KR101831040B1 - 신규한 락토바실러스 균주 및 그의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 신규한 락토바실러스 균주 및 특히 식품, 동물 사료, 약학적 조성물 및/또는 화장용 조성물 보존을 위한 그의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 신규한 락토바실러스 균주 및 특히 식품, 동물 사료, 약학적 조성물 및/또는 화장용 조성물 보존을 위한 그의 용도에 관한 것이다.
식품 및 동물 사료는, 이들의 영양 성분 때문에, 미생물을 위한 좋은 기질이다. 약학적 및 화장용 조성물에 대해, 이에 종종 포함되는 생약 물질 또는 담체 및 보조 물질 때문에 유사한 생각이 적용된다. 이들 미생물, 특히 진균의 다수는, 식품 및 동물 사료뿐만 아니라, 약학적 또는 화장용 조성물의 가장 흔한 부패 원인 중의 하나이다. 특히 치명적인 것은 특히 미생물에 의해 형성된 독성 및 발암성 마이코톡신으로, 이는 인간의 건강에 해롭다. 이 효과에 더하여, 식품 부패는 매년 막대한 경제적 영향을 미친다. 매년 약 5 - 10 %의 식품이 부패로 인해 파괴되는 것으로 추정된다.
예를 들어 식품 및 동물 사료의 부패를 막기 위해, 이들은 화학적 또는 생물학적 보존제 첨가 또는 처리에 의해 더 오래가도록 만들어진다. 많은 소비자들이 화학적 보존제를 피하려고 하기 때문에, 생물학적 보존제에 대한 요구가 특히 증가하고 있다.
예를 들어 젖산 박테리아가 이러한 생물학적 보존제에 속한다. 이들 박테리아는 보통 인간에게 무해하고 역사적으로 식품 보존에 수 세기 동안 사용되어 왔다. 이들의 안전성 및 무해함은 미국 FDA(Food and Drug Administration)로부터의 이들의 소위 GRAS 등급(안전한 것으로 일반적으로 승인됨)에 의해 표현된다. 또한 많은 식품에서, 젖산 박테리아는 이미 자연적으로 발생한다.
생물학적 보존의 메커니즘은 길항성 및 항균성 대사 물질의 경쟁적 성장 또는 생합성에 기인할 수 있다. 일차적으로, 젖산 박테리아의 보존 효과는 젖산과 같은 유기산의 생성으로 인한 것이다. 이로 인해, pH 값이 감소하고, 이는 많은 미생물의 성장을 억제한다.
젖산에 더하여, 식품 및 동물 사료 보존에 중요한 아세트산, 과산화수소, 디아세틸, 루테린 및 소위 박테리오신과 같은 일련의 다른 대사 물질이 있다.
젖산 및 루테린과 같은 이러한 대사 물질의 일부는 박테리아 및 진균의 성장을 억제하고, 박테리오신과 같은 다른 물질은 오직 박테리아의 성장을 억제하고, 또한 다른 물질은 오직 진균에 대해서만 작용한다. 젖산 박테리아의 항진균 활성에 대한 연구에서, 여러 억제 물질을 확인할 수 있었다: 카프로산, 프로피온산, 부티르산, 아세트산, 포름산 및 길초산(문헌 [Corsetti, A.G., Antimould activity of sourdough lactic acid bacteria: identification of a mixture of organic acids produced by Lactobacillus sanfrancisco CB1, Applied Microbiology and Biotechnology (50), pp. 253-256, (1998)]), 메틸히단토인 및 메발로노락톤(문헌 [Niku-Paavola, M.L., New types of antimicrobial compounds produced by Lactobacillus plantarum, Journal of Applied Microbiology (86), pp. 29-35, (1999)]), 다양한 수산화 지방산(문헌 [Sjogren, J.M., Antifungal 3-hydroxy fatty acids from Lactobacillus plantarum MiLAB 14, Applied and Environmental Microbiology (69), pp. 7554-7557, (2003)]), 3-페닐 젖산(문헌 [Lavermicocca, P.V., Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain 21B, Applied and Environmental Microbiology (66), pp. 4084-90, (2000)]), 및 디케토피페라진(위의 문헌 [Niku-Paavola] 참조). 그러나, 항진균 활성을 갖는 일부 단백질 생성 성분은 확인할 수 없었다(문헌 [Magnusson, J., Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis strain Si3 produces a broad-spectrum proteinaceous antifungal compound, Applied and Environmental Microbiology (67), pp. 1-5, (2001)]).
많은 대사 물질이 젖산 박테리아의 세포 성장에 수반되어 형성되는 반면, 다른 것들은 오직 유도 후에 생성되는 것으로 알려져 있다. 이 메커니즘은 일반적으로 자가유도 또는 "정족수 감지"로 불린다. 이 효과는 카르노박테리움 피시콜라 (문헌 [Kleerebezem, M.K., A two-component signal transduction cascade in Carnobacterium piscicola LV17B: two signaling peptides and one sensor-transmitter, Peptides (22), pp. 1597-1601, (2003)]), 락토바실러스 사케이(문헌 [Diep, D.B., The synthesis of the bacteriocin sakacin A is a temperature-sensitive process regulated by a pheromone peptide through a three-component regulatory system, Microbiology (146), pp. 2155-2160, (2000)]), 락토바실러스 플란타룸(문헌 [Maldonado, A.J.-D., Induction of Plantaricin Production in Lactobacillus plantarum NC8 after Coculture with Specific Gram-Positive Bacteria Is Mediated by an Autoinduction Mechanism, J. Bacteriol., 5 (186), pp. 1556-1564 (2003)]) 및 엔테로코커스 패시움(문헌 [Nilsen, T.I., An exported inducer peptide regulates bacteriocin production in Enterococcus faecium CTC 492, J. Bacteriol. (180), pp. 1848-1854, (1998)])과 같은 일부 박테리오신에 대해 이미 알려져 있다.
그러나, 부르크홀데리아 및 슈도모나스 종의 박테리아는, GRAS 등급을 갖고 있지 않고 따라서 식품 또는 동물 사료에의 사용에 적합하지 않다.
파트라 팔구니(Patra Falguni) 등(문헌 ["Productions of proteinaceous antifungal substances form Lactobacillus brevis NDCD 02", International Journal of Dairy Technology vol. 63, No. 1, 1 February 2010, pages 70-76])은 식품에서 효과적인 생물학적 보존제 및 비-스타터 LAB로 사용될 수 있는 항진균 범위가 넓은 락토바실러스 브레비스 균주를 개시한다. 이 균주의 주요 한계는 항진균 물질을 생성하기 위해 영양이 풍부한 배지를 요한다는 것이다. 예를 들어 탈지 우유에서의 항진균 물질 생성은 무시해도 될 정도이다. 따라서 이 락토바실러스 브레비스 균주는 유제품 내의 식품 첨가물로의 사용에 적합하지 않다.
EP 2543246은 치즈 코팅 내의 페니실리움 및 아스페르길루스에 대한 락토바실러스 플란타룸 균주의 생활성 박테리아의 항진균 효과를 개시한다. 따라서 항진균 효과는 호기성 조건하에서 발생했다. 혐기성 조건하에서의 항진균 효과는 나타나지 않았다. 그러나 유제품에서의 식품 첨가물로의 사용을 위해서는 항진균 효과가 호기성 및 혐기성 조건하에서 존재하는 것이 중요하다.
이 배경을 고려하면, 항진균 대사 물질을 형성하고, 진균 성장을 억제하고 따라서 종래 기술의 한계 및 약점 없이 보존제로 적합한, GRAS-승인된 미생물을 제공하는 것이 바람직할 것이다.
따라서 본 발명의 기술적 과제는 진균 성장을 억제하고 식품, 동물 사료, 약학적 및/또는 화장용 조성물에 사용되기에 적합한 미생물을 제공하는 것이다.
이 과제는 독립항의 특징에 의해 해결된다. 본 발명의 바람직한 실시태양은 종속항에 의해 제공된다.
이 기술적 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 젖산 박테리아가 헤테로젖산균이고 젖산 박테리아가 하나 이상의 진균 생물의 성장을 억제하는, 식품 첨가물용 젖산 박테리아 그룹에 속하는 미생물 또는 그의 단편을 교시한다.
젖산 박테리아는 분류학적 관점에서 스트렙토코커스, 류코노스톡, 페디오코커스, 락토바실러스 및 락토코커스의 하위 분류로 나뉜다. 본 발명의 미생물이 락토바실러스 종인 것이 바람직하다. 젖산 박테리아 그룹의 일원은 보통 포르피린 및 시토크롬이 없고, 전자 전달 인산화를 수행하지 않고 따라서 오직 기질 수준 인산화에 의해 에너지를 얻는다. 즉 젖산 박테리아에서 ATP는 탄수화물의 발효를 통해 합성된다. 모든 젖산 박테리아는 혐기성으로 성장하지만, 많은 혐기성 생물과 달리 대부분의 젖산 박테리아는 산소에 민감하지 않고 따라서 산소가 존재하지 않을 때뿐만 아니라 존재할 때도 성장할 수 있다. 따라서, 본 발명의 박테리아는 락토바실러스 속에 속하는 바람직하게는 내기성 혐기성 젖산 박테리아이다.
혐기성 조건하에서 성장하는 능력은 종래 기술에서 공지된 균주에 비교하여 주된 이점이다. 따라서 이제 유제품 코팅에서뿐만 아니라 우유, 요구르트 또는 코티지 치즈와 같은 제품 자체에서도 본 발명의 젖산 박테리아를 식품 첨가물로 이용할 수 있다.
본 발명의 젖산 박테리아는 항진균 활성을 나타내기 위해 임의의 특별한 영양이 풍부한 배지를 요하지 않는다. 실험은 본 발명의 젖산 박테리아가 탈지 우유 내의 하나 이상의 진균 생물의 성장을 또한 억제할 수 있다는 것을 나타낸다. 따라서 본 발명의 젖산 박테리아는 식품 첨가물로의 사용에 단점일 수 있는 임의의 추가적인 영양소의 첨가 없이 상이한 종류의 유제품에 사용될 수 있다. 이 사실 때문에 본 발명의 미생물은 종래 기술에서 공지된 미생물, 특히 파트라 팔구니 등의 것에 비해 우수하다.
