KR101811238B1

KR101811238B1 - 항산화 활성, 리파아제 저해활성 및 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 scgb 159 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101811238B1
Application number: KR1020160142233A
Authority: KR
Inventors: 엄정선; 류명선; 양희종; 정수지; 정성엽; 김진경; 정도연
Original assignee: 재단법인 발효미생물산업진흥원
Priority date: 2016-10-28
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2017-12-22

Abstract

본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159 균주는 항산화 활성, 췌장 리파아제 저해활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하므로, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용 및 비만개선용 조성물은 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품으로 매우 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 바실러스 서틸리스 SCGB 159 균주는 장류의 발효 과정 동안 바이오제닉 아민을 분비하지 않으면서, 유해 미생물의 증식을 억제할 수 있으므로, 상기 균주를 이용하여 독성이 없는 안전한 장류 식품 생산 효과를 가져올 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

Description

항산화 활성, 리파아제 저해활성 및 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 SCGB 159 균주 및 이의 용도{Bacillus subtilis SCGB 159 strain having antioxidant activity, lipase inhibition activity and antimicrobial activity and not producing biogenic amine and secreting protease and amylase and uses thereof}

본 발명은 장류로부터 분리된, 항산화 활성, 췌장 리파아제 저해활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

바이오제닉 아민(biogenic amine)은 아미노산의 탈탄산 작용, 아미노기 전이작용 등의 화학적 작용에 의해 주로 생성되는 질소화합물로서, 단백질 함유 식품 내에서 미생물 또는 생화학적 활성에 의해 발생된다.

대표적인 바이오제닉 아민으로는 퓨트레신(putrescine), 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 카다베린(cadaverine), 스퍼미딘(spermidine) 및 세로토닌(serotonin) 등이 있다. 바이오제닉 아민은 체내에서 신경전달 물질로 직·간접적으로 작용하고 혈압조절 및 혈류 등의 심혈관계 질환에도 영향을 미치므로, 바이오제닉 아민 함유 식품의 섭취로 여러가지 약리적인 현상이 나타날 수 있다. 이들 중 인체의 분해 한도를 넘어서는 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine)을 식품에서 섭취하는 경우에는 발진, 국소적 피부염증, 알레르기, 구토, 오심, 설사 등의 증상을 유발한다. 또한, 바이오제닉 아민에 의해 혈관 수축 및 심박 활동이 증가되어 혈압 상승을 유발하고, 동공과 눈꺼풀 조직을 확장시켜 눈물의 분비를 촉진하고, 타액의 과다분비, 호흡 증가 및 혈당 상승을 가져오며 편두통을 유발하기도 하는 것으로 보고되었다.

한편, 장의 발효에 관여하는 주된 미생물 중의 하나는 바실러스(Bacillus) 속이다. 세균으로서 바실러스 서브그룹(Bacillus subgroup) 1에 속하는 바실러스 마이코이드(B. mycoides ), 바실러스 튜린지엔시스(B. thuringiensis), 바실러스 안트라시스(B. anthracis) 또는 바실러스 세레우스(B. cereus)는 유해균으로 알려져 있다. 특히 바실러스 세레우스는 HBL(haemolysin BL), NHE(non-hemolytic enterotoxin) 또는 cytK(cytotoxin K)와 같은 설사나 장염을 일으키는 단백질을 생산할 수 있다. 또한, 식품에 오염된 바실러스 세레우스 균이 증식하여 생산한 독소(cereulide) 및 구토를 일으키는 펩티드 형태의 안트락스(anthrax)와 유사한 호흡 질환을 유발하는 세트락스(certhrax)를 생산한다.

따라서, 앞으로 전통 장류의 지향점은 전통적인 장류의 맛과 풍미는 유지하되 발효 미생물 제어를 통한 식품 위생상의 안전성을 동시에 확보할 수 있어야 한다. 이를 위해 발효 동안 유해 균주들의 증식을 억제하며, 바이오제닉 아민을 생산하지 않고 동시에 분해도 가능한 발효 균주의 선발은 필수적이다.

한국등록특허 제1516588호에서는 '바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 속 균주 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, '항산화 활성, 췌장 리파아제 저해활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 SCGB 159 균주 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 장류로부터 항산화 활성, 췌장 리파아제 저해활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 SCGB 159 균주를 분리하였다.

