KR102100367B1 - 장 부착능이 우수하고, 항노화 활성 및 프로바이오틱스 특성을 가지는 락토바실러스 브레비스 srcm103306 균주 및 이의 용도 - Google Patents
장 부착능이 우수하고, 항노화 활성 및 프로바이오틱스 특성을 가지는 락토바실러스 브레비스 srcm103306 균주 및 이의 용도 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 내산성, 내담즙성, 효소 분비능, 커드 생성능, γ-용혈 활성, 항생제 내성, 항노화 활성, 유해 미생물에 대한 항균활성 및 장 부착능이 있고, 바이오제닉 아민, 유해대사산물 및 유해효소를 생성하지 않는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM103306 균주에 관한 것으로, 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SRCM103306 균주는 정장제, 장류 제조를 위한 스타터 균주 및 항균용 조성물 등의 관련 산업 분야에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 장 부착능이 우수하고, 항노화 활성 및 프로바이오틱스 특성을 가지는 락토바실러스 브레비스 SRCM103306 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
최근 현대인들의 생활수준 향상과 더불어 건강에 대한 관심도 높아지고 있으며, 건강 증진을 위하여 체내 자연 균총을 새롭게 형성하거나 면역계 활성 등을 위하여 프로바이오틱스(probiotics)라는 미생물 식품 보충제가 널리 사용되고 있다. 일반적으로 프로바이오틱스로 사용되는 미생물들은 위장의 위산, 담낭의 담즙 및 소장에서 분비되는 각종 소화효소와 같은 저해환경으로부터 저항력을 가지며 대장과 직장에 도달해 증식하고 정착하는 능력을 구비해야 한다. 현재, 프로바이오틱스로는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 바실러스 폴리퍼멘티쿠스(Bacillus polyfermenticus), 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) 등이 주로 연구되었다. 그 중 바실러스 속은 산업적으로 중요한 종으로 오랜 세월 동안 식품, 의약품 및 각종 발효 산업에서 사용되어 안전성이 확립되어 있다.
프로바이오틱스(Probiotics)란 살아있는 생균제로서 사람 및 동물에 투여된 생균이 장내의 소화관 벽에 밀집, 정착하여 유해균이 정착하지 못하게 하는 작용을 하며, 유산을 생성하여 장내의 pH를 낮추어서 유해세균이 증식하지 못하게 한다. 또한, 투여된 프로바이오틱스는 박테리오신(bacteriocin) 혹은 과산화물을 생성하여 병원균의 증식을 억제하며 영양분의 흡수를 담당하는 장융모의 활동을 도와준다. 이밖에도, 프로바이오틱스는 영양소의 흡수와 이용을 돕는 물질을 생성하고, 사료요구율을 개선시키며, 병원균이 생성하는 독성물질을 중화하는 물질을 생성하기도 한다. 프로바이오틱스는 대체로 동물 혹은 어류가 스트레스로 인한 소화관의 유용 균주 감소를 억제할 목적으로 이용되며, 항생물질을 경구투여하고 난 후 병원균보다 먼저 세균이 없는 소화관 벽에 부착하여 병원균이 정착하는 것을 방지한다.
프로바이오틱스로서 필요한 특성은 안전성, 기능적 측면(생존성, 정착성, 서식성, 항미생물제 생성능, 면역 촉진능, 항유전독성 활성, 병원성 세균의 억제능), 기술적 측면(관능적 특성, 안정성, 박테리오파지 저항성, 제조과정 중의 생존성) 및 GRAS(Generally Recognized As Safe) 미생물이다. 프로바이오틱스는 항생제와는 반대되는 특성을 가지고 있는데, 항생제가 미생물이 생산하는 대사 산물로서 소량으로 다른 미생물의 발육을 억제하거나 사멸시키는 물질이라면 프로바이오틱스는 균들의 공생, 상생의 능력을 이용하여 면역기능을 증진시키고 유해 미생물의 성장을 저해하는 등의 효과를 나타내고 있어 이러한 면역 증진 기능을 지닌 기능성 물질 및 프로바이오틱스는 현재 오남용으로 사회적 문제가 되고 있는 항생제의 대체 물질로서 이용이 가능하다.
한편, 한국공개특허 제2013-0068864호에는 '열무김치로부터 분리된 감마-아미노뷰티르산을 생산하는 락토바실러스 브레비스 균주 및 이의 용도'에 대해 개시하고 있고, 한국공개특허 제2015-0032379호에는 'GABA 생산능이 우수한 락토바실러스 브레비스 4-12 균주 및 이를 함유한 김치의 제조방법'에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 '장 부착능이 우수하고, 항노화 활성 및 프로바이오틱스 특성을 가지는 락토바실러스 브레비스 SRCM103306 균주 및 이의 용도'에 대해 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 내산성, 내담즙성, 11종의 효소 분비능, 커드(curd) 생성능, γ-용혈 활성, 21종의 항생제에 대한 내성, 항노화 활성, 장 부착능, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)에 대한 항균활성이 있고, 바이오제닉 아민인 히스타민 및 티라민, 유해대사산물인 인돌(indole) 및 페닐피루브산(Phenylpyruvic acid), 그리고 유해효소인 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 및 우레아제(urease)를 생성하지 않는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM103306 균주(KCCM12445P)를 분리하였다. 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SRCM103306 균주는 상기와 같은 프로바이오틱스 특징을 가지므로, 정장제로 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 품질 좋은 장류 혹은 발효유 제조를 위한 스타터 균주 그리고 항균용 제제로도 사용이 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 내산성, 내담즙성, 효소 분비능, 커드(curd) 생성능, γ-용혈 활성, 항생제 내성, 항노화 활성, 유해 미생물에 대한 항균활성 및 장 부착능이 있고, 바이오제닉 아민, 유해대사산물 및 유해효소를 생성하지 않는, 기탁번호가 KCCM12445P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM103306 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 또는 발효유 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 락토바실러스 브레비스 SRCM103306 균주는 내산성, 내담즙성, 커드(curd) 생성능, γ-용혈 활성, 항노화 활성 및 장 부착능이 있고, 다양한 분해효소를 분비하고 다양한 당을 이용할 수 있으며, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)의 증식을 억제할 뿐만 아니라, 21종의 항생제에 대해 내성을 나타내고, 바이오제닉 아민인 히스타민 및 티라민, 유해대사산물인 인돌(indole) 및 페닐피루브산(Phenylpyruvic acid) 그리고 유해효소인 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 및 우레아제(urease)를 생성하지 않으므로, 정장제, 장류 또는 발효유 제조를 위한 스타터 균주 및 항균용 조성물 등의 관련 산업 분야에 매우 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 분리한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM103306 균주의 16S rRNA의 염기을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 락토바실러스 브레비스 SRCM103306 균주의 계통도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에서 분리한 28종의 유산균 균주를 대상으로 항노화 관련 pmk-1 유전자의 발현 증가 효과를 나타낸 것이다. LGG는 비교대조구로 사용한 락토바실러스 람노서스 GG 균주이며, OP50은 예쁜꼬마선충의 일반적인 먹이로서 대장균 OP 균주를 나타낸다.
도 4는 본 발명에서 분리한 락토바실러스 브레비스 SRCM103306 균주의 수명연장 효과를 나타낸 것이다. 103305 및 103457은 비교대조구인 SRCM103305 및 SRCM103457 균주이고, LGG는 양성대조구로 사용한 락토바실러스 람노서스 GG 균주이며, OP50은 예쁜꼬마선충의 일반적인 먹이로서 대장균 OP50 균주를 나타낸다.
