KR102376622B1 - 항염증 및 항산화 활성을 갖는 락토바실러스 펜토수스 srcm209254 균주 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항산화 활성, 항염증 활성 및 항균 활성을 가지며, β-글루코시다아제 및 프로테아제 효소를 분비하는 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM209254 균주(기탁번호: KCCM13020P); 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물, 상기 균주를 이용한 울금 발효액의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 울금 발효액에 관한 것이다.

Description

항염증 및 항산화 활성을 갖는 락토바실러스 펜토수스 SRCM209254 균주 및 이의 용도{Lactobacillus pentosus SRCM209254 strain having anti-inflammatory and antioxidant activity and uses thereof}

본 발명은 항산화 활성, 항염증 활성 및 항균 활성을 가지며, β-글루코시다아제 및 프로테아제 효소를 분비하는 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM209254 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

울금은 우리나라에서는 생강목 생강과의 한해살이 풀인 강황(姜黃/薑黃, Curcuma longa Linne)의 덩이뿌리를 그대로 또는 주피를 제거하고 쪄서 말린 것을 말하며 생김새는 잎은 파초나 칸나처럼 긴 타원형이며 두 줄기로 뻗어 다 자란 높이가 1~1.5 m 가량이고 뿌리는 생강과 같으며 늦여름에 꽃이 핀다.

울금은 본초강목과 동의보감 등의 고서에서 '울금은 간장의 해독을 촉하고 담즙분비 및 이혈 작용이 뛰어나다'고 기록되어 있다. 특히, 그 주요성분 중 디케톤 화합물인 커큐민(curcumin)은 항암효과가 뛰어난 것으로 알려져 있으며 항종양, 항산화, 항아밀로이드 및 항염증 등의 작용이 있다. 또한, 커큐민은 산화에 의한 DNA 손상과 산화를 억제하고, 항산화 작용과 자유 라디칼의 청소부 역할을 한다. 그리고 커큐민이 알츠하이머 발병의 원인으로 꼽히는 뇌내 플라크의 생성을 억제하고, 이미 생성된 플라크는 파괴하는 효능을 지니고 있음이 확인된 바 있다.

그러나, 울금은 특유의 맛과 냄새로 그 음용이 매우 어렵다는 문제점 때문에 기존에는 울금으로부터 유효성분을 추출하여 울금의 유효성분을 활용하였던 바, 그 방법으로는, 커큐민을 아세톤에 용해하고 셀라이트(celite)를 가한 후, 얻어진 분말을 소결된 유리 깔때기에서 디하이드로겐 포스페이트가 포화된 실리카 겔 상에 위치시키고 이를 에틸 아세테이트-헵탄의 1:1 혼합물로부터 재결정하는 방법과 그 외의 다른 방법들에 의하여 울금의 유효성분을 추출하여 사람이 음용하기 편리한 또 다른 재료로 가공하여 왔다.

상기한 바와 같이 울금의 유효성분을 추출하는 방법은 매우 많은 공정을 필요로 하고, 또한 이렇게 추출된 유효성분으로 가공되는 재료는 고가에 판매되고 있어 대중적으로 널리 보급되지 못한다는 단점이 있으며, 유효성분을 추출하지 않고 울금 자체를 음용하고자 할 경우에는 울금 특유의 쓴맛과 냄새 때문에 소비자로부터 거부반응을 야기하는 문제점이 있었다.

커큐민(curcumin)은 울금에 함유되어 있는 디아릴헵타노이드(diarylheptanoid) 화합물로, 커큐미노이드(curcuminoid) 계열이며, 알칼로이드의 일종이다. 노란색의 색소 성분으로서 울금이나 강황과 같은 식물의 뿌리에 다량 함유되어 있고, 색소 또는 식품 첨가제로서 널리 사용되고 있다. 커큐민은 난소암, 췌장암, 대장암 등 다양한 종류의 암에 대한 항암 활성, 혈중 콜레스테롤 감소, 항염증, 지방세포 분화억제 그리고 간보호 활성을 가지며, 최근에는 커큐민의 항산화 효과가 알려지면서 당뇨, 비만, 치매 등 다양한 효능을 가질 수 있다는 점이 추가로 확인되었다.

한국등록특허 제0196680호에는 김치로부터 분리한 락토바실러스 펜토서스 LSDM 균주가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1796494호에는 락토바실러스 펜토서스 GFC LP 균주가 개시되어 있으나, 본 발명의 항염증 및 항산화 활성을 갖는 락토바실러스 펜토수스 SRCM209254 균주와는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 고품질의 발효 울금을 제조할 수 있는 유산균을 선별하고자 하여, 발효식품으로부터 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM209254 균주를 분리하였고, 상기 균주는 항산화 활성, 항염증 활성 및 항균 활성을 가지며, 효소를 분비함을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 분리한 락토바실러스 펜토수스 SRCM209254 균주는 고품질의 발효 울금 제조에 중요하게 사용될 수 있는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 항산화 활성, 항염증 활성 및 항균 활성을 가지며, β-글루코시다아제 및 프로테아제 효소를 분비하는 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM209254 균주(기탁번호: KCCM13020P)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 항균용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 울금 발효용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 (1) 물에 울금 분말 및 설탕을 첨가한 후 멸균하여 울금액을 제조하는 단계; (2) 상기 (1)단계의 멸균한 울금액에 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM209254 균주(기탁번호: KCCM13020P)를 접종하는 단계; 및 (3) 상기 (2)단계의 접종한 울금액을 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 울금 발효액의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 울금 발효액을 제공한다.

본 발명에서는 발효식품으로부터 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM209254 균주를 분리하였고, 상기 균주가 항산화 활성, 항염증 활성 및 항균 활성을 가지며, 효소를 분비하는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명에서 분리한 락토바실러스 펜토수스 SRCM209254 균주는 고품질의 발효 울금 제조에 중요하게 사용할 수 있어, 관련 업계에 매우 중요한 발명으로 평가된다.

도 1은 선발된 효모의 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하여 GenBank에 등록되어 있는 유산균들과 상동성을 분석한 것이다.
도 2는 균주 농도에 따른 Raw 264.7 세포 생존율을 비교한 그래프이다.
도 3은 LPS 처리와 균주 농도별 NO 생성량을 비교한 그래프이다.
도 4는 LPS 처리와 균주 농도별 TNF-α 생성량을 비교한 그래프이다.
도 5는 LPS 처리와 균주 농도별 ROS 생성 저해능을 비교한 그래프이다.
도 6은 유산균 종류(1~59번)를 달리한 울금 발효액을 TLC를 이용하여 커큐민 정성 분석한 결과이다.
도 7은 1, 39, 40, 41, 42, 51, 52(SRCM209254)번 유산균을 이용한 울금 발효액을 TLC를 이용하여 커큐민 정성 분석한 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항산화 활성, 항염증 활성 및 항균 활성을 가지며, β-글루코시다아제 및 프로테아제 효소를 분비하는 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM209254 균주(기탁번호: KCCM13020P)를 제공한다.

본 발명에 따른 락토바실러스 펜토수스 SRCM209254 균주는 울금 발효 시 AGI(α-glucosidase inhibitor) 활성, PLI(Pancreatic lipase inhibitor) 활성 및 ACE(Angiotensin-converting enzyme) 저해 활성과 커큐민 함량을 증진시킬 수 있어, 울금 발효에 적합한 균주로 선발한 것이다.

