KR101839375B1 - 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 srcm 100730 균주 및 이의 용도 - Google Patents

항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 srcm 100730 균주 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101839375B1
KR101839375B1 KR1020170040454A KR20170040454A KR101839375B1 KR 101839375 B1 KR101839375 B1 KR 101839375B1 KR 1020170040454 A KR1020170040454 A KR 1020170040454A KR 20170040454 A KR20170040454 A KR 20170040454A KR 101839375 B1 KR101839375 B1 KR 101839375B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
strain
srcm
culture
activity
bacillus amyloliquefaciens
Prior art date
Application number
KR1020170040454A
Other languages
English (en)
Inventor
엄정선
류명선
조승화
양희종
정수지
정성엽
정도연
Original Assignee
재단법인 발효미생물산업진흥원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 재단법인 발효미생물산업진흥원 filed Critical 재단법인 발효미생물산업진흥원
Priority to KR1020170040454A priority Critical patent/KR101839375B1/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101839375B1 publication Critical patent/KR101839375B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A01N63/02—
    • A23L11/09—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L11/00—Pulses, i.e. fruits of leguminous plants, for production of food; Products from legumes; Preparation or treatment thereof
    • A23L11/50—Fermented pulses or legumes; Fermentation of pulses or legumes based on the addition of microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/065—Microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2200/00—Function of food ingredients
    • A23V2200/30—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health
    • A23V2200/32—Foods, ingredients or supplements having a functional effect on health having an effect on the health of the digestive tract
    • A23V2200/3204—Probiotics, living bacteria to be ingested for action in the digestive tract
    • C12R1/07—
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Agronomy & Crop Science (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 내산성, 내담즙성, 세포외 효소 분비능, α-용혈 활성, 혈전분해 활성, 유해 미생물에 대한 항균활성, 장내 부착능 및 바이오제닉 아민 분해능이 있고, 바이오제닉 아민, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM 100730 균주에 관한 것으로, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 SRCM 100730 균주는 정장제, 장류 제조를 위한 스타터 균주 및 항균용 미생물 제제 등 관련 산업에 다양하게 사용될 수 있는 유용한 균주로 판단된다.

Description

항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 SRCM 100730 균주 및 이의 용도{Bacillus amyloliquefaciens SRCM 100730 strain having antimicrobial activity and probiotics properties and uses thereof}
본 발명은 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 SRCM 100730 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 내산성, 내담즙성, 세포외 효소 분비능, α-용혈 활성, 혈전분해 활성, 유해 미생물에 대한 항균활성, 장내 부착능 및 바이오제닉 아민 분해능이 있고, 바이오제닉 아민, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM 100730 균주에 관한 것이다.
최근 현대인들은 생활수준의 향상과 더불어 건강에 대한 관심도 높아지고 있으며, 건강 증진을 위하여 체내 자연 균총을 새롭게 형성하거나 면역계 활성 등을 위하여 프로바이오틱스(probiotics)라는 미생물 식품 보충제가 널리 사용되고 있다. 일반적으로 프로바이오틱스로 사용되는 미생물들은 위장의 위산, 담낭의 담즙 및 소장에서 분비되는 각종 소화효소와 같은 저해환경으로부터 저항력을 가지며 대장과 직장에 도달해 증식하고 정착하는 능력을 구비해야 한다. 현재, 프로바이오틱스로는 락토바실러스 애시도필러스, 바실러스 폴리퍼멘티쿠스, 바실러스 서틸리스 등이 주로 연구되었다. 그 중 바실러스 속은 산업적으로 중요한 종으로 오랜 세월 동안 식품, 의약품 및 각종 발효 산업에서 사용되어 안전성이 확립되어 있다.
프로바이오틱스(probiotics)는 인간 및 동물에 투여되어 장내 미생물 균총의 균형을 개선하여, 성장의 촉진, 사료 이용률 증대, 장 이상 발효나 설사의 방지, 영양 섭취 저해인자를 제거하는 미생물로 간주되고 있으며, 이유자돈에서 프로바이오틱스의 공급은 성장과 사료효율을 개선시킨다는 보고가 있다. 프로바이오틱스에 사용되는 균들은 주로 건강한 사람의 장에서 흔하게 발견되는 상주균들로 락토바실러스와 비피더스균이 주종을 이룬다. 프로바이오틱스로서 필요한 특성은 안전성, 기능적 측면(생존성, 정착성, 서식성, 항미생물제 생성능, 면역 촉진능, 항유전독성 활성, 병원성 세균의 억제능), 기술적 측면(관능적 특성, 안정성, 박테리오파지 저항성, 제조과정 중의 생존성) 및 GRAS(Generally Recognized As Safe) 미생물이다. 프로바이오틱스는 항생제와는 반대되는 특성을 가지고 있는데, 항생제가 미생물이 생산하는 대사 산물로서 소량으로 다른 미생물의 발육을 억제하거나 사멸시키는 물질이라면 프로바이오틱스는 균들의 공생, 상생의 능력을 이용하여 면역기능을 증진시키고 유해 미생물의 성장을 저해하는 등의 효과를 나타내고 있어 이러한 면역 증진 기능을 지닌 기능성 물질 및 프로바이오틱스는 현재 오남용으로 사회적 문제가 되고 있는 항생제의 대체 물질로서 이용이 가능하다.
한국공개특허 제2013-0033026호에서는 '프로테아제 생산능이 향상된 신규한 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 ＢＹ０４ 균주 및 이를 이용한 프로테아제 생산방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2016-0120569호에서는 '단백질 분해 활성 및 α-글루코시다아제 저해 활성을 가지는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 균주 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, '항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 SRCM 100730 균주 및 이의 용도'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 내산성, 내담즙성, 프로테아제, 셀룰라제 및 아밀라제인 세포외 효소 분비능, α-용혈 활성, 혈전분해 활성, 바실러스 세레우스, 마이크로코커스 루테우스 및 슈도모나스 에루기노사인 유해 미생물에 대한 항균활성 및 장내 부착능이 있고, 티라민, 퓨트레신 및 카다베린인 바이오제닉 아민을 분해하며, 티라민 또는 히스타민인 바이오제닉 아민을 생성하지 않고, 인돌 및 페닐피루브산인 유해물질 및 β-글루쿠로니다아제 및 우레아제인 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM 100730 균주(KCCM11966P)를 분리하였다.