본 발명의 젖산 박테리아 그룹에 속하는 미생물은 바람직하게는, 길고 갸름한 것에서 짧고 구부러진 막대까지의, 막대 형상이고, 보다 바람직하게는 비운동성 및/또는 무포자성이다. 본 발명의 젖산 박테리아가 분리되거나 짝지어 있는 것이 바람직하다. 이들은 바람직하게는 발효 대사의 주된 또는 유일한 생성물로 젖산을 생성한다. 본 발명의 젖산 박테리아가 오탄당 인산 경로를 통해 글루코스로부터 50 % 이상의 양으로 젖산, 바람직하게는 젖산의 DL-이성질체를 생성하는 것이 바람직하다. 본 발명의 젖산 박테리아는 이산화탄소 및 에탄올을 또한 생성할 수 있다. 젖산 박테리아가 15 ℃ 또는 45 ℃의 온도에서 가변적 성장을 나타내는 것이 바람직하다. 이들이 세포 벽에 글리세롤 테이코산을 포함하는 것이 또한 바람직하다.
위에서 기술한 특성에 기초하여, 본 발명의 젖산 박테리아는 락토바실러스 속에 속하는 것으로 분류할 수 있다. 전통적인 분류학을 사용하여, 예를 들어, 문헌 ["Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" (Williams & Wilkins Co., 1984)]의 관련 설명을 참조하여, 본 발명의 젖산 박테리아는 락토바실러스 속에 속하는 것으로 판단할 수 있다. 다르게는, 본 발명의 젖산 박테리아는 해당 기술 분야에서 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 이들의 대사 지문(metabolic fingerprint), 즉 본 발명의 미생물(들)이 당을 대사하는 능력의 비교 검토에 의해 또는, 예를 들어, 문헌 [Schleifer et al., System. Appl. Microb., 18 (1995), 461-467] 또는 문헌 [Ludwig et al., System. Appl. Microb., 15 (1992), 487-501]에 기술된 다른 방법에 의해 락토바실러스 속에 속하는 것으로 분류될 수 있다. 본 발명의 미생물은 락토바실러스 속에 속하는 미생물에 대해 기술 분야에서 공지되고 통상적인 당 출처를 대사할 수 있다. 그러나 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 젖산 박테리아는 다음으로 이루어지는 군에서 선택되는 대사 지문을 갖는다:
(i) D-락토오스를 대사하지만, L-소르보오스 및/또는 D-사카로오스 및/또는 D-이눌린을 대사하지 않음,
(ii) 이눌린을 대사함,
(iii) L-소르보오스를 대사하지만, D-락토오스 및/또는 D-사카로오스 및/또는 이눌린을 대사하지 않음, 및
(iv) L-소르보오스, D-락토오스 및 이눌린을 대사함.
바람직하게는, 본 발명의 젖산 박테리아는 다음으로 이루어지는 군에서 선택되는 대사 지문을 갖는다:
(i) D-락토오스를 대사하지만, L-소르보오스, D-사카로오스 및 이눌린을 대사하지 않음,
(ii) L-소르보오스, D-락토오스 및 이눌린을 대사하지만, D-사카로오스를 대사하지 않음,
(iii) L-소르보오스를 대사하지만, D-락토오스, D-사카로오스 및 이눌린을 대사하지 않음, 및
(iv) L-소르보오스, D-락토오스, D-사카로오스를 대사하지만, 이눌린을 대사하지 않음.
물론, 본 발명의 젖산 박테리아는 전술한 대사 지문 양식에서 언급한 당의 대사에 한정되지 않고, 락토바실러스 종에 의해 흔히 대사되는 추가적인 당을 대사할 수 있을 수 있다.
본 발명의 미생물의 락토바실러스 속에의 소속은 기술 분야에서 공지된 다른 방법, 예를 들어, 판단할 종의 총 단백질의 SDS-PAGE 겔 전기영동을 사용하고 이를 락토바실러스 속의 공지되고 이미 특성화된 균주와 비교함으로써 또한 특성화될 수 있다. 위에서 기술한 대로 총 단백질 프로파일의 준비 및 이러한 프로파일의 수치 해석을 위한 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 그러나, 결과는 과정의 각 단계가 충분히 표준화되었을 경우에만 신뢰할 수 있다. 미생물의 락토바실러스 속에의 귀속을 판단할 때의 정확성의 요건에 직면하여, 표준화된 절차는, 1994년 9월 12일부터 16일까지 벨기에 겐트 대학에서 유럽 연합이 개최한 "워크샵" 도중 발표한 대로(문헌 [Fingerprinting techniques for classification and identification of bacteria, SDS-PAGE of whole cell protein)] 폿(Pot) 등의 것과 같은 저자에 의해 정식으로 공중이 이용 가능하게 되어 있다. SDS-PAGE 전기영동 겔 분석을 위한 기술에 사용된 소프트웨어는 종 간의 상관 정도가 이 소프트웨어에 의해 사용되는 파라미터 및 알고리즘에 달려있기 때문에 매우 중요하다. 이론적 세부사항을 조사하지 않고서, 농도계에 의해 측정되고 컴퓨터에 의해 표준화된 밴드의 정량 비교는 바람직하게는 피어슨 상관 계수로 수행된다. 이렇게 얻어진 유사도 매트릭스는 가장 유사한 프로파일을 짝지어줄 수 있을 뿐만 아니라, 계통도를 그릴 수 있는 UPGMA(unweighted pair group method using average linkage) 알고리즘의 도움으로 조직화될 수 있다(문헌 [Kersters, Numerical methods in the classification and identification of bacteria by electrophoresis, in Computer-assisted Bacterial Systematics, 337-368, M. Goodfellow, A. G. O'Donnell Ed., John Wiley and Sons Ltd, 1985] 참조).
다르게는, 상기 본 발명의 미생물의 락토바실러스 속에의 소속은 소위 리보프린터(Riboprinter. RTM) 내의 리보솜 RNA와 관련하여 특성화할 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 새롭게 확인된 종의 락토바실러스 속에의 소속은 본 발명의 박테리아의 16S 리보솜 RNA의, 또는 16S 리보솜 RNA를 코딩하는 유전체 DNA의 뉴클레오티드 서열을, 지금까지 알려진 젖산 박테리아의 다른 속 및 종의 그것과 비교함으로써 입증된다. 본 발명의 새롭게 확인된 종의 락토바실러스 속에의 귀속을 판단하기 위한 다른 바람직한 별법은 16S-23S rRNA 스페이서 영역을 표적으로 하는 종-특이적 PCR 프라이머의 사용이다. 다른 바람직한 별법은 본 발명에 따라 확인된 미생물의 락토바실러스 속에의 소속을 판단할 수 있게 하는 균주 특이적 DNA 패턴이 생성되는 것을 활용하는 RAPD-PCR이다(문헌 [Nigatu et al. in Antonie van Leenwenhoek (79), 1-6, 2001]). 본 발명의 미생물의 락토바실러스 속에의 소속을 판단하는 데에 유용한 다른 기술은 제한효소 단편 길이 다형분석(RFLP)(문헌 [Giraffa et al., Int. J. Food Microbiol. 82 (2003), 163-172]), 반복 요소의 지문분석(문헌 [Gevers et al., FEMS Microbiol. Lett. 205 (2001) 31-36]) 또는 박테리아 세포의 지방산 메틸 에스테르(FAME) 패턴 분석(문헌 [Heyrman et al., FEMS Microbial. Lett. 181 (1991), 55-62])이다. 다르게는, 락토바실러스는 렉틴 유형분석(문헌 [Annuk et al., J. Med. Microbiol. 50 (2001), 1069-1074])에 의해 또는 이들의 세포 벽 단백질 분석(문헌 [Gatti et al., Lett. Appl. Microbiol. 25 (1997), 345-348])에 의해 판단할 수 있다.
특히 바람직한 실시태양에서 본 발명은 다음을 포함하는 방법에 의해 생성된 단리된 젖산 박테리아 또는 그의 단편에 관한 것이다:
a) 기질을 제공하는 단계,
b) 검토 중인 젖산 박테리아를 포함하는 제제를 제공하는 단계,
c) 젖산 박테리아를 포함하는 제제를 기질에 첨가하고, 임의적으로 이어서 발효하는 단계,
d) 미리 정해진 수의 진균 포자를 단계 c)의 생성물에 첨가하는 단계,
e) 단계 d)에서 얻어진 시험 샘플을 미리 정해진 온도에서 미리 정해진 기간 동안 인큐베이션하는 단계,
f) 진균 성장을 검출하고, 임의적으로 이어서 평가하는 단계,
g) 하나 이상의 젖산 박테리아를 단리하는 단계.
진균 성장을 검출할 수 없으면, 젖산 박테리아는 본 발명에 따른 젖산 박테리아이다. 따라서 단계 g)가 진균 성장을 검출할 수 없을 때 수행되는 것이 바람직하다.
또한, 단계 c)가 누락된 대조 시험 샘플에 비해 감소된 진균 성장이 검출되면, 젖산 박테리아는 역시 본 발명에 따른 종이다. 여기서 어구 "감소된"은 20 % 이상, 바람직하게는 50 % 이상, 보다 바람직하게는 90 % 이상의 진균 성장 감소를 의미한다.
본 발명의 젖산 박테리아가 다음의 단계에 따라 분석될 수 있는 것을 특징으로 하는 것이 또한 바람직하다:
A) 기질이 확립되고,
B) 검토 중인 젖산 박테리아를 포함하는 제제가 확립되고,
C) 젖산 박테리아를 포함하는 제제가 기질에 첨가되고, 임의적으로 발효 단계가 이어지고,
D) 단계 C)의 생성물이 샘플 홀더에 샘플링되고, 여기에서 시험 샘플이 형성되고,
E) 미리 정해진 수의 진균 포자가 하나 이상의 시험 샘플에 첨가되고,
F) 단계 E)에서 얻어진 시험 샘플의 인큐베이션이 미리 정해진 온도에서 미리 정해진 기간 동안 수행되고,
G) 진균 성장을 검출하고, 임의적으로 이어서 평가한다.