상기 선발된 본 발명의 SRCM209254 균주는 16S rRNA 영역의 염기서열 분석을 실시한 결과, 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus)로 동정되었다.

본 발명의 균주 락토바실러스 펜토수스 SRCM209254 균주를 한국미생물보존센터에 2021년 7월 12일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM13020P).

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 항균 활성은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균 활성인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 항염증 활성은 NO(Nitric Oxide) 및 TNF-α 생성 억제를 통해 이루어지는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 유해미생물은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 조성물은 바람직하게는 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품 형태일 수 있고, 상기 식품은 유제품(우유, 두유, 가공우유), 발효유(액상 요구르트, 호상 요구르트), 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 락토바실러스 펜토수스 SRCM209254 균주를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 균주를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 균주는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 바람직하게는 식품은 락토바실러스 펜토수스 SRCM209254 균주를 함유하는 형태일 수 있으며, 또한 다른 식품의 첨가물로서도 이용될 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품은 기능성 식품을 포함할 수 있는데, 본 발명의 기능성 식품에는 상기 유효성분 외에도 필요에 따라 다양한 보조성분을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품의 경우, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B12, 엽산 (folic acid), 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E 등의 비타민류와, 구리, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 아연 등의 미네랄 또는 유산균 등을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 기능성 식품 중, 건강음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로오스 등의 이당류, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올류 등을 들 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제는 기초사료에 일정 비율로 첨가하는 것이다. 상기 기초사료는 주성분이 옥수수, 대두박, 유청, 어분, 당밀, 소금, 비타민 프리믹스 및 미네랄 프리믹스 등으로 이루어질 수 있다. 비타민 프리믹스는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 리보프라빈 및 나이아신으로 구성될 수 있으며, 미네랄 프리믹스는 망간, 철, 아연, 칼슘, 구리, 코발트 및 셀레니늄 등으로 구성될 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 의약품을 제공한다. 상기 의약품은 항균물질을 함유하고 있으므로 유해 세균에 의한 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 균주는 바람직하게는 락토바실러스 펜토수스 SRCM209254 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 울금 발효용 조성물을 제공한다.

상기 균주가 항산화 활성, 항염증 활성 및 항균 활성을 가지며, 효소를 분비하는 특징을 가지며, 울금 발효 시 AGI(α-glucosidase inhibitor) 활성, PLI(Pancreatic lipase inhibitor) 활성 및 ACE(Angiotensin-converting enzyme) 저해 활성과 커큐민 함량을 증진시킬 수 있어, 울금 발효의 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명은 또한,

(1) 물에 울금 분말 및 설탕을 첨가한 후 멸균하여 울금액을 제조하는 단계;

(2) 상기 (1)단계의 멸균한 울금액에 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM209254 균주(기탁번호: KCCM13020P)를 접종하는 단계; 및

(3) 상기 (2)단계의 접종한 울금액을 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 울금 발효액의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 울금 발효액의 제조방법은, 보다 구체적으로는

(1) 물에 울금 분말 4~6%(w/w) 및 설탕 4~6%(w/w)를 첨가한 후 110~130℃에서 10~20분 동안 멸균하여 울금액을 제조하는 단계;

(2) 상기 (1)단계의 멸균한 울금액에 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM209254 균주(기탁번호: KCCM13020P)를 접종하는 단계; 및

(3) 상기 (2)단계의 접종한 울금액을 35~40℃에서 1~3일 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있으며,

더욱 구체적으로는

(1) 물에 울금 분말 5%(w/w) 및 설탕 5%(w/w)를 첨가한 후 121℃에서 15분 동안 멸균하여 울금액을 제조하는 단계;

(2) 상기 (1)단계의 멸균한 울금액에 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM209254 균주(기탁번호: KCCM13020P)를 접종하는 단계; 및

(3) 상기 (2)단계의 접종한 울금액을 37℃에서 2일 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 울금 발효액을 제공한다.

이하, 본 발명의 실시예를 들어 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1. 울금 발효액 제조

정제수에 울금 분말 5%(w/w) 및 설탕 5%(w/w)를 첨가한 후 121℃에서 15분 동안 가압 멸균한 후 40℃ 이하로 냉각하였다. 상기 냉각한 울금액에 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM209254 균주를 1%(w/w) 접종한 후 37℃에서 2일 동안 발효하였다.

재료 및 방법

1. 유산균의 분리 및 배양조건

국내에 있는 가정에서 담근 전통식 된장, 간장, 고추장, 누룩, 배추김치, 막걸리 등의 시료 100여 종을 근원 시료로 사용하였다. 각각의 시료 1 g을 멸균생리식염수 9 mL에 단계 희석하여 MRS 아가(DifcoTM, MI, USA) 배지에 100 ㎕를 도말하여 30℃에서 48시간 배양하였다. 각각의 배양한 미생물에서 집락형태가 상이한 균주를 선별하여 순수분리하였으며, 선별 균주는 10% 스킴 밀크(Difco TM)에 재부유하고 -80℃에 보관하여 사용하였다.

2. 선별 균주의 동정 및 계통수 작성

선별 균주를 마크로젠(Seoul, Korea)에 16S rDNA sequence 분석을 의뢰하였고, 분석된 염기서열은 NCBI의 data base와 비교하여 동정하였다. 16S rRNA 염기서열 분석을 위해 universal 프라이머인 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'; 서열번호 2)와 1492R (5'-GGTTAC CTTGTTACGACTT-3'; 서열번호 3)을 사용하여 유전자를 증폭 후 염기서열을 해독하였다. 염기서열의 크로마토그램을 이용하여 갭을 최소화한 후 NCBI에서 서열 일치도가 높은 표준 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열을 확보하여 계통도를 작성하였다. 계통도 분석은 tamura-Nei 모델에 기초한 maximum likelihood 방법을 사용하여 분석하였고, 산출한 각각의 계통수에서 각 분지에 대한 통계학적 신뢰도를 산출하기 위해 bootstrap 분석을 1,000회 실행하였으며, 분석은 MEGA 7.0.26 program을 사용하였다.

3. 용혈성 및 효소활성 측정

선별된 균주의 용혈성 확인을 위해 혈액 아가 베이스(BD, Difco)에 5% 염소 혈액(MBcell, Korea)을 첨가하여 혈액 아가 배지를 제조하였다. 선별 균주는 획선 도말하여 37℃에서 24시간 배양 후 균체 주위에 생기는 환의 형태로 α, β 및 γ 용혈성을 확인하였다.

β-글루코시다아제 활성 분석은 1.5% LB agar와 Esculin Iron agar를 멸균 후 1:1 비율로 혼합하여 배지 제조 후 플레이트에 획선도말하여 30℃에서 24시간 배양하였다. 콜로니 주변에 black complex 형성 정도에 따라 정성적으로 활성을 -, +,++,+++ 등으로 표기하였다. 프로테아제 활성 분석은 2% skim milk agar plate를 제작(90 mm 페트리디쉬에 25 mL 첨가)하여 플레이트에 8 mm 홀(hole)을 형성한 후 균주 배양상등액(LB or TSB) 100 ㎕를 로딩하고 말린 후 30℃에서 24시간 배양한 후 홀 주변에 형성된 환의 크기를 측정하여 프로테아제 활성을 분석하였다.