본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 SRCM 100730 균주는 상기와 같은 프로바이틱스의 특징을 모두 가지므로, 정장제로 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 품질 좋은 장류 제조를 위한 스타터 균주 및 바실러스 세레우스, 마이크로코커스 루테우스 및 슈도모나스 에루기노사인 유해 미생물에 대한 항균용 제제로도 사용이 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 내산성, 내담즙성, 세포외 효소 분비능, α-용혈 활성, 혈전분해 활성, 유해 미생물에 대한 항균활성, 장내 부착능 및 바이오제닉 아민 분해능이 있고, 바이오제닉 아민, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM 100730 균주(KCCM11966P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM 100730 균주(KCCM11966P)는 내산성, 내담즙성, 프로테아제, 셀룰라제 및 아밀라제인 세포외 효소 분비능, α-용혈 활성, 혈전분해 활성, 바실러스 세레우스, 마이크로코커스 루테우스 및 슈도모나스 에루기노사인 유해 미생물에 대한 항균활성 및 장내 부착능이 있고, 티라민, 퓨트레신 및 카다베린인 바이오제닉 아민을 분해하며, 티라민 또는 히스타민인 바이오제닉 아민을 생성하지 않고, 인돌 및 페닐피루브산인 유해물질 및 β-글루쿠로니다아제 및 우레아제인 유해효소를 생성하지 않는 점을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 SRCM 100730 균주는 정장제, 장류 제조를 위한 스타터 균주 및 항균용 미생물 제제 등 관련 산업에 다양하게 사용될 수 있는 유용한 균주로 판단된다.
도 1은 본 발명에서 분리한 SRCM 100730 균주의 계통도를 나타낸다.
도 2는 본 발명에서 분리한 SRCM 100730 균주의 16s rRNA의 염기서열을 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 내산성, 내담즙성, 세포외 효소 분비능, α-용혈 활성, 혈전분해 활성, 유해 미생물에 대한 항균활성, 장내 부착능 및 바이오제닉 아민 분해능이 있고, 바이오제닉 아민, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM 100730 균주(KCCM11966P)를 제공한다.
본 발명에서 전통장류로부터 균주를 분리하였고, 그 중 내산성, 내담즙성, 세포외 효소 분비능, α-용혈 활성, 혈전분해 활성, 유해 미생물에 대한 항균활성, 장내 부착능 및 바이오제닉 아민 분해능이 있고, 바이오제닉 아민, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 균주 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens)를 확인하였으며, 이를 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM 100730 균주로 동정하여 한국미생물보존센터(KCCM)에 2017년 2월 3일에 기탁하였다(기탁번호: KCCM11966P).
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 세포외 효소는 프로테아제, 셀룰라제 및 아밀라제이며, 유해 미생물은 바실러스 세레우스, 마이크로코커스 루테우스 및 슈도모나스 에루기노사이며, 분해할 수 있는 바이오제닉 아민은 티라민, 퓨트레신 및 카다베린이며, 생성하지 않는 바이오제닉 아민은 티라민 또는 히스타민이며, 유해물질은 인돌 및 페닐피루브산이며, 유해효소는 β-글루쿠로니다아제 및 우레아제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
상기 프로바이오틱스 제제는 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 SRCM 100730 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물은 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여 산제(powder), 액제(liquids and solutions), 정제(tablet), 캡슐(capsule), 시럽(syrup), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 투여 용량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성률, 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 축종, 상태 및 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프로바이오틱스 제제를 포함하는 식품을 제공한다.
본 발명의 상기 프로바이오틱스 제제는 내산성, 내담즙성, 세포외 효소 분비능, α-용혈 활성, 혈전분해 활성, 유해 미생물에 대한 항균활성, 장내 부착능 및 바이오제닉 아민 분해능이 있고, 바이오제닉 아민, 유해물질 및 유해효소를 생성하지 않는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 SRCM 100730 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 상기 프로바이오틱스를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 프로바이오틱스를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 프로바이오틱스는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 혼합양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 혼합양은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 프로바이오틱스를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 빵, 캔디류, 스낵류, 과자류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 장류 제조용 스타터(starter)란 장류 제조를 위해 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 장류 제조 시에 첨가함으로써 발효된 장류에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 장류 발효용 스타터를 사용하여 장류를 제조하는 경우, 상기 장류 발효용 스타터에 포함된 미생물에 의하여, 장류의 품질을 일정하게 조절하거나, 특정한 목적, 일 예로 장류에서 이취를 발생시키지 않거나, 감소시키는 목적 또는 장류에서 구수한 맛이나 단맛을 강화시키기 위한 목적을 달성할 수 있다.
