KR102457506B1

KR102457506B1 - 여드름 유발 균주에 대한 항균 활성을 갖는 락토바실러스 펜토수스 srcm216971 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102457506B1
Application number: KR1020220070310A
Authority: KR
Inventors: 조승화; 박슬기; 임은정; 강현진; 조성호; 정도연; 유강열
Original assignee: 재단법인 발효미생물산업진흥원
Priority date: 2022-06-09
Filing date: 2022-06-09
Publication date: 2022-10-20

Abstract

본 발명은 항산화 활성 및 항균 활성을 가지며, β-글루코시다아제 및 프로테아제 효소를 분비하는 토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM216971 균주(기탁번호: KCCM13145P); 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물, 상기 균주를 이용한 뽕잎 발효물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 뽕잎 발효물에 관한 것이다.

Description

여드름 유발 균주에 대한 항균 활성을 갖는 락토바실러스 펜토수스 SRCM216971 균주 및 이의 용도{Lactobacillus pentosus SRCM216971 strain having antimicrobial activity against acne-causing strain and uses thereof}

본 발명은 항산화 활성 및 항균 활성을 가지며, β-글루코시다아제 및 프로테아제 효소를 분비하는 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM216971 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

여드름균(Propionibacterium acnes)은 여드름의 원인균으로 알려져 있고, 피지의 과잉분비와 세포각질의 과다와 축척으로 인해 피지가 모낭속에 남게 되면 모낭의 모루두에 존재하는 피부상주균인 여드름균과 피부포도상구균이 증가하고 이들 균의 지질분해 효소인 리파아제가 피지를 구성하고 있는 지질 중에 트라이글리세라이드를 분해해서 유리지방산으로 변화시킨다. 여드름균은 유리지방산이 모낭벽이나 모공주위의 세포들을 자극해 염증을 일으키고 그 결과 과각화되어 어느 순간 막혀 초기 면포가 생성된다. 유리지방산이 염증을 증폭할 수 있는 효소를 생산하고 이 효소의 작용으로 백혈구가 분해하고 파열된 모낭속의 내용물이 진피 속에 들어가 염증을 일으켜 여드름이 유발된다.

뽕잎(Mulberry leaf)은 뽕나무과(Moraceae)의 뽕나무(Morus)속에 속하는 식물의 잎으로 수 천년 전부터 누에의 먹이로 쓰여 왔지만, 생약재로도 민간요법에 이용되어 왔고, 최근에는 인체에 유용한 영양성분 및 생리활성성분에 관한 연구가 진행됨으로서 기능성 식품으로서 각광을 받고 있다.

뽕잎에는 수분, 탄수화물, 단백질(25~35%) 및 25종의 아미노산이 들어 있으며, 그 중 뇌의 혈액순환과 노인성 치매를 예방해주는 세린과 타이로신 성분이 각각 1.2%와 0.8% 수준으로 함유되어 있고, 지질함량은 3.5% 정도로 대부분의 지방산이 불포화지방산으로 식물성 스테롤이 0.08% 함유되어 있어 혈중콜레스테롤 함량을 감소시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 글루탐산(glutamic acid)과 아스파르트산(aspartic acid)이 많이 함유되어 있으며, 녹차에 비하여 무기질 중 칼슘, 철분, 칼륨과 식이섬유가 월등히 많이 존재한다. 뽕잎의 생리활성으로는 혈중지질 억제효과, 혈당강하효과, 중금속 흡착억제 및 해독효과와 항산화효과가 있으며, 생리활성으로 밝혀진 성분은 혈압을 떨어뜨리는 가바(GABA), 모세관 혈관을 강화시키고 특히 뇌 속의 출혈을 예방하는 작용을 하는 루틴(Rutin), 항산화작용뿐만 아니라 이뇨작용과 항모세관 투과작용이 탁월한 플라보노이드 화합물 등이 있다. 이러한 뽕잎은 녹차나 커피에 비하여 카페인이 소량 함유되어 있고, 떫은맛 성분도 적어서 오랫동안 우리거나 끓여서 차로 이용할 수 있고, 국수, 냉면, 절편, 송편, 과자, 아이스크림, 빵 등에도 이용되고 있다.

한국등록특허 제1796500호에는 김치로부터 분리한 락토바실러스 펜토서스 GFC03 균주가 개시되어 있고, 한국등록특허 제2248398호에는 베타-글루코시다제 및 알파-람노시다제 활성을 동시에 갖는 락토바실러스 펜토서스 NGI01 균주가 개시되어 있으나, 본 발명의 여드름 유발 균주에 대한 항균 활성을 갖는 락토바실러스 펜토수스 SRCM216971 균주와는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 발효식품으로부터 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM216971 균주를 분리하였고, 상기 균주는 항산화 활성을 가지며, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)와 여드름 원인균인 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성을 가지며, 효소를 분비함을 확인하였다.