본 발명의 바실러스 서틸리스 SCGB 159 균주는 항산화 활성, 췌장 리파아제 저해활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 특징을 모두 가지므로, 품질 좋은 장류 제조를 위한 스타터 균주로 기존의 균주보다 훨씬 효과적임을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 장류로부터 항산화 활성, 췌장 리파아제 저해활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 SCGB 159 균주(KCCM11900P)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159 균주는 항산화 활성, 췌장 리파아제 저해활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하므로, 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용 및 비만개선용 조성물은 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품으로 매우 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 바실러스 서틸리스 SCGB 159 균주는 장류의 발효 과정 동안 바이오제닉 아민을 분비하지 않으면서, 유해 미생물의 증식을 억제할 수 있으므로, 상기 균주를 이용하여 독성이 없는 안전한 장류 식품 생산 효과를 가져올 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

도 1은 본 발명에 이용된 균주들의 바이오제닉 아민 생성여부를 확인한 결과이다. SCGB 159는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159를 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 분리한 SCGB 159 균주의 16S rRNA 염기서열을 토대로 하여 계통수(phylogenetic tree)를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에서 분리한 SCGB 159 균주의 16S rRNA 염기서열(서열번호 1)을 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 장류로부터 분리된, 항산화 활성, 췌장 리파아제 저해활성 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 SCGB 159 균주를 제공한다.

본 발명에서 고추장의 장류로부터 균주를 분리하였고, 그 중 유해미생물인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대해 항균 활성이 뛰어난 균주 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) 균주를 확인하였으며, 이를 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159 균주로 동정하여 한국미생물보존센터(KCCM)에 2016년 9월 23일에 기탁하였다(기탁번호: KCCM11900P).

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 바이오제닉 아민은 히스타민(histamine) 또는 티라민(tyramine)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

"항균 (antimicrobial)"의 의미는 어떤 농도에서 미생물의 성장 또는 생존을 감소, 방지, 억제, 또는 제거하는 능력을 의미한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 유해미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 장류 제조용 스타터(starter)란 장류 제조를 위해 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 장류 제조 시에 첨가함으로써 발효된 장류에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 장류 발효용 스타터를 사용하여 장류를 제조하는 경우, 상기 장류 발효용 스타터에 포함된 미생물에 의하여, 장류의 품질을 일정하게 조절하거나, 특정한 목적, 일 예로 장류에서 이취를 발생시키지 않거나, 감소시키는 목적 또는 장류에서 구수한 맛이나 단맛을 강화시키기 위한 목적을 달성할 수 있다. 본 발명에서는 바실러스 서틸리스 SCGB 159 균주 또는 이의 배양액을 스타터 균주로 이용함으로써, 바이오제닉 아민은 포함하지 않고, 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있으며, 더욱이 항산화 활성 및 췌장 리파아제 저해 활성이 있고, 프로테아제 및 아밀라제를 포함하는 장류를 제조할 수 있다.

본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 균주를 배양하는 단계에서 얻어지는 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 첨가제로 사용할 경우, 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 그대로 첨가하거나 다른 첨가제를 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법을 제공한다. 상기 장류 유해 미생물 제어는 본 발명의 바실러스 서틸리스 SCGB 159 균주를 장류에 처리함으로써, 유해 미생물의 성장을 지연시키거나 저해시키는 것을 의미한다. 본 발명의 상기 유해미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 유해미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 유해미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 항균용 조성물에서, 상기 조성물은 바람직하게는 식품, 식품 첨가제, 사료 첨가제 또는 의약품 형태일 수 있고, 상기 식품은 유제품(우유, 두유, 가공우유), 발효유(액상 요구르트, 호상 요구르트), 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 알코올 음료 및 비타민 복합제로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159 균주를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 균주를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 균주는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 바람직하게는 식품은 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159 균주를 함유하는 형태일 수 있으며, 또한 다른 식품의 첨가물로서도 이용될 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 식품은 기능성 식품을 포함할 수 있는데, 본 발명의 기능성 식품에는 상기 유효성분 외에도 필요에 따라 다양한 보조성분을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품의 경우, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B12, 엽산 (folic acid), 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E 등의 비타민류와, 구리, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 아연 등의 미네랄 또는 유산균 등을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 기능성 식품 중, 건강음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로오스 등의 이당류, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올류 등을 들 수 있다.