본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 균주를 배양하는 단계에서 얻어지는 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 첨가제로 사용할 경우, 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 그대로 첨가하거나 다른 첨가제를 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 이용하여 장류를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 항균 조성물이란 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항진균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 바람직하게는 바실러스 세레우스, 마이크로코커스 루테우스 및 슈도모나스 에루기노사 등을 포함하는 병원성 미생물, 특히 그람 음성 병원성 미생물의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항균 조성물은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM 100730 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물 외에 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류를 포함할 수 있다. 상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 또는 미네랄류는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일 예로 상기 당질은 벌꿀, 덱스트린, 수크로오스, 팔라티노스, 포도당, 과당, 물엿, 당알콜(sugar alcohol), 소르비톨, 크실리톨, 말티톨일 수 있고 상기 단백질은 카제인(casein), 유청 단백질(whey protein) 등의 우유 유래 단백질, 대두 단백질, 이들 단백질의 트립신, 펩신 등의 동물 유래 효소 및 뉴트라아제(neutrase), 알칼라아제(alkilase)에 의한 가수분해물일 수 있으며, 상기 지질은 제1가 포화지방산, 다가 불포화지방산을 포함하는 해바라기유, 채종유(rapeseed oil), 올리브유, 홍화유(safflower oil), 옥수수유, 대두유, 팜유(palm oil), 야자유 등의 각종 식물 유래 유지, 중쇄 지방산(middle-chain fatty acid), EPA, DHA, 대두유래 인지질, 우유 유래 인지질일 수 있고, 상기 미네랄류는 인산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨, 유산칼슘, 글루콘산칼슘, 판토텐산칼슘, 카제인칼슘, 염화마그네슘, 황산제1철, 탄산수소나트륨일 수 있으나, 각각의 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
균주 분리 및 배양 조건
전라북도 순창군에서 전통적인 방법으로 제조한 고추장 시료를 수거하여 실험에 사용하였다. 수거한 고추장 1 g의 시료를 9 mL의 멸균 생리식염수(0.85% NaCl)에 넣어 십진법으로 희석한 후 LB (트립톤 1%, 효모추출물 0.5%, 염화나트륨 0.5%) 배지에 도말하여 30℃에서 24시간 배양하였다. 순수한 균주를 분리하기 위해 단일 콜로니를 분리하였고, LB 액체배지에서 30℃, 24시간 배양하였다. 선별한 균주를 대상으로 20%의 글리세롤을 포함한 LB 액체배지에 혼합하여 4℃에서 보관하였다. 보관 후 세포의 활성화는 LB 액체배지에서 30℃, 24시간 배양하여 활성화하여 사용하였다. 효소의 활성도 측정은 균체 배양액을 12,000 rpm, 4℃, 30분 원심분리 후 상등액을 회수한 후 0.45 μm 맴브레인 필터(Sartorius, Frankfurt, Germany)로 제균하여 측정하였다.
선별 균주의 동정
선별 균주의 동정을 위해 균체는 한천 평판배지로부터 회수하였으며, 이들의 DNA는 ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep kit를 사용하여 추출하였다. 16S rRNA 유전자는 두 개의 알려진 유니버셜 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 두 유니버셜 프라이머의 염기서열은 다음과 같다. 먼저 정방향 프라이머는 27F 프라이머 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'(서열번호 2), 역방향 프라이머는 1492R 프라이머 5‘-TACGGYTACCTTGTT ACGACTT-3'(서열번호 3). PCR을 위한 각 반응의 조건은 다음과 같다. DNA의 변성 95℃ 1분, 프라이머의 어닐링 60℃ 1분, DNA 가닥의 합성 72℃ 1분 또는 2분의 과정을 35회 반복하는 조건을 사용하였으며, 반응이 끝난 PCR 산물은 1% 아가로스 겔 (5 ㎕, X-gal 30 mg/ml)에서 전기영동한 후 밴드를 확인한 후 증폭이 확인된 PCR 산물은 코스모진텍(주)에 의뢰하여 동정을 실시하였다.
세포외 효소의 활성측정
선별 균주가 균체 외로 방출하는 세포외 효소들 중 단백질, 섬유소, 전분 분해효소의 활성을 측정하기 위하여 각 효소와 특이적으로 반응할 기질 성분이 포함된 고체 평판배지를 각각 제조하였다. 분리한 미생물의 각 배양 상등액을 0.45 μm 맴브레인 필터(Sartorius, Frankfurt, Germany)로 제균한 뒤 100 ㎕씩을 8 mm의 준비한 웰에 접종하여 25℃에서 24시간 반응시킨 후 저지원의 크기를 측정하였다. 단백질 분해효소(protease)의 분비능은 Vermelho 등의 방법에 따라 2% 스킴밀크 (DifcoTM, MI, USA)에 1.5% 한천(Junsei Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)를 첨가하여 분리균의 배양 상등액을 접종한 후 저지환의 크기를 관찰하였고, 섬유소 분해효소(cellulase)의 활성은 Teather와 Wood의 방법에 따라 1% CMC (carboxylmethyl cellulose, Junsei Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)에 1.5% 한천을 첨가하여 분리균의 배양 상등액을 접종하고 0.1% 콩고레드 (Sigma-aldrich, MO, USA)로 염색하고, 1M NaCl로 세척한 뒤 저지원의 크기를 관찰하였다. 또한 전분분해효소(amylase)의 활성은 전분(starch)을 기질로 사용하여 1%의 가용성 전분 (Junsei chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)를 함유한 전분 배지에 각 선별한 균주의 배양 상등액을 상기 방법과 동일하게 제균하고 100 ㎕씩을 준비한 웰에 분주하고 25℃에서 24시간 반응시킨 후 루골 용액 (Sigma-aldrich, MO, USA)으로 염색한 뒤 분해능을 저지원의 직경의 크기를 관찰하여 측정하였다.
용혈성 및 유해 대사산물과 유해효소 생성 분석
균주의 용혈성을 확인하기 위하여 혈액 아가 배지를 이용하였으며, 혈액 아가 베이스(BD, USA)에 5% 양(sheep) 혈액(Kisanbio, korea)를 첨가하여 혈액 아가 배지를 제조하였다. 균주를 혈액 아가 배지에 접종하여 37℃에서 24~48시간 배양하여 균주 주위로 생기는 환의 형태로 용혈성을 확인하였다. 유해대사산물로 인돌(indole), 페닐피루브산(phenyl-pyruvic acid)의 생성 여부를 확인하였다. 트립토판(Tryptophan)의 탈아미노화로 인하여 생성되는 인돌을 균주가 생성하는지 확인하기 위하여 TSB 액체배지에 접종하고 37℃에서 24시간 진탕배양 후 인돌 용액 드로퍼 (BBL, USA)를 첨가하고 부드럽게 흔든 후 30초 내 배지 표면에 나타나는 색 변화로 인돌 형성 여부를 확인하였다. 페닐피루브산은 페닐알라닌 아가(BD, USA) 배지에 균주를 접종하여 37℃에서 24~48시간 배양 후 10% ferric-chloride를 3-4 방울 첨가 후 균주 주위로 색의 변화로 페닐피루브산 생성 여부를 확인하였다. 유해효소인 우레아제, β-글루쿠로니다아제의 생성 여부를 확인하였다. 우레아제는 우레아 신속 테스트 키트 (MB cell, korea)에 균주를 접종하고 바젤린 오일(vaseline oil)을 첨가하여 산소가 차단된 상태로 37℃에서 4~24 시간 배양하며 색 변화를 확인하여 우레아제 생성여부를 확인하였다. β-글루쿠로니다아제는 TBX 아가(Oxoid, germany) 배지에 균주를 접종하여 37℃에서 24~48시간 배양 후 균주의 색 변화를 확인하여 β-글루쿠로니다아제 생성여부를 확인하였다.