또한, 상기 균주를 뽕잎 발효를 위한 스타터 균주로 이용하여 뽕잎 발효물을 제조한 결과, 항산화 활성 및 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성과 총 페놀 및 플라보노이드 함량을 증가하는 것을 확인하여, 건강기능식품 및 화장품의 용도로 중요하게 사용될 수 있는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 항산화 활성 및 항균 활성을 가지며, β-글루코시다아제 및 프로테아제 효소를 분비하는 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM216971 균주(기탁번호: KCCM13145P)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 뽕잎 발효용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 뽕잎에 물을 첨가하고 추출한 후 살균하여 뽕잎 추출물을 제조하는 단계; (2) 상기 (1)단계의 제조한 뽕잎 추출물에 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM216971 균주(기탁번호: KCCM13145P)를 접종하는 단계; 및 (3) 상기 (2)단계의 접종한 뽕잎 추출물을 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성을 가지는 뽕잎 발효물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성을 가지는 뽕잎 발효물을 제공한다.

또한, 본 발명은 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성을 가지는 뽕잎 발효물을 유효성분으로 함유하는 여드름 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성을 가지는 뽕잎 발효물을 유효성분으로 함유하는 여드름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에서는 발효식품으로부터 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM216971 균주를 분리하였고, 상기 균주가 항산화 활성과 다양한 병원균 및 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)의 여드름 원인균에 대해 항균 활성을 가지며, 효소를 분비하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 분리한 락토바실러스 펜토수스 SRCM216971 균주를 이용한 뽕잎 발효물은 여드름 치료제로서 이용가능하므로, 기능성 식품 및 화장료 조성물로 관련 산업에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 선발된 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하여 GenBank에 등록되어 있는 유산균들과 상동성을 분석한 것이다.
도 2는 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM216971 균주의 배양시간에 따른 생균수를 비교한 그래프이다.
도 3은 배지조건에 따른 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM216971 균주의 생균수를 비교한 그래프이다.
도 4는 영양원 조건에 따른 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM216971 균주의 생균수를 비교한 그래프이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항산화 활성 및 항균 활성을 가지며, β-글루코시다아제 및 프로테아제 효소를 분비하는 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM216971 균주(기탁번호: KCCM13145P)를 제공한다.

본 발명에 따른 락토바실러스 펜토수스 SRCM216971 균주는 뽕잎 발효 시 항산화 활성 및 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성과 총 페놀 및 플라보노이드 함량을 증진시킬 수 있어, 뽕잎 발효에 적합한 균주로 선발한 것이다.

상기 선발된 본 발명의 SRCM216971 균주는 16S rRNA 영역의 염기서열 분석을 실시한 결과, 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus)로 동정되었다.

본 발명의 균주 락토바실러스 펜토수스 SRCM216971 균주를 한국미생물보존센터에 2022년 03월 17일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM13145P).

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 항균 활성은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 기재된 "항균 (antimicrobial)"의 의미는 어떤 농도에서 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 유해미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 유해미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 조성물은 바람직하게는 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제, 화장품 또는 의약품 형태일 수 있고, 상기 식품은 유제품(우유, 두유, 가공우유), 발효유(액상 요구르트, 호상 요구르트), 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 락토바실러스 펜토수스 SRCM216971 균주를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 균주를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.

본 발명의 상기 락토바실러스 펜토수스 SRCM216971 균주를 사료 첨가제로 사용할 경우, 사료 첨가제는 기초사료에 일정 비율로 첨가하는 것이다. 상기 기초사료는 주성분이 옥수수, 대두박, 유청, 어분, 당밀, 소금, 비타민 프리믹스 및 미네랄 프리믹스 등으로 이루어질 수 있다. 비타민 프리믹스는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 리보프라빈 및 나이아신으로 구성될 수 있으며, 미네랄 프리믹스는 망간, 철, 아연, 칼슘, 구리, 코발트 및 셀레니늄 등으로 구성될 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 의약품을 제공한다. 상기 의약품은 항균물질을 함유하고 있으므로 유해 세균에 의한 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 균주는 바람직하게는 락토바실러스 펜토수스 SRCM216971 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 뽕잎 발효용 조성물을 제공한다.

상기 균주가 항산화 활성 및 항균 활성을 가지며, 효소를 분비하는 특징을 가지며, 뽕잎 발효 시 항산화 활성 및 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성과 총 페놀 및 플라보노이드 함량을 증진시킬 수 있어, 뽕잎 발효의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 또한,

(1) 뽕잎에 물을 첨가하고 추출한 후 살균하여 뽕잎 추출물을 제조하는 단계;

(2) 상기 (1)단계의 제조한 뽕잎 추출물에 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM216971 균주(기탁번호: KCCM13145P)를 접종하는 단계; 및

(3) 상기 (2)단계의 접종한 뽕잎 추출물을 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성을 가지는 뽕잎 발효물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 뽕잎 발효물의 제조방법은, 보다 구체적으로는

(1) 뽕잎에 물을 8~12배(v/w) 첨가하고 95~100℃에서 2~4시간 동안 추출한 후 여과하고 95~105℃에서 8~12분 동안 살균하여 뽕잎 추출물을 제조하는 단계;

(2) 상기 (1)단계의 제조한 뽕잎 추출물에 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM216971 균주(기탁번호: KCCM13145P)를 0.5~1.5%(w/w) 접종하는 단계; 및

(3) 상기 (2)단계의 접종한 뽕잎 추출물을 35~40℃에서 1~3일 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있으며,

더욱 구체적으로는

(1) 뽕잎에 물을 10배(v/w) 첨가하고 95~100℃에서 3시간 동안 추출한 후 여과하고 100℃에서 10분 동안 살균하여 뽕잎 추출물을 제조하는 단계;

(2) 상기 (1)단계의 제조한 뽕잎 추출물에 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM216971 균주(기탁번호: KCCM13145P)를 1%(w/w) 접종하는 단계; 및

(3) 상기 (2)단계의 접종한 뽕잎 추출물을 37℃에서 2일 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성을 가지는 뽕잎 발효물을 제공한다.

