 240 taacggctca ccatggcaat gatacgtagc cgacctgaga gggtaatcgg ccacattggg 300 actgagacac ggcccaaact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc acaatggacg 360 aaagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaagggtt tcggctcgta aaactctgtt 420 gttaaagaag aacatatctg agagtaactg ttcaggtatt gacggtattt aaccagaaag 480 ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat 540 ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggtt ttttaagtct gatgtgaaag ccttcggctc 600 aaccgaagaa gtgcatcgga aactgggaaa cttgagtgca gaagaggaca gtggaactcc 660 atgtgtagcg gtgaaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggctgtct 720 ggtctgtaac tgacgctgag gctcgaaagt atgggtagca aacaggatta gataccctgg 780 tagtccatac cgtaaacgat gaatgctaag tgttggaggg tttccgccct tcagtgctgc 840 agctaacgca ttaagcattc cgcctgggga gtacggccgc aaggctgaaa ctcaaaggaa 900 ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcta cgcgaagaac 960 cttaccaggt cttgacatac tatgcaaatc taagagatta gacgttccct tcggggacat 1020 ggatacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080 caacgagcgc aacccttatt atcagttgcc agcattaagt tgggcactct ggtgagactg 1140 ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg 1200 ggctacacac gtgctacaat ggatggtaca acgagttgcg aactcgcgag agtaagctaa 1260 tctcttaaag ccattctcag ttcggattgt aggctgcaac tcgcctacat gaagtcggaa 1320 tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380 gcccgtcaca ccatgagagt ttgaacaccc aaagtcgggg ggaaccttta gaaccaccgc 1440 tagggacgag gg 1452

Claims

항산화 활성, 항염 활성, 피부 미백 활성, 항균 활성 및 항혈전 활성을 가지는 기탁번호가 KCCM12791P인 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주.
제1항의 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 그람 음성균에 대한 항균용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 그람 음성균은 에스케리키아 콜리(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 항균용 조성물.
제1항의 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 발효식품 제조용 스타터(starter) 조성물.
제1항의 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 프로바이오틱 조성물.
제1항의 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 혈전증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제1항의 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항의 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus) OKBL-L.PE 1 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 사료첨가제 조성물.