본 발명의 사료 첨가제는 기초사료에 일정 비율로 첨가하는 것이다. 상기 기초사료는 주성분이 옥수수, 대두박, 유청, 어분, 당밀, 소금, 비타민 프리믹스 및 미네랄 프리믹스 등으로 이루어질 수 있다. 비타민 프리믹스는 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 리보프라빈 및 나이아신으로 구성될 수 있으며, 미네랄 프리믹스는 망간, 철, 아연, 칼슘, 구리, 코발트 및 셀레니늄 등으로 구성될 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 의약품을 제공한다. 상기 의약품은 항균물질을 함유하고 있으므로 유해 세균에 의한 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 상기 균주는 바람직하게는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159 균주일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159 균주는 췌장 리파아제 저해활성을 가지는 것을 확인하였으므로, 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 식품 섭취시 궁극적으로 항비만 효과를 가질 수 있게 한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

균주 분리 및 배양 조건

전라북도 순창군에서 전통적인 방법으로 제조한 고추장 시료를 수거하여 실험에 사용하였다. 수거한 고추장 1 g의 시료를 9 mL의 멸균 생리식염수(0.85% NaCl)에 넣어 십진법으로 희석한 후 LB (트립톤 1%, 효모추출물 0.5%, 염화나트륨 0.5%) 배지에 도말하여 30℃에서 24시간 배양하였다. 순수한 바실러스 서틸리스 균주를 분리하기 위해 단일 콜로니를 분리하였고, LB 액체배지에서 30℃, 24시간 배양하였다. 선별한 균주를 대상으로 20%의 글리세롤을 포함한 LB 액체배지에 혼합하여 4℃에서 보관하였다. 보관 후 세포의 활성화는 LB 액체배지에서 30℃, 24시간 배양하여 활성화하여 사용하였다. 효소의 활성도 측정은 균체 배양액을 12,000 rpm, 4℃, 30분 원심분리 후 상등액을 회수한 후 0.45 μm 맴브레인 필터(Sartorius, Frankfurt, Germany)로 제균하여 측정하였다.

바이오제닉 아민 생성여부 확인 (정성분석)

바이오제닉 아민 생성여부의 정성분석은 다음과 같이 수행하였다. 순수한 바실러스 균주 콜로니를 1백금 취하여 바이오제닉 아민 생성 배지에 획선 도말하였다. 바이오제닉 아민 생성을 확인하기 위한 배지로는 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% 염화나트륨, pH 5.0)에 1.5% 한천과 0.25% 글리세롤, 0.006% 브로모크레졸 퍼플(bromocresol purple), 0.1%의 히스티딘 또는 티로신을 첨가한 후 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 발색여부를 확인하였다. 대조구로 상기 배지에서 아미노산만을 첨가하지 않은 배지에서 동일하게 실험한 후 대조구로 사용하였다.

바이오제닉 아민 생성여부 확인 (정량분석)

티라민, 히스타민의 정량 분석은 HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석에 사용한 티라민, 히스타민, 티로신, 히스티딘 댄실염화물 및 1,7-디아미노헵탄은 시그마 알드리치(sigma aldrich)사 제품을 구입하여 사용하였고, 프롤린, 에테르 및 염산은 삼천 화학 제품을 사용하였다. 아세토나이트릴과 물은 J.T. Baker 사 제품을 구입해 사용하였다. 표준용액은 0.1 노르말 염산에 녹여 약 1 g/L되도록 제조한 후 0.1에서 100 mg/L의 농도로 2종의 표준 용액을 희석해 준비하였고, 분석을 통하여 검량곡선을 작성하였다. 바이오제닉 아민 분석의 생성여부를 확인하기 위해 선별 균주를 티라민, 히스타민의 전구체인 티로신, 히스티딘이 각각 200 ppm이 함유된 LB 액체배지에 접종한 후 30℃에서 24시간 배양하였고, 배양액을 분석에 활용하였다. 배양액과 표준용액을 각각 시험관에 0.5 mL씩 취한 후 1,7-디아미노헵탄 (0.1g/L) 0.25 mL씩 첨가하였다. 포화탄산나트륨용액 0.25 ml와 1% 댄실염화물 아세톤 용액 0.4 mL를 추가하여 혼합한 후 마개를 하여 45℃에서 1시간 동안 유도체화 하였다. 유도체화 후 10% 프롤린 용액 0.25 mL를 가하여 과잉의 댄실염화물을 제거하고, 시험관에 에테르 2.5 mL를 가하여 3분간 진탕한 후 상등액을 취하여 이를 질소농축기에서 완전히 증발시킨 후 잔사를 아세토나이트릴 0.5 mL에 녹이고 0.45 ㎕ 필터로 여과한 후 HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석조건은 아래 표와 같다.