본 발명은 또한, 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성을 가지는 뽕잎 발효물을 유효성분으로 함유하는 여드름 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 건강기능식품은 여드름을 예방하거나 개선하기 위해 섭취할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 뽕잎 발효물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다.

그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 식품은 기능성 식품을 포함할 수 있는데, 본 발명의 기능성 식품에는 상기 유효성분 외에도 필요에 따라 다양한 보조성분을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품의 경우, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B12, 엽산 (folic acid), 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E 등의 비타민류와, 구리, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 아연 등의 미네랄 또는 유산균 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 뽕잎 발효물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 혼합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

또한, 본 발명은 상기 피부염 원인균에 대한 항균 활성을 가지는 뽕잎 발효물을 유효성분으로 함유하는 여드름 또는 아토피 피부염의 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 여드름 또는 아토피 피부염 개선용 화장료 조성물에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부외용연고, 크림, 유연화장수, 영양화장수, 팩, 에센스, 헤어토닉, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 트리트먼트, 젤, 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 마사지 크림, 영양크림, 아이크림, 모이스처 크림, 핸드 크림, 파운데이션, 영양에센스, 선스크린, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디 로션 및 바디 클렌저로 이루어지는 군으로부터 선택된 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 각 제형의 조성물은 그 제형의 제제화에 필요하고 적절한 각종의 기제와 첨가물을 함유할 수 있으며, 이들 성분의 종류와 양은 당업자에 의해 용이하게 선정될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

이하, 본 발명의 실시예를 들어 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 뽕잎 발효물 제조

뽕잎에 정제수를 10배(v/w) 첨가하고 95~100℃에서 3시간 동안 추출한 후 여과하고 100℃에서 10분 동안 살균하여 뽕잎 추출물을 제조하였다. 상기 제조한 뽕잎 추출물을 40℃ 이하로 냉각하고, 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM216971 균주(기탁번호: KCCM13145P)를 1%(w/w) 접종한 후 37℃에서 2일 동안 발효하였다.

재료 및 방법

1. 유산균의 분리 및 배양조건

국내에 있는 가정에서 담근 전통식 된장, 간장, 고추장, 누룩, 배추김치, 막걸리 등의 시료 100여 종을 근원 시료로 사용하였다. 각각의 시료 1 g을 멸균생리식염수 9 mL에 단계 희석하여 MRS 아가(DifcoTM, MI, USA) 배지에 100 ㎕를 도말하여 30℃에서 48시간 배양하였다. 각각의 배양한 미생물에서 집락형태가 상이한 균주를 선별하여 순수분리하였으며, 선별 균주는 10% 스킴 밀크(Difco TM)에 재부유하고 -80℃에 보관하여 사용하였다.

2. 선별 균주의 동정 및 계통수 작성

선별 균주를 마크로젠(Seoul, Korea)에 16S rDNA sequence 분석을 의뢰하였고, 분석된 염기서열은 NCBI의 data base와 비교하여 동정하였다. 16S rRNA 염기서열 분석을 위해 universal 프라이머인 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'; 서열번호 2)와 1492R (5'-GGTTAC CTTGTTACGACTT-3'; 서열번호 3)을 사용하여 유전자를 증폭 후 염기서열을 해독하였다. 염기서열의 크로마토그램을 이용하여 갭을 최소화한 후 NCBI에서 서열 일치도가 높은 표준 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열을 확보하여 계통도를 작성하였다. 계통도 분석은 tamura-Nei 모델에 기초한 maximum likelihood 방법을 사용하여 분석하였고, 산출한 각각의 계통수에서 각 분지에 대한 통계학적 신뢰도를 산출하기 위해 bootstrap 분석을 1,000회 실행하였으며, 분석은 MEGA 7.0.26 program을 사용하였다.

3. 용혈성 및 효소활성 측정

선별된 균주의 용혈성 확인을 위해 혈액 아가 베이스(BD, Difco)에 5% 염소 혈액(MBcell, Korea)을 첨가하여 혈액 아가 배지를 제조하였다. 선별 균주는 획선 도말하여 37℃에서 24시간 배양 후 균체 주위에 생기는 환의 형태로 α, β 및 γ 용혈성을 확인하였다.