도 5는 본 발명에서 분리한 락토바실러스 브레비스 SRCM103306 균주의 장 부착능을 나타낸 것이다. 103305 및 103457은 비교대조구인 SRCM103305 및 SRCM103457 균주이고, LGG는 양성대조구로 사용한 락토바실러스 람노서스 GG 균주이다.
도 2는 본 발명에서 분리한 락토바실러스 브레비스 SRCM103306 균주의 계통도를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에서 분리한 28종의 유산균 균주를 대상으로 항노화 관련 pmk-1 유전자의 발현 증가 효과를 나타낸 것이다. LGG는 비교대조구로 사용한 락토바실러스 람노서스 GG 균주이며, OP50은 예쁜꼬마선충의 일반적인 먹이로서 대장균 OP 균주를 나타낸다.
도 4는 본 발명에서 분리한 락토바실러스 브레비스 SRCM103306 균주의 수명연장 효과를 나타낸 것이다. 103305 및 103457은 비교대조구인 SRCM103305 및 SRCM103457 균주이고, LGG는 양성대조구로 사용한 락토바실러스 람노서스 GG 균주이며, OP50은 예쁜꼬마선충의 일반적인 먹이로서 대장균 OP50 균주를 나타낸다.
도 5는 본 발명에서 분리한 락토바실러스 브레비스 SRCM103306 균주의 장 부착능을 나타낸 것이다. 103305 및 103457은 비교대조구인 SRCM103305 및 SRCM103457 균주이고, LGG는 양성대조구로 사용한 락토바실러스 람노서스 GG 균주이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 내산성, 내담즙성, 효소 분비능, 커드(curd) 생성능, γ-용혈 활성, 항생제 내성, 항노화 활성, 유해 미생물에 대한 항균활성 및 장 부착능이 있고, 바이오제닉 아민, 유해대사산물 및 유해효소를 생성하지 않는, 기탁번호가 KCCM12445P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM103306 균주를 제공한다.
본 발명에서는 막걸리로부터 유산균 균주를 분리하였고, 그 중 내산성, 내담즙성, 효소 분비능, 커드(curd) 생성능, γ-용혈 활성, 항생제 내성, 항노화 활성, 유해 미생물에 대한 항균활성 및 장 부착능이 있고, 바이오제닉 아민, 유해대사산물 및 유해효소를 생성하지 않는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 균주를 분리·동정하였으며, 이를 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM103306 균주로 명명하여 한국미생물보존센터(KCCM)에 2019년 02월 28일에 기탁하였다(기탁번호: KCCM12445P).
본 발명의 락토바실러스 브레비스 SRCM103306 균주(KCCM12445P)에 있어서, 상기 분비 가능한 효소는 알카라인 포스파타아제(Alkaline phosphatase), 루신 아릴아미다아제(leucin arylamidase), 발린 아릴아미다아제(valine arymidase), 시스틴 아릴아미다아제(cystine arylamidase), α-키모트립신(α-chymotrypsin), 산성 인산가수분해효소(Acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(Naphol-AS-BI-phosphohydrolase), α-갈락토시다아제(α-galactosidase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), α-글루코시다아제(α-glucosidase) 및 β-글루코시다아제(β-glucosidase)이다.
또한, 본 발명의 SRCM103306 균주가 내성을 보이는 상기 항생제는 세프타지딤(ceftazidime), 세푸록심(cefuroxime), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 클린다마이신(clindamycin), 카나마이신(kanamycin), 린코마이신(lincomycin), 메티실린(methicillin), 메트로니다졸(metronidazole), 날리딕스산(nalidixic acid), 노르플록사신(norfloxacin), 옥사실린(oxacillin), 페니실린 G(penicillin G(1IU, 10IU 및 2IU)), 피페미드산(pipemidic acid), 피페라실린(piperacillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 테이코플라닌(teicoplanin), 트리메토프림(trimethoprim), 트리메토프림-설파메톡사졸(trimethoprim-sulfamethoxazole) 및 반코마이신(vancomycin)이며, 본 발명의 SRCM103306 균주가 항균 활성을 보이는 상기 유해 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)이다.
본 발명의 SRCM103306 균주가 생성하지 않는 것으로 확인된 바이오제닉 아민은 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine)이며, 상기 유해물질은 인돌(indole) 및 페닐피루브산(Phenylpyruvic acid)이고, 상기 유해효소는 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 및 우레아제(urease)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 내산성은 pH 2~5에 대한 내산성이며, 내담즙성은 0.1~1%의 담즙산염에 대한 내담즙성이다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
상기 프로바이오틱스 제제는 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 락토바실러스 브레비스 SRCM103306 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물은 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여 산제(powder), 액제(liquids and solutions), 정제(tablet), 캡슐(capsule), 시럽(syrup), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 투여 용량은 체내에서의 활성성분의 흡수도, 불활성률, 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 축종, 상태 및 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 프로바이오틱스 제제를 포함하는 식품을 제공한다.
본 발명의 상기 프로바이오틱스 제제는 내산성, 내담즙성, 효소 분비능, 커드(curd) 생성능, γ-용혈 활성, 항생제 내성, 항노화 활성, 유해 미생물에 대한 항균활성 및 장 부착능이 있고, 바이오제닉 아민, 유해대사산물 및 유해효소를 생성하지 않는, 락토바실러스 브레비스 SRCM103306 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 상기 프로바이오틱스 제제를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 프로바이오틱스를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 프로바이오틱스 제제는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 혼합양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 혼합양은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 프로바이오틱스 제제를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 빵, 캔디류, 스낵류, 과자류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 또는 발효유 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 장류 제조용 스타터(starter)란 장류 제조를 위해 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 장류 제조 시에 첨가함으로써 발효된 장류에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 장류 발효용 스타터를 사용하여 장류를 제조하는 경우, 상기 장류 발효용 스타터에 포함된 미생물에 의하여, 장류의 품질을 일정하게 조절하거나, 특정한 목적, 일 예로 장류에서 이취를 발생시키지 않거나, 감소시키는 목적 또는 장류에서 구수한 맛이나 단맛을 강화시키기 위한 목적을 달성할 수 있다.