단계 F) 및 진균 성장 평가 후 시험 샘플의 화상 또는 육안 검사를 수행함으로써 진균 성장을 검출하는 것이 바람직하다.
진균 성장을 검출할 수 없으면, 젖산 박테리아는 본 발명에 따른 젖산 박테리아이다. 또한, 단계 C)가 누락된 대조 시험 샘플에 비해 감소된 진균 성장이 검출되면, 젖산 박테리아는 역시 본 발명에 따른 종이다. 여기서 어구 "감소된"은 20 % 이상, 바람직하게는 50 % 이상, 보다 바람직하게는 90 % 이상의 진균 성장 감소를 의미한다. 정량화는 정의된 콘트라스트 설정에서의 화상 수행 및 진균 범위와 관계된 픽셀수의 자동화된 계수에 의해 수행될 수 있고, 이때 진균 범위와 관계된 픽셀의 수가 시험 샘플의 화상의 총 픽셀 수와 관계된다. 화상은 바람직하게는 흑백일 것이다. 일부 경우 기질에 대한 진균의 대조를 향상시키기 위해 기질을 짙은 착색제 또는 염색제(바람직하게는 미생물학적으로 불활성인)로 염색하는 것이 도움이 될 수 있다, 예를 들어 기질이 흰색의 요구르트 기질이면 기질 및 진균이 또한 흰색을 나타낸다. 특히, 시험 분석은 실시예 1.2, 마지막 단락에 서술한 대로 수행될 수 있다. 카메라로 플루오르켐(FluorChem®) FC2 촬영 시스템(미국 산타 클라라 소재 알파 이노텍/셀 바이오사이언스(Alpha Innotech/Cell Biosciences)) 시스템이 다음의 설정으로 유용하다: 노출 시간: 100 - 150 ms, 조리개: 8, 콘트라스트 세팅: 블랙 레벨: 55000, 화이트 레벨: 60000, 감마: 3.0, 광 세팅: 트랜스 광 "켜짐", 반사 광 "켜짐", 화학 디스플레이 "켜짐", 속도/해상도: 보통/울트라. 알파이즈에프씨(AlphaEaseFC) 소프트웨어로 이미지를 분석했다.
대안적인 또는 추가적인 대조 시험 샘플로, 위에서 기술한 단계 c) 대신, 식품 보존 분야에서 일반적인 미리 정해진 양으로(예를 들어 그램 당 0.2 mg) 소르빈산 칼륨이 단계 c)에서 사용되는 시험 샘플이 사용될 수 있다. 이어서 이 대조 시험 샘플은 기준의 역할을 할 수 있다, 즉 본 발명의 젖산 박테리아는 이 대조 시험 샘플과 적어도 동일한 양으로 진균 성장 억제 효과를 낸다.
세포는 적용가능하면 세포가 첨가되거나 세포가 그 위에 적용되는 각 기질과의 공배양에서 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, 독일 브라운슈바이크)의 생활성 시험을 만족시킨다면 생활성이다.
젖산 박테리아가 생 젖산 박테리아인 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 생 미생물이 식품에 부정적인 영향 없이 강력한 항진균 능력을 나타내는 것은 놀라웠다.
젖산 박테리아가 락토바실러스 브레비스 (Lactobacillus brevis ), 락토바실러스 힐가르디(Lactobacillus hilgardii ), 락토바실러스 플란타룸 (Lactobacillus plantarum ), 락토바실러스 프룩디보란스 (Lactobacillus fructivorans ) 또는 락토바실러스 파라파라 기니스(Lactobacillus parafarraginis)인 것이 특히 바람직하다.
본 발명에 따르면, 미생물은 락토바실러스 속, 보다 바람직하게는 본원에서 기술하는 락토바실러스 종에 속하는 젖산 박테리아이다. 더욱 바람직하게는 본 발명의 락토바실러스는 락토바실러스 브레비스이고; 다른 바람직한 락토바실러스는 L. 파라파라기니스이다. 그러나, 락토바실러스 종은 이에 제한되지 않는다. 특히 바람직한 실시태양에서 본 발명의 미생물은 "단리"되거나 "정제"된다. 용어 "단리된"은 물질이 원래의 환경, 예를 들어 자연 발생적인 경우 자연 환경으로부터 제거된 것을 의미한다. 예를 들어, 자연계에서 공존하는 물질의 일부 또는 전부로부터 분리된 자연 발생적인 미생물, 바람직하게는 락토바실러스 종은 단리된 것이다. 이러한 미생물은 조성물의 일부일 수 있고, 조성물이 자연 환경의 일부가 아니라는 점에서 여전히 단리된 것으로 여겨질 것이다.
용어 "정제된"은 절대적인 순도를 요구하지 않고; 오히려, 상대적인 정의로 의도된다. 라이브러리로부터 얻어지는 각 미생물은 미생물학적 균일성으로 관습적으로 정제된다, 즉 이들은 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 한천 플레이트에 도말되었을 때 단일 콜로니로 성장한다. 바람직하게는, 이 절차에 사용되는 한천 플레이트는 락토바실러스 종에 대해 선택적이다. 이러한 선택적인 한천 플레이트는 기술 분야에 공지되어 있다.
젖산 박테리아가 DSM 22721로 제출된 젖산 박테리아 또는 그의 단편, 변이체 및/또는 유도체이고, 상기 단편, 변이체 또는 유도체가 진균 생물의 성장을 억제하는 능력을 보유하는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 특히 바람직한 실시태양에서, 본 발명의 젖산 박테리아는 DSMZ 수탁 번호 DSM 22721을 갖는 락토바실러스 브레비스 또는 그의 변이체 또는 유도체로 이루어지는 군에서 선택되고, 상기 변이체 또는 유도체는 진균 생물의 성장을 억제하는 능력을 보유한다. 용어 "DSMZ 수탁 번호를 갖는 락토바실러스 브레비스"는 2009년 6월 26일 도이치 삼룽 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하("DSMZ")에 기탁되고 다음의 수탁 번호 DSM 22721을 갖는 락토바실러스 브레비스 종에 속하는 미생물의 세포에 관한 것이다. DSMZ는 독일 D-38124 브라운슈바이크 마스쉐로더 웨그 1b에 위치한다. 전술한 DSMZ 기탁은 특허절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 조항에 따라 이루어졌다.
식품의 진균 오염은 식품 제조 산업의 주된 문제가 되고 있다. 화학 물질의 사용과 같은 종래 기술에 공지된 식품 보존 방법은 식품에 바람직하지 않은 성질을 가할 수 있다. 또한 이러한 방법은 소비자들 사이에서 관심을 일으킬 수 있다. 따라서, 대안적인 보존 방법에 대한 필요성은 식품 분야의 중요한 쟁점이 되었다. 따라서 본 발명, 특히 DSM 22721로 제출된 젖산 박테리아는 임의의 부작용 없이 대안적인 효율적인 식품 보존 방법을 가능하게 하기 때문에 특히 중요하다.
본 발명의 젖산 박테리아의, 바람직하게는 기탁된 락토바실러스 브레비스의 "변이체 또는 유도체"는 바람직하게는 각각의 기탁된 균주와 동일한 특성을 갖는다, 즉, 바람직하게는 위에서 기술한 것과 같은 억제 특성과 함께 진균 생물의 성장을 억제하는 능력을 보유한다. 예를 들어, 상기 유도체는 유전학적으로 조작될 수 있다. 본 발명의 맥락에서 용어 "유전학적으로 조작된"은 가장 넓은 개념으로 재조합 DNA 기술에 의해 유전학적 변형이 영향을 받고 유전자가 바뀌도록 원하는 핵산을 시험관 내 및 체 내 변형하는 당업자에게 공지된 방법에 대해 사용된다. 따라서, 상기 방법이 재조합 핵산의 복제, 서열화 및 변환을 포함하는 것이 바람직하다. 이 목적에 적합한 벡터는, 예를 들어, EP-B1 506 789, EP-B1 316 677, EP-B1 251 064, EP-B1-218 230, EP-B1 133 046 또는 WO 89/01970에 기술된 것과 같은 락토바실러스 종을 위한 표현 벡터를 포함한 벡터이다.
본 발명의 맥락에서 사용될 때, 용어 "본 발명의 젖산 박테리아"는 상술한 진균 생물의 성장을 억제하는 능력을 보유하는 상기 미생물(들)의 세포막 분획과 같은 유도체 또는 변이체 또는 유사체 또는 단편을 또한 포괄한다. 용어 "유도체", "변이체", "유사체" 및 "단편"은 본원의 다른 곳에 기술한다.
DSMZ 수탁 번호 DSM 22721을 갖는 락토바실러스 브레비스 또는 그의 변이체 또는 유도체는 다음 사항에 의해 특성화된다. 생물은 호기성 또는 혐기성 조건하에서 30 ℃ 내지 37 ℃에서 최적 성장을 나타낸다. 42 ℃ 초과에서 성장이 검출되지 않는다.
DSMZ 수탁 번호 DSM 22721을 갖는 락토바실러스 브레비스 또는 그의 변이체 또는 유도체의 호기성 발효는 더 높은 세포 밀도를 가져온다.
표준 조건(예를 들어 MRS-배지, 37 ℃, 혐기성)하에서의 DSMZ 수탁 번호 DSM 22721을 갖는 락토바실러스 브레비스 또는 그의 변이체 또는 유도체 배양의 결과는 pH 3,5 - 3,7을 갖는 산성화이다.
DSMZ 수탁 번호 DSM 22721을 갖는 락토바실러스 브레비스 또는 그의 변이체 또는 유도체는 분리된 막대로 또는 쌍으로 또는 드물게는 단사슬(2 - 10 ㎛)로 존재한다. 표준 조건하에서 이들은 약간 무광의 외관 및 약간 구조화된 표면을 갖는 흰색 내지 크림색 콜로니를 형성하는 경향이 있다.