β-글루코시다아제 활성 분석은 1.5% LB agar와 Esculin Iron agar를 멸균 후 1:1 비율로 혼합하여 배지 제조 후 플레이트에 획선도말하여 30℃에서 24시간 배양하였다. 콜로니 주변에 black complex 형성 정도에 따라 정성적으로 활성을 -, +,++,+++ 등으로 표기하였다. 프로테아제 활성 분석은 2% skim milk agar plate를 제작(90 mm 페트리디쉬에 25 mL 첨가)하여 플레이트에 8 mm 홀(hole)을 형성한 후 균주 배양상등액(LB or TSB) 100 ㎕를 로딩하고 말린 후 30℃에서 24시간 배양한 후 홀 주변에 형성된 환의 크기를 측정하여 프로테아제 활성을 분석하였다.

4. 항균 활성 측정

항균 활성은 디스크확산법(paper disc method)을 이용하여 조사하였다. 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 10798, 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) KCTC1056, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) KCCM 11593, 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) KCTC34440, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) ATCC11778에 대한 선별 균주의 항균력을 조사하였다. 선별 균주를 37℃에서 24시간 배양한 후 0.4 ㎛ 멤브레인 필터(Millipore, Membrane filter, Ireland)를 이용하여 제균한 상등액을 시료로 사용하여 항균력을 측정하였다. 각각의 지시균주가 10⁵ CFU/ml로 도말된 고체배지에 8 mm 직경의 페이퍼 디스크(Advantec, Tokyo, Japan)를 놓고 시료 100 ㎕씩 분주하여 생육저지환을 측정하였다.

5. 프로피오니박테리움 아크네스( Propionibacterium acnes )에 대한 항균 활성 측정

여드름의 원인으로 알려진 프로피오니박테리움 아크네스에 대한 항균 활성을 측정하기 위해 well diffusion method를 이용하였다. 여드름균은 BHI broth(Difco Co., USA) 배지에 접종하여 37℃, 혐기조건에서 2일간 정치 배양하였고 600 nm에서 흡광도값을 0.6으로 조정하여 사용하였다. 흡광도 값을 조정한 여드름균 배양액은 멸균된 면봉을 이용하여 BHI agar 배지에 도말하였고, 지정된 위치에 8 mm의 구멍을 뚫어주었다. 그 구멍에 배양 상등액 100 ㎕를 분주하여 30분 동안 흡수시킨 뒤 37℃, 혐기조건에서 2일간 정치 배양하였다. 배양 후 웰(well) 주변에 형성된 투명환의 직경(mm)를 측정하여 나타내었다.

6. 유산균을 활용한 뽕잎 발효물 제조

선발된 균주를 화장품소재로 이용하고자 천연물별 테스트를 한 결과 소재로 뽕잎이 선정되었다(데이터 미제시). 뽕잎 발효물은 고형분 대비 10배를 가수하고 환류냉각기를 이용하여 열수추출하여 추출물을 획득하였다. 이 추출물은 Whatman No.2로 여과하고 이를 100℃에서 10분간 가열 살균하여 냉각한 후 이에 선별된 유산 균주 5종을 1%씩 접종하여 37℃에서 2일간 발효하여 각각의 뽕잎 발효물을 제조하였다.

7. 뽕잎 발효물의 품질 분석

1) pH 및 총 산도

pH는 pH 미터(SevenMulti, Mettler Toledo GmBH, Germany)를 사용하여 측정하였으며, 총 산도는 시료 1 mL에 0.1N NaOH를 첨가하여 pH 8.3까지 도달할 때까지 소모된 양을 lactic acid(f=0.009) 함량으로 산출하였다.

총 산도(%) = {(V×F×A×D)/S}×100

V: 0.1 N-NaOH 용액의 적정치 소비량 (mL)

F: 0.1 N-NaOH 용액의 역가

A: 0.1 N-NaOH 용액 1 mL에 상당하는 유기산의 양 (g) (젖산 : 0.009)

D: 희석배수

S: 시료의 채취량 (g)

2) 유산균 생균수 측정

유산균 생균수를 측정하기 위하여 시료 1 mL를 취하여 9 mL 멸균수에 단계희석한 다음, MRS 고체배지에 도말하였다. 30℃에서 48시간 배양한 다음 콜로니를 계수하여 측정하였다. 추출물에 각각의 유산균 초기접종량을 약 6 log CFU/mL로 맞춰 접종한 다음, 발효 후 생균 수를 측정하였다.

3) 항산화 활성

(1) 시료 전처리

발효물을 원심분리(10,000 ×g, 20분, 4℃)하여 0.45 ㎛ 멤브레인 필터에 통과시킨 후 사용하였다.

(2) DPPH 라디칼 소거능

DPPH 라디칼 소거능은 시료 50 ㎕에 100 μM DPPH 라디칼 용액 150 ㎕를 첨가하여 암실에서 30분간 반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였으며 대조구로는 L-아스코르브산을 사용하였다. DPPH 라디칼 소거능은 다음의 식에 의하여 얻어진 결과에서 산출하여 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거능(%) = (대조구 흡광도 - 시료 흡광도/대조구 흡광도)×100

(3) ABTS 라디칼 소거능

ABTS 라디칼 소거능 측정에 사용된 ABTS 라디칼 용액은 7 mM ABTS 용액과 2.45 mM 과황산칼륨(potassium persulfate)을 혼합한 후 16시간 동안 암실에서 반응시킨 뒤 생성된 ABTS 라디칼 용액을 95% 에탄올과 적절하게 혼합하여 734 nm에서 흡광도가 0.70±0.02가 되도록 조절하여 사용하였다. 시료 20 ㎕에 ABTS 라디칼 용액 180 ㎕를 첨가하여 암실에서 2분간 반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였으며 대조구로는 L-아스코르브산을 사용하였다. ABTS 라디칼 소거능은 다음의 식에 의하여 얻어진 결과에서 산출하여 나타내었다.