본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 균주를 배양하는 단계에서 얻어지는 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 첨가제로 사용할 경우, 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 그대로 첨가하거나 다른 첨가제를 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 이용하여 장류 또는 발효유를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 유해 미생물에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명의 항균용 조성물이란 항미생물제를 총칭하는 의미인 항생제와 같은 의미일 수 있고, 항진균제, 살균제, 방부제, 보존제 또는 제균제와 같은 의미일 수 있으며, 바람직하게는 바실러스 세레우스, 마이크로코커스 루테우스 등을 포함하는 병원성 미생물의 발육과 생활 기능을 저지 또는 억제할 수 있는 물질을 의미할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항균 조성물은 락토바실러스 브레비스 SRCM103306 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물 외에 당질, 단백질, 지질, 비타민류 및 미네랄류를 포함할 수 있다. 상기 당질, 단백질, 지질, 비타민류 또는 미네랄류는 그 사용 목적 및 용도에 따라 적의 선택될 수 있으며, 일 예로 상기 당질은 벌꿀, 덱스트린, 수크로오스, 팔라티노스, 포도당, 과당, 물엿, 당알콜(sugar alcohol), 소르비톨, 크실리톨, 말티톨일 수 있고 상기 단백질은 카제인(casein), 유청 단백질(whey protein) 등의 우유 유래 단백질, 대두 단백질, 이들 단백질의 트립신, 펩신 등의 동물 유래 효소 및 뉴트라아제(neutrase), 알칼라아제(alkilase)에 의한 가수분해물일 수 있으며, 상기 지질은 제1가 포화지방산, 다가 불포화지방산을 포함하는 해바라기유, 채종유(rapeseed oil), 올리브유, 홍화유(safflower oil), 옥수수유, 대두유, 팜유(palm oil), 야자유 등의 각종 식물 유래 유지, 중쇄 지방산(middle-chain fatty acid), EPA, DHA, 대두유래 인지질, 우유 유래 인지질일 수 있고, 상기 미네랄류는 인산칼륨, 탄산칼륨, 염화칼륨, 염화나트륨, 유산칼슘, 글루콘산칼슘, 판토텐산칼슘, 카제인칼슘, 염화마그네슘, 황산제1철, 탄산수소나트륨일 수 있으나, 각각의 예에 의해 특별히 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
균주 분리 및 배양 조건
유산균 분리를 위하여 막걸리 시료 1mL을 취하여 멸균된 0.85% 염화나트륨 용액 9mL에 단계별로 희석하였다. 희석액 100㎕을 Lactobacilli MRS 아가(DifcoTM, MI, USA)를 함유하는 플레이트 상에 도말하여 37℃에서 48시간 배양한 후 락토바실러스와 유사한 형태적 특징을 갖는 균주를 1차 선별하였다. 순수 분리한 유산균은 MRS 고체 배지에 배양하여 10% 스킴 밀크(BD Difco, Sparks, MD, USA) 용액에 현탁하고 -80℃에서 보관하여 사용하였다.
예쁜꼬마선충의
준비
예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 AY102 돌연변이 및 fer - 15;fem -1 돌연변이를 사용하였다. 예쁜꼬마선충의 알만을 모으기 위해 지름 90mm의 플레이트에 변형된 NGM 아가 배지(염화나트륨 3g/L, 아가 20g/L, 박토 펩톤 3.5g/L, 1M 황산마그네슘 1㎖/L, 1M 인산칼륨 버퍼 25㎖/L, 1M 염화칼슘 1㎖/L, 스트렙토마이신(100mg/㎖) 1㎖/L, 니스타틴 현탁액(50 unit/㎖) 5㎖/L, pH 6.0)와 5M 수산화칼륨 100㎕ 및 치아염소산나트륨(MW 74.44) 400㎕을 포함하는 블리칭 용액(bleaching solution)을 준비하였다.
배양 중인 플레이트를 검경하여 예쁜꼬마선충 주변에 1~2개의 알을 확인하였으며, 1ml의 NGM 버퍼로 세척한 후 수거하여 이튜브(e-tube)에 옮긴 후, 5,000 rpm으로 스핀다운(spin-down)한 다음, 상등액을 제거하였고 최종 부피는 700㎕이 되었다. 이후에, 300㎕의 블리칭 용액을 첨가하여 2분 30초 동안 약하게 볼텍싱(vortexing)하였으며, 검경하여 예쁜꼬마선충의 알을 확인하고 예쁜꼬마선충이 많이 보이면 볼텍싱(vortexing)을 추가로 수행하여 모두 잔여물(debris)이 될 때까지 처리하였다. 5000 rpm에서 1~2분 동안 원심분리를 한 후 상등액을 제거하자 최종 부피가 100㎕이 되었으며, 이 과정을 총 3번 반복하였다. 이 과정을 통해 분리한 알을 NGM 플레이트(OP50 없는 플레이트)에 옮겨 이를 검경(30-40 egg/site)하였다. 이를 NGM 플레이트에 고루 퍼뜨린 후 건조시켜 배양기로 이동시키고, 이후에 알에서 선충이 깨어난 후 대장균 OP50을 도말한 NGM 플레이트로 옮겨, L4 단계(유충 상태)가 되도록 동조화(age synchronized worm)시켰다.
세균 배양 및 분석용 플레이트 준비
비병원성 대장균 OP50을 LB 아가 배지(Luria-Bertani agar, BD Difco, Sparks, MD, USA)를 이용하여 37℃에서 배양하였으며, 선별 균주 및 양성대조구인 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) GG는 MRS 배지(de Man, Rogosa and Sharpe, BD Difco, Sparks, MD, USA)를 이용하여 37℃에서 배양하였다. 배양된 비병원성 대장균 OP50과 선별 균주들은 각각 원심분리(7,000 rpm, 10 min)하여 세포 펠렛만 회수하였다. 최종적으로, M9 버퍼(제1인산칼륨 3g/L, 인산수소이나트륨 6g/L, 염화나트륨 5g/L 및 1M 황산마그네슘 1ml/L)를 사용하여 각각 5배 균주 농축액을 제조한 다음 변형된 NGM 아가 플레이트에 분주하고 상온에 충분히 건조시킨 후, 100㎕씩 도말하여 건조 후 4℃에서 보관하면서 2주 동안 실험에 사용하였다.
GFP
형광 단백질을 이용한 항노화 기능성 탐색
L4/young adult 단계의 예쁜꼬마선충 AY102 돌연변이를 M9 버퍼로 2회 세척한 후 선별 균주가 분주된 변형된 NGM 아가 배지에 옮겨 25℃에서 24시간 동안 노출시켰다. 선별 균주에 24시간 노출된 예쁜꼬마선충을 M9 버퍼로 3회 세척한 후, MP 버퍼에 아가로오스를 첨가한 후 전자레인지로 용해시켜 제조한 2% 아가로오스 겔 패드에 옮기고 30mM NaN3를 노출하여 마취하였다. DIC 형광현미경(Olympus, JP/IX53)을 이용하여 예쁜꼬마선충 장관 부위의 pmk-1(P38 map Kinase family protein 1) 유전자 발현 변화를 시각화하여 관찰하였다. 이미지 J 프로그램을 사용하여 이미지의 형광 강도를 측정하고 타겟 유전자가 대조구인 락토바실러스 람노서스 GG 보다 상대적으로 높게 발현된 선별 균주를 선발하였다.
수명연장 미생물 기능성 평가
L4/young adult 단계의 예쁜꼬마선충 fer - 15;fem -1 돌연변이를 M9 버퍼로 2회 세척한 후 선별 균주의 플레이트에 옮겨 25℃에서 3주 동안 보관하며 매일 생존율을 측정하였다. 일반적으로, 백금 와이어를 이용하여 조심스럽게 터치한 후 반응을 나타내면 살아있는 것으로 평가하였으며, 정확한 측정과 배지의 오염예방을 위해 3일 간격으로 새로운 배지로 교체하였다.