4. 항균활성 측정

항균 활성은 디스크확산법(paper disc method)을 이용하여 조사하였다. 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) ATCC 10798, 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) KCTC1056, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) KCCM 11593, 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) KCTC34440, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) ATCC11778에 대한 선별 균주의 항균력을 조사하였다. 선별 균주를 37℃에서 24시간 배양한 후 0.4 ㎛ 멤브레인 필터(Millipore, Membrane filter, Ireland)를 이용하여 제균한 상등액을 시료로 사용하여 항균력을 측정하였다. 각각의 지시균주가 10⁵ CFU/ml로 도말된 고체배지에 8 mm 직경의 페이퍼 디스크(Advantec, Tokyo, Japan)를 놓고 시료 100 ㎕씩 분주하여 생육저지환을 측정하였다.

5. 항염증 활성

선별된 유산균을 동결건조하고 이의 파쇄물 100 mg을 10% DMSO에 용해시키고 DMEM(Dulbecco’modified Eagle’medium) 배지로 희석하여 세포실험에 사용하였다.

5-1. Raw 264.7 세포 배양

본 실험에서 항염증 활성 확인을 위하여 사용한 mouse 유래 Raw 264.7 macrophage은 한국세포주은행(Korean cell line bank, KCLB)에서 분양받아 사용하였다. Raw 264.7 세포는 10% FBS(fetal bovine sereum), 1% penicillin/streptomycin을 첨가한 DMEM(Dulbecco’modified Eagle’medium) 배지를 이용하여 5% CO₂가 존재하는 37℃ 배양기에서 2일에 한번씩 계대 배양하였다.

5-2. 세포 생존율 측정

Raw 264.7 세포에서 시료가 세포 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위하여 cell counting kit-8(CCK-8, Dojindo Molecular Technologies Inc., Rockville, MD, USA)을 이용하였다. Raw 264.7 세포를 96 웰 플레이트에 5×10³ cells/well 밀도로 접종하여 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 24시간 배양한 후 시료를 최종농도가 0.1, 0.2, 0.4, 1 mg/mL이 되도록 처리하여 48시간 배양하였다. 그 후 배양액을 제거하고 PBS 100 ㎕와 cck-8 시약 10 ㎕를 혼합하여 분주한 후 암실상태의 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 2시간 반응시켰다. 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였고 다음의 식을 이용해 세포 생존율을 평가하였다.

생존율(%) = (시료 흡광도/대조구 흡광도)×100

5-3. 항염증 활성 측정

5-3-1. NO(Nitric oxide) 생성량

항염증 활성의 NO 생성량 측정은 Raw 264.7 세포를 96 웰 플레이트에 5

10⁵ cells/mL로 접종하여 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 24시간 배양하였다. 그 후 유산균체의 최종농도가 0.1, 0.2, 0.4 mg/mL이 되도록 처리하였으며 LPS(lipopolysaccharides from Escherichia coli, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 1 ㎍/mL 농도로 처리하여 24시간 배양하였다. 이후, 항염증 활성을 측정하기 위하여 세포 배양 시 생성되는 NO양을 측정하였다. NO 생성량은 세포 배양액 100 ㎕와 그리스 시약(Sigma-Aldrich Co.) 100 ㎕를 혼합하여 실온에서 10분간 반응시켰다. 발색된 반응액의 흡광도를 마이크로플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이때 표준물질로 아질산나트륨(NaNO₂. Alfa Aesar Co., Haverhill, MA, USA)를 사용하여 아질산염(nitrite)으로 NO 생성량을 계산하였다.

5-3-2. 세포 배양액의 TNF-α 및 Il-1β 정량

96-웰 플레이트에 세포를 5×10⁵ cells/mL의 밀도로 분주하여 5% CO₂로 조정된 37℃의 인큐베이터에서 24시간 배양한 후 LPS(1 ㎍/mL)와 희석배수별로 희석된 시료를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 세포배양 상등액 내의 TNF-α와 IL-1β의 분비량은 ELISA kit(R&D system Co.)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다

6. 항산화 활성 측정

6-1. 세포 내 ROS 생성량

96-웰 플레이트에 세포를 5×10⁵ cells/mL의 밀도로 분주하여 5% CO₂로 조정된 37℃ 인큐베이터에서 24시간 배양한 후 LPS(1 ㎍/mL)와 희석배수별로 희석된 시료(0.1, 0.2, 0.4 mg/mL)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. ROS의 측정은 ROS kit(Abcam Inc., Cambridge, MA, USA)의 지시에 따라, 20 μM DCFH-DA 100 ㎕를 분주하여 암실 상태의 5% CO₂, 37℃ 배양기에서 45분간 반응시켰다. 반응 후 상등액을 제거하고, buffer 100 ㎕를 분주하여 마이크로플레이트 리더를 이용하여 485 nm(excitation), 528 nm(emission)에서 형광값을 측정하였다. 세포 내 ROS 생성량은 LPS 처리 대조군에 대한 백분율(%)로 나타내었다.

7. 울금 발효액 제조

울금 분말(진도산)을 이용하여 유산균 발효액을 제조하고자 울금 분말 5%(w/w), 설탕 5%(w/w)의 울금액을 제조하여 121℃에서 15분간 가압 멸균한 후 냉각하였다. 유산균 59종(균주 목록 미첨부)을 전 배양한 후, 울금액에 1%(w/w) 접종하여 37℃에서 24시간 동안 발효하였다.

8. TLC(Thin-layer chromatography)를 이용한 커큐민 정성분석

TLC 실리카겔 60 F₂₅₄(Merck사)를 이용하여 커큐민 정성분석을 진행하였다. 유산균 울금 발효액 및 커큐민 표준용액을 TLC 플레이트에 3 ㎕ 도말하였다. 클로로포름:메탄올 = 47:3 비율로 전개용매를 만들어 TLC 플레이트를 전개하였다. 10% 황산을 이용하여 발색시켜 커큐민 표준품 및 대조구 시료와 비교하였다.

9. 선발균주를 이용한 유산균 울금 발효액의 품질분석

1) pH

시료 1 g을 적정기(Mettler Toledo CH/MPC227, Switzerland)를 사용하여 증류수로 시료를 최대 50배 희석하여 3회 반복 측정한 후 평균값을 구하였다.

2) 적정 산도

시료 1 g을 적정기(Mettler Toledo CH/MPC227, Switzerland)를 사용하여 acidity paste 분석법(고체시료)으로 시료를 최대 50배 희석하고, 0.1N-NaOH를 가하여 pH 8.3이 될 때까지 적정하고, 이때 소비된 NaOH의 양(mL)을 젖산(f=0.009)으로 환산하여 산도 값을 구하고, 3회 반복하여 평균값을 구하였다.