바이오제닉 아민, 알코올, 당 분석을 위한 HPLC 기기 분석 조건

바이오제닉 아민 분석을 위한 HPLC 분석 조건
Instrument	Agilent 1200 series (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)
Column	CapcellPak C18 Column
Detector	DAD detector (254 μm)
Mobile phase	A: 0.1% formic acid in H₂O
	B: 0.1% formic acid in ACN
Gradient condition	A:B = 45:55, 0~10 min
	A:B = 35:65, 10~15 min
	A:B = 20:80, 15~20 min
	A:B = 10:90, 20~30 min
	A:B = 10:90, 40 min over
Flow rate	1.0 mL/min
Temperature	40℃
Injection volume	20 μL

세포외 효소의 활성측정(정성분석)

선별 균주가 균체 외로 방출하는 세포외 효소들 중 단백질, 섬유소, 전분 분해효소의 활성을 측정하기 위하여 각 효소와 특이적으로 반응할 기질 성분이 포함된 고체 평판배지를 각각 제조하였다. 분리한 미생물의 각 배양 상등액을 0.45 μm 맴브레인 필터(Sartorius, Frankfurt, Germany)로 제균한 뒤 100 ㎕씩을 8 mm의 준비한 웰에 접종하여 25℃에서 24시간 반응시킨 후 저지원의 크기를 측정하였다. 단백질 분해효소(protease)의 분비능은 2% 스킴 밀크 (Difco^TM, MI, USA)에 1.5% 한천(Junsei Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)을 첨가하여 분리균의 배양 상등액을 접종한 후 저지환의 크기를 관찰하였고, 섬유소 분해효소(cellulase)의 활성은 1% CMC(carboxylmethyl cellulose, Junsei Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)에 1.5% 한천을 첨가하여 분리균의 배양 상등액을 접종하고 0.1% 콩고레드 (Sigma-aldrich, MO, USA)로 염색하고, 1M NaCl로 세척한 뒤 저지원의 크기를 관찰하였다. 또한 전분분해효소(amylase)의 활성은 전분(starch)을 기질로 사용하여 1%의 가용성 전분 (Junsei chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)를 함유한 전분 배지에 각 선별한 균주의 배양 상등액을 상기 방법과 동일하게 제균하고 100 ㎕씩을 준비한 웰에 분주하고 25℃에서 24시간 반응시킨 후 Lugol solution (Sigma-aldrich, MO, USA)으로 염색한 뒤 분해능을 저지원의 직경의 크기를 관찰하여 측정하였다.

식중독 관련 유해병원성 미생물에 대한 항균력 확인

식품을 부패 또는 오염시켜 식중독을 유발하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)와 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성을 측정하였다. 항균 활성의 측정을 위해 바실러스 세레우스 KCTC3624는 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)로부터, 바실러스 세레우스 KCCM 40935 및 스타필로코커스 아우레우스 KCCM 11593은 한국미생물보존센터(KCCM)으로부터 분양받아 지시균주로 사용하였다. 측정 방법은 웰 확산 방법을 이용하였으며, 각 지시균주의 배양액(3.0×10⁵)을 0.8% 한천을 함유한 enriched nutrient broth (NB) soft 배지에 첨가하여 평판배지를 제작한 후 선별 균주의 배양 상등액 100 ㎕을 well에 분주하여 배양 상등액이 시험 평판배지에 확산되게 한 후 지시균주의 생육 최적 온도에서 18시간 이상 배양하여 저해환의 크기를 측정하여 항균력을 측정하였다.

항산화 활성

선별한 균주의 DPPH법에 의한 전자 공여능의 측정은 DPPH(2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl)의 방법을 따라 실험하였다. 100 μM DPPH 에탄올 용액 1mL에 200 μL의 배양 상등액을 가한다. 대조구로 배양 배지만을 첨가한 실험구를 사용하며, 반응 산물은 30분 동안 실온에서 반응 후 528㎚에서 자외선/가시광선 분광광도계(UV/VIS spectrophotometer, SPECORD 200, Analytic jeca)로 흡광도를 측정하여 아래 식에 따라 항산화 활성의 정도를 측정하였다.