ABTS 라디칼 소거능(%) = (대조구 흡광도 - 시료 흡광도/대조구 흡광도)×100

(4) 총 페놀 함량

총 페놀 함량은 Folin-Denis 변법에 따라 추출된 시료를 농도별로 적절히 희석한 후 측정하였다. 각 농도별 시료 200 ㎕에 Folin-Ciocalteu reagent 12.5 ㎕를 혼합하여 교반한 뒤, 60분 동안 상온에서 방치하여 반응시켰다. 반응액의 흡광도 값은 765 nm에서 분석하였다. 총 페놀 함량은 gallic acid 분석 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선으로부터 시료 추출물의 총 페놀 함량을 산출하였고, 총 폴리페놀 함량은 1 mL 중의 ㎍ gallic acid equivalent(GAE)로 나타내었다.

(5) 총 플라보노이드 함량

총 플라보노이드 함량은 Davis 변법에 따라 추출된 시료를 농도별로 적절히 희석한 후 측정하였다. 각 농도별 시료 0.5 mL에 10% 질산알루미늄(aluminum nitrate) 0.1 mL, 1M 아세트산칼륨(potassium acetate) 0.1 mL 및 에탄올 4.3 mL를 차례로 가하여 혼합한 후 상온에서 40분간 방치하여 반응시켜 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로는 퀘르세틴(Quercetin)을 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선으로부터 시료 추출물의 총 플라보노이드 함량을 산출하였고, 총 플라보노이드 함량은 1 mL 중의 ㎍ quercetin equivalent(QE)로 나타내었다.

8. 선발된 균주의 배양조건 확립

1) 균주 전배양

균주의 본배양에 앞서 seed culture를 위한 전배양을 다음과 같이 진행하였다. MRS broth 5 mL에 균주를 1 백금 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였고, 그 후 OD₆₀₀nm를 측정하여 0.6 Abs가 되도록 희석한 후 이를 1차 전배양액으로 하였고, MRS broth 100 mL에 1차 전배양액을 1% 접종하여 37℃에서 24시간 배양하여 이를 2차 전배양액으로 하였다.

2) 생장패턴 확인

균주의 생장패턴을 확인하기 위하여 다음과 같이 진행하였다. MRS broth 250 mL에 2차 전배양을 1% 접종한 후, 0시간부터 48시간까지 3시간 간격으로 생균수(CFU/mL) 및 OD₆₀₀nm를 측정하였고, 그 결과로 생장곡선을 확인하였다.

3) 탄소원 및 질소원 조건에 따른 균주 배양

탄소원 및 질소원의 조건에 따른 균주의 배양 조건 설정을 표 1과 같이 진행하였다. 뽕잎 100% 열수추출물에 조건별(M1~M16)로 탄소원 질소원을 첨가한 배지 20 mL에 균주 전배양액 200 ㎕씩 접종한 후 37℃에서 배양한 후 생균수를 확인하였고 배양시간은 앞서 실험한 생장곡선 실험에서 대수기가 끝나는 시점(21시간)으로 잡았고, 보편적으로 사용되고 있는 배지인 MRS broth(Control)와 함께 비교실험을 진행하였다.

탄소원 및 질소원 조건에 따른 배지 조성

	Glucose				Yeast extract
	0.5%	1%	2%	3%	0.2%	0.5%	0.7%	1%
M1	+	-	-	-	+	-	-	-
M2	+	-	-	-	-	+	-	-
M3	+	-	-	-	-	-	+	-
M4	+	-	-	-	-	-	-	+
M5	-	+	-	-	+	-	-	-
M6	-	+	-	-	-	+	-	-
M7	-	+	-	-	-	-	+	-
M8	-	+	-	-	-	-	-	+
M9	-	-	+	-	+	-	-	-
M10	-	-	+	-	-	+	-	-
M11	-	-	+	-	-	-	+	-
M12	-	-	+	-	-	-	-	+
M13	-	-	-	+	+	-	-	-
M14	-	-	-	+	-	+	-	-
M15	-	-	-	+	-	-	+	-
M16	-	-	-	+	-	-	-	+
Control	MRS broth

4) 기타영양원 조건에 따른 균주 배양

탄소원 및 질소원 외 기타영양원의 추가에 따라 균주의 배양 정도를 파악하기 위해 표 2와 같이 조건을 설정하여 진행하였다. 조건별로 제조한 배지(E1~E8) 20 mL에 전배양을 1% 접종한 후 37℃에서 21시간 배양한 후 생균수를 측정하였다.