혈전분해효소 활성 측정
식품의약품안전처 독성연구소 혈전용해제의 효능검색 방법(Fibrin plate 방법, Astrup and Mullertz, 1952)을 변형하여 혈전분해 활성분석에 사용하였다. 100 unit/㎖ 트롬빈 용액을 90mm 페트리 디쉬에 200㎕ 분주하고 0.5% 피브리노겐 용액 (in PBS buffer, pH7.4) 10㎖과 1.0% 아가로스 용액 10㎖을 순서대로 분주하고 잘 혼합하여 평판 피브린 플레이트를 제조하였다. 선별된 균주는 LB 액체배지에서 30℃, 24시간 진탕 배양하여 15,000×g로 10분간 원심분리 후 상등액을 취하고 0.45㎛ 맴브레인 필터로 제균한 뒤 피브린 플레이트에 6mm hole에 각각 분주하였다. 37℃에서 20시간 반응 후 생긴 투명한 환의 지름을 측정하여 혈전분해 활성을 확인하였다. 양성대조구로 플라스민을 사용하였다.
식중독 관련 유해병원성 미생물에 대한 항균력 확인
식품을 부패 또는 오염시켜 식중독 유발 등 인체에 유해하다고 알려진 유해미생물에 대한 균주의 항균활성을 확인하였다. 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) KACC 10097, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) KACC 13064, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) KACC 10778, 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus) KACC 13397, 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) KACC 10259을 지시균주로 사용하였으며, 각 지시균주는 NB 배지에서 37℃, 24시간 배양 후 균일한 농도 (O.D.660; 0.4)로 NA 배지에 200㎕씩 분주하고 도말하였다. 균주는 LB 액체배지에서 30℃, 24시간 진탕배양 하여 15,000×g로 10분간 원심분리 후 상등액 취하고 0.45㎛ 맴브레인 필터로 제균한 뒤 6mm 페이퍼 디스크에 분주하였다. 분주한 후 30℃에서 24시간 배양하고 웰 주변에 생기는 억제환의 크기를 측정하여 균주의 유해미생물에 대한 길항 능력을 확인하였다.
선별 균주의 바실러스 세레우스 ( Bacillus cereus ) 독소 유전자 분석을 통한 안전성 분석
선별 균주를 대상으로 바실러스 세레우스가 생성하는 구토, 설사 관련 독소 유전자 보유 여부를 확인하기 위하여 PCR (Veriti 96-well Thermal Cycler, life technologies) 분석 방법을 이용하였다. 균주를 LB 액체배지에서 37℃에서 18시간 진탕 배양하여 원심분리로 세포를 모아 QIAamp DNA mini kit(QIAGEN)을 이용하여 DNA를 추출하였으며, 추출한 DNA와 PowerChekT Bacillus cereus Toxin 6-plex Detection Kit (코젠바이오텍)와 그 외 제작한 바실러스 세레우스 독소 유전자 프라이머를 사용하여 PCR 분석을 진행하였다. 선발균주를 대상으로 바실러스 세레우스 Toxin 6-plex Detection Kit에서 제공하는 6개 독소 유전자(cytK, nheA, entFM, bceT, hblC, CER)와 키트에서 제공하지 않는 4개 독소 유전자(hblA, hblB, nheB, nheC)의 보유 여부를 확인하였다. PCR 혼합물은 키트 매뉴얼에 따라 진행하였으며, PCR 반응 조건은 Veriti 96-well Thermal Cycler (Life technologies)를 이용하여 95℃에서 10분간 초기 변성 후, 95℃ 1분간 변성, 56℃ 1분간 결합, 72℃ 1분간 증폭 과정을 35회 반복하고 72℃에서 5분간 마지막 증폭을 실시하였다. PCR 산물은 0.5% TAE 버퍼에 0.5 ㎍/mL SYBR green가 포함된 1.0% 아가로스 겔로 전기영동 한 후 UV transilluminator (Gel documentation, Bio-Rad)에서 밴드를 확인하여 독소 유전자의 보유 여부를 확인하였다.
바이오제닉 아민 생성여부 확인
티라민, 히스타민의 정량 분석은 HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석에 사용한 티라민, 히스타민, 티로신, 히스티딘 댄실염화물 및 1,7-디아미노헵탄은 시그마 알드리치(sigma aldrich)사 제품을 구입하여 사용하였고, 프롤린, 에테르 및 염산은 삼천 화학 제품을 사용하였다. 아세토나이트릴과 물은 J.T. Baker사 제품을 구입해 사용하였다. 표준용액은 0.1 노르말 염산에 녹여 약 1 g/L 되도록 제조한 후 0.1에서 100 mg/L의 농도로 2종의 표준 용액을 희석해 준비하였고, 분석을 통하여 검량곡선을 작성하였다. 바이오제닉 아민 분석의 생성여부를 확인하기 위해 선별 균주를 티라민, 히스타민의 전구체인 티로신, 히스티딘이 각각 200 ppm이 함유된 LB 액체배지에 접종한 후 30℃에서 24시간 배양하였고, 배양액을 분석에 활용하였다. 배양액과 표준용액을 각각 시험관에 0.5 mL씩 취한 후 1,7-디아미노헵탄 (0.1g/L) 0.25 mL씩 첨가하였다. 포화탄산나트륨용액 0.25 ml와 1% 댄실염화물 아세톤 용액 0.4 mL를 추가하여 혼합한 후 마개를 하여 45℃에서 1시간 동안 유도체화 하였다. 유도체화 후 10% 프롤린 용액 0.25 mL를 가하여 과잉의 댄실염화물을 제거하고, 시험관에 에테르 2.5 mL를 가하여 3분간 진탕한 후 상등액을 취하여 이를 질소농축기에서 완전히 증발시킨 후 잔사를 아세토나이트릴 0.5 mL에 녹이고 0.45 ㎕ 필터로 여과한 후 HPLC를 이용하여 분석하였다. 분석조건은 아래 표와 같다.