Antioxidant activity (%) = [1-(Abs₅₂₈ _{nm of sample})/(Abs₅₂₈ _{nm of control})]×100

항비만 활성 측정

분리주의 항비만 활성 분석을 위해 췌장 리파아제(pancreatic lipase)　저해 활성 분석을 측정하였다. 35g의　spirit blue agar 배지(Difco)를 1L 증류수에 녹여 멸균시킨 후, 배지의 온도가 약　55℃가 되었을 때, 30㎖의　리파아제 시약을 혼합하였고,　배지　25㎖씩　플레이트에 분주하여 평판배지를 제조하였다.　상기 평판배지에 균주 배양 상등액　100㎕를 접종하여　37℃에서　72시간 동안 배양한 후 리파아제 저해 활성을 확인하였다.

최종 선별 균주의 동정

최종 선별 균주의 동정을 위해 균체는 한천 평판배지로부터 회수하였으며, 이들의 DNA는 ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep kit를 사용하여 추출하였다. 16S rRNA 유전자는 두 개의 알려진 유니버셜 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 두 유니버셜 프라이머의 염기서열은 다음과 같다. 먼저 정방향 프라이머는(27F) 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(서열번호 2), 역방향 프라이머(1492R) 5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3'(서열번호 3). PCR을 위한 각 반응의 조건은 다음과 같다. DNA의 변성 95℃ 1분, 어닐링 60℃ 1분, DNA 가닥의 합성 72℃에서 1분 또는 2분의 과정을 35회 반복하는 조건을 사용하였으며, 반응이 끝난 PCR 산물은 1% 아가로스 겔 (5 ㎕, X-gal 30 mg/ml)에서 전기영동 한 후 밴드를 확인한 후 증폭이 확인된 PCR 산물은 코스모진텍(주)에 의뢰하여 동정을 실시하였다.

최종 선별 균주의 바실러스 세레우스 ( Bacillus cereus ) 독소 유전자 분석을 통한 안전성 분석

최종 선별 균주의 식품내 안전성 여부를 확인하기 위해 바실러스 세레우스가 생성하는 6개의 설사형 독소와 구토형 독소 유전자를 보유하고 있는지를 확인하기 위해 PCR 방법을 이용하여 동정하였다. PCR (Veriti 96-well Thermal Cycler, Life technologies)은 코젠 바이오텍의 PowerChek^TM Bacillus cereus Toxin 60 plex Detection kit을 사용하여 조사하였으며, CER, hblC, bceT, entFM, nheA, cytK 등 6개 독소 유전자를 대상으로 유전자 보유 여부를 조사하였다. 먼저 PCR 반응을 위한 혼합물은 코젠 바이오텍의 매뉴얼에 따라 실시하였으며, PCR 반응 조건은 1회 95℃ 10분, 35회(95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초)로 실시하였고, 72℃에서 10분간 post-extension을 실시하였다. 증폭을 통해 확보한 PCR 산물은 0.5% TAE 버퍼에 0.5 μg/mL SYBR green가 포함된 1.0% 아가로스겔로 전기영동한 후 UV transilluminator (Gel documentation, Bio-Rad)에서 밴드를 확인하여 독소 유전자의 보유 여부를 확인하였다.

실시예 1. 전통 고추장으로부터 미생물의 분리

다양한 효소활성 및 항균활성과 항산화 활성을 갖는 바실러스를 선별하기 위하여 전라북도 순창군에서 전통적인 방법으로 제조한 고추장 104종을 수거하여 실험에 사용하였다. 고추장으로부터 786종의 분리주를 확보하였으며, 분리한 균주는 -20℃에서 보관한 뒤 다음 연구에 이용하였다.

실시예 2. 바이오제닉 아민 생성여부 확인 (정성분석)

선별한 분리주를 대상으로 하여 정성분석을 통한 바이오제닉 아민 생성 여부를 조사하였다. 그 결과 선별한 분리주 786종 중 322종의 분리주가 바이오제닉 아민을 생성하지 않음을 확인하였으며, 322종의 분리주를 대상으로 다음 연구를 진행하였다.

실시예 3. 바이오제닉 아민 생성여부 확인 (정량분석)

식품에 바이오제닉 아민이 존재할 경우 바이오제닉 아민은 매스꺼움, 구토, 고혈압, 두통과 같은 증상을 발생할 수 있다고 연구결과가 보고되기도 하였다. 바이오제닉 아민의 분포도 조사를 한 결과 한국인의 주된 식재료인 고추장에서는 히스타민은 206.1-952 (평균 569.4) mg/kg, 티라민은 284.4-1430.7 (평균 669.5) mg/kg으로 한국인들이 주로 섭취하는 34종의 식품 가운데 평균적으로 높았다. 그러므로 우리는 장류에서 분리한 균주의 바이오제닉 아민의 생성 여부를 확인하고, 분리한 균주를 이용하여 식품에 사용할 수 있는 균주를 분리하는데 목표를 두고 조사를 실시하였다.