기타영양원 조건에 따른 배지 조성(%)

	E1	E2	E3	E4	E5	E6	E7	E8
Glucose	2	2	2	2	2	2	2	2
Yeast extract	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5	0.5
Manganese sulfate monohydrate	-	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05	0.05
Magnesium sulfate heptahydrate	-	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1	0.1
Ammonium sulfate	-	-	0.2	-	-	0.2	-	0.2
Potassium phosphate monobasic	-	-	-	0.2	-	0.2	0.2	0.2
Ammonium phosphate dibasic	-	-	-	-	0.2	-	0.2	0.2

실시예 1. 5종 균주의 용혈성 및 효소활성 측정

선별된 5종의 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) 균주의 용혈성 및 효소 활성을 측정한 결과, 모든 균주는 β-글루코시다아제 효소 활성이 있는 것으로 나타났고, SRCM216971 균주는 프로테아제 활성이 가장 우수한 것을 확인되었다.

선별균주의 용혈성 및 효소활성

Strains	Enzyme activity(size: cm)
Strains	Hemolysis	β-glucosidase	α-amylase	Cellulase	Protease
23(Lactobacillus pentosus)	-	+	-	-	1.0
25(Lactobacillus pentosus)	-	+	-	-	1.1
Lactobacillus pentosus SRCM216971	-	+	-	-	1.5
87(Lactobacillus pentosus)	-	+	-	-	-
91(Lactobacillus pentosus)	-	+	-	-	1.0

실시예 2. 항균 활성 측정

선별된 5종의 균주의 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성을 확인한 결과, SRCM216971 균주는 상기 5종의 유해균에 대해 항균 활성이 가장 높은 것으로 확인하였다.

선별된 균주의 항균 활성

Strains	Antibacterial activity(size: cm)
Strains	B. cereus	E. coli	M. luteus	S. aureus	P. acnes
23	1.4	1.2	1.3	1.4	1.2
25	1.2	1.0	1.4	1.4	1.1
Lactobacillus pentosus SRCM216971	2.0	2.0	2.0	2.0	1.6
87	-	-	-	-	1.4
91	1.0	1.2	1.2	1.2	1.4

실시예 1 및 2의 실험 결과, β-글루코시다아제 효소 및 프로테아제 활성과 항균 활성을 보유하고 있는 SRCM216971 균주의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석(서열번호 1)하였으며, 결과를 기반으로 BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) 검색 결과 SRCM209254는 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus)로 판명되었으며, 최종적으로 락토바실러스 펜토수스 SRCM216971로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2022년 03월 17일에 기탁하였다(KCCM13145P).

실시예 3. 균주별 뽕잎 발효물의 품질분석

뽕잎 발효물을 제조하기 위하여 뽕잎 추출조건을 확립하였고(데이터 미제시), 이에 선별된 균주를 적용하여 뽕잎 발효를 진행하였다. 발효 전, 후 품질을 분석한 결과는 하기 표 5와 같다.

모든 균주에서 발효 전, 후 유의적인 pH 감소와 산도 및 생균수의 증가를 보였다. 그 중 SRCM216971 유산균으로 발효하였을 때 발효 전 pH 6.24에서 발효 후 pH 3.58로 가장 많은 감소를 보였고, 산도의 경우 발효 전 0.16%에서 발효 후 1.35%로 가장 많은 유산생성을 나타내었다.

균주별 뽕잎 유산균 발효물의 품질분석

시료	pH		산도(%)		생균수(log CFU/mL)
시료	발효 전	발효 후	발효 전	발효 후	발효 전	발효 후
Control	6.24±0.01^a1)3)	6.24±0.01^a	0.14±0.01^a	0.14±0.01^e	-	-
23	6.25±0.01^a	3.70±0.02^***2)c	0.16±0.01^a	1.21±0.01^***c	6.69	8.89
25	6.24±0.01^a	3.85±0.05^***b	0.15±0.01^a	1.10±0.01^***d	6.58	8.49
SRCM216971	6.24±0.00^a	3.58±0.01^***e	0.16±0.01^a	1.35±0.01^***a	6.74	9.16
87	6.24±0.01^a	3.73±0.01^***c	0.15±0.01^a	1.09±0.03^***d	6.45	8.65
91	6.25±0.01^a	3.62±0.00^***d	0.15±0.00^a	1.27±0.01^***b	6.51	9.00

¹⁾실험 결과는 3회 반복 분석하여 평균±표준편차로 나타냄

²⁾ Levene's t-test를 이용하여 두 집단 간의 평균 차이를 ^*** P<0.001 수준에서 검증함

³⁾Duncan의 다중범위 검정을 이용하여 같은 열의(a, b, c, etc) 유의적 차이를 P<0.05 수준에서 검증함

실시예 4. 선별된 균주를 활용한 뽕잎 발효물의 항산화 활성

균주별 유산발효 후 항산화 활성을 측정한 결과는 표 6과 같다. DPPH 및 ABTS 라디칼 소거능에서 SRCM216971 균주를 사용하였을 때 발효 전 각각 60.59%, 72.29%에서 발효 후 64.53%, 79.50%으로 유의적인 증가를 보였다. 총 페놀 함량 결과에서는 SRCM216971 균주를 이용하였을 때 발효 전 2624.13 ㎍ GAE/mL에서 발효 후 3211.15 ㎍ GAE/mL로 약 18% 정도 증가하였다. 마찬가지로 총 플라보노이드 함량도 SRCM216971 균주를 사용하였을 때 발효 전 2254.12 ㎍ QE/mL에서 발효 후 2880.13 ug QE/mL 으로 약 21% 정도 증가하였다.