장
부착능
평가
L4/young adult 단계의 예쁜꼬마선충 fer - 15;fem -1 돌연변이를 M9 버퍼로 2회 세척한 후 선별 균주의 플레이트에 옮겨 25℃에서 24시간 동안 장내 부착을 유도하였다. 그 후, 예쁜꼬마선충 10마리씩 카나마이신 및 스트렙토마이신이 첨가된 BHI(Brain Heart Infusion, BD Difco, Sparks, MD, USA) 아가 배지에 5분 동안 노출하여 예쁜꼬마선충 표피에 존재하는 미생물을 제거하였다. 미생물이 제거된 예쁜꼬마선충을 M9 버퍼로 5회 세척하고 1% 트리톤 X-100이 포함된 M9 버퍼를 첨가한 후, 모터 막자(motor pestle)를 사용하여 선충을 분쇄한 후, 0.85% NaCl을 사용하여 십진 희석하고 MRS 아가 배지(pH 5.0)에 3회 반복으로 도말하여 생균수를 측정하였다.
바이오제닉
아민
생성 확인
바이오제닉 아민의 생성 여부 확인을 위한 정성실험은 창 등의 방법에 따라 확인하였다. 구체적으로, 선별 균주의 바이오제닉 아민 생성 확인용 고체배지는 0.25% 글리세롤, 0.006% 브로모크레솔 퍼플(bromocresol purple) 및 0.1% 히스티딘 또는 티로신이 포함된 MRS 아가 배지(pH 5.3)를 제조하여 사용하였다. 선별 균주를 각 배지에 획선 도말 후 37℃에서 24시간 배양 후 대조구인 일반 MRS 배지와 발색 정도를 비교함에 따라 바이오제닉 아민의 생성 여부를 확인하였다.
식품유해 미생물에 대한 항균활성 측정
항균력을 조사하기 위해 분리 유산균은 MRS 액체배지에 접종하였고 37℃에서 24시간 배양 후, 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액은 0.45μm의 시린지 필터(Sartorius, Frankfurt, Germany)로 제균한 후, 0.8% 소프트 아가 플레이트를 이용한 웰 확산 방법을 이용하여 분리 균주의 상등액을 6mm 웰에 100㎕씩 분주하였고 30℃에서 24시간 동안 배양하여 형성된 억제환의 크기를 측정하였다. 항균 활성을 측정하기 위해 사용한 5종의 지시 균주는 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에서 분양받았고, 20% 글리세롤에 스톡하여 80℃에서 보관하여 사용하였다. 유해 미생물들은 하기 표 1에 개시한 해당 배지에 배양하여 균일한 농도(O.D.600=0.4)로 조절한 후, 0.8% 소프트 아가 플레이트를 제조하여 항균 활성 측정을 위한 배지를 제조하였다.
| 유해 미생물 | 그람 양성/음성 |
산소요구 상태 |
배지 | 배양온도(℃) |
| Bacillus cereus KCCM11204 | positive | aerobic bacteria | LB broth | 30 |
| Escherichia coli KCCM11234 | negative | aerobic bacteria | Nutrient broth | 37 |
| Microccus luteus KCCM11211 | positive | aerobic bacteria | Nutrient broth | 26 |
| Staphylococcus aureus supsp. aureus KCCM11335 | positive | aerobic bacteria | Trypic soy broth | 37 |
| Staphylococcus aureus supsp. aureus KCCM11593 | positive | aerobic bacteria | Trypic soy broth | 37 |
용혈성 및
유해대사산물과
유해효소 생성 분석
선별된 균주의 용혈성 확인을 위해 혈액 아가 베이스(BD, Difco)에 5% 염소 혈액(MBcell, Korea)을 첨가하여 혈액 아가 배지를 제조하였다. 선별 균주는 획선 도말하여 37℃에서 24시간 배양 후 균체 주위에 생기는 환의 형태로 α, β 및 γ 용혈성을 확인하였다. 또한, 암 유발 관련 유해대사산물인 인돌(indole) 및 페닐피루브산(Phenylpyruvic acid)의 생성 여부를 확인하기 위해 선별 균주를 MRS(BD, Difco) 액체배지에 접종한 후 37℃에서 24시간 동안 진탕 배양하고, 인돌 시약 (BBL, BD Difco)을 첨가하여 배지 표면의 색 변화로 인돌 생성 여부를 확인하였으며, 페닐피루브산의 생성 여부는 페닐알라닌 아가(fluka, Buchs, switzerland) 배지에 균주를 접종하여 37℃에서 24시간 및 48시간 동안 배양 후 10% 염화제2철(MBcell, Korea)을 3~4방울 첨가하여 균주 주위의 색 변화로 확인하였다.
또한, 우레아제(urase) 및 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)와 같은 대장암 유발 유해효소의 생성 여부를 확인하였다. 우레아제의 생성 여부는 우레아 신속 테스트 키트(MB cell, Korea)에 선별 균주를 접종하였고, 바젤린 오일(vaseline oil, MBcell, Korea)을 표면에 첨가하여 혐기 상태로 37℃에서 4~24시간 동안 배양하며 색 변화를 확인하였다. β-글루쿠로니다아제는 TBX(Tryptone bile X-glucuronide, Oxoid) 아가 배지에 선별 균주를 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 균주의 색 변화를 확인하였다.
우유 응고성(
커드
생성능
)
유단백질의 응고성은 선별된 유산균을 MRS 액체 배지에서 37℃의 조건으로 24시간 동안 배양한 후 멸균된 10% 스킴 밀크(difco, USA)에 1%씩 접종하였다. 균주가 접종된 스킴 밀크는 37℃에서 5일 동안 정치배양 후 커드 생성 정도를 관찰하였고, 응고 정도에 따라 발효유 제조용 스타터로서의 사용 가능성을 판단하였다.
내산성
및
내담즙성
확인
위액과 담즙에 대한 내성을 갖는 균주를 선별하기 위해, 내산성 및 내담즙성 실험을 수행하였다. 내산성 분석을 위해 선별 균주를 MRS 액체배지에 1.0×108 CFU/mL가 되도록 접종하였고, pH 2.0, pH 3.0, pH 4.0 및 pH 5.0으로 조절한 MRS 액체 배지에 선별 균주를 각각 1%씩 접종하여 37℃에서 3시간 동안 정치배양 후 생균수를 측정하였으며, pH 조절 전의 생균수를 대조구로 사용하였다. 또한, 담즙산에 대한 내성을 분석하기 위해 선별 균주는 MRS 액체배지에 초기 균수가 1.0×108 CFU/mL가 되도록 접종하였고 담즙(oxgall, Neogen, USA)의 농도가 0.1%, 0.3%, 0.5% 및 1.0%로 첨가된 MRS 액체 배지에 선별 균주를 각각 1%씩 접종하여 37℃에서 6시간 동안 배양 후 생균수를 측정하였다. 담즙 첨가 전의 생균수를 대조구로 사용하였으며, 생존율을 계산하여 내담즙성 정도를 확인하였다.
항생제 감수성 확인
선별된 균주의 항생제 감수성 확인을 위하여 디스크 확산법(diffusion method)으로 실시하였다. 사용한 항생제 디스크(BBL Sensi-disc, Becton Dickinson Co, USA)는 아목시실린(amoxicillin, 25㎍, AML), 아미카신(amikacin, 30㎍, AK), 아목시실린-글라불란산(amoxicillin-clavulanic acid, 3㎍, AUG), 암피실린(ampicillin, 10㎍, AMP), 아지트로마이신(azithromycin, 15㎍, AZM), 세파클로르(cefaclor, 30㎍, CEC), 세포탁심(cefotaxime, 30㎍, CTX), 세프타지딤(ceftazidime, 30㎍, CAZ), 세푸록심(cefuroxime, 30㎍, CXM), 세파렉신(cephalexin, 30㎍, CL), 시프로플록사신(ciprofloxacin, 5㎍, CIP), 클린다마이신(clindamycin, 10㎍, CD), 에리트로마이신(erythromycin, 15㎍, E), 푸시딘산(fusidic acid, 30㎍, FC), 젠타마이신(gentamicin, 30㎍, CN), 이미페넴(imipenem, 10㎍, IMI), 카나마이신(kanamycin, 30㎍, K), 린코마이신(lincomycin, 15㎍, MY), 메티실린(methicillin, 5㎍, MET), 메트로니다졸(metronidazole, 5㎍, MTZ), 날리딕스산(nalidixic acid, 30㎍, NA), 네오마이신(neomycin, 30㎍, N), 네틸마이신(netilmicin, 30㎍, NET), 니트로푸란토인(nitrofurantoin, 300㎍, F), 노르플록사신(norfloxacin, 10㎍, NOR), 오플록사신(ofloxacin, 5㎍, OFX), 옥사실린(oxacillin, 5㎍, OX), 페니실린 G(penicillin G(1IU, 10IU 및 2IU, P), 피페미드산(pipemidic acid, 20㎍, PI), 피페라실린(piperacillin, 100㎍, PRL), 리팜피신(rifampicin, 5㎍, RD), 록시시트로마이신(roxithromycin, 15㎍, RXT), 스트렙토마이신(streptomycin, 10㎍, S), 테이코플라닌(teicoplanin, 30㎍,TEC), 테트라사이클린(tetracycline, 30㎍,TE), 트리메토프림(trimethoprim, 5㎍,TM), 트리메토프림-설파메톡사졸(trimethoprim-sulfamethoxazole, 25㎍, SXT) 및 반코마이신(vancomycin, 30㎍, VA)으로 총 40종을 사용하였다. 감수성 시험방법은 최종 균주를 이용하여 MRS 고체 배지를 만든 후 디스크 디스펜서 8(Liofilchem, Italy)에 항생제를 꽂아 순서대로 디스크를 올려놓고 37℃에서 24시간 동안 방치한 다음, 각 항생제에 대한 억제환 크기를 측정하고 CLSI(Clinical Laboratory Standards Institute) 가이드라인에 따라 감수성과 내성을 판정하였다.
당 이용성 확인
선별 균주의 당 이용성을 확인하기 위하여 총 49종의 탄수화물 이용성을 기초로 제작된 API 50 CHL 키트(BioMerieux, France)를 사용하였다. 선별 균주를 5mL의 MRS 액체 배지에 계대배양하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 후 배양액 1mL을 13,000 rpm에서 20분간 원심 분리하여 상층액을 걷어내고 세포 펠렛만 회수하여 PBS(phosphate buffered saline, 0.1M, pH 7.0)로 2회 세척한 뒤 실험에 사용하였다. McFarland(BioMerieux)로 탁도 2로 조정하여 현탁액을 제조하였고, API 50 CHL 배지에 현탁한 균주 배양액 1mL을 첨가 후 혼합하여, API 50 CH 스트립에 120㎕씩 분주하고, 미네랄 오일(mineral oil)로 튜브당 2~3방울씩 첨가하여 37℃에서 24시간 및 48시간 동안 배양한 후 각각의 당 발효패턴을 비교하였다. 당 발효 패턴은 튜브의 색 변화를 확인하여 양성 및 음성으로 판독하였다.
API
ZYM
키트를
이용한 효소활성 분석
선별 균주의 효소 생성 여부를 조사하기 위해 총 19종의 각종 효소의 기질 이용성을 기초로 제작된 API ZYM 키트(bioMeriux Co., France)를 사용하였다. 선별 균주를 MRS 고체 배지에서 배양한 후 균체를 회수하여 0.85% NaCl 용액에 현탁해 Macfarland로 탁도 5~6로 조정하였다. API ZYM 키트의 각 튜브에 현탁액을 분주하고 37℃에서 4시간 배양한 후 ZYM-A 및 ZYM-B 시약을 각 튜브에 한 방울씩 떨어뜨리고 5분간 실온에서 반응시켜 색 변화로 각각의 기질 효소에 대한 활성 여부를 판독하였다. 색의 변화 정도에 따라 0~5까지 값으로 표시하였으며, 0은 음성반응, 5 (=40 nanomoles)는 최대 강도의 반응이고 4~1은 각각 30, 20, 10 및 5 nanomoles의 중간 값을 나타내며 3 이상일 경우 양성으로 판정하였다.
선별 균주의 동정 및 계통수 작성
선별 균주의 분자학적 동정 및 계통수 작성을 위해 균주를 MRS 액체 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 원심분리하여 균체를 회수하고 ZR Fungal/Bacterial DNA Miniprep kit(Zymo Research Corp., CA., USA)를 이용하여 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA는 유니버설 프라이머인 785F(5´-GGATTAGATACCCTGGTA-3´, 번호 2)와 907R(5´-CCGTCAATTCMTTT RAGTTT-3´, 번호 3)로 합성하여 16S rRNA 유전자 단편을 증폭시켰고, 증폭된 PCR 산물은 QIAquick PCR Purification kit(QIAGEN)를 사용하여 정제한 후 ㈜마크로젠에 의뢰하여 염기을 분석하였다. NCBI(National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA)의 nucleotide BLAST를 사용하여 분석결과를 GeneBank에 등록된 염기과 상동성을 비교하였다. 염기은 ExTaxone-e 서버(http://www.eztaxon.org)를 통해 표준 균주의 염기을 확보하여 MEGA 7.0 프로그램을 사용하였으며, 염기 간 상호비교 후 계통도를 작성하였다. 계통도는 Neighbor-joining 알고리즘을 사용하였으며, 1,000회 반복을 통해 bootstrapping하여 작성한 계통도의 견고성을 확인하였다.
실시예
1.
SRCM103306
균주의 동정
선별된 SRCM103306 균주의 동정을 위해 16S rRNA 유전자 염기(번호 1, 도 1)을 분석하였으며, 결과를 바탕으로 NCBI BLAST 검색 결과, SRCM103306 균주는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)와 99%의 상동성을 나타내었으며, 표준 균주의 16S rRNA 염기을 토대로 계통수(phylogenetic tree)를 작성한 결과, 락토바실러스 브레비스 ATCC14869와 가장 가까운 근연관계로 확인되었다(도 2). 최종적으로 선별된 균주를 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM103306로 명명하였고, 2019년 2월 28일 한국미생물보존센터(KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM12445P를 부여받았다.
실시예
2.
GFP
형광 단백질을 이용한 항노화 기능성 분석
기존에 노화와 밀접한 관계가 있는 것으로 알려진 pmk -1 유전자의 프로모터부위에 GFP가 부착된 형질전환 예쁜꼬마선충(AY102)을 CGC(Caenorhabditis Genetics Center; http://www.cbs.umn.edu/CGC/)에서 획득한 후 분리 균주가 도말된 플레이트에 24시간 동안 노출시킨 후 형광현미경을 이용하여 예쁜꼬마선충의 장 부위의 pmk -1 유전자 발현 변화를 시각적으로 손쉽게 탐색하여 형광 강도가 높게 나오는 균주를 선발함으로써 1차적으로 유용미생물 균주를 스크리닝하였다. 총 28종의 유산균 균주를 각각 24시간 동안 노출시킨 예쁜꼬마선충의 형광 강도를 이미지 J 프로그램을 사용하여 측정한 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 총 3종의 유산균 균주가 높은 형광 강도 수치를 나타내어 상대적으로 pmk -1 유전자 발현이 증가한 것을 확인하였으며, 이 결과를 통해 SRCM103305, SRCM103306 및 SRCM103457로 총 3종의 분리 균주를 1차적으로 선발하였다.
실시예
3. 수명연장 미생물 기능성 분석
하룻밤 동안 배양된 각각의 분리 균주를 원심분리(6,000×g, 20 min)하여 세포 펠렛만 회수한 후, M9 버퍼로 7회 세척하고, 최종적으로 5배 균주 농축액을 제조한 후 NGM 아가 배지에 분주한 후 상온에서 1시간 동안 건조시켰다. 건조 후 4℃에서 보관하면서 수명연장 확인용 플레이트로 2주간 사용하였으며, L4/young adult 단계까지 성장시킨 예쁜꼬마선충, CGC에서 획득한 fer - 15;fem -1 돌연변이를 수명연장 플레이트에 옮긴 후 25℃에서 3주간 매일 생존율을 측정하였다. 대조구로 일반 미생물 먹이는 대장균(E. coli) OP50를 사용하였으며, 양성대조구로 락토바실러스 람노서스 GG를 사용하였다. 일반적으로 백금 와이어를 이용하여 조심스럽게 터치한 후 반응을 나타내면 살아있는 것으로 평가하였다. 그 결과, 도 4에 개시한 바와 같이 SRCM103306 및 SRCM103457 균주가 대장균 OP50과 비교하여 통계적으로 유의한 차이를 나타내며 예쁜꼬마선충의 생존율이 증가한 것을 확인하였다.
실시예
4. 장
부착능
분석
선별 균주 분석용 플레이트에 L4/young adult 단계까지 성장시킨 예쁜꼬마선충 fer - 15;fem -1 돌연변이를 노출시키고 24시간 동안 예쁜꼬마선충의 장내 부착을 유도하였다. 각 처리구에서 10마리의 예쁜꼬마선충을 분리한 후 M9로 5회 세척을 실시하고 모터 막자(motor pestle)를 이용하여 선충을 분쇄한 후 생성된 선충 용해물을 0.85% NaCl로 연속 희석한 후 MRS 아가 배지(pH 5.0)에 도말하여 균수를 측정하였다. 상기 실시예 1에서 1차적으로 선발한 3종의 유산균 균주(SRCM103305, SRCM103306 및 SRCM103457)를 대상으로 장내 부착능을 측정한 결과, 도 5에 개시한 바와 같이 SRCM103306 균주가 1.4184 log CFU/g으로 측정되었으며, 상기 실시예 2 및 3을 토대로 SRCM103306 균주를 최종적으로 선발하였다.
실시예
5.
SRCM103306
균주의
바이오제닉
아민
생성 확인
바이오제닉 아민은 주로 단백질이 함유되어 있는 발효식품에서 높은 농도로 검출되며, 식품의 발효 및 숙성과 저장과정에서 아미노산이나 탈탄산효소(decarboxylase) 생산 미생물에 의해 생성된다. 바이오제닉 아민 중에 히스타민(histamine)은 사람이 섭취 시 식중독과 알레르기를 유발하기도 하며, 티라민(tyramine)의 경우에 혈관수축인자들을 분비해 고혈압을 일으킬 수 있다. 따라서 SRCM103306 균주의 바이오제닉 아민 생성여부를 확인한 결과, 하기 표 2에 개시한 바와 같이 전구체 아미노산인 히스티딘(Histidine)과 티로신(Thyrosine)을 각각 첨가한 배지에서 SRCM103306 균주가 이를 이용하지 않은 것으로 나타나 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 것으로 확인되었다.
| 바이오제닉 아민 | SRCM103306 균주 |
| 히스타민 | - |
| 티라민 | - |
- : 생성하지 않음, + : 생성함
실시예
6.
SRCM103306
균주의 식품유해 미생물에 대한 항균활성 측정
총 5종의 병원성 미생물에 대하여 항균 활성을 측정한 결과, SRCM103306 균주가 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)의 생육을 저해시켰으며, 특히 마이크로코커스 루테우스에 대해 항균 활성이 우수한 것을 확인하였다(표 3). 전통 장류 발효 및 식품 제조에 있어, 다양한 항균 스펙트럼을 갖는 미생물의 사용은 식품 제조업체에서의 병원성 미생물에 의한 오염의 문제 해결에 유용할 것으로 보이며, 천연식품 보존제 또는 사료 보존제로서 뿐만 아니라 새로운 항생제 대체 의약소재로의 응용이 가능함을 보여주었다.
| No | 유해 미생물 | SRCM103306 |
| 1 | Bacillus cereus KCCM11204 | ++ |
| 2 | Escherichia coli KCCM11234 | - |
| 3 | Microccus luteus KCCM11211 | +++++ |
| 4 | Staphylococcus aureus supsp. aureus KCCM11335 | - |
| 5 | Staphylococcus aureus supsp. aureus KCCM11593 | - |
+ : < 1cm, ++ : > 1cm, +++ : > 1.5cm, ++++ : > 2cm, +++++ : > 2.5cm
실시예
7.
SRCM103306
균주의 용혈성 및
유해대사산물과
유해효소 생성 분석
용혈은 자연적으로 적혈구가 파괴에 의해 일어나기도 하지만 유전적 결함, 화학물질 및 미생물에 의한 독성물질에 의해 비정상적으로 일어나기도 한다. 용혈성은 적혈구 막을 파괴하여 황달 및 빈혈을 유발하는 β-헤몰리시스(γ-hemolysis)와 적혈구 막을 파괴하지 않고 헤모글로빈을 메트헤모글로빈으로 산화시키는 α-헤몰리시스, 용혈현상이 없는 γ-헤몰리시스로 나눠볼 수 있는데, 본 발명의 SRCM103306 균주는 가용성 헤몰리신(hemolysin)에 의한 적혈구 막 파괴를 일으키는 주로 병원성 미생물이 나타내는 β-헤몰리시스가 아님을 확인할 수 있었다.
또한, 선별 균주는 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 및 우레아제(urease)와 같은 암 형성에 관련된 효소를 생성하지 않았고, 유해대사산물로 알려진 인돌(indole) 및 페닐피루브산(Phenylpyruvic acid)을 생성하지 않았다. 따라서 β-헤몰리시스가 아니고 유해효소 및 유해대사산물 모두 생성하지 않는 것으로 확인되어 SRCM103306 균주의 안정성을 확인할 수 있었다.
| 분석 | SRCM103306 |
| 용혈성(Hemolysis) | γ-hemolysis |
| β-글루쿠로니다아제(β-Glucuronidase) | ND |
| 우레아제(Urease) | ND |
| 인돌(Indole) | ND |
| 페닐피루브산(Phenyl pyruvic acid) | ND |
ND: 미검출
실시예
8.
SRCM103306
균주의 우유
응고력
SRCM103306 균주의 유단백질(mlik protein) 응고성을 확인하기 위해, 환원탈지유에서의 커드(curd) 형성 특성을 조사하였다. 그 결과, SRCM103306 균주는 배양 48시간에 커드를 형성하여 유단백질 발효 활성이 우수한 것으로 확인하였다(표 5). 이러한 우수한 커드 형성 능력은 발효유용 스타터로서 적합하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
| Strain | SRCM103306 |
| 유단백질 응고성 | + |
+: 37℃에서 120시간 후 유단백질의 응고 반응 있음
실시예
9.
SRCM103306
균주의
내산성
및
내담즙성
분석
사람의 소화기관을 안정적으로 많은 수의 균이 살아서 장내까지 도달하기 위해 가져야 할 프로바이오틱스 특성 중 낮은 pH의 위액과 미생물의 세포막에 영향을 주어 사멸하게 하는 담즙산에 대한 내성이 필요하여, SRCM103306 균주를 대상으로 내산성 및 내담즙성 실험을 진행하였다. 내산성은 pH 조절 전 생균수 대비 pH 5.0, pH 4.0, pH 3.0 및 pH 2.0 조건에서 생존율을 확인하였다. 그 결과, 하기 표 6에 개시한 바와 같이 pH 3.0, pH 4.0, pH 5.0 조건에서 100%가 넘는 생존율을 보여주었으며, pH 2.0에서도 75.13%의 생존율을 나타내었다. 내담즙성의 경우에는 모든 농도에서 90%가 넘는 생존율을 보여주어, 담즙산에 내성이 강한 균주로 확인되었다. 따라서 선별 균주는 내산성 및 내담즙성이 우수하여 이 균주를 이용할 때 낮은 위액의 pH와 담즙산 미생물 세포막 분해를 견디고 장까지 이동이 가능할 것으로 판단된다.
| 선별균주 | 생존율(%) | |||||||
| pH | 담즙(%) | |||||||
| 5.0 | 4.0 | 3.0 | 2.0 | 0.1 | 0.3 | 0.5 | 1.0 | |
| SRCM 103306 |
100.70 | 102.16 | 100.85 | 75.13 | 95.94 | 95.36 | 96.52 | 90.64 |
실시예
10.
SRCM103306
균주의 항생제 내성 확인
유산균은 식품 및 의약품의 소재로 많이 이용되고 있으며, 이로 인해 항생제 내성을 확인하는 것은 매우 중요한 요소이므로 최종 선별된 SRCM103306 균주를 대상으로 항생제 감수성 분석을 하였다. 그 결과, 세프타지딤(ceftazidime), 세푸록심(cefuroxime), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 클린다마이신(clindamycin), 카나마이신(kanamycin), 린코마이신(lincomycin), 메티실린(methicillin), 메트로니다졸(metronidazole), 날리딕스산(nalidixic acid), 노르플록사신(norfloxacin), 옥사실린(oxacillin), 페니실린 G(penicillin G(1IU, 10IU 및 2IU)), 피페미드산(pipemidic acid), 피페라실린(piperacillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 테이코플라닌(teicoplanin), 트리메토프림(trimethoprim), 트리메토프림-설파메톡사졸(trimethoprim-sulfamethoxazole) 및 반코마이신(vancomycin) 계열의 항생제에 대하여 내성을 지니고 있음을 확인하였다(표 7).
| No. | 항생제 명칭(code) | 농도 | 결과 |
| 1 | Amoxicillin (AML) | 25 ㎍ | M |
| 2 | Amikacin (AK) | 30 ㎍ | W |
| 3 | Amoxicillin+Clavulanic acid (AUG) | 3 ㎍ | W |
| 4 | Ampicillin (AMP) | 10 ㎍ | M |
| 5 | Azithromycin (AZM) | 15 ㎍ | M |
| 6 | Cefaclor (CEC) | 30 ㎍ | M |
| 7 | Cefotaxime (CTX) | 30 ㎍ | M |
| 8 | Ceftazidime ( CAZ ) | 30 ㎍ | ND |
| 9 | Cefuroxime ( CXM ) | 30 ㎍ | ND |
| 10 | Cephalexin (CL) | 30 ㎍ | M |
| 11 | Ciprofloxacin (CIP) | 5 ㎍ | ND |
| 12 | Clindamycin (CD) | 10 ㎍ | ND |
| 13 | Erythromycin (E) | 15 ㎍ | M |
| 14 | Fusidic acid (FC) | 30 ㎍ | W |
| 15 | Gentamicin (CN) | 30 ㎍ | M |
| 16 | Imipenem (IMI) | 10 ㎍ | S |
| 17 | Kanamycin (K) | 30 ㎍ | ND |
| 18 | Lincomycin (MY) | 15 ㎍ | ND |
| 19 | Methicillin (MET) | 5 ㎍ | ND |
| 20 | Metronidazole ( MTZ ) | 5 ㎍ | ND |
| 21 | Nalidixic acid (NA) | 30 ㎍ | ND |
| 22 | Neomycin (N) | 30 ㎍ | W |
| 23 | Netilmicin (NET) | 30 ㎍ | M |
| 24 | Nitrofurantoin (F) | 300 ㎍ | M |
| 25 | Norfloxacin (NOR) | 10 ㎍ | ND |
| 26 | Ofloxacin (OFX) | 5 ㎍ | M |
| 27 | Oxacillin (OX) | 5 ㎍ | ND |
| 28 | Penicillin G (P) | 1 IU | ND |
| 29 | Penicillin G (P) | 10 IU | ND |
| 30 | Penicillin G (P) | 2 IU | ND |
| 31 | Pipemidic acid (PI) | 20 ㎍ | ND |
| 32 | Piperacillin ( PRL ) | 100 ㎍ | ND |
| 33 | Rifampicin (RD) | 5 ㎍ | M |
| 34 | Roxithromycin (RXT) | 15 ㎍ | M |
| 35 | Streptomycin (S) | 10 ㎍ | ND |
| 36 | Teicoplanin ( TEC ) | 30 ㎍ | ND |
| 37 | Tetracycline (TE) | 30 ㎍ | W |
| 38 | Trimethoprim ( TM ) | 5 ㎍ | ND |
| 39 | Trimethoprim - Sulfamethoxazole ( SXT ) | 25 ㎍ | ND |
| 40 | Vancomycin (VA) | 30 ㎍ | ND |
ND : no inhibition, W : ≤ 1cm, M : ≤ 2cm, S : > 2cm
실시예
11.
SRCM103306
균주의 당 이용성 확인
API 50 CHL 키트(바이오메리오사)를 사용하여 락토바실러스 브레비스 SRCM103306 균주의 당 이용성을 확인하였다. 그 결과, SRCM103306 균주는 D-아라비노오스(D-arabinose), D-리보오스(D-ribose), D-자일로오스(D-xylose), D-글루코오스(D-glucose), D-프룩토오스(D-fructose), 에스쿨린(esculin) 및 D-말토오스(D-maltose)를 탄소원으로 이용할 수 있음을 확인하였다(표 8).
| 당 | 반응 | 당 | 반응 |
| Control | + | Esculin | + |
| Glycerol | - | Salicin | - |
| Erythritol | - | D-cellobiose | - |
| D-arabinose | - | D-maltose | + |
| L- arabinose | + | D-lactose | - |
| D-ribose | + | D-melibiose | - |
| D- xylose | + | Sucrose | - |
| L-Xylose | - | Trehalose | - |
| D-adonitol | - | Inulin | - |
| Methyl-D-xylopyranoside | - | D-melezitose | - |
| D-galactose | - | D-raffinose | - |
| D-glucose | + | Amidon(Starch) | - |
| D-fructose | + | Glycogen | - |
| D-mannose | - | Xylitol | - |
| L-sorbose | - | Gentiobiose | - |
| Rhamnose | - | D-turanose | - |
| Dulcitol | - | D-lyxose | - |
| Inositol | - | D-tagatose | - |
| Mannitol | - | D-fucose | - |
| Sorbitol | - | L-fucose | - |
| Methyl-α-D-glucopyranose | - | D-arabitol | - |
| Methyl-α-D-glucoside | - | L-arabitol | - |
| N-Acetyl-D-glucosamine | - | Glycogen | - |
| Amygdalin | - | 2-Ketogluconate | - |
| Arbutin | - | 5-Ketogluconate | - |
-: 음성 반응, +: 양성 반응
실시예
12.
SRCM103306
균주의
API
ZYM
키트를
이용한 효소 활성 확인
일반적으로 유산균이 프로바이오틱스로 사용되기 위해서는 이들이 생산하는 효소 또한 매우 중요한 부분을 차지하고 있어 최종 선별한 SRCM103306 균주의 효소 생산 여부를 확인하기 위해 API ZYM 키트를 이용하여 조사하였다. 그 결과, 알카라인 포스파타아제(Alkaline phosphatase), 루신 아릴아미다아제(leucin arylamidase), 발린 아릴아미다아제(valine arymidase), 시스틴 아릴아미다아제(cystine arylamidase), α-키모트립신(α-chymotrypsin), 산성 인산가수분해효소(Acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(Naphol-AS-BI-phosphohydrolase), α-갈락토시다아제(α-galactosidase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), α-글루코시다아제(α-glucosidase) 및 β-글루코시다아제(β-glucosidase) 활성이 있음을 확인하였다(표 9).
| 락토바실러스 브레비스 SRCM103306 | |
| Control | - |
| Alkaline phosphatase | + |
| Esterase(C4) | - |
| Esterase lipase(C8) | - |
| Lipase(C14) | - |
| Leucine arylamidase | + |
| Valine arylamidase | + |
| Cystine arylamidase | + |
| Trypsin | - |
| α- chymotrypsin | + |
| Acid phosphatase | + |
| Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase | + |
| α- galactosidase | + |
| β- galactosidase | + |
| β-glucuronidase | - |
| α- glucosidase | + |
| β- glucosidase | + |
| N-acetyl-β-glucosaminidase | - |
| α-mannosidase | - |
| α-fucosidase | - |
-: 음성 반응, +: 양성 반응
<110> Microbial Institute for Fermentation Industyry
<120> Lactobacillus brevis SRCM103306 strain having improved mucosal
adhesive capacity, anti-aging activity and probiotics property
and uses thereof
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<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1467
<212> DNA
<213> Lactobacillus brevis
<400> 1
gcaagtcgaa cgagcttccg ttgaatgacg tgcttgcact gatttcaaca atgaagcgag 60
tggcgaactg gtgagtaaca cgtggggaat ctgcccagaa gcaggggata acacttggaa 120
acaggtgcta ataccgtata acaacaaaat ccgcatggat tttgtttgaa aggtggcttc 180
ggctatcact tctggatgat cccgcggcgt attagttagt tggtgaggta aaggcccacc 240
aagacgatga tacgtagccg acctgagagg gtaatcggcc acattgggac tgagacacgg 300
cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac aatggacgaa agtctgatgg 360
agcaatgccg cgtgagtgaa gaagggtttc ggctcgtaaa actctgttgt taaagaagaa 420
cacctttgag agtaactgtt caagggttga cggtatttaa ccagaaagcc acggctaact 480
acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggattt attgggcgta 540
aagcgagcgc aggcggtttt ttaagtctga tgtgaaagcc ttcggcttaa ccggagaagt 600
gcatcggaaa ctgggagact tgagtgcaga agaggacagt ggaactccat gtgtagcggt 660
ggaatgcgta gatatatgga agaacaccag tggcgaaggc ggctgtctag tctgtaactg 720
acgctgaggc tcgaaagcat gggtagcgaa caggattaga taccctggta gtccatgccg 780
taaacgatga gtgctaagtg ttggagggtt tccgcccttc agtgctgcag ctaacgcatt 840
aagcactccg cctggggagt acgaccgcaa ggttgaaact caaaggaatt gacgggggcc 900
cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt cgaagctacg cgaagaacct taccaggtct 960
tgacatcttc tgccaatctt agagataaga cgttcccttc ggggacagaa tgacaggtgg 1020
tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa 1080
cccttattat cagttgccag cattcagttg ggcactctgg tgagactgcc ggtgacaaac 1140
cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt 1200
gctacaatgg acggtacaac gagtcgcgaa gtcgtgaggc taagctaatc tcttaaagcc 1260
gttctcagtt cggattgtag gctgcaactc gcctacatga agttggaatc gctagtaatc 1320
gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc 1380
atgagagttt gtaacaccca aagccggtga gataaccttc gggagtcagc cgtctaaggt 1440
gggacagatg attagggtga atctaca 1467
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
ggattagata ccctggta 18
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
ccgtcaattc mtttragttt 20
Claims (5)
- 내산성, 내담즙성, 효소 분비능, 커드(curd) 생성능, γ-용혈 활성, 항생제 내성, pmk-1 유전자 발현 증가 활성, 유해 미생물에 대한 항균활성 및 장 부착능이 있고, 바이오제닉 아민, 유해대사산물 및 유해효소를 생성하지 않는, 기탁번호가 KCCM12445P인 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) SRCM103306 균주로서,
상기 효소는 알카라인 포스파타아제(Alkaline phosphatase), 루신 아릴아미다아제(leucin arylamidase), 발린 아릴아미다아제(valine arymidase), 시스틴 아릴아미다아제(cystine arylamidase), α-키모트립신(α-chymotrypsin), 산성 인산가수분해효소(Acid phosphatase), 나프톨-AS-BI-포스포히드롤라아제(Naphol-AS-BI-phosphohydrolase), α-갈락토시다아제(α-galactosidase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), α-글루코시다아제(α-glucosidase) 및 β-글루코시다아제(β-glucosidase)이며, 상기 항생제는 세프타지딤(ceftazidime), 세푸록심(cefuroxime), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 클린다마이신(clindamycin), 카나마이신(kanamycin), 린코마이신(lincomycin), 메티실린(methicillin), 메트로니다졸(metronidazole), 날리딕스산(nalidixic acid), 노르플록사신(norfloxacin), 옥사실린(oxacillin), 페니실린 G(penicillin G), 피페미드산(pipemidic acid), 피페라실린(piperacillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 테이코플라닌(teicoplanin), 트리메토프림(trimethoprim), 트리메토프림-설파메톡사졸(trimethoprim-sulfamethoxazole) 및 반코마이신(vancomycin) 이며, 상기 유해 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)이며, 상기 바이오제닉 아민은 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine)이며, 상기 유해대사산물은 인돌(indole) 및 페닐피루브산(Phenylpyruvic acid)이며, 상기 유해효소는 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase) 및 우레아제(urease)인 것을 특징으로 하는 균주. - 삭제
- 제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제.
- 제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 장류 또는 발효유 제조용 스타터(starter) 조성물.
- 제1항의 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물을 유효성분으로 함유하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 또는 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus)에 대한 항균용 조성물.
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