산도 = {(NaOH 적정값(mL)× NaOH 농도(N) × 젖산 0.009 × 희석배수)/시료량} × 100

3) 생균수

생균수의 측정방법은 일반세균수 표준평판법을 참고하여 시험하였다. 배지는 MRS agar(유산균)를 사용하였다. 시료를 단계별로 10배 희석하고, 그 희석액 100 ㎕씩을 준비한 배지에 도말한 후 37℃에서 24시간 동안 배양하여 투명환이 발생한 집락수(30~300개 범위 내)를 계산하고, 그 평균집락수에 희석배수를 곱하여 생균수로 하였다.

10. 선발균주를 이용한 울금 유산균 발효액의 항산화 활성 및 생리활성 분석

1) 시료 전처리

울금 유산균 발효액과 메탄올을 1:1로 혼합한 후, 1시간 동안 초음파 추출을 진행하였다. 이 후, 원심분리(10,000 rpm, 5분)하여 상등액을 0.2 ㎛ 실린지 필터에 통과시킨 후 사용하였다.

2) 항산화 분석

(1) DPPH 라디칼 소거능

DPPH 라디칼 소거능은 시료 100 ㎕에 100 μM DPPH 라디칼 용액 2 mL를 첨가하여 암실에서 20분간 반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 515 nm에서 흡광도를 측정하였으며 대조구로는 L-아스코르브산을 사용하였다. DPPH 라디칼 소거능은 다음의 식에 의하여 얻어진 결과에서 산출하여 나타내었으며, 선형 방정식을 이용하여 50%의 소거능을 보이는 희석배수를 IC₅₀으로 나타내었다.

DPPH 라디칼 소거능(%) = (대조구 흡광도 - 시료 흡광도/대조구 흡광도)×100

(2) ABTS 라디칼 소거능

ABTS 라디칼 소거능 측정에 사용된 ABTS 라디칼 용액은 7 mM ABTS 용액과 2.45 mM 과황산칼륨(potassium persulfate)을 혼합한 후 16시간 동안 암실에서 반응시킨 뒤 생성된 ABTS 라디칼 용액을 95% 에탄올과 적절하게 혼합하여 734 nm에서 흡광도가 0.70±0.02가 되도록 조절하여 사용하였다. 시료 30 ㎕에 ABTS 라디칼 용액 3 mL를 첨가하여 암실에서 6분간 반응시킨 후 분광광도계를 이용하여 734 nm에서 흡광도를 측정하였으며 대조구로는 L-아스코르브산을 사용하였다. ABTS 라디칼 소거능은 다음의 식에 의하여 얻어진 결과에서 산출하여 나타내었으며, 선형 방정식을 이용하여 50%의 소거능을 보이는 희석배수를 IC₅₀으로 나타내었다.

ABTS 라디칼 소거능(%) = (대조구 흡광도 - 시료 흡광도/대조구 흡광도)×100

(3) 총 페놀 함량

농도별 시료 1 mL에 메탄올 1 mL와 증류수를 5 mL씩 첨가한 후 혼합하였다. 이를 1N Folin-ciocalteu’phenol reagent를 0.5 mL 첨가한 후 5분간 정치하였다. 정치한 시료에 5% Na₂CO₃를 1 mL 첨가한 후 암소에서 1시간 동안 반응시킨 후, UV-Vis 분광광도계를 사용하여 725 nm 파장에서 흡광도를 분석하였다. 이를 통해 얻어진 결과는 시료 g당 GAE(Gallic acid equivalent)로 나타내며 또한 각 농도별 실험 결과들에 희석배수를 계산하였다.

(4) 총 플라보노이드 함량

농도별로 조성된 시료와 메탄올을 1:9의 비율로 혼합하여 만들어진 혼합물 0.5 mL과 10% Al(NO₃)₃와 1M KCH₃CO₂를 각각 0.1 mL씩 첨가하였다. 이렇게 만들어진 혼합물에 메탄올을 4.3 mL를 첨가한 후 실온에서 40분간 반응시켰다. 반응이 끝난 시료는 UV-Vis 분광광도계를 사용하여 415 nm 파장에서 흡광도를 측정하였다. 추출물 내 총 플라보노이드의 함량은 QE(Quercetin equivalent)로 나타내었다. 또한, 농도별 실험 결과들에 희석배수를 계산하였다.

3) 생리활성 분석

(1) AGI(α-glucosidase inhibition) 활성 측정

AGI(α-glucosidase inhibition) 활성을 측정하기 위해 α-글루코시다아제(sigma, G3651-50UN)를 0.1M 인산나트륨 완충액(sodium phosphate buffer, pH 6.8) 용액에 녹여 효소액(0.5 unit/mL)로 조제하였고, 5 mM ρ-NPG(ρ-nitro-phenyl-α-glucopyranoside, sigma, N1377-5G)도 동일한 완충액(buffer)에 용해하여 기질용액으로 하였다. 기질용액 40 ㎕를 96 웰 플레이트에 분주한 후 시료액 20 ㎕를 첨가하여 혼합하였고, 대조구로 buffer, 양성대조구로 아카보스(6 mg/mL) 용액도 각각 같은 방법으로 첨가한 후 효소액 40 ㎕를 첨가하여 혼합한 후 30분 동안 37℃ 인큐베이터에서 반응시켰다. 반응을 정지하기 위해 0.25M 탄산나트륨(sodium carbonate) 0.1 mL를 첨가하여 혼합한 후 405 nm에서 흡광도를 측정하였고 아래의 계산식으로 저해 활성을 평가하였다.

AGI 활성(%) = {1 - (Abs.Sample - Abs.blank/Abs.NC - Abs.blank)} × 100

Abs.NC : 시료 대신 buffer를 첨가하여 반응한 경우의 흡광도

Abs.blank : 시료와 효소 대신 buffer를 첨가해 반응한 경우의 흡광도

Abs.Sample : 시료 또는 acarbose를 첨가해 반응한 경우의 흡광도

(2) PLI(Pancreatic lipase inhibition) 활성 측정

췌장 리파아제(Pancreatic lipase) 저해 활성을 측정하기 위해 돼지 췌장 리파아제(porcine pancreatic lipase) 0.3 mg에 10 mM MOPS와 1 mM EDTA(pH 6.8)을 포함하는 완충액(buffer)을 30 ㎕ 넣고 tris buffer(100 mM tris-HCl, 5 mM CaCl₂, pH 7.0)를 850 ㎕ 첨가하여 효소 완충액(enzyme buffer)을 준비하였다. 효소 완충액에 시료 20 ㎕를 첨가하여 37℃에서 15분 동안 반응시켰다. 반응 후 10 mM ρ-니트로페닐 부티레이트(nitrophenyl butyrate, 4-NPB, sigma, N9876-5G) 20 ㎕를 첨가하여 37℃에서 15분 동안 반응시킨 다음 400 nm에서 흡광도를 측정하였고, 아래의 계산식으로 저해 활성을 계산하였다.

췌장 리파아제 저해 활성(%) = [1-(B-C)/A] ×100

A : 시료 대신 증류수를 첨가하여 반응한 경우의 흡광도

B : 시료를 첨가해 반응한 경우의 흡광도

C : 효소를 첨가하지 않고 반응한 경우의 흡광도

(3) ACE(Angiotensin-converting enzyme) 저해 활성

ACE 저해 활성을 확인하기 위하여 ACE inhibition kit(Dojindo Inc., Japan)을 사용하였다. 효소 작용 용액(enzyme working solution)을 만들기 위하여 증류수를 키트의 enzyme B에 2 mL 주입하여 녹이고 enzyme A에 enzyme B를 1.5 mL에 주입했다. 인디케이터 작용 용액(indicator working solution)을 제작하기 위하여 증류수를 각각 enzyme C, coenzyme Bottle에 3 mL씩 주입 후 녹여 인디케이터 용액에 각각 2.8 mL씩 넣어 혼합하여 만들었다. 96 웰 플레이트에 프로토콜을 따라 blank 1과 2에는 증류수를 20 ㎕, 시료를 각 농도별로 20 ㎕씩 처리하였다. 모든 웰에 20 ㎕의 substrate buffer를 처리한 이후 blank 2를 제외한 웰에는 효소 작용 용액을 20 ㎕씩 처리하였고 blank 2에는 증류수 20 ㎕를 처리하였다. 37℃ 진탕배양기에서 60분간 반응 후 모든 웰에 200 ㎕의 인디케이터 작용 용액을 처리하여 상온에서 10분간 반응시켜 450 nm의 흡광도에서 측정하였다.

ACE 저해 활성(%) = {1-(시료 흡광도 - blank 흡광도/NC 흡광도-blank 흡광도)} × 100

4) 커큐민 함량 분석

울금 발효액에 함유된 커큐민 함량은 HPLC로 분석하였으며, 사용된 시료는 0.20 ㎛ 멤브레인 필터로 여과하여 사용하였다. HPLC 시스템(Agilent)에서 사용된 칼럼은 CAPCELL PAK C18(4.6 mm I.D.× 250 mm, 5 ㎛)이었다. 칼럼의 온도는 30℃, 유속은 1.0 mL/min, 시료 주입량은 10 ㎕이었으며, 이동상으로 85% 메탄올을 선정하였다. 검출기는 DAD(Agilent)를 사용하였으며 420 nm에서 검출하였다. 분리된 커큐민의 각 피크는 동일 조건에서 분석한 표준물질의 피크 면적비와 머무름 시간(retention time)을 비교하여 함량을 산출하였다.

커큐민 HPLC 분석 조건

항목	조건
Instument	Agilent
Detector	DAD 420 nm
Column	CAPCELL PAK C18(4.6 mm I.D.×250 mm, 5 ㎛)
Temperature	30℃
Injection volume	10 ㎕
Flow rate	1.0 mL/min
Mobile phase	85% MeOH with 0.1% acetic acid

실시예 1. 3종 균주의 용혈성 및 효소활성 측정

선별된 3종의 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) 균주의 용혈성 및 효소 활성을 측정한 결과, 42번과 52번 균주는 β-글루코시다아제 효소 활성이 있는 것으로 나타났고, 52번 균주는 프로테아제 활성도 보유하고 있는 것으로 확인되었다.

선별균주의 용혈성 및 효소활성

Strains	Enzyme activity(size: cm)
	Hemolysis	β-glucosidase	α-amylase	Cellulase	Protease
41(Lactobacillus pentosus)	-	-	-	-	-
42(Lactobacillus pentosus)	-	+	-	-	-
52(Lactobacillus pentosus SRCM209254)	-	+	-	-	1.35±0.07

실시예 2. 3종 균주의 항균활성 측정

선별된 3종의 균주의 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균 활성을 확인한 결과, SRCM209254 균주는 스타필로코커스 아우레우스, 리스테리아 모노사이토게네스 및 바실러스 세레우스에 대한 항균 활성을 지니는 것을 확인하였다.

선별된 균주의 항균활성

Strains	Antibacterial activity(size: cm)
	B. cereus	L. monocytogenes	E. coli	M. luteus	S. aureus
41 (Lactobacillus pentosus)	-	-	-	-	-
42 (Lactobacillus pentosus)	-	-	-	-	-
52(Lactobacillus pentosus SRCM209254)	1.10±0.14	1.60±0.28	-	-	1.00±0.14

실시예 1 및 2의 실험 결과, β-글루코시다아제 효소 및 프로테아제 활성과 항균 활성을 보유하고 있는 SRCM209254 균주의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석(서열번호 1)하였으며, 결과를 기반으로 BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) 검색 결과 SRCM209254는 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus)로 판명되었으며, 최종적으로 락토바실러스 펜토수스 SRCM209254로 명명하였으며, 한국미생물보존센터에 2021년 7월 12일에 기탁하였다(KCCM13020P).

실시예 3. SRCM209254 균주의 항염증 활성

(1) 세포 생존율

SRCM209254 균주의 세포독성은 ISO 10993-5(2009)의 방법을 참고하여 비처리구와 비교해 30% 이상 감소된 흡광도를 보이는 시료 처리 농도를 확인하였고, 오차수준을 고려하여 세포생존율은 80% 이상 유지된 시료처리 농도를 안전한 농도로 판단하였다.

선발균체 시료 농도에 따른 항염증 활성 평가는 시료가 세포생존율에 미치는 영향을 확인한 후 실험을 진행하였다. 시료가 Raw 264.7 세포 생존율에 미치는 영향은 도 2와 같다. 선발균체의 최종농도가 0.1, 0.2, 0.4, 1 mg/mL이 되도록 처리하여 생존율을 확인하였다. 그 결과 선별균체는 최종농도가 0.4 mg/mL 이하에서 100% 이상의 생존율을 보여 세포독성이 확인되지 않았고, 1 mg/mL의 농도에서 50%의 세포생존율을 보였기 때문에 80% 이상의 생존율을 보이는 농도는 0.1, 0.2, 0.4 mg/mL에 대한 차후 효능평가를 진행하였다.

(2) NO(Nitric Oxide) 생성 저해 효과

SRCM209254 균주 처리에 따른 항염증 효과를 알아보기 위하여 Raw 264.7 세포에 시료와 LPS(1 ㎍/mL)를 동시 처리하여 생성된 NO 생성량을 측정한 결과는 도 3과 같다.

시료 처리는 LPS 단독처리군 대비 농도 의존적으로 NO 생성을 억제하였다. 특히, 유산균체 0.4 mg/mL 처리구는 LPS 단독처리구 대비 16.65% NO 생성 억제능이 확인되었다.

(3) TNF-α 생성 억제 효과

SRCM209254 균주 처리에 따른 항염증 효과를 알아보기 위하여 Raw 264.7 세포에 시료와 LPS(1 ㎍/mL)를 동시 처리하여 생성된 TNF-α 생성량을 측정한 결과는 도 4와 같다. 시료 처리는 LPS 단독처리구 대비 TNF-α 생성을 억제하였다. 특히, 0.4 mg/mL 처리는 LPS 단독처리구 대비 35.55% TNF-α 생성 억제 효과가 확인되었고, 0.2와 0.4 mg/mL의 유의차는 없었다.

실시예 4. SRCM209254 균주의 항산화 활성

SRCM209254 균주 처리에 따른 ROS 생성 저해 효과를 알아보기 위하여 RAW 264.7 대식세포에 LPS를 처리하여 활성산소종(superoxide radical (O₂ ^-), hydrogenperoxide (H₂O₂), hydroxy radical (·OH) 등)의 생성을 촉진하고 시료처리 후 저감효과를 측정한 결과는 도 5와 같다.