1차 선발 유산균을 이용한 뽕잎 유산균 발효물의 항산화 활성

시료	DPPH 라디칼 소거능(%)⁴⁾		ABTS 라디칼 소거능(%)⁵⁾		총 페놀 함량 (㎍ GAE/mL)		총 플라보노이드 함량 (㎍ QCE/mL)
시료	발효 전	발효 후	발효 전	발효 후	발효 전	발효 후	발효 전	발효 후
Control	60.45± 0.33^a1)3)	60.85± 0.72^b	73.85± 0.85^a	74.19± 0.07^a	2540.52± 58.41^a	2596.32± 62.09^c	2230.56± 5.68^a	2235.13± 17.24^c
23	59.93± 1.01^a	58.33± 0.77^c	72.92± 0.56^a	70.51± 1.79^a	2589.53± 48.63^a	2956.52± 43.85^*b	2227.46± 10.75^a	2678.95± 32.16^*b
25	60.36± 0.57^a	57.12± 0.29^c	73.12± 0.33^a	67.15± 0.92^d	2555.66± 33.96^a	2485.12± 21.55^c	2236.77± 9.26^a	2291.58± 56.84^c
SRCM216971	60.59± 0.40^a	64.53± 0.24^**2)a	72.29± 0.35^a	79.50± 0.06^***a	2624.13±37.25^a	3211.15± 44.29^**a	2254.12± 17.52^a	2880.13± 47.76^**a
87	60.41± 0.75^a	61.26± 0.33^b	73.52± 0.40^a	73.24± 0.71^b	2596.05±40.01^a	2814.07± 80.04^*b	2248.08± 21.35^a	2593.03± 136.18^*b
91	61.01± 0.63^a	60.52± 0.41^b	72.88± 0.75^a	70.06± 0.30^c	2615.74± 29.35^a	2548.89± 36.98^c	2314.11± 85.53^a	2396.71± 66.45^c

²⁾ Levene's t-test를 이용하여 두 집단 간의 평균 차이를 ^** P<0.01,^*** P<0.001 수준에서 검증함

⁴⁾양성대조군 Ascorbic acid IC₅₀: 2.79±0.16 ㎍/mL

⁵⁾양성대조군 Ascorbic acid IC₅₀: 8.26±0.23 ㎍/mL

실시예 5. 선별된 균주를 활용한 뽕잎 발효물의 항균 활성

프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 억제활성이 우수하였던 유산균 5종을 선발하여, 뽕잎 열수 추출물에 균주별 유산발효 후 P. acnes에 대해 항균 활성을 확인한 결과를 표 7에 나타내었다. 모든 유산균 발효물에서 20 mm 이상의 억제환이 형성되었다. 그 중, SRCM216971 유산균으로 발효하였을 때 억제환이 24.90 mm로 가장 강한 항균 활성을 나타내었다.

균주별 뽕잎 유산균 발효물의 P. acnes에 대한 항균 활성

시료	clear zone(mm)
시료	발효 전	발효 후
Control	10.90±0.14^a1)3)	10.85±0.07^e
23	10.90±0.14^a	20.90±0.14^***2)c
25	10.95±0.07^a	21.95±0.07^***b
SRCM216971	10.90±0.14^a	24.90±0.14^***a
87	10.95±0.07^a	20.15±0.21^***d
91	10.90±0.14^a	20.85±0.21^***c

³⁾Duncan의 다중범위 검정을 이용하여 같은 열의(a, b, c, etc) 유의적 차이를 P<0.05 수준에서 검증

실시예 6. 선발 유산균의 배양조건 확립

1) 선발 유산균 SRCM216971의 생장곡선

SRCM216971 균주의 생장곡선을 측정한 결과를 도 2에 나타내었다. 생균수는 3~21시간 사이에 급격히 증가하여 21시간에 10.96 log CFU/mL으로 가장 높은 생균수를 나타내었다. 이 후 생균수는 점차 감소하는 경향을 보였다. 따라서 가장 생균수가 높은 21시간을 배양기간으로 설정하였고 차후 실험에 적용하도록 하였다.

2) 배지조건에 따른 SRCM216971 균주의 생균수 결과

배지조건에 따른 SRCM216971 균주의 생균수 결과를 도 3에 나타내었다. 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) 균주는 탄소원인 글루코스(glucose)와 질소원인 효모 추출물(yeast extract)의 농도가 증가할수록 생균수가 증가하는 경향을 보였다. M1~M9의 배지 조건은 대조구인 MRS broth에서 배양한 것보다 생균수가 낮은 결과를 보였고, M10~M16의 배지 조건은 생균수가 더 높은 결과를 보였다. 그 중 M10(glucose 2%, yeast extract 0.5%) 배지가 대조구 배지와 유의적인 차이를 보였고, 글루코스 및 효모 추출물(yeast extract) 농도가 가장 낮아 대량생산을 고려할 경우 산업적 배양배지로 가장 적합한 배지조건이라고 판단되었다.