바이오제닉 아민 분석을 위한 HPLC 기기 분석 조건
바이오제닉 아민 분석을 위한 HPLC 분석 조건
기기 Agilent 1200 series
(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)
컬럼 CapcellPak C18 Column
검출기 DAD detector (254 nm)
이동상 A: 0.1% formic acid in H2O
B: 0.1% formic acid in ACN
구배조건 A:B = 45:55, 0~10 min
A:B = 35:65, 10~15 min
A:B = 20:80, 15~20 min
A:B = 10:90, 20~30 min
A:B = 10:90, 40 min over
유량 1.0 mL/min
온도 40oC
주입량 20 μL
바이오제닉 아민 합성 유전자 분석
선별 균주에서 바이오제닉 아민 합성과 연관 있다고 알려진 티로신 디카르복시라제(hdc), 히스타민 디카르복시라제(tdc) 유전자 유무를 확인하기 위해 배양한 배양액을 QIAamp DNA mini kit(QIAGEN)을 이용하여 DNA를 추출 후, 특정 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 전체 부피 25㎕의 반응 혼합물(GeDEPOT)을 사용하였다. 1 ㎕의 게놈 DNA와 10 pmol 프라이머들을 넣었다. PCR 산물은 1.0% 아가로스 겔로 전기영동한 후 UV 트랜스일루미네이터에서 밴드를 확인하였다.
내산성 및 내담즙성 분석
pH 및 담즙산염에 대한 내성 효과를 알아보기 위하여 균주를 LB 액체배지에서 37℃에서 18시간 배양하여 실험을 진행하였다. 내산성 분석을 위해 LB 액체배지에서 37℃에서 18시간 배양액을 HCl과 NaOH를 이용하여 각각 pH 2.0과 7.0으로 조절한 후 37℃에서 3시간 진탕 배양하였다. 배양액을 0.85% 멸균 생리식염수로 연속 희석하여 LB 고체배지에 도말하고 37℃에서 18시간 배양하여 생균수를 측정하였다. pH 조절 전 생균수를 대조구로 생존률을 확인하여 내산성 정도를 확인하였다. 내답즙성 분석은 LB 액체배지에서 37℃에서 18시간 배양액에 담즙을 0, 0.3, 0.6% 첨가하여 37℃에서 3시간 진탕배양 후 배양액을 0.85% 멸균 생리식염수로 연속 희석하여 LB 고체배지에 도말하고 37℃에서 18시간 배양하여 생균수를 측정하였다. 담즙 첨가 전 생균수를 대조구로 생존률을 확인하여 내답즙성 정도를 확인하였다.
선발 균주의 세포표면 소수성 ( Hydrophobicity ) 측정
선발 균주 배양액에 소수성층으로 헥사데칸(hexadecane)을 넣고, 볼텍스 믹서(vortex mixer)로 진탕, 혼합한 후 상층의 탄화수소상(hydrocarbon phase)으로 이동된 세포의 양을 스펙트로포토미터(600nm 흡광도)를 이용하여 아래의 공식에 따라 세포표면의 소수성을 측정하였다.
표면 소수성(%) = 100 X (Absinital - Absfinal) / Absinitial
실시예 1. SRCM 100730의 동정
전통적인 방법으로 제조된 고추장에서 분리한 SRCM 100730 균주는 16S rRNA 염기서열을 해독하여 바실러스 속 표준균주들과 계통도를 분석한 결과 SRCM 100730 균주는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 표준균주들과 가장 가까운 근연 관계를 보여(도 1) 최종적으로 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 SRCM 100730로 명명하였으며, 한국미생물보존센터 (KCCM, Korean Culture Center of Microorganisms)에 KCCM 11966P(Bacillus amyloliquefaciens SRCM 100730)으로 기탁하였다. 바실러스 아밀로리퀘파시엔스는 바실러스 서틸리스와 함께 식품의약품안전처 고시에 따라 식품에 사용할 수 있는 균주로 적용할 수 있는 분야가 많을 것으로 사료된다.
실시예 2. 평판 배지를 이용한 세포외 효소의 활성 측정
미생물이 생성하는 다양한 효소들은 발효과정을 통해 콩이 가지는 단백질, 지질, 이소플라본 등을 아미노산, 지방산, 이소플라본, 아글리콘 등으로 분해하여 발효식품의 풍미를 향상시키고 기능성을 가지는 2차 대사산물을 생성한다고 알려져 있어 대표적인 세포 외 분해 효소인 단백질 분해효소와 다당류 분해효소, 섬유소 분해효소의 활성을 확인하였다. 콩의 단백질을 아미노산, 폴리펩티드 등으로 가수분해하여 구수한 맛을 향상시키는데 관여하는 프로테아제의 활성이 19mm로 매우 높은 활성을 가지는 것으로 확인하였으며, 다당류를 분해하여 감미성분 등에 관여하는 아밀라제의 활성 또한 12mm로 높은 활성을 가지고 있는 것을 확인할 수 있었다. 식물세포벽의 주성분인 셀룰라제의 활성도 11mm로 높은 것을 확인하여 발효 식품에 적용 시 풍미 향상 등이 기대되어 발효에 적합한 균주로 생각된다.