그러므로 앞서 조사한 정성분석을 기반으로 하여 선별된 분리주를 대상으로 정량 분석을 실시한 결과 대부분의 분리 균주에서 정성분석과 동일한 결과 값을 확인하였고, 일부 분리 균주에서 정성에서는 측정되지 않았던 티라민이나 히스타민이 일부 검출되었지만 정량을 할 수 있는 정도의 수치는 나타내지 않아 다음 실험을 실시하였다.

선별 균주의 바이오제닉 아민 생성능 분석 결과

Strain No.	Histamine	Tyramine
SCGB 157	ND	ND
SCGB 158	ND	ND
SCGB 159	ND	ND
SCGB 160	ND	ND

ND : 미검출(not detected)

실시예 4. 세포외 효소의 활성측정

각종 유기물 분해능의 검정을 위하여 프로테아제, 셀룰라아제, 아밀라제를 대상으로 효소활성을 측정하였다. 각각의 스킴 밀크, CMC(carboxymethyl cellulose), 전분(starch) 배지를 살균한 후, 배지가 완전히 굳은 다음 각각의 분리 균주를 배양한 배양액을 웰 확산 방법을 이용하여 실시하였다. 각종 효소의 활성이 검증되는 25℃에서 12시간 활성화한 후 스킴 밀크, CMC, 전분의 분해능을 저지원(clear zone)의 직경으로 조사하였다.

아래 표 3에서 볼 수 있는 바와 같이, SCGB 159 균주는 정성 분석 방법에 따른 측정 결과 단백질과 전분 분해효소에서 효소 활성을 갖고 있는 것으로 나타났으며, 특히 단백질 분해효소에 대한 활성이 매우 높은 균주로 나타났다.

세포외 효소 활성 검정 (protease, cellulase, amylase)

Strain No.	Protease	Cellulase	Amylase
SCGB 157	12	w	-
SCGB 159	18	w	13
SCGB 160	17	w	-

단위 : mm, 직경

w : 약함

실시예 5. 식중독 관련 유해병원성 미생물에 대한 항균활성

식중독 관련 병원성 미생물에 대한 항균활성의 측정을 선별한 분리 균주를 대상으로 웰 확산 방법을 이용하여 확인하였다. 그 결과 SCGB 159는 지시균주 3종에 대한 높은 활성을 보였으며, 분리 균주 중에서 가장 높은 수치를 보이고 있어 식중독 유해 미생물에 대한 억제능이 가장 우수한 분리주로 확인하였다.

고추장으로부터 분리한 분리 균주의 항균활성 측정 결과

No.	Strains No.	Antibacterial activity (diameter, mm)
No.	Strains No.	Bacillus cereus KCTC 3624	Bacillus cereus KCCM 40935	Staphylococcus aureus KCCM 11593
1	SCGB 157	-	-	-
2	SCGB 159	19	17	14
3	SCGB 160	-	-	11
4	SCGB 161	12	10	12

-, 반응없음

실시예 6. 항산화 활성

본 발명의 전통 고추장으로부터 분리한 분리 균주 중에서 바이오제닉 아민 비생성 및 항균 활성이 우수한 분리주 SCGB 159의 항산화 효과 측정은 DPPH에 의한 자유 라디컬 소거 효과를 측정하여 확인하였다. DPPH를 이용하여 선별주의 항산화 효과를 측정한 결과 28.94±0.13%의 항산화능을 보여, 자유 라디컬 소거에 대한 항산화능이 우수한 것으로 조사되었다.

고추장으로부터 분리한 분리주의 항산화 활성(DPPH) 측정 결과

No.	Strains No.	Identification	DPPH (%)
1	SCGB 158	미동정	28.68±0.45
2	SCGB 159	Bacillus subtilis	28.94±0.13
3	SCGB 160	미동정	19.87±0.36
4	SCGB 161	Bacillus subtilis	24.34±0.31

실시예 7. 항비만 활성 측정

선발 균주의 항비만 능력을 확인하기 위해 췌장 리파아제 억제 활성을 확인한 결과,　SCGB 159　균주는　100%　췌장 리파아제를 억제하는 것으로 확인되어 항비만에 우수한 효과를 가지는 균주로 식품 및 응용분야에서 사용할 수 있을 것으로 확인하였다.