3) 배지조건에 따른 SRCM216971 균주의 생균수 결과

SRCM216971 균주의 기타영양원 추가에 따른 생균수 결과는 도 4와 같다. 기타 영양원이 첨가 되지 않은 E1 조건과 망간(manganese)과 마그네슘(magnesium)을 첨가한 E2는 생균수에서 유의적 차이가 없는 것으로 확인되었다. 그 외에 황산암모늄(Ammonium sulfate), 제일인산칼륨(Potassium phosphate monobasic), 제이인산암모늄(Ammonium phosphate dibasic)의 추가 실험 결과, 제이인산암모늄을 추가하였을 때 다른 조건에 비해 유의적으로 생균수가 증가하는 것을 확인하였다. 따라서 E5 배지조건(glucose 2%, yeast extract 0.5%, magnesium sulfate monohydrate 0.05%, manganese sulfate heptahydrate 0.1%, ammonium phosphate dibasic 0.2%)을 선정하였다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM13145P

20220317

<110> Microbial Institute for Fermentation Industyry <120> Lactobacillus pentosus SRCM216971 strain having antimicrobial activity against acne-causing strain and uses thereof <130> PN22197 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1477 <212> DNA <213> Lactobacillus pentosus <400> 1 ggcgtgccta atacatgcaa gtcgaacgaa ctctggtatt gattggtgct tgcatcatga 60 tttacatttg agtgagtggc gaactggtga gtaacacgtg ggaaacctgc ccagaagcgg 120 gggataacac ctggaaacag atgctaatac cgcataacaa cttggaccgc atggtccgag 180 tttgaaagat ggcttcggct atcacttttg gatggtcccg cggcgtatta gctagatggt 240 ggggtaacgg ctcaccatgg caatgatacg tagccgacct gagagggtaa tcggccacat 300 tgggactgag acacggccca aactcctacg ggaggcagca gtagggaatc ttccacaatg 360 gacgaaagtc tgatggagca acgccgcgtg agtgaagaag ggtttcggct cgtaaaactc 420 tgttgttaaa gaagaacata tctgagagta actgttcagg tattgacggt atttaaccag 480 aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc 540 ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcaggc ggttttttaa gtctgatgtg aaagccttcg 600 gctcaaccga agaagtgcat cggaaactgg gaaacttgag tgcagaagag gacagtggaa 660 ctccatgtgt agcggtgaaa tgcgtagata tatggaagaa caccagtggc gaaggcggct 720 gtctggtctg taactgacgc tgaggctcga aagtatgggt agcaaacagg attagatacc 780 ctggtagtcc ataccgtaaa cgatgaatgc taagtgttgg agggtttccg cccttcagtg 840 ctgcagctaa cgcattaagc attccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct gaaactcaaa 900 ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gctacgcgaa 960 gaaccttacc aggtcttgac atactatgca aatctaagag attagacgtt cccttcgggg 1020 acatggatac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1080 cccgcaacga gcgcaaccct tattatcagt tgccagcatt aagttgggca ctctggtgag 1140 actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga 1200 cctgggctac acacgtgcta caatggatgg tacaacgagt tgcgaactcg cgagagtaag 1260 ctaatctctt aaagccattc tcagttcgga ttgtaggctg caactcgcct acatgaagtc 1320 ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1380 caccgcccgt cacaccatga gagtttgtaa cacccaaagt cggtggggta accttttagg 1440 aaccagccgc ctaaggtggg acagatgatt agggtga 1477 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

항산화 활성 및 항균 활성을 가지며, β-글루코시다아제 및 프로테아제 효소를 분비하는 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM216971 균주(기탁번호: KCCM13145P).
제1항에 있어서, 상기 항균 활성은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM216971 균주.
제2항에 있어서, 상기 균주는 뽕잎 발효 시 항산화 활성 및 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성과 총 페놀 및 플라보노이드 함량을 증진시키는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM216971 균주.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균용 조성물.
삭제
(1) 뽕잎에 물을 첨가하고 추출한 후 살균하여 뽕잎 추출물을 제조하는 단계;
(2) 상기 (1)단계의 제조한 뽕잎 추출물에 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM216971 균주(기탁번호: KCCM13145P)를 접종하는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계의 접종한 뽕잎 추출물을 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성을 가지는 뽕잎 발효물의 제조방법.
제6항에 있어서,
(1) 뽕잎에 물을 8~12배(v/w) 첨가하고 95~100℃에서 2~4시간 동안 추출한 후 살균하여 뽕잎 추출물을 제조하는 단계;
(2) 상기 (1)단계의 제조한 뽕잎 추출물에 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM216971 균주(기탁번호: KCCM13145P)를 접종하는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계의 접종한 뽕잎 추출물을 35~40℃에서 1~3일 동안 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성을 가지는 뽕잎 발효물의 제조방법.
제6항 또는 제7항의 방법으로 제조된 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성을 가지는 뽕잎 발효물.
제8항의 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성을 가지는 뽕잎 발효물을 유효성분으로 함유하는 여드름 피부염의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제8항의 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)에 대한 항균 활성을 가지는 뽕잎 발효물을 유효성분으로 함유하는 여드름 피부염의 개선용 화장료 조성물.