균주명 동정 효소 활성(직경, mm)
프로테아제 셀룰라제 아밀라제
SCGB 180 B. subtilis 16 w* 12
SRCM 101336 B. subtilis 11 9 12.6
SRCM 100730 B. amyloliquefaciens 19 11 12
w, 약한 반응
실시예 3. 바실러스 세레우스 독성 유전자 분석
SRCM 100730 균주에 대하여 바실러스 속의 식품 유해균인 바실러스 세레우스의 설사형 독소 및 구토형 독소 유전자 보유 여부를 확인하여 식품 내 안전성을 확인하였다. PCR 분석을 통하여 바실러스 세레우스의 10개의 독소 유전자를 확인한 결과, 10개에 해당하는 모든 독소 유전자를 보유하고 있지 않은 것으로 확인되었다. 따라서 SRCM 100730 균주는 식품 내에서 식중독에 관하여 안전성을 가짐을 확인 할 수 있었다.
바실러스 세레우스 독소 유전자 보유 여부 확인
균주명 동정 독소유전자
hblA ,C,D nheA ,B,C entFM cytK ces bceT
SRCM 100169 B. subtilis ND ND ND ND ND ND
SRCM 101336 B. subtilis ND ND ND ND ND ND
SRCM 100730 B. amyloliquefaciens ND ND ND ND ND ND
실시예 4. 용혈성 및 유해대사산물 , 유해효소 생성 여부 확인
SRCM 100730 균주를 대상으로 인체에 유해한 영향을 미칠 수 있는 물질과 효소의 생성 여부를 확인하기 위하여 용혈성, 인돌 및 페닐피루브산(phenyl-pyruvic acid), β-글루쿠로니다아제 및 우레아제에 대한 분석을 실시하였다. 용혈성은 적혈구 막을 파괴하여 황달 및 빈혈을 유발하는 β-헤몰리시스(γ-hemolysis)와 적혈구 막을 파괴하지 않고 헤모글로빈을 메트헤모글로빈으로 산화시키는 α-헤몰리시스, 용혈현상이 없는 γ-헤몰리시스로 나눠볼 수 있는데, SRCM 100730은 α-헤몰리시스로 병원성인 β-헤몰리시스가 아님을 확인할 수 있었다. 또한, 대장암 및 방광암을 유발시키는 물질로 알려져 있으며 트립토파나제(tryptophanase)에 의해 트립토판(tryptophan)에서 전환된 인돌과 유해대사산물로 알려진 페닐피루브산(phenyl-pyruvic acid)을 생성하지 않았으며, 발암에 유의하다고 알려진 β-글루쿠로니다아제 및 우레아제를 생성하지 않아 전체적으로 SRCM 100730 균주의 안전성을 확인할 수 있었다.
용혈성 및 유해물질, 유해효소 생성 여부 확인
균주명 동정 용혈성 유해물질 유해효소
Indole Phenyl-pyruvic acid β-glucuronidase Urease
SRCM
100169		 B. subtilis α-hemolysis - - - -
SRCM 101336 B. subtilis α-hemolysis - - - -
SRCM 100730 B. amyloliquefaciens α- hemolysis - - - -
-; 음성효과, +; 양성효과
실시예 4. 혈전분해효소 활성 측정
SRCM 100730 균주의 세포 외로 분비되는 혈전분해 효소의 활성을 확인하기 위하여 피브린 플레이트 방법을 이용하였다. 대조군으로 혈전용해효소인 플라스민을 농도별로 처리하여 혈전분해 활성을 비교한 결과, SRCM 100730 균주는 17.9mm로 플라스민 0.5 Unit 이하에 해당하는 활성을 가지고 있는 것으로 확인할 수 있었다. 부작용이 많은 혈전용해제를 대신한 새로운 혈전용해제에 대한 연구가 활발하며 특히 발효식품에 대한 관심이 높아지는 추세에 SRCM 100730 균주는 기존의 혈전용해제 대체에 새로운 가능성을 보여 주었다.
혈전 용해 활성 분석
균주명 동정 혈전분해 활성
(할로직경(mm), 평균±SD)
SRCM 100169 B. subtilis 12.6 ± 0.6
SRCM 101336 B. subtilis 9.4 ± 0.1
SRCM 100730 B. amyloliquefaciens 17.9 ± 0.2
Plasmin 750 ug /ml 1.5U 22
Plasmin 500 ug /ml 1.0U 21
Plasmin 250 ug /ml 0.5U 20
실시예 5. 내산성 및 내담즙성 분석
사람의 소화기관을 안정적으로 많은 수의 생균이 장내까지 도달하기 위하여 가져야 할 특성으로 위액의 낮은 pH와 미생물의 세포막에 영향을 주어 사멸하게 하는 담즙산에 대한 내성을 SRCM 100730 균주를 대상으로 확인하였다. SRCM 100730 균주는 0.3% 담즙산과 0.6% 답즙산에 내성을 가지고 있으며, pH 2.0에서도 생존하는 것을 확인하여 프로바이오틱스 균주로써 장내까지 생균으로 도달할 수 있음을 확인할 수 있었다.
SRCM 100730 내산성 및 내담즙성 분석
균주명 동정 pH
(log CFU /ml) 		Bile salt
(log CFU /ml)
pH 7.0 pH 2.0 Oxgall 0.3% Oxgall 0.6%
SCGB
180		 B. subtilis 6.46 2.27 4.76 5.59
SRCM
101336		 B. subtilis 7.03 1.65 6.02 6.27
SRCM 100730 B. amyloliquefaciens 6.18 4.32 5.95 5.73
실시예 6. 세포표면 소수성 ( Hydrophobicity ) 측정
SRCM 100730 균주의 프로바이오틱스 특성인 세포표면 소수성을 측정한 결과 헥사데칸에에 대하여 프로바이오틱스 균주도 잘 알려진 락토바실러스 람노서스 GG(LGG)보다 낮게 측정되었으나 70%의 소수성을 보여 장막과 소수결합하여 장내 부착이 가능할 것으로 확인할 수 있었다.