LPS 처리에 의해 Raw 264.7 세포내 ROS의 생성은 정상적으로 유도되었으며, 시료를 0.1~0.4 mg/mL 수준으로 처리하였을 때 농도의존적으로 ROS 생성량을 감소시키는 것으로 분석되었다. 특히 선발균체 0.4 mg/mL 처리구에서 22.08% ROS 생성 억제 효과가 확인되었다.

실시예 5. TLC를 이용한 울금 발효액의 커큐민 정성분석 결과

TLC는 크로마토그래피 방법 중 하나이며, 두 가지 이상의 성분으로 된 물질을 고정상(TLC plate)에 스포팅(spotting) 후, 전개용매를 흘려주면 물질이 이동상 용매의 용해도와 고정상과의 흡착 정도에 따라 물질이 이동하게 된다. 커큐민 표준물질과 울금 유산균 발효액을 함께 스포팅하여 RF(retention factor)값으로 환산하여 물질의 유무를 확인하였다. 유산균 종류(1~59번)에 따른 울금 발효액의 TLC 결과를 도 6에 나타내었다. 1, 39, 40, 41, 42, 51, 52번 유산균 발효액에서 커큐민 표준물질과 동일선상에서 spot이 나타났다. 재현성을 확인하기 위해 추가적으로 TLC를 이용하여 분석하였고, 결과는 도 7에 나타내었다. 최종적으로 41, 42, 52번 유산균 발효액에서 커큐민이 관찰되었고, 3개 균주를 이용하여 품질분석, 항산화 활성 및 생리활성 분석을 진행하였다.

실시예 5. 1차 선발 유산균을 이용한 울금 유산균 발효액의 품질분석

선발 유산균을 이용한 울금 유산균 발효액 품질분석 결과를 표 4에 나타내었다. 모든 균주에서 발효 전 pH 6.44~6.56에서 발효 후 pH 4.23~5.02로 감소하였고, 산도는 발효 전 0.04~0.05%에서 발효 후 0.33~0.50%로 증가하였다. 생균수는 발효 전 7.47~7.68 log CFU/mL에서 발효 후 8.52~8.71 log CFU/mL를 나타내었다.

1차 선발 유산균을 이용한 울금 유산균 발효액의 품질분석

시료	발효 기간(day)
	발효 0일			발효 1일
	pH	산도(%)	생균수 (log CFU/mL)	pH	산도(%)	생균수 (log CFU/mL)
대조구	6.56±0.04	0.04±0.00	-	6.67±0.04	0.04±0.00	-
41(Lactobacillus pentosus)	6.48±0.06	0.05±0.01	7.61	5.02±0.06	0.33±0.01	8.62
42(Lactobacillus pentosus)	6.44±0.10	0.05±0.04	7.68	4.52±0.10	0.50±0.04	8.71
52(Lactobacillus pentosus SRCM209254)	6.49±0.03	0.04±0.01	7.47	4.23±0.03	0.44±0.01	8.52

실시예 6. 1차 선발 유산균을 이용한 울금 유산균 발효액의 항산화 활성

선발 유산균을 이용한 울금 유산균 발효액의 항산화 활성 결과를 표 5에 나타내었다. DPPH 및 ABTS 라디칼 소거 활성에서 발효 전, 후 유의적인 차이를 보이지 않았다.

1차 선발 유산균을 이용한 울금 유산균 발효액의 항산화 활성

시료	DPPH 라디칼 소거능(%)1)		ABTS 라디칼 소거능(%)2)		총 페놀 함량 (㎍ GAE/mL)		총 플라보노이드 함량 (㎍ QCE/mL)
	발효 전	발효 후	발효 전	발효 후	발효 전	발효 후	발효 전	발효 후
대조구	43.98± 0.01a3)	44.94± 0.01a	47.57± 0.26a	48.26± 0.26a	158.38± 3.97a	158.38± 4.68a	310.85± 6.82a	312.46± 8.78a
41(Lactobacillus pentosus)	44.33± 0.35a	45.15± 0.56a	48.24± 0.35a	47.45± 0.17a	155.75± 1.85a	152.48± 4.42a	314.99± 2.74a	319.87± 0.88a
42(Lactobacillus pentosus)	43.92± 0.18a	44.06± 0.20a	47.93± 1.07a	49.48± 1.32a	159.43± 3.84a	160.24± 4.21a	315.73± 2.84a	315.62± 4.89a
52(Lactobacillus pentosus SRCM209254)	44.54± 0.78a	45.47± 1.24a	47.75± 1.52a	49.15± 1.91a	160.45± 2.86a	165.92± 5.86a	313.58± 1.24a	320.75± 4.01a

¹⁾ 양성대조군 Ascorbic acid IC₅₀: 12.78±0.42 ㎍/mL

²⁾ 양성대조군 Ascorbic acid IC₅₀: 27.63±0.42 ㎍/mL

³⁾ Duncan의 다중범위 검정을 이용하여 같은 열의(a, b, c, etc) 유의적 차이를 P<0.05 수준에서 검증함

실시예 7. 1차 선발 유산균을 이용한 울금 유산균 발효액의 생리활성 분석

선발 유산균을 이용한 울금 유산균 발효액의 생리활성 분석 결과를 표 6에 나타내었다. AGI 활성에서 41, 52번 유산균으로 발효한 울금 발효액이 발효 전 35.12%, 34.66%에서 발효 후 38.74%, 52.42%로 유의적인 증가를 보였다. PLI 활성도 마찬가지로 41번, 52번 유산균 발효액이 발효전 51.35%, 50.35%에서 발효 후 58.12%, 68.15%로 유의적인 증가를 보였다. ACE I 활성에서는 모든 유산균 발효액에서 유의적인 활성을 보였고 그 중, 52번 유산균 발효액이 가장 높은 활성을 나타내었다. 종합적으로 유산균 SRCM209254가 항당뇨 등 생리활성 측면에서 가장 적합한 균주라고 판단되었다.

1차 선발 유산균을 이용한 울금 유산균 발효액의 생리활성 분석

시료	AGI (%)1)		PLI (%)2)		ACE I(%)3)
	발효 전	발효 후	발효 전	발효 후	발효 전	발효 후
대조구	34.74±0.33a4)	34.01±0.61c	50.71±0.91a	51.01±0.91c	15.79±0.55a	16.23±0.83c
41(Lactobacillus pentosus)	35.12±1.65a	38.74±1.22b*5)	51.35±0.33a	58.12±1.83b*	16.12±1.45a	33.56±3.71b**
42(Lactobacillus pentosus)	35.98±1.12a	23.24±1.07d	50.98±0.54a	34.87±1.60d	16.87±0.39a	35.68±1.15b**
52(Lactobacillus pentosus SRCM209254)	34.66±1.85a	52.42±2.43a**	50.35±1.54a	68.15±3.16a**	16.34±0.73a	46.90±2.39a***

¹⁾ 양성대조군 Acarbose IC₅₀ : 0.92±0.14 mg/mL

²⁾ 양성대조군 Orlistat IC₅₀ : 2.72±0.25 ㎍/mL

³⁾ 양성대조군 Captopril IC₅₀ : 1.96±0.10 ng/mL

⁴⁾ Levene's t-test를 이용하여 두 집단 간의 평균 차이를 ^* P<0.05, ^** P<0.01,^*** P<0.001 수준에서 검증함

⁵⁾ Duncan의 다중범위 검정을 이용하여 같은 열의(a, b, c, etc) 유의적 차이를 P<0.05 수준에서 검증함

실시예 8. 1차 선발 유산균을 이용한 울금 유산균 발효액의 커큐민 함량 분석

세가지 선발 유산균을 이용한 발효액의 커큐민 함량 분석 결과를 표 7에 나타내었다. 42번 유산균을 제외하고 41, 52번 유산균은 각각 발효 전 42.24, 43.04 ppm에서 발효 후 46.43, 50.40 ppm으로 증가하였다.