놀랍게도 본 발명의 젖산 박테리아, 바람직하게는 DSMZ 수탁 번호 DSM 22721을 갖는 락토바실러스 브레비스 또는 그의 변이체 또는 유도체의 첨가는 식품, 특히 요구르트의 질감 또는 색을 변화시키지 않는다.
본 발명의 젖산 박테리아, 바람직하게는 DSMZ 수탁 번호 DSM 22721을 갖는 락토바실러스 브레비스 또는 그의 변이체 또는 유도체가 다음의 서열 1(SEQ ID No.1)을 갖는 16S rDNA를 포함하는 것이 바람직하다:
본 발명의 젖산 박테리아, 바람직하게는 DSMZ 수탁 번호 DSM 22721을 갖는 락토바실러스 브레비스 또는 그의 변이체 또는 유도체의 다른 이점은 약 - 20 ℃ 또는 약 - 80 ℃에서 6 개월 이상 동안 균주를 급속 냉동할 수 있다는 것이다. 박테리아는 안정하게 유지되고 진균 생물의 성장을 억제하는 능력을 상실하지 않는다. 동결건조 후 본 발명의 젖산 박테리아를 보관하는 것 또한 가능하다(도 2를 또한 참조).
한 이점은 특히 DSM 22721로 제출된 본 발명의 젖산 박테리아 또는 그의 단편, 변이체 및/또는 유도체가, 페니실리움, 특히 페니실리움 코뮨 또는 페니실리움 로크포르티, 아스페르길루스 속 및 알타나리아 속, 특히 알타나리아 알테르나타, 페니실리움 엑스판섬, 페니실리움 시트리늄, 페니실리움 디지타텀, 페니실리움 이탈리컴, 스코퓰라리옵시스 브레비아콜리스, 아스페르길루스 플라부스, 아스페르길루스 파라시티커스, 보트리티스 시네레아, 리조푸스 sp., 무코 sp., 유로티움 허바리오룸, 게오트리쿰 칸디둠, 클라도스포리움 헤르바룸, 푸사리움 삼부시눔, 피토포라 인페스탄스 및 스클레로티니아 스케로티오룸의 성장을 억제한다는 것이다.
다른 바람직한 실시태양에서 본 발명은 젖산 박테리아, 바람직하게는 생 젖산 박테리아, 또는 그의 단편을 식품, 동물 사료, 또는 약학적 또는 화장용 조성물에 첨가하여, 식품 조성물, 동물 사료, 또는 약학적 또는 화장용 조성물을 제조하기 위한 상기 젖산 박테리아 또는 그의 단편의 용도에 관한 것이다.
락토바실러스 브레비스는 헤테로발효성 대사를 사용하고 따라서 헤테로젖산균인 것으로 일반적으로 알려져 있다. 헤테로발효성 대사는 보통 기체 및 산 생성을 특징으로 한다. 두 효과 모두 식품, 약품 또는 화장품 제조에 불리하다. 따라서 본 발명의 젖산 박테리아, 특히 DSMZ 수탁 번호 DSM 22721을 갖는 락토바실러스 브레비스 또는 그의 변이체 또는 유도체가 화장용 또는 약학적 조성물 또는 식품, 예를 들어 유제품 바람직하게는 요구르트에서 배양될 때 정상발효성 특징을 나타내는 것은 매우 놀라웠다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 생약 제제는 이 기술 분야에서 일반적인 방식으로 만들어질 수 있다. 적합한 고체 또는 액체 생약 제형은 예를 들어 과립, 분말, 당의정, 태블릿, (마이크로)캡슐, 좌약, 시럽, 즙, 현탁액 또는 유화액이고, 그 제조를 위해 담체 물질, 폭약, 결합제, 코팅제, 팽창제, 미끄럼제 또는 윤활제, 미각제, 감미료 및 용액 매개제와 같은 통상의 수단이 사용된다. 보조 물질로 여기에서 탄산 마그네슘, 이산화 티타늄, 락토오스, 만니톨 및 다른 당, 활석, 우유 단백질, 젤라틴, 녹말, 셀룰로오스 및 유도체, 대구 간유, 해바라기유, 땅콩 기름 또는 참기름과 같은 동물성 및 식물성 기름, 폴리에틸렌 글리콜 및 멸균수와 같은 용매 및 일가 또는 다가 알콜, 예를 들어 글리세린이 나열된다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 본 발명에 따른 젖산 박테리아가 약학적으로 적합하고 생리학적으로 내성 좋은 담체 및 임의로 추가적인 적합한 활성, 첨가 또는 보조 물질과 정해진 양으로 혼합되고, 원하는 투여형으로 제제됨으로써 제조할 수 있다. 담체는 특히 "말토덱스트린, 미정질 셀룰로오스, 녹말, 특히 옥수수 녹말, 레불로오스, 락토오스, 덱스트로오스, 및 이러한 물질의 혼합물"로 이루어지는 군에서 선택되는 물질이다. 조성물은 세포 및 담체의 총량 대비 0.1 내지 95 중량% 담체 및 5 내지 99.9 중량% 동결건조된 젖산 박테리아를 함유하거나 이로 이루어질 수 있다.
DSMZ 수탁 번호 DSM 22721을 갖는 락토바실러스 브레비스 또는 그의 변이체 또는 유도체는 표준 조건(예를 들어 혐기성 조건하의 발효 배지 또는 MRS 배지)하에서 헤테로발효성이다. 이는 표준 조건하에서 배양되면 생물이 발효 도중 기체를 생성한다는 것을 의미한다.
따라서 DSMZ 수탁 번호 DSM 22721을 갖는 락토바실러스 브레비스 또는 그의 변이체 또는 유도체가 유제품, 바람직하게는 요구르트에서 배양될 때 정상발효성 특성을 보인다는 것은 매우 놀라웠다. "표준 요구르트"는 43 ℃, pH 4,5 - 4,7에서 표준 발효 스타터 및 탈지 분유로 강화된 탈지 우유로 제조되었다. 그 후 요구르트는 7 ℃에 보관된다. DSMZ 수탁 번호 DSM 22721을 갖는 락토바실러스 브레비 스 또는 그의 변이체 또는 유도체가 요구르트에 첨가되었을 때 기체 생성(기포 또는 볼록한 뚜껑)을 관찰할 수 없다. 30 일 후 HPLC 또는 상부 공간 분석을 통해 풍미 상실을 측정했다. 유제품 내의 정상발효성 특성의 놀라운 효과는 제품의 풍미 상실의 변화가 없다는 이점을 갖는다.
DSMZ 수탁 번호 DSM 22721을 갖는 락토바실러스 브레비스 또는 그의 변이체 또는 유도체의 다른 특성은 표준 조건(MRS 배지)하에서 및 발효 조건하에서 이들 생물이 H2O2를 생성하지 않는다는 것이다. 이는 H2O2-시험 스트립으로 시험했다.
다른 약점은 유기 산의 조성물이 DSMZ 수탁 번호 DSM 22721을 갖는 락토바실러스 브레비스 또는 그의 변이체 또는 유도체가 첨가된 요구르트 내에서 매우 안정하다는 것이다. pH-변화가 거의 관찰되지 않았다. 이는 식품에서의 사용을 위해 특히 중요하다.
DSMZ 수탁 번호 DSM 22721을 갖는 락토바실러스 브레비스 또는 그의 변이체 또는 유도체는 요구르트에서 정적 성장을 나타낸다. "표준 요구르트"는 43 ℃에서 표준 발효 스타터로, 탈지 분유로 강화된 탈지 우유로 제조되었고 최종 pH는 4,5 - 4,7이었다. DSMZ 수탁 번호 DSM 22721을 갖는 락토바실러스 브레비스가 첨가되었다. 제조된 요구르트는 7 ℃에서 3 주 동안 보관되었다. 이 3 주 후 본 발명의 박테리아의 증가가 관찰되지 않았다.
약학적 또는 화장용 조성물에서 사용할 때, 물론 조성물이 세포의 생활성 및 또는 본 발명에 따라 사용되는 세포, 화합물, 그의 단편 또는 상청액의 활성을 실질적으로 손상시키는 임의의 물질, 특히 활성 물질을 함유하지 않을 것이 요구된다. 각 물질 또는 활성 물질의 기술 분야의 당업자는, 예를 들어 DSMZ에 의해 제시된 것과 같은 생활성 시험에 의해, 각 조성물 내에서와 같은 농도의 각 물질 또는 활성 물질과 함께 공배양으로만 만들어지는지 용이하게 판단할 수 있다. 이 시험이 양성이면, 본 발명에 따른 세포는 성공적으로 사용될 수 있다. 이 시험이 음성이면, 본 발명에 따른 효과가 달성되지 않거나 감소된 정도로만 달성되기 때문에 각 조성물의 활용은 배제된다. 활성과 관련하여, 예를 들어 위에서 기술한대로 본 발명의 미생물을 특성화하는 억제 활성을 확인하기 위해 약학적 또는 화장용 조성물을 분석 시험에 넣는 것이 가능하다.
화장용 조성물은 예를 들어 샴푸, 수분 크림, 수분 로션, 글리콜 크림, 글리콜 로션, 클렌저, 색조 메이크업 파운데이션, 색조 메이크업 파우더 또는 색조 메이크업 컨실러이다.
본 발명의 젖산 박테리아는 직접 접종 제품으로 사용될 수 있다. 따라서 박테리아는 임의의 선행 가공 단계 없이 식품, 화장용 또는 약학적 조성물에 첨가될 수 있다. 본 발명의 박테리아가 그들 자신의 발효 상청액에 저온 보존되는 것이 바람직하다. 이는 제품의 생산을 용이하게 하고 따라서 시간 및 비용 절약에 도움이 된다.
다른 바람직한 실시태양에서 본 발명은 식품 및 상기 젖산 박테리아 또는 그의 단편을 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.