고추장으로부터 분리한 분리주의 항비만 활성 측정 결과

NO	Strains	Identification	Pancreatic lipase inhibition (%)
1	SCGB 157	미동정	100
2	SCGB 158	미동정	80
3	SCGB 159	Bacillus subtilis	100

실시예 8. 최종 선별 분리주 SCGB 159의 동정

최종 선별한 SCGB 159 균주의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기서열을 분석하였으며, 결과를 기반으로 BLAST 검색 결과 SCGB 159는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis)로 판명되었으며, 염기서열을 이용하여 Eztaxon serve에서 표준 균주와 상동성을 분석한 결과 SCGB 159는 바실러스 서틸리스 DSM 10과 유사성이 높게 나타났으며, 16S rRNA 염기서열을 토대로 하여 계통수(phylogenetic tree)를 작성하였다. 최종적으로 바실러스 서틸리스 SCGB 159으로 명명하였으며, 한국미생물보존센터(KCCM, Korean Culture Center of Microorganisms)에 바실러스 서틸리스 KCCM11900P로 기탁하였다.

실시예 9. 바실러스 세레우스 ( Bacillus cereus ) 독소 유전자 분석을 통한 안전성 분석

고추장으로부터 분리한 고초균의 균주 특성 및 기능성 효능 평가와 균주 동정을 통해 GRAS 균주로 확인된 SCGB 159를 최종 식품 적용 가능 기능성 균주로 선정하였으며, 이를 식품에 이용하기 위해 최종적으로 식중독 유발 독소 유전자의 유무를 확인하여 안전성을 확보하고자 하였다. SCGB 159에 대한 바실러스 세레우스 독소 유전자에 대하여 PowerChek^TM Bacillus cereus Toxin 6-plex Detection kit을 사용하여 확인한 결과 6종의 독소를 생성하는 유전자가 없는 것으로 나타나 식중독에 대한 안전성을 지니고 있어 식품 및 식품첨가제 등과 같은 다양한 응용 분야에 이용 가능함을 확인하였다.

SCGB 159의 바실러스 세레우스 독소 유전자 분석 결과

Strain No.	Identification (16s rRNA seq )	PowerChek ^TM *Bacillus* *cereus* Toxin 6- plex Detection Kit
Strain No.	Identification (16s rRNA seq )	CytK	nheA	ent FM	bceT	hblC	CER
SCGB 159	Bacillus subtilis	ND	ND	ND	ND	ND	ND

ND : 미검출(not detected)

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11900P

20160923

<110> Microbial Institute for Fermentation Industry <120> Bacillus subtilis SCGB 159 strain having antioxidant activity, lipase inhibition activity and antimicrobial activity and not producing biogenic amine and secreting protease and amylase and uses thereof <130> PN16417 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1507 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 tttagagttt tgattctggc tcaggacgaa cgctggcggc gtgcctaata catgcaagtc 60 gagcggacag atgggagctt gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag taacacgtgg 120 gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc ggatggttgt 180 ttgaaccgca tggttcaaac ataaaaggtg gcttcggcta ccacttacag atggacccgc 240 ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc aacgatgcgt agccgacctg 300 agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 360 tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga gtgatgaagg 420 ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg aagaacaagt accgttcgaa tagggcggta 480 ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc gcggtaatac 540 gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagg gctcgcaggc ggtttcttaa 600 gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag 660 tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa 720 caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg 780 agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag 840 ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg 900 tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt 960 ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac aatcctagag 1020 ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt 1080 cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt 1140 cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca 1200 aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggacag aacaaagggc 1260 agcgaaaccg cgaggttaag ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg 1320 caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat 1380 acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt 1440 cggtgaggta accttttagg agccagccgc cgaaggtggg acagatgatt ggggtgaagt 1500 cgtacgg 1507 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims

장류로부터 분리된, 항산화 활성, 췌장 리파아제 저해활성 및 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항균 활성이 있고, 티라민 및 히스타민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159 균주(KCCM11900P).
제1항의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물.
제1항의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 제어 방법.
제1항의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대한 항균용 조성물.
제1항의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 비만 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.