1차 선발 유산균을 이용한 울금 유산균 발효액의 커큐민 함량 분석

시료	커큐민 함량(ppm)
	발효 전	발효 후
대조구	42.49±0.97a1)	43.49±1.27c
41(Lactobacillus pentosus)	42.24±0.86a	46.43±1.07b*2)
42(Lactobacillus pentosus)	42.33±0.67a	43.34±0.15c
52(Lactobacillus pentosus SRCM209254)	43.04±1.10a	50.40±0.53a**

¹⁾ Levene's t-test를 이용하여 두 집단 간의 평균 차이를 ^* P<0.05, ^** P<0.01 수준에서 검증함

²⁾ Duncan의 다중범위 검정을 이용하여 같은 열의(a, b, c) 유의적 차이를 P<0.05 수준에서 검증함

결과를 종합하여, 유산균 SRCM209254가 생리활성 및 커큐민 함량 측면에서 울금 발효에 가장 적합한 균주라고 판단되었다.

실시예 9. SRCM209254를 이용한 울금 유산균 발효액의 최적화를 위한 품질분석

선발된 유산균(SRCM209254)을 이용하여 발효 최적화를 위해 울금 농도별(1%, 3%, 5%), 설탕 농도별(1%, 3%, 5%) 첨가하여 발효 날짜(0~3일)에 따라 품질분석 결과를 표 8에 나타내었다.

(1) 울금 농도에 다른 비교

울금의 농도에 따라서 산도의 차이를 보였는데, 발효 후(발효 3일) 울금 농도 1%에서 0.42~0.44%, 3%에서 0.69~0.72%, 5%에서는 0.79~0.81%의 결과를 보였다. 울금 농도가 증가할수록 유산균 발효에 의한 산도 증가율이 높은 것으로 나타났다. 생균수도 산도의 결과와 비슷하게 1%에서 7.12~7.31 log CFU/mL, 3%에서 8.30~8.44 log CFU/mL, 5%에서 8.65~8.88 log CFU/mL로 울금 농도가 증가할수록 유산균 생육이 증가하는 결과를 보였다.

(2) 설탕 농도에 따른 비교

같은 울금 농도에서 설탕 농도에 따른 pH 및 산도 변화는 거의 비슷한 경향을 보였다.

(3) 발효 기간에 따른 비교

발효 0~2일까지 pH 감소와 산도 증가가 급격하게 변화하였고, 유산균 생육 발효 2일까지 증가하였다. 발효 3일에 접어들면서 발효 2일보다 산도 증가율이 작은 것으로 나타났고, 생균수도 점차 감소하였다. 이는 미생물 생장곡선에서 발효 0-2일까지는 미생물의 수가 급격히 증가하는 증식기(대수기), 발효 3일은 생균수가 일정하기 유지되는 정지기로 보인다. 경제적인 측면에서 발효 일수는 2일이 적합하다고 판단되었다.

SRCM209254를 이용한 울금 유산균 발효액의 품질분석

구분

발효기간(day)

발효 0일

발효 2일

발효 2일

발효 3일

울금 함량 (%)

설탕 함량 (%)

시료

pH

산도 (%)

생균수 (log CFU/mL)

pH

산도 (%)

생균수 (log CFU/mL)

pH

산도 (%)

생균수 (log CFU/mL)

pH

산도 (%)

생균수 (log CFU/mL)

1

1

대조구

6.05±0.01

0.04±0.01

-

6.03±0.01

0.04±0.01

-

6.05±0.01

0.04±0.01

-

6.05±0.01

0.04±0.01

-

실험구

6.05±0.01

0.04±0.01

7.52

4.07±0.01

0.30±0.03

7.98

3.37±0.08

0.37±0.01

7.88

3.22±0.00

0.42±0.01

7.12

3

대조구

6.06±0.01

0.04±0.01

-

6.03±0.01

0.04±0.01

-

6.05±0.01

0.05±0.01

-

6.05±0.01

0.05±0.01

-

실험구

6.07±0.01

0.05±0.01

7.52

3.92±0.03

0.32±0.00

8.00

3.43±0.02

0.39±0.01

8.00

3.16±0.01

0.44±0.00

7.23

5

대조구

6.04±0.01

0.05±0.01

-

6.03±0.01

0.04±0.01

-

6.05±0.01

0.05±0.01

-

6.05±0.01

0.04±0.01

-

실험구

6.05±0.01

0.04±0.00

7.52

3.81±0.01

0.32±0.03

8.31

3.29±0.01

0.37±0.01

7.83

3.09±0.03

0.44±0.00

7.31

3

1

대조구

6.05±0.01

0.05±0.01

-

6.03±0.01

0.04±0.01

-

6.05±0.01

0.05±0.01

-

6.05±0.01

0.04±0.01

-

실험구

6.06±0.01

0.04±0.00

7.52

3.67±0.03

0.48±0.01

8.35

3.26±0.06

0.64±0.03

8.46

3.08±0.02

0.69±0.04

8.30

3

대조구

6.05±0.01

0.05±0.01

-

6.03±0.01

0.04±0.01

-

6.05±0.01

0.05±0.01

-

6.05±0.01

0.04±0.01

-

실험구

6.06±0.01

0.04±0.00

7.52

3.55±0.06

0.44±0.03

8.42

3.13±0.01

0.64±0.01

8.53

3.01±0.02

0.71±0.02

8.35

5

대조구

6.05±0.01

0.05±0.01

-

6.03±0.01

0.04±0.01

-

6.05±0.01

0.05±0.01

-

6.05±0.01

0.04±0.01

-

실험구

6.05±0.01

0.04±0.00

7.52

3.95±0.03

0.48±0.01

8.45

3.13±0.03

0.64±0.01

8.78

3.02±0.01

0.72±0.01

8.44

5

1

대조구

6.39±0.01

0.05±0.01

-

6.33±0.01

0.05±0.01

-

6.33±0.01

0.05±0.01

-

6.33±0.01

0.04±0.01

-

실험구

6.38±0.01

0.04±0.00

7.52

3.99±0.01

0.54±0.01

8.77

3.24±0.01

0.72±0.01

8.91

3.13±0.01

0.79±0.01

8.88

3

대조구

6.38±0.01

0.05±0.01

-

6.34±0.01

0.05±0.01

-

6.33±0.01

0.05±0.01

-

6.33±0.01

0.04±0.01

-

실험구

6.40±0.01

0.04±0.00

7.52

3.96±0.04

0.47±0.00

8.75

3.29±0.06

0.71±0.01

8.76

3.1±0.05

0.81±0.03

8.65

5

대조구

6.38±0.01

0.04±0.00

-

6.33±0.01

0.05±0.01

-

6.33±0.01

0.05±0.01

-

6.33±0.01

0.04±0.01

-

실험구

6.35±0.04

0.04±0.00

7.52

3.94±0.02

0.48±0.01

8.89

3.23±0.01

0.71±0.01

8.87

3.13±0.01

0.81±0.02

8.75

실시예 10. SRCM209254를 이용한 울금 유산균 발효액의 최적화를 위한 커큐민 함량 분석

울금 함량 및 설탕 함량에 따른 울금 유산균 발효액의 커큐민 함량 분석을 표 9에 나타내었다. 커큐민 표준물질 검량선 분석 결과 검출한계 0.59 ppm, 정량한계 11.62 ppm으로 나타났다. 정량한계는 분석물질을 합리적인 신뢰성을 가지고 정량적 측정을 할 수 있는 농도로, 정량한계 이상인 값을 신뢰도가 있다고 판단이 가능하다. 울금 함량 1% 발효액에서 발효 전, 후 증가율이 51~62%로 증가하였지만 정량한계 미만이므로 데이터를 신뢰하기 어렵다고 판단하였다. 발효 전, 후 커큐민 증가율이 가장 높은 구간은 울금함량 5%, 설탕함량 5% 조건으로 발효한 울금 발효액에서 커큐민 증가율이 18.93%로 가장 높았다.

SRCM209254를 이용한 울금 유산균 발효액의 커큐민 함량 분석(단위: ppm)

울금 함량(%)	설탕 함량(%)	시료	발효 전	발효 후	증가율(%)
1	1	대조구	3.56±0.06	3.56±0.03	-
		실험구	3.50±0.04	5.68±0.05	62.20
	3	대조구	3.51±0.12	3.45±0.12	-
		실험구	3.40±0.22	5.15±0.18	51.40
	5	대조구	3.44±0.11	3.36±0.28	-
		실험구	3.42±0.31	5.29±0.11	54.68
3	1	대조구	19.36±0.18	19.44±0.39	-
		실험구	19.30±0.20	21.31±0.21*1)	10.41
	3	대조구	18.90±0.10	18.80±0.52	-
		실험구	18.72±0.05	21.25±0.16*	13.51
	5	대조구	19.78±0.32	20.67±0.05	-
		실험구	19.92±0.12	23.28±0.40*	16.86
5	1	대조구	40.11±0.26	40.02±2.41	-
		실험구	39.95±0.17	38.87±2.84	-
	3	대조구	38.82±0.33	38.25±1.33	-
		실험구	38.72±0.52	44.92±1.44*	16.01
	5	대조구	40.05±0.35	40.35±1.34	-
		실험구	40.20±0.31	47.81±0.82**	18.93

¹⁾ Levene's t-test를 이용하여 두 집단 간의 평균 차이를 ^* P<0.05, ^** P<0.01,^*** P<0.001 수준에서 검증함

한국미생물보존센터(국외) KCCM13020P 20210712

<110> Microbial Institute for Fermentation Industyry <120> Lactobacillus pentosus SRCM209254 strain having anti-inflammatory and antioxidant activity and uses thereof <130> PN21509 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1487 <212> DNA <213> Lactobacillus pentosus <400> 1 aacgctggcg gcgtgcctaa tacatgcaag tcgaacgaac tctggtattg attggtgctt 60 gcatcatgat ttacatttga gtgagtggcg aactggtgag taacacgtgg gaaacctgcc 120 cagaagcggg ggataacacc tggaaacaga tgctaatacc gcataacaac ttggaccgca 180 tggtccgagt ttgaaagatg gcttcggcta tcacttttgg atggtcccgc ggcgtattag 240 ctagatggtg aggtaacggc tcaccatggc aatgatacgt agccgacctg agagggtaat 300 cggccacatt gggactgaga cacggcccaa actcctacgg gaggcagcag tagggaatct 360 tccacaatgg acgaaagtct gatggagcaa cgccgcgtga gtgaagaagg gtttcggctc 420 gtaaaactct gttgttaaag aagaacatat ctgagagtaa ctgttcaggt attgacggta 480 tttaaccaga aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa 540 gcgttgtccg gatttattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg gttttttaag tctgatgtga 600 aagccttcgg ctcaaccgaa gaagtgcatc ggaaactggg aaacttgagt gcagaagagg 660 acagtggaac tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat atggaagaac accagtggcg 720 aaggcggctg tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa agtatgggta gcaaacagga 780 ttagataccc tggtagtcca taccgtaaac gatgaatgct aagtgttgga gggtttccgc 840 ccttcagtgc tgcagctaac gcattaagca ttccgcctgg ggagtacggc cgcaaggctg 900 aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag 960 ctacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tactatgcaa atctaagaga ttagacgttc 1020 ccttcgggga catggataca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 1080 gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt attatcagtt gccagcatta agttgggcac 1140 tctggtgaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc 1200 cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggatggt acaacgagtt gcgaactcgc 1260 gagagtaagc taatctctta aagccattct cagttcggat tgtaggctgc aactcgccta 1320 catgaagtcg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg 1380 ccttgtacac accgcccgtc acaccatgag agtttgtaac acccaaagtc ggtggggtaa 1440 ccttttagga accagccgcc taaggtggga cagatgatta gggtgaa 1487 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (8)

1. 항산화 활성, 항염증 활성 및 항균 활성을 가지며, β-글루코시다아제 및 프로테아제 효소를 분비하는 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM209254 균주(기탁번호: KCCM13020P).
2. 제1항에 있어서, 상기 항균 활성은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균 활성인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM209254 균주.
3. 제2항에 있어서, 상기 균주는 울금 발효 시 AGI(α-glucosidase inhibitor) 활성, PLI(Pancreatic lipase inhibitor) 활성 및 ACE(Angiotensin-converting enzyme) 저해 활성과 커큐민 함량을 증진시키는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM209254 균주.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 또는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균용 조성물.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는, 울금 발효용 조성물.
6. (1) 물에 울금 분말 및 설탕을 첨가한 후 멸균하여 울금액을 제조하는 단계;
   (2) 상기 (1)단계의 멸균한 울금액에 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM209254 균주(기탁번호: KCCM13020P)를 접종하는 단계; 및
   (3) 상기 (2)단계의 접종한 울금액을 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 울금 발효액의 제조방법.
7. 제6항에 있어서,
   (1) 물에 울금 분말 4~6%(w/w) 및 설탕 4~6%(w/w)를 첨가한 후 멸균하여 울금액을 제조하는 단계;
   (2) 상기 (1)단계의 멸균한 울금액에 락토바실러스 펜토수스(Lactobacillus pentosus) SRCM209254 균주(기탁번호: KCCM13020P)를 접종하는 단계; 및
   (3) 상기 (2)단계의 접종한 울금액을 35~40℃에서 1~3일 동안 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 울금 발효액의 제조방법.
8. 제6항 또는 제7항의 방법으로 제조된 울금 발효액.

Images