선발 균주의 세포표면 소수성 측정
균주명 동정 소수성 (%)
SCGB 180 B. subtilis 59
SRCM 101336 B. subtilis 57
SRCM 100730 B. amyloliquefaciens 70
LGG L. rhamnosus GG 81
실시예 7. 식품 유해 미생물에 대한 항균활성 분석
SRCM 100730 균주를 대상으로 구토와 설사 등을 유발하는 유해병원성 미생물에 대한 항균활성을 확인한 결과, 스타필로코커스 아우레우스 KACC 10778에 대해서는 항균 활성을 보이지 않았으며, 바실러스 세레우스 KACC 10097에 대해서는 높은 항균 활성을 보임을 확인할 수 있었다. 이외 바실러스 세레우스 KACC 13064, 마이크로코커스 루테우스 KACC 13397, 슈도모나스 에루기노사 KACC 10259에서도 항균 활성을 보이는 바 장내 유해미생물 제어에 효과가 있을 것으로 분석되었다.
선발 균주의 항균 활성
균주명 동정 항균활성 (직경, mm)
바실러스 세레우스
KACC 10097		 바실러스 세레우스
KACC 13064		 스타필로코커스 아우레우스
KACC 10778		 마이크로코커스 루테우스
KACC 13397		 슈도모나스 에루기노사
KACC 10259
SRCM 100169 B. subtilis - - - - -
SRCM 101336 B. subtilis - - - - -
SRCM 100730 B. amyloliquefaciens 8.1 7.7 - 6.9 7
-, 반응 없음
실시예 8. 정성적 바이오제닉 아민 생성능 분석 및 정량적 바이오제닉 아민 분해능 분석
바이오제닉 아민은 생체 유지에 필수적인 물질이나 과량 섭취 시 구토 및 설사, 두통 등의 독성 반응을 보여 최근 국내에서도 발효식품 내 규격 및 검출에 관련한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 콩을 이용한 발효식품의 경우 아미노산과 단백질 함량이 높아 미생물의 대사와 상호 작용으로 바이오제닉 아민이 생성되기 좋은 조건을 가지고 있다. 2006년 국내 유통 발효식품 34종 중 전통장류의 바이오제닉 아민 함량이 높게 나타남에 따라 전통 장류 섭취로 인하여 과량의 바이오제닉 아민 섭취가 가능할 수 있으므로 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 균주를 확보하는 것이 필수적으로 요구되어 선별 균주를 대상으로 바이오제닉 아민 생성 여부를 확인하였다.
전구체 아미노산인 티로신과 히스티딘을 첨가한 배지를 이용한 정성적 방법을 이용하여 바이오제닉 아민 생성 여부를 확인한 결과 SRCM 100730 균주는 티라민과 히스타민을 생성하지 않는 것으로 확인할 수 있었다. 또한, SRCM 100730 균주는 바이오제닉 아민이 첨가된 최소배지에서 배양 후 바이오제닉 아민 잔여량을 HPLC로 확인한 결과, 티라민, 퓨트레신, 카다베린이 초기 첨가량보다 낮아져 바이오제닉 아민을 분해한 것을 확인할 수 있었다.
선별 균주의 바이오제닉 아민 생성 및 분해 능 분석
균주명 동정 바이오제닉 아민 생성 바이오제닉 아민 분해율 (%)
티라민 히스타민 히스타민 티라민 퓨트레신 카다베린
SCBG
180		 B. subtilis ND ND - - - -
SRCM
101336		 B. subtilis ND ND - - - -
SRCM 100730 B. amyloliquefaciens ND ND ND 17 22 15
* ND ; 검출 안됨
실시예 9. 바이오제닉 아민 합성 유전자 분석
바이오제닉 아민에 대한 안전성을 확인하기 위하여 바이오제닉 아민 합성에 관여하는 유전자를 보유하는지 확인하였다. 티라민과 히스타민 합성에 관여하는 것으로 알려진 티로신 디카르복시라제(tdc)와 히스타민 디카르복시라제(hdc) 유전자의 유무를 확인한 결과 SRCM 100730 균주는 유전자를 보유하지 않음을 확인하였다.
선별균주의 바이오제닉 아민 관련 유전자 분석
균주명 동정 tdc hdc
SRCM 100169 B. subtilis ND ND
SRCM 101336 B. subtilis ND ND
SRCM 100730 B. amyloliquefaciens ND ND
* ND ; 검출 안됨
한국미생물보존센터(국외) KCCM11966P 20170203
<110> Microbial Institute for Fermentation Industry <120> Bacillus amyloliquefaciens SRCM 100730 strain having antimicrobial activity and probiotics properties and uses thereof <130> PN17132 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1559 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens SRCM 100730 <400> 1 tctcgtcaga cgaacgctgg cggcgtgcct aatacatgca agtcgagcgg acagatggga 60 gcttgctccc tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcctgtaag 120 actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgc ttgtttgaac cgcatggttt 180 cacacataaa aggtggcttc ggctaccact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt 240 tggtgaggta acggctcacc aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc 300 acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc 360 aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa 420 gctctgttgt tagggaagaa caagtgccgt tcaaataggg cggcaccttg acggtaccta 480 accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt 540 tgtccggaat tattgggcgt aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc 600 ccccggctca accggggagg gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag aagaggagag 660 tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg 720 cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag 780 ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct 840 tagtgctgca gctaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac 900 tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac 960 gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaatcc tagagatagg acgtcccctt 1020 cgggggcaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1080 taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca gcattcagtt gggcactcta 1140 aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtgggggatg acgtcaaatc atcatgcccc 1200 ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag 1260 gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt 1320 gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct 1380 tgtacacacc gcccgtcaca ccacgaagag tttgtaacac ccgaagtcgg tgaggtaacc 1440 ttttaggagc cagccgccga aggtgggaca gatgattggg gtgaatctac aggtaaaccc 1500 gcgataaaag ggggtgtaaa ttaaccagtg agttatgggg tgtgctcccg ggggagcgg 1559 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims (5)

  1. 내산성, 내담즙성, 프로테아제, 셀룰라제 및 아밀라제 분비능, α-용혈 활성, 혈전분해 활성, 바실러스 세레우스, 마이크로코커스 루테우스 및 슈도모나스 에루기노사에 대한 항균활성 및 장내 부착능이 있고, 티라민, 퓨트레신 및 카다베린을 분해하며, 티라민, 히스타민, 인돌, 페닐피루브산, β-글루쿠로니다아제 및 우레아제를 생성하지 않는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM 100730 균주(KCCM11966P).