식품 조성물, 동물 사료, 약학적 조성물 또는 화장용 조성물이 절대값으로, 또는 세포를 함유하는 100 g의 식품, 동물 사료, 또는 약학적 조성물에 대해 10^2 내지 10^15, 바람직하게는 10^6 또는 10^8 내지 10^12, 특히 10^8 내지 10^10 젖산 박테리아 세포 또는 그의 단편을 함유하는 것이 바람직하다. 이러한 양은 임의의 부정적 효과 없이 매우 효율적으로 진균 성장을 억제시킬 수 있기 때문에 특히 유용하다.
젖산 박테리아가 0.0001 % 이상의 농도로 존재하는 것이 바람직하다. 이러한 농도는 식품에서 효율적인 진균 성장 억제를 제공하기 때문에 특히 유용하다.
식품 조성물이 육류 제품 또는 유제품, 바람직하게는 요구르트, 우유, 치즈, 크림, 및/또는 커드 치즈인 것이 또한 바람직하다. 이들 제품은 일반적으로 곰팡이에 취약하고 이것이 본 발명의 젖산 박테리아, 바람직하게는 DSMZ 수탁 번호 DSM 22721을 갖는 락토바실러스 브레비스 또는 그의 변이체 또는 유도체의 사용이 특히 유용한 이유이다. 한 추가적인 이점은 진균 성장 억제 효과가 유제품, 특히 요구르트 생산에 사용되는 스타터 배양균 및/또는 탈지 분유의 종류에 따라 달라지지 않는다는 것이다. 따라서 본 발명의 젖산 박테리아는 유리한 효과를 상실하지 않고 다양한 식품에 사용될 수 있다.
다른 바람직한 실시태양에서 본 발명은 젖산 박테리아를 식품, 동물 사료, 또는 약학적 조성물에 첨가하는, 식품, 동물 사료, 또는 약학적 또는 화장용 조성물의 보존 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 젖산 박테리아를 사용한 보존을 위해, 제조 과정으로부터 또는 보관 중의 오염에 의해 진균 생물을 포함할 수 있는 원칙적으로 모든 식품, 동물 사료, 또는 약학적 또는 화장용 조성물이 사용될 수 있다.
식품, 동물 사료, 또는 약학적 또는 화장용 조성물 100 g 당, 10^2 내지 10^15, 바람직하게는 10^6 또는 10^8 내지 10^12, 특히 10^8 내지 10^10 젖산 박테리아 세포 또는 그의 단편이 첨가되는 것이 바람직하다.
젖산 박테리아가 0.0001 % 내지 0.01 %, 바람직하게는 0.001 %의 농도로 첨가되는 것이 또한 바람직하다. 이러한 농도는 식품에서 진균 성장의 효율적 억제를 제공하기 때문에 특히 유용하다. 젖산 박테리아를 0.0001 % 이상, 바람직하게는 0.001 %의 농도로 첨가함으로써, 진균 성장은 영구적으로 억제되어 식품, 동물 사료, 또는 약학적 또는 화장용 조성물이 진균 성장을 방지하는 능력을 상실하지 않고 오랫동안 보관될 수 있다.
0.0001 % 내지 0.01 %, 바람직하게는 0.001 %의 본 발명의 락토바실러스의 펠릿화된, 급속 냉동된 배양물이 바람직하게는 요구르트 발효에 첨가되는 것이 특히 바람직하다. 락토바실러스의 펠릿화된, 급속 냉동된 배양균의 사용은 산업적 생산에 유용하다.
락토바실러스의 1 ml 급속 냉동 배양균이 0,5x10^10 CFU(콜로니 형성 단위(colony forming units))를 함유하는 것이 또한 바람직하다.
다른 바람직한 실시태양에서 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 상기 젖산 박테리아의 확인 방법에 관한 것이다:
h) 기질을 제공하는 단계,
i) 검토 중인 젖산 박테리아를 포함하는 제제를 제공하는 단계,
j) 젖산 박테리아를 포함하는 제제를 기질에 첨가하고, 임의적으로 이어서 발효하는 단계,
k) 미리 정해진 수의 진균 포자를 단계 j)의 생성물에 첨가하는 단계,
l) 단계 l)에서 얻어진 시험 샘플을 미리 정해진 온도에서 미리 정해진 기간 동안 인큐베이션하는 단계,
m) 진균 성장을 검출하고, 임의적으로 이어서 평가하는 단계.
본 발명의 다른 측면은 열적으로 비활성화되거나 동결건조된 상기 젖산 박테리아의 유사체 또는 단편이고, 상기 유사체 또는 단편은 진균 생물의 성장을 억제하는 능력을 보유한다. 유사체 또는 단편은 특히 본 발명의 미생물 또는 이러한 미생물의 단편의 배양액의 상청액에 존재할 수 있다. 능력은 본 발명의 미생물의 특성화를 위해 위에서 기술한대로 측정할 수 있다.
본 발명의 미생물의 특성화를 위한 다른 별법으로 참조 문헌 [P. Raspor et al., Food Technol. Biotechnol. 48(3):336-343 (2010)]에 기술된 바이오대조 분석을 사용하는 것이 가능하고, 여기서 이 분석은 검토 중인 미생물을 사용하여 수행되고 미생물이 없는 대조 실험 및/또는 미생물이 정해진 농도로 통상의 화학적 항곰팡이 화합물로 대체된 대조 실험과 비교된다.
본 발명에 따른 세포 없이 진균 생물의 배양으로, 동일한 배양 조건하에서 본 발명에 따른 세포와 함께 진균 생물의 공배양에 비해, 진균 생물의 배양 배지에서 주어진 시간에 정착 밀도로 측정한 진균 생물의 성장이 10 % 이상, 바람직하게는 50 % 이상 증가하면 진균 생물의 성장은 억제된다. 위에서 단지 예시로 기술한 특정 분석을 참조하기 바란다.
프라이머, 효소, 중간체 구조의 복제를 위한 추가적인 숙주 세포 등이 사용될 수 있고 당업자에게 공지되어 있다. 바람직하게는, 유전학적으로 조작된 변이체는 박테리아 염색체 또는 한(하나의) 플라스미드(들)에 포함되거나 박테리아 염색체 및/또는 (하나의) 플라스미드(들)에 포함된 재조합 핵산을 품고 있는 본 발명의 미생물의, 바람직하게는 기탁된 락토바실러스 종의 세포를 포함한다. 상기 재조합 핵산은 바람직하게는 본 발명의 미생물에 이물이다. "이물"이란 폴리뉴클레오티드 또는 핵산 분자가 숙주 세포에 대해 이형, 즉 상이한 유전적 배경의 세포 또는 생물로부터 유래하거나, 숙주 세포에 대해 동형이지만 상기 핵산 분자의 자연 발생적인 대응물과 상이한 유전적 환경에 위치한다는 것을 의미한다. 이는, 핵산 분자가 숙주 세포에 대해 동형이면, 상기 숙주 세포의 유전체에서 자연적 위치에 위치하지 않고, 특히 상이한 유전자에 의해 둘러싸여 있다는 것을 의미한다. 이 경우 폴리뉴클레오티드는 자신의 프로모터의 통제하에 있거나 이형 프로모터의 통제하에 있을 수 있다. 숙주 세포 내에 존재하는 본 발명에 따른 벡터 또는 핵산 분자는 숙주 세포의 유전체에 통합될 수 있거나 염색체외적으로 몇몇 형태로 유지될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 핵산 분자가 동형 재조합을 통해 변이 유전자를 복원하거나 생성할 수 있는 것으로 또한 이해될 것이다.
본 발명의 미생물의 변이체, 바람직하게는 기탁된 락토바실러스 균주의 변이체는 바람직하게는 인공적으로 변이된다. 본 발명에 따라, 용어 "변이된"은 예를 들어, 자연적으로 또는 물리적 수단 또는 EMS 또는 ENU와 같은 화학적 화합물/물질/약제에 의해 유발된 유전 물질, 즉 핵산의 (하나의) 영구적 변형(들)을 의미한다. 상기 변형은 트랜지션 또는 트랜스버젼과 같은 점 변이, 핵산/유전자/염색체 내의 하나 이상의 염기를 삭제/삽입/첨가함으로써, 그 중에서도, 예를 들어, 주로 부정적인 효과를 가져오는 비정상적인 유전자 발현/전사/번역 또는 비활성 유전자 산물, 구성물질 활성/비활성 유전자 산물을 초래할 수 있는 핵산/유전자/염색체를 변형시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 변이는 향상된 진균 생물의 성장을 억제하는 능력을 가져온다. 따라서, 기탁된 미생물의 변이 세포가 (하나의) 바람직한 유전자(들)에 (하나의) 변이(들)를 품거나 (하나의) 바람직한 유전자(들) 내의 (하나의)변이(들)이 당업자에게 공지된 방법에 의해 유도되는 것이 또한 바람직하다. 종래 기술에서 변이되거나 유전학적으로 조작된 박테리아 세포가 임의의 적합한 방법/표현형에 의해 선택될 수 있는 것으로 또한 알려져 있다. 본 발명의 맥락에서, 상승된 진균 생물의 성장을 억제하는 능력을 갖는 변이체는 본원의 실시예에서 기술하는 방법에 따라 시험할 수 있다. 그러나 용어 "변이체"는, 유전체, 즉 박테리아 염색체 내에 자연 발생적인, 자연 변이를 품고 있는 본 발명의 미생물의 세포, 바람직하게는 기탁된 미생물의 세포를 또한 포함한다. "자연 변이"는 자연적으로, 즉, 인간에 의하거나 변이원에의 노출에 의한 직접적인 유전자 조작 없이 일어나는 변이이다. 자연 변이의 선택은 균주를 배양하고, 예를 들어, 변종 박테리아의 향상된 성장을 나타내는 능력에 의해 바람직한 변종을 선택함으로써 달성할 수 있다. 자연 변이체의 선택 방법은 기술 분야에서 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.(2001); Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)] 참조). 예를 들어, 이러한 변이는 배양 도중, 예를 들어, DNA 복제와 결부된 정상적인 세포 분열 과정 도중 또는 본 발명의 미생물의 변이체의 경과 및/또는 보관 도중 발생할 수 있다.
다른 측면에서 본 발명은 열적으로 비활성화되거나 동결건조된 본 발명의 미생물의 유사체 또는 단편에 관한 것이고, 상기 유사체는 진균 생물의 성장을 억제하는 능력을 보유한다.
본 발명에 따른 용어 "본 발명의 미생물의 유사체"는 락토바실러스 속에 속하는 미생물에 특이적인 플레이트에서 더이상 단일 콜로니를 형성할 수 없는 본 발명의 미생물의, 바람직하게는 본원에 기술하는 락토바실러스 종의 죽거나 비활성화된 세포를 또한 포함한다. 상기 죽거나 비활성화 세포는 온전하거나 깨진 세포막일 수 있다. 본 발명의 미생물의 세포의 사멸 또는 비활성화 방법은 당해 기술 분야에서 공지되어 있다. 문헌 [EI-Nezami et al., J. Food Prot. 61 (1998), 466-468]은 UV-조사에 의해 락토바실러스 종을 비활성화하는 방법을 기술한다. 바람직하게는, 본 발명의 미생물의 세포는 열적으로 비활성화되거나 동결건조된다. 본 발명의 세포의 동결건조는 진균 생물의 성장을 억제하는 능력을 보유하면서 쉽게 보관하고 취급할 수 있다는 이점을 갖는다. 또한, 동결건조된 세포는 기술 분야에서 공지된 조건 하에서 적절한 액체 또는 고체 배지에 적용되면 다시 성장할 수 있다. 동결건조는 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 수행된다. 바람직하게는, 실온, 즉 16 ℃ 내지 25 ℃ 사이의 임의의 온도에서 2 시간 이상 수행된다. 또한, 본 발명의 미생물의 동결건조된 세포는 본원에서 기술하는 진균 생물을 여전히 억제하도록 4 ℃의 온도에서 4 주 이상 안정하다. 열적 비활성화는 본 발명의 미생물의 세포를 2 시간 이상 170 ℃의 온도에서 인큐베이션함으로써 달성할 수 있다. 또한, 열적 비활성화는 바람직하게는 상기 세포를 121 ℃의 온도에서 20 분 이상 동안 2 바의 기압의 포화 증기 존재하에서 상기 세포를 오토클레이빙 함으로써 달성된다. 별법으로, 본 발명의 미생물의 세포의 열적 비활성화는 상기 세포를 4 주, 3 주, 2 주, 1 주, 12 시간, 6 시간, 2 시간 또는 1 시간 이상 동안 -20 ℃에서 냉동함으로써 달성된다. 70 %, 75 % 또는 80 %, 보다 바람직하게는 85 %, 90 % 또는 95 % 이상 및 특히 바람직하게는 97 %, 98 %, 99 % 및 보다 특히 바람직하게는, 99.1 %, 99.2 %, 99.3 %, 99.4 %, 99.5 %, 99.6 %, 99.7 %, 99.8 % 또는 99.9 % 이상 및 가장 특히 바람직하게는 100 %의 본 발명의 미생물의 유사체의 세포가 죽거나 비활성화되지만, 이들이 여전히 진균 생물의 성장을 억제하는 능력을 갖는 것이 바람직하다. 본 발명의 미생물의 유사체 또는 단편이 확실히 죽거나 비활성화되었는지는 기술 분야에서 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 생활성 시험에 의해 시험할 수 있다.
용어 "본 발명의 미생물의 유사체"는 본 발명의 미생물의, 바람직하게는 본원에 개시하는 락토바실러스 종의 용해물 또는 분획을 포괄한다. 본 발명에 따르면 용어 "용해물"은 깨진 본 발명의 미생물의 세포의 수성 배지 내의 용액 또는 현탁액을 의미한다. 그러나, 용어는 임의의 제한적인 방식으로 여겨져서는 안된다. 세포 용해물은, 예를 들어, DNA, RNA, 단백질, 펩타이드, 탄수화물, 지질 등과 같은 거대 분자 및/또는, 아미노산, 당, 지방산 등과 같은 미소분자, 또는 그의 분획을 포함한다. 또한, 상기 용해물은 매끈하거나 과립 구조일 수 있는 세포 잔해를 포함한다. 예를 들면, 프렌치 프레스, 유리 또는 철 비드를 사용한 세포 밀링 또는 효소에 의한 세포 용해 등의 사용에 의한 미생물의 세포 용해물 제조 방법은 기술 분야에서 공지되어 있다. 또한, 세포를 용해시키는 것은 세포 개방/파괴 기술 분야에서 공지된 다양한 방법과 관계된다. 세포를 용해시키는 방법은 중요하지 않고 본 발명의 미생물의 세포 용해를 달성할 수 있는 임의의 방법이 사용될 수 있다. 적합한 것은 당업자에 의해 선택될 수 있고, 예를 들어 세포 개방/파괴는 효소에 의해, 화학적으로 또는 물리적으로 수행될 수 있다. 효소 및 효소 혼합물의 비제한적 예는 프로테이나아제 K와 같은 프로테아제, 리파아제 또는 글리코시다아제이고; 화학물질의 비제한적 예는 이온투과담체, 황산 도데실 나트륨과 같은 세제, 산 또는 염기이고; 물리적 수단의 비제한적 예는 프렌치 프레싱과 같은 고압, 삼투압, 열 또는 추위와 같은 온도이다. 또한, 단백질 분해 효소이외의 효소, 산, 염기 등의 적절한 조합을 사용하는 방법 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 미생물의 세포는 냉동 및 해동, 보다 바람직하게는 -70 ℃ 미만의 온도에서 냉동하고 30 ℃ 초과의 온도에서 해동함으로써 용해되고, 특히 -75 ℃ 미만의 온도에서 냉동하는 것이 바람직하고 35 ℃ 초과의 온도에서 해동하는 것이 바람직하고, 가장 바람직한 것은 -80 ℃ 미만의 냉동 온도 및 37 ℃ 초과의 해동 온도이다. 상기 냉동/해동이 1 회 이상, 보다 바람직하게는 2 회 이상, 더욱 바람직하게는 3 회 이상, 특히 바람직하게는 4 회 이상 및 가장 바람직하게는 5 회 이상 반복되는 것이 또한 바람직하다.
따라서, 당업자는 위의 일반적인 설명을 참조하고, 필요한 겅우 이들 방법을 적절히 변형 또는 수정함으로써 원하는 용해물을 제조할 수 있다. 바람직하게는, 기술한 용해물에 사용되는 수성 배지는 물, 생리 식염수, 또는 완충 용액이다. 박테리아 세포 용해물의 이점은 기술 장비가 덜 필요하기 때문에 용이하게 제조되고 비용 효율적으로 보관될 수 있다는 점이다.
본 발명에 따르면, 용해물은 또한 상술한 용해물로부터의 분자의 분획의 제제이다. 이들 분획은 당업자에게 공지된 방법, 예를 들어, 친화 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 및 칼럼에 다른 크로마토그래피 물질을 갖는 크로마토그래피를 예로서 포함한 크로마토그래피 또는 회분식 방법, 다른 분별 방법, 예를 들어, 여과 방법, 예를 들어, 한외여과, 투석, 원심분리에서의 크기 배제를 사용한 투석 및 농축, 밀도 구배 또는 단계 매트릭스에서의 원심분리, 석출, 예를 들어, 친화 석출, 염용 또는 염석(황산암모늄-석출), 알코올성 석출 또는 용해물의 상기 성분을 분리하는 다른 단백질화학적, 분자 생물학적, 생화학적, 면역학적, 화학적 또는 물리적 방법에 의해 얻을 수 있다.
"본 발명의 미생물의 단편"은 본 발명의 미생물의 세포의 임의의 부분을 포괄한다. 바람직하게는, 상기 단편은 막 제제로부터 얻어지는 막 단편이다. 락토바실러스 속에 속하는 미생물의 막 제제는 기술 분야에서 공지된 방법에 의해, 예를 들어, 문헌 [Rollan et al., Int. J. Food Microbiol. 70 (2001), 303-301], 문헌 [Matsuguchi et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10 (2003), 259-266] 또는 문헌 [Stentz et al., Appl. Environ. Microbiol. 66 (2000), 4272-4278] 또는 문헌 [Varmanen et al., J. Bacteriology 182 (2000), 146-154]에 기술된 방법을 사용함으로써 얻을 수 있다. 다르게는, 전 세포 제제가 또한 구상된다. 바람직하게는, 본원에서 기술하는 본 발명의 미생물의 유도체 또는 단편은 본원에서 상세하게 기술하는 진균 생물의 성장을 억제하는 능력을 보유한다.
본 발명은 무엇보다도 진균 성장을 억제함으로써 요구르트의 유통 기간을 연장할 수 있는 락토바실러스 균주의 발견에 기초한다. 이러한 락토바실러스 균주를 사용함으로써, 지금까지 사용되는 보존제 소르빈산 칼륨을 대체할 수 있다. 실험에서, 페니실리움, 아스페르길루스 및 알타나리아 종의 진균과 관련된 락토바실러스 세포의 억제 활성을 시험했다. 먼저, 항진균 활성과 관련하여 생 락토바실러스 세포를 사용했다. 락토바실러스 균주(락토바실러스 브레비스)가 확인되었고, 이는 시험되는 진균 균주의 성장을 억제할 수 있다. 박테리아는 "락토바실러스 항곰팡이제"로 지정되었고 2009년 6월 26일에 명칭 DSM 22721으로 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 제출되었다.
다른 실험에서, 락토바실러스 균주를 식품에서 시험했다. 이 목적을 위해, 락토바실러스 균주를 요구르트 스타터 배양균과 함께 요구르트 제조를 위한 스타팅 배지에 첨가했다. 요구르트 발효 후, 진균 포자를 첨가했고, 요구르트를 7 ℃에서 보관했다. 보존제로써 소르빈산 칼륨을 첨가한 것과 첨가하지 않는 대조용 배치와 비교하여, 본 발명의 락토바실러스를 갖는 배치에서 지속성의 현저한 연장이 달성된 것, 즉 진균 성장이 소르빈산 칼륨을 갖는 것보다 훨씬 더 긴 기간에 걸쳐 억제될 수 있음이 확인되었다.
식품, 동물 사료 또는 약학적 또는 화장용 조성물 보존을 위한 이러한 락토바실러스 균주 사용은 보통의 보존 방법에 비해 결정적인 이점을 갖는다. 이는 식품의 풍미 또는 질감을 변화시키지 않는 생물학적 보존제이다.
본 발명은 또한 식품, 동물 사료, 또는 약학적 또는 화장용 조성물에 미생물 세포를 첨가하여 보존된 식품, 동물 사료, 또는 약학적 또는 화장용 조성물의 제조를 위한 본 발명에 따른 미생물 세포의 용도, 및 식품, 동물 사료, 또는 약학적 또는 화장용 조성물에 본 발명에 따른 미생물 세포를 첨가하는 식품, 동물 사료, 또는 약학적 또는 화장용 조성물의 보존 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 미생물 세포의 응용은 간단하며, 식품의 경우 본 발명의 박테리아의 (생) 세포, 또는 단편 또는 유사체가 식품에 명시된 양으로 첨가된다. 동물 사료 또는 약학적 조성물에 유사한 생각이 적용된다.
도 1은 실시예 2의 결과를 나타낸다.
도 2는 동결건조된 본 발명의 젖산 박테리아의 안정성을 나타낸다. 안정성은 g 당 콜로니 형성 단위(cfu)를 통해 측정된다.
도 3은 급속 냉동된 본 발명의 젖산 박테리아의 -20 ℃에서 보관 후의 안정성을 나타낸다.
도 4는 급속 냉동된 본 발명의 젖산 박테리아의 -80 ℃에서 보관 후의 안정성을 나타낸다.
도 2는 동결건조된 본 발명의 젖산 박테리아의 안정성을 나타낸다. 안정성은 g 당 콜로니 형성 단위(cfu)를 통해 측정된다.
도 3은 급속 냉동된 본 발명의 젖산 박테리아의 -20 ℃에서 보관 후의 안정성을 나타낸다.
도 4는 급속 냉동된 본 발명의 젖산 박테리아의 -80 ℃에서 보관 후의 안정성을 나타낸다.
실시예
다음에서, 본 발명을 실시예를 참조하여 이들 실시예에 제한되지 않고 더욱 자세히 기술한다.
실시예 1: 식품에서의 진균 억제.
사용된 물질:
사용된 배양균은 다음과 같았다: 요구르트 스타터 배양균 요-믹스(Yo-Mix) 401(덴마크 대니스코(Danisco) 제조), 락토바실러스 DSM 22721, 페니실리움 코뮨, 페니실리움 로크포르티, 안테르나리아 알테르나타 및 아스페르길루스와 같은 다른 단리물.
사용된 화학물질 또는 배지는 다음과 같았다:
초고온 처리된 균질 우유, 1.5 % 지방, 예를 들어 마크 브란덴부르크 소재 캄피나(Campina) 제조,
D-87751 하이머팅겐 소재 그라노비타 게엠베하(Granovita GmbH) 제조 인스턴트 탈지 분유 "프레마 리폼(frema Reform)"(리폼하우스 뎀스키(Reformhaus Demski로부터 얻을 수 있음)),
소르빈산 칼륨 용액 20 mg/ml(VWR 인터네셔널 게엠베하(VWR International GmbH), 독일 다름슈타트), 무균-여과됨,
YDA 부이용(효모 추출물 PTU(올리 게엠베하(Ohly GmbH)) 25.0 g/l, D(+)글루코스 1수화물(머크, 독일 다름슈타트) 20.0 g/l, 트윈(Tween) 80(머크, 독일 다름슈타트) 1.0 g/l, 시트르산 수소 디암모늄(머크, 독일 다름슈타트) 2.0 g/l, 아세트산 나트륨(머크, 독일 다름슈타트) 5.0 g/l, 황산 마그네슘 7수화물(머크, 독일 다름슈타트) 0.1 g/l, 황산 망가니즈(II) 일수화물(시그마-알드리치, 실츠) 0.05 g/l, 인산 수소 디포타슘(머크, 독일 다름슈타트) 2.0 g/l, 121 ℃에서 20 분 동안 오토클레이빙, 오토클레이빙 후 pH 5.7,
인공 요구르트 배지(aYH 배지), D(+) 글루코스 1수화물(머크, 독일 다름슈타트) 22 g/l, 바이오스프링거(Biospringer) 0207/0-MG-L 효모 추출물(바이오스프링거, 프랑스 세덱스 메종-아포트) 15 g/l, 탈지 분유(그라노비타 게엠베하, 하이머팅겐) 20 g/l, 트윈 80(머크, 독일 다름슈타트) 1.0 g/l, 시트르산 수소 디암모늄(머크, 독일 다름슈타트) 2.0 g/l, 아세트산 나트륨(머크, 독일 다름슈타트) 5.0 g/l, 황산 마그네슘 7수화물(머크, 독일 다름슈타트) 0.1 g/l, 황산 망가니즈(II) 1수화물(시그마-알드리치, 실츠) 0.05 g/l, 인산 수소 디포타슘(머크, 독일 다름슈타트) 2.0 g/l,
요구르트 배지(초고온 처리된 우유(1.5 % 지방) + 2.0 % w/w 바이오 탈지 우유),
MRS 부이용(MRS 락토바실러스 액(BD 디프코(Difco), 아우스부르크) 55 g/l, pH 6.5),
감자 덱스트로스 한천 배지(감자 덱스트로스 배지(BD 디프코, 아우스부르크) 24 g/l, 과립화된 한천(BD 디프코, 아우스부르크) 1.5 g/l, pH 5.1), 및
초저온보호 용액(글루코스 1수화물(머크, 독일 다름슈타트) 80 g/l, 펩톤 트립티카제(BD 디프코, 아우스부르크) 2 g/l, 마그네슘 7수화물(머크, 독일 다름슈타트) 10 g/l, 인산 이수소 칼륨(머크, 독일 다름슈타트) 4 g/l, 질산 나트륨(머크, 독일 다름슈타트) 6 g/l, 염화 칼륨(머크, 독일 다름슈타트) 1 g/l, 황산 철(II) 7수화물(머크, 독일 다름슈타트) 0.02 g/l, 글리세린(85 %)(머크, 독일 다름슈타트) 200 g/l, pH 5.6).
사용된 방법:
1 g 동결건조된 요구르트 스타터(요-믹스 401, 대니스코, 덴마크)를 500 ml 초고온 처리된 저지방 우유에 녹이고 상온에서 20 분 동안 팽창하도록 둠으로써 스타터 배양균을 제조했다.
본 발명에 따른 락토바실러스의 사전 배양은 9 ml YDA 부이용에 1.5 ml 급속 냉동 배양균을 접종하고, 이어서 48 시간 동안 37 ℃에서 혐기성 인큐베이션함으로써 수행했다.
본 발명에 따른 락토바실러스의 주 배양은 30 ml YDA 부이용에 8 ml의 사전 배양균으로부터의 펠릿을 접종하고, 이어서 24 시간 동안 37 ℃에서 혐기성 인큐베이션함으로써 수행했다.
본 발명에 따른 락토바실러스의 발효는 28 ml의 주 배양균을 4,500 rpm으로 5 분 동안 원심분리함으로써 수행했고 상청액은 버렸다. 얻어진 펠릿은 5 ml 무균 0.9 % NaCl 용액에 재현탁했고 0.5 l aYH 배지가 있는 1 l 삼각 플라스크로 완전히 옮겼다. 이어서 혐기성 인큐베이션을 150 rpm의 교반기 위에서 24 시간 동안 37 ℃에서 수행했다. 발효 후, pH 값을 2 M KOH를 사용하여 5.5 ± 0.1의 값으로 조정했다.
요구르트 제조를 위해, 100 ml 초고온 처리된 우유(1.5 % 지방) + 2.0 g 탈지 분유(2 % w/w)를 쇼트 플라스크에 넣었다. 이어서 혼합물을 오토클레이브에서 15 분 동안 110 ℃로 가열했다. 42 ℃로 냉각 후, 0.5 ml의 막 제조한 요구르트 스타터 배양균을 첨가했다. 그 후, 혐기성 인큐베이션을 42 ℃에서 수행하여 4.6 ± 0.1의 pH 값을 얻었다. 이후의 사용까지의 보관은 7 ℃에서 이루어졌다.
초저온 진균 포자 현탁액 제조를 위해, 진균 샘플을 감자 덱스트로스 한천 배지에 플레이팅하고, 이어서 포자 형성까지 1 - 4 주 동안 25 - 30 ℃에서 호기성 조건에서 배양했다. 이어서 배양균을 10 ml 초저온보호 배양액에 담그고, 액체 상청액을 제거하고 초저온튜브에 옮겼다. 초저온배양균의 보관은 - 80 ℃에서 이루어졌다.
생물학적 분석을 위한 진균 준비를 위해, 0.1 ml의 초저온 진균 포자 현탁액을 감자 덱스트로스 한천 배지에 플레이팅하고, 이어서 포자 형성까지 호기성 조건하에서 25 - 30 ℃에서 1 - 4 주동안 배양했다. 이어서 배양균을 10 ml의 0.1 % 트윈 80 용액에 담구었다. 액체 상청액을 팔콘 튜브에 옮기고 4 - 6 ℃에서 보관했다. H2Odist를 사용하여 250 포자/ml로 현탁액의 희석을 수행했다.
감자 덱스트로스 한천 배지 위에서 락토바실러스에 의한 진균 억제의 생물학적 분석은 250 포자/ml를 갖는 200 ㎕의 포자 현탁액을 감자 덱스트로스 한천 배지 플레이트에 플레이팅함으로써 수행했다. 건조 후, 코르크 드릴을 사용해서 5 구멍을 한천 플레이트에 뚫었다. 각각 40 ㎕의 다음의 혼합물을 피펫팅했다:
1) MRS 배지 내의 24 h 락토바실러스 배양균,
2) MRS 배지 내의 24 h 락토바실러스 배양균으로부터의 상청액,
3) MRS 내의 24 h 배양균으로부터의 락토바실러스, 과립화되고 PBS 완충액에 재현탁됨(→PBS 내의 세포),
4) MRS 배지,
5) PBS.
이어서 플레이트의 혐기성 배양을 14 일까지 동안 실온에서 수행했다.
요구르트 내에서 락토바실러스에 의한 진균 억제를 증명하기 위한 생물학적 분석을 40 ml 요구르트 배지를 팔콘 튜브에 넣어 만들었다. 이어서 0.2 ml 스타터 배양균을 첨가했다. 다음과 같은 샘플이 제공되었다:
1) 1 x 108 락토바실러스 세포의 첨가,
2) 락토바실러스가 없는 대조물 A, 및
3) 락토바실러스가 없고, 0.4 ml 소르빈산 칼륨 용액이 발효-후 첨가된 대조물 B.
이어서 각각 42 ℃에서 pH = 4.6 ± 0.1까지 한 번 발효하고 7 ℃로 냉각하고, 6-웰 플레이트를 각 샘플 8 ml로 채우고, 샘플(포자가 없는 대조물) 당 50 포자를 첨가하고, 7 ℃에서 인큐베이션하고 진균 성장을 일일 육안 검사로 확인했다. 육안 검사를 대신하여, 진균을 밑에 있는 기질과 구별하는 사전설정 콘트라스트 세팅이 사용되는 디지털 카메라를 사용하여 자동화된 평가를 수행할 수 있다. 이는 미리 정해진 휘도 한계점 아래 또는 위로써 진균 성장에 관계되는 픽셀의 계수를 수행하는 것을 가능하게 한다. 이어서 픽셀 수는 샘플과 관련된 총 픽셀 수의 비로 설정될 수 있고, 시험된 샘플 내에 존재하는 진균의 양의 정량적 측정을 제공한다. 카메라로 플루오르켐(FluorChem®) FC2 촬영 시스템(미국 산타 클라라 소재 알파 이노텍/셀 바이오사이언스) 시스템이 다음의 설정으로 적합하다: 노출 시간: 100 - 150 ms, 조리개: 8, 콘트라스트 세팅: 블랙 레벨: 55000, 화이트 레벨: 60000, 감마: 3.0, 광 세팅: 트랜스 광 "켜짐", 반사 광 "켜짐", 화학 디스플레이 "켜짐", 속도/해상도: 보통/울트라. 알파이즈에프씨 소프트웨어로 이미지를 분석했다.
본 발명에 따른 락토바실러스 세포에 의한 진균 성장 억제.
요구르트에서 본 발명에 따른 락토바실러스에 의한 진균 성장 억제를 입증하기 위한 생물학적 분석을 수행하여 다음의 결과를 얻었다. 7 일 후, 락토바실러스 또는 소르빈산 칼륨이 없는 샘플(대조물 A)에서 육안 검사에 의해 진균 성장이 검출되었다. 9 일 후, 소르빈산 칼륨이 있는 샘플(대조물 B)에서 진균 성장이 또한 검출되었다. 그러나 28 일 후에서야, 본 발명에 따른 락토바실러스 세포가 있는 샘플에서 진균 성장이 또한 검출되었다. 결과는 본 발명에 따른 락토바실러스 세포에 의한 진균 성장의 뚜렷한 감소, 따라서 요구르트의 지속성의 실질적인 연장이 달성되었다는 것이다.
실시예 2
접종된 요구르트 표면으로부터 진균 포자를 채취하고 최적화된 조건(25 ℃, 호기성, 5 일)하에서 진균 최적화된 배지(감자 덱스트로스 한천 배지) 위에서 배양했다. 0,1 % 락토바실러스 브레비스 DSM 22721를 사용한 결과 진균 성장이 전혀 없었다(도 1 비교; (13)). 락토바실러스 브레비스 DSM 22721의 효과는 정균제가 아닌 살균제이다. 이 실험은 락토바실러스 브레비스 DSM 22721의 효과가 소르빈산 칼륨보다 우수하다는 것을 또한 나타냈다 (도 1 비교: 소르빈산 칼륨(11), 소르빈산 칼륨 없음(10)).
실시예 3
포자 현탁액 준비:
초저온 진균 포자 현탁액 제조를 위해, 진균 샘플을 감자 덱스트로스 한천 배지에 플레이팅하고, 이어서 포자 형성까지 1 - 4 주 동안 25 - 30 ℃에서 호기성 조건하에서 배양했다. 이어서 배양균을 10 ml 초저온보호 용액에 담그고, 상청액을 제거하고 초저온튜브로 이동했다. 초저온 배양균의 보관은 -80 ℃에서 이루어졌다.
생물학적 분석을 위한 포자 준비를 위해, 포자 현탁액을 감자 덱스트로스 배지에 5*106/mL으로 준비했다.
락토바실러스 세포 준비:
락토바실러스 배양균을 37 ℃에서 24 시간 동안 YDA 배지 내에서 배양했다. 이어서 4000 x g에서 원심분리에 의해 세포를 채취하고, 세포를 dH2O로 세척했다. 그 후 세포를 dH20에 10-배 농축했다.
공-인큐베이션 분석 준비:
공-인큐베이션 분석을 위해, 5*106/mL의 포자 및 20 ㎕의 10-배 락토바실러스 농축물을 함유하는 980 ㎕의 P. 코뮨 포자 현탁액을 24-웰 플레이트 내에서 24 시간 동안 25 ℃에서 공-인큐베이션 했다. 포자의 발아율을 토마 상자 내의 샘플의 현미경 평가에 의해 상이한 시점에 평가했다. 따라서 100 포자 이상을 평가했고 발아한 포자의 퍼센티지를 계산했다. 포자는 성장 길이가 포자의 직경을 초과하면 발아한 것으로 판단했다.
결과는 도 5에 나타낸다: 락토바실러스 세포와 함께 및 없이 공-인큐베이션 후 P. 코뮨 포자의 [%] 단위의 발아율. 10 % 이상 포자의 발아가 억제되면 발아 억제가 현저한 것으로 간주했다.
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<213> Lactobacillus brevis
<400> 1
gcgacttttc ggattattgg gcgtaaagcg agcgcaggcg gttttttagg tctgatgtga 60
aagccttcgg cttaaccgga gaagggcatc ggaaaccggg agacttgagt gcagaagagg 120
acagtggaac tccatgtgta gcggtgaaat gcgtagatat atggaagaac accagtggcg 180
aaggcggctg tctggtctgt aactgacgct gaggctcgaa agcatgggta gcgaacagga 240
ttagataccc tggtagtcca tgccgtaaac gatgagtgct aagtgttgga gggtttccgc 300
ccttcagtgc tgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg ggagtacgac cgcaaggttg 360
aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgatg 420
ctacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca tcttctgcta acctaagaga ttaggcgttc 480
ccttcgggga cggaatgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt 540
gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt attgtcagtt gccagcattt agttgggcac 600
tctggcgaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc 660
cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatggacggt acaacgagtc gcgaaaccgc 720
gaggtcaagc taatctctta aagccgttct cagttcggat tgcaggctgc aactcgcctg 780
catgaagttg gaatcgctag taatcgtgga tcagcatgcc acggtgaata cgttcccggg 840
cccttgtaca caccgcccgt cacaccatga gagtttgtaa cacccaaagc ccgtgaggta 900
accttcggga accagccgtc taagtgggac agatgattag gtgaagtcga c 951
Claims (15)
- 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) DSM 22721 젖산 박테리아.
- 제1항에 있어서, 상기 젖산 박테리아가 생 젖산 박테리아인, 젖산 박테리아.
- 제1항에 따른 젖산 박테리아의 용해물(lysate).
- 제1항 또는 제2항에 따른 젖산 박테리아 또는 제3항에 따른 용해물을 포함하는, 식품 첨가물용 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 따른 젖산 박테리아 또는 제3항에 따른 용해물을 식품, 동물 사료, 또는 약학적 또는 화장용 조성물에 첨가하여 식품 조성물, 동물 사료, 또는 약학적 또는 화장용 조성물을 제조하기 위한, 제1항 또는 제2항에 따른 젖산 박테리아 또는 제3항에 따른 용해물의 사용 방법.
- 식품 및 제1항 또는 제2항에 따른 젖산 박테리아 또는 제3항에 따른 용해물을 포함하는, 식품 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 젖산 박테리아 또는 그의 용해물이 0.0001% 내지 0.01%의 농도로 존재하는, 식품 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 식품 조성물이 육류 제품 또는 유제품인, 식품 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 유제품이 요구르트, 우유, 치즈, 크림, 및 커드 치즈로부터 선택되는 하나 이상인, 식품 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 따른 젖산 박테리아 102 내지 1015개를 함유하는, 동물 사료 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 따른 젖산 박테리아 102 내지 1015개를 함유하고, 상기 젖산 박테리아가 보존제로서 사용된, 약학적 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 따른 젖산 박테리아 102 내지 1015개를 함유하는, 화장용 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 따른 젖산 박테리아 또는 제3항에 따른 용해물을 식품, 동물 사료, 또는 약학적 또는 화장용 조성물에 첨가하는, 식품, 동물 사료, 또는 약학적 또는 화장용 조성물의 보존 방법.
- 제13항에 있어서, 식품, 동물 사료, 또는 약학적 또는 화장용 조성물 100 g 당, 상기 젖산 박테리아 102 내지 1015개를 첨가하는, 보존 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 젖산 박테리아 또는 그의 용해물이 0.0001% 내지 0.01%의 농도로 첨가되는, 보존 방법.
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