  2. 삭제
  3. 제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제.
  4. 제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 제조용 스타터(starter) 조성물.
  5. 제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 바실러스 세레우스, 마이크로코커스 루테우스 또는 슈도모나스 에루기노사에 대한 항균용 조성물.
KR1020170040454A 2017-03-30 2017-03-30 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 srcm 100730 균주 및 이의 용도 KR101839375B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170040454A KR101839375B1 (ko) 2017-03-30 2017-03-30 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 srcm 100730 균주 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170040454A KR101839375B1 (ko) 2017-03-30 2017-03-30 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 srcm 100730 균주 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR101839375B1 true KR101839375B1 (ko) 2018-03-19

Family

ID=61911289

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170040454A KR101839375B1 (ko) 2017-03-30 2017-03-30 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 srcm 100730 균주 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101839375B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101993617B1 (ko) * 2018-05-21 2019-06-27 재단법인 발효미생물산업진흥원 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 락토바실러스 펜토서스 srcm101105 균주 및 이의 용도
KR102065581B1 (ko) * 2018-11-12 2020-01-13 재단법인 발효미생물산업진흥원 항균 물질을 합성하는 유전자를 보유하며, 프로바이오틱스 특성을 가지는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 srcm101368 균주 및 이의 용도

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101993617B1 (ko) * 2018-05-21 2019-06-27 재단법인 발효미생물산업진흥원 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 락토바실러스 펜토서스 srcm101105 균주 및 이의 용도
KR102065581B1 (ko) * 2018-11-12 2020-01-13 재단법인 발효미생물산업진흥원 항균 물질을 합성하는 유전자를 보유하며, 프로바이오틱스 특성을 가지는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 srcm101368 균주 및 이의 용도

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101839374B1 (ko) 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 바실러스 서틸리스 scgb 574 균주 및 이의 용도
KR102115506B1 (ko) 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 락토바실러스 파라카제이 srcm102343 균주 및 이의 용도
KR101589028B1 (ko) 바이오제닉 아민은 생산하지 않고, 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있는 바실러스 서틸리스 scj4 균주 및 이의 용도
JP2001000143A (ja) Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ除菌性飲食品
KR101839371B1 (ko) 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 srcm 100731 균주 및 이의 용도
KR102044365B1 (ko) 장 부착능이 우수하고, 항균 물질을 합성하는 유전자를 보유하며, 프로바이오틱스 특성을 가지는 바실러스 서틸리스 scdb 291 균주 및 이의 용도
KR102065580B1 (ko) 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 락토바실러스 브레비스 scml 432 균주 및 이의 용도
KR101993617B1 (ko) 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 락토바실러스 펜토서스 srcm101105 균주 및 이의 용도
KR101394322B1 (ko) 신규한 바실러스 서브틸리스 ｂｃｎｕ 9169 균주 및 이를 유효성분으로 포함하는 생균제 조성물
KR101589026B1 (ko) 바이오제닉 아민은 생산하지 않고, 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있는 바실러스 서틸리스 scj1 균주 및 이의 용도
KR102159379B1 (ko) 장 부착능 및 세포외 효소 분비능이 우수하고, 프로바이오틱스 특성을 가지는 바실러스 서틸리스 srcm101371 균주 및 이의 용도
KR101839375B1 (ko) 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 srcm 100730 균주 및 이의 용도
KR101811246B1 (ko) 내산성, 내담즙성, 항산화 활성, 리파아제 저해활성, 혈전분해활성 및 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 scgb 320 균주 및 이의 용도
KR101839372B1 (ko) 내산성, 내담즙성, 항산화 활성 및 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제, 셀룰라제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 scgb 634 균주 및 이의 용도
KR101860836B1 (ko) 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 scgb 1 균주 및 이의 용도
KR101996080B1 (ko) 항균 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 락토바실러스 플란타룸 srcm101594 균주 및 이의 용도
KR20220004865A (ko) 프로바이오틱스 관련 효소 분비능, 항산화 활성, 담즙산염 분해 활성, 항균 활성이 있고, 유해효소 및 유해대사산물을 생성하지 않는 락토바실러스 브레비스 srcm101607 균주 및 이의 용도
KR102136064B1 (ko) 담즙산염 분해 활성 및 식품 유해균에 대한 항균 활성을 가지며, 프로바이오틱스 특성을 보유한 락토바실러스 브레비스 scml 379 균주 및 이의 용도
KR20220004864A (ko) 프로바이오틱스 관련 효소 분비능, 혈전분해 활성, 항균 활성이 있고, 유해효소 및 유해물질을 생성하지 않는 락토바실러스 플란타룸 srcm101587 균주 및 이의 용도
KR102159380B1 (ko) 항산화 활성과 프로바이오틱스 특성을 갖는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 srcm101439 균주 및 이의 용도
KR20220000109A (ko) 프로바이오틱스 관련 효소 분비능, 혈전분해 활성, 항균 활성이 있고, 유해효소 및 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 바실러스 서브틸리스 srcm101393 균주 및 이의 용도
KR101811241B1 (ko) 내산성, 내담즙성, 항산화 활성, 리파아제 저해활성 및 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라제 효소를 분비하는 바실러스 서틸리스 scgb 180 균주 및 이의 용도
KR20150129233A (ko) 신규한 바실러스 라이체니포미스 균주 및 이의 용도
KR101816129B1 (ko) 리파아제 저해활성, 글루타메이트 생산능 및 유해 미생물에 대한 항균 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 바실러스 서틸리스 scdb 352 균주 및 이의 용도
KR102100367B1 (ko) 장 부착능이 우수하고, 항노화 활성 및 프로바이오틱스 특성을 가지는 락토바실러스 브레비스 srcm103306 균주 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant