RU2681437C2 - Новые штаммы молочнокислых бактерий и их применения - Google Patents
Новые штаммы молочнокислых бактерий и их применения Download PDFInfo
- Publication number
- RU2681437C2 RU2681437C2 RU2015137764A RU2015137764A RU2681437C2 RU 2681437 C2 RU2681437 C2 RU 2681437C2 RU 2015137764 A RU2015137764 A RU 2015137764A RU 2015137764 A RU2015137764 A RU 2015137764A RU 2681437 C2 RU2681437 C2 RU 2681437C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- lactic acid
- present
- lactobacillus
- growth
- acid bacteria
- Prior art date
Links
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 title description 70
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 title description 58
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 196
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 107
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims abstract description 98
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 98
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 76
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims abstract description 63
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims abstract description 50
- 240000001929 Lactobacillus brevis Species 0.000 claims abstract description 32
- 235000019249 food preservative Nutrition 0.000 claims abstract description 7
- 239000005452 food preservative Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims abstract description 5
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 5
- 241001507677 Penicillium commune Species 0.000 claims description 5
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims description 4
- 241000223600 Alternaria Species 0.000 claims description 3
- 240000000064 Penicillium roqueforti Species 0.000 claims description 3
- 235000002233 Penicillium roqueforti Nutrition 0.000 claims description 3
- 241000223602 Alternaria alternata Species 0.000 claims description 2
- 241000228197 Aspergillus flavus Species 0.000 claims description 2
- 241000228230 Aspergillus parasiticus Species 0.000 claims description 2
- 241000123650 Botrytis cinerea Species 0.000 claims description 2
- 241000228153 Penicillium citrinum Species 0.000 claims description 2
- 241001507673 Penicillium digitatum Species 0.000 claims description 2
- 241001123663 Penicillium expansum Species 0.000 claims description 2
- 241000122123 Penicillium italicum Species 0.000 claims description 2
- 241000952054 Rhizopus sp. Species 0.000 claims description 2
- 241000122799 Scopulariopsis Species 0.000 claims description 2
- 241000132177 Aspergillus glaucus Species 0.000 claims 1
- 244000168141 Geotrichum candidum Species 0.000 claims 1
- 235000017388 Geotrichum candidum Nutrition 0.000 claims 1
- 241001558145 Mucor sp. Species 0.000 claims 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 52
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 39
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 abstract description 24
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 abstract description 23
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 69
- 238000000034 method Methods 0.000 description 46
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 31
- 235000013957 Lactobacillus brevis Nutrition 0.000 description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 24
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 23
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 16
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 15
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 15
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 13
- 241000894007 species Species 0.000 description 13
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 2,4-Hexadienoic acid, potassium salt (1:1), (2E,4E)- Chemical compound [K+].CC=CC=CC([O-])=O CHHHXKFHOYLYRE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 10
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 10
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 10
- 239000004302 potassium sorbate Substances 0.000 description 10
- 235000010241 potassium sorbate Nutrition 0.000 description 10
- 229940069338 potassium sorbate Drugs 0.000 description 10
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 9
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 9
- 239000001965 potato dextrose agar Substances 0.000 description 9
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 9
- 229920001202 Inulin Polymers 0.000 description 8
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 229940029339 inulin Drugs 0.000 description 8
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- GUBGYTABKSRVRQ-DCSYEGIMSA-N Beta-Lactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-DCSYEGIMSA-N 0.000 description 7
- LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N L-(-)-Sorbose Chemical compound OCC1(O)OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O LKDRXBCSQODPBY-AMVSKUEXSA-N 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N inulin Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)OC[C@]1(OC[C@]2(OC[C@]3(OC[C@]4(OC[C@]5(OC[C@]6(OC[C@]7(OC[C@]8(OC[C@]9(OC[C@]%10(OC[C@]%11(OC[C@]%12(OC[C@]%13(OC[C@]%14(OC[C@]%15(OC[C@]%16(OC[C@]%17(OC[C@]%18(OC[C@]%19(OC[C@]%20(OC[C@]%21(OC[C@]%22(OC[C@]%23(OC[C@]%24(OC[C@]%25(OC[C@]%26(OC[C@]%27(OC[C@]%28(OC[C@]%29(OC[C@]%30(OC[C@]%31(OC[C@]%32(OC[C@]%33(OC[C@]%34(OC[C@]%35(OC[C@]%36(O[C@@H]%37[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O%37)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%36)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%35)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%34)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%33)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%32)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%31)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%30)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%29)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%28)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%27)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%26)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%25)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%24)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%23)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%22)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%21)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%20)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%19)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%18)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%17)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%16)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%15)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%14)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%13)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%12)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%11)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O%10)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O9)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O8)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H]([C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 JYJIGFIDKWBXDU-MNNPPOADSA-N 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 6
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 6
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 6
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 6
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 6
- 239000006872 mrs medium Substances 0.000 description 6
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 6
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 6
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 5
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 5
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 5
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 5
- 108010062877 Bacteriocins Proteins 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000011953 bioanalysis Methods 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 4
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 210000003578 bacterial chromosome Anatomy 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 3
- -1 diacetyl Chemical compound 0.000 description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 230000035784 germination Effects 0.000 description 3
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229940061634 magnesium sulfate heptahydrate Drugs 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OSNSWKAZFASRNG-WNFIKIDCSA-N (2s,3r,4s,5s,6r)-6-(hydroxymethyl)oxane-2,3,4,5-tetrol;hydrate Chemical compound O.OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O OSNSWKAZFASRNG-WNFIKIDCSA-N 0.000 description 2
- AKXKFZDCRYJKTF-UHFFFAOYSA-N 3-Hydroxypropionaldehyde Chemical compound OCCC=O AKXKFZDCRYJKTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000206600 Carnobacterium maltaromaticum Species 0.000 description 2
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000831743 Lactobacillus parafarraginis Species 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- FUSGACRLAFQQRL-UHFFFAOYSA-N N-Ethyl-N-nitrosourea Chemical compound CCN(N=O)C(N)=O FUSGACRLAFQQRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 2
- GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N Titan oxide Chemical compound O=[Ti]=O GWEVSGVZZGPLCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 229940077731 carbohydrate nutrients Drugs 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000000959 cryoprotective effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 235000019387 fatty acid methyl ester Nutrition 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000009920 food preservation Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000021474 generally recognized As safe (food) Nutrition 0.000 description 2
- 235000021473 generally recognized as safe (food ingredients) Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 2
- ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate monohydrate Chemical compound O.[Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O ISPYRSDWRDQNSW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 2
- YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N triammonium citrate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[NH4+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O YWYZEGXAUVWDED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- JYVXNLLUYHCIIH-UHFFFAOYSA-N (+/-)-mevalonolactone Natural products CC1(O)CCOC(=O)C1 JYVXNLLUYHCIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WSWCOQWTEOXDQX-MQQKCMAXSA-M (E,E)-sorbate Chemical compound C\C=C\C=C\C([O-])=O WSWCOQWTEOXDQX-MQQKCMAXSA-M 0.000 description 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 3-(2-methoxyethoxy)benzohydrazide Chemical compound COCCOC1=CC=CC(C(=O)NN)=C1 GNFTZDOKVXKIBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VOXXWSYKYCBWHO-UHFFFAOYSA-N 3-phenyllactic acid Chemical compound OC(=O)C(O)CC1=CC=CC=C1 VOXXWSYKYCBWHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710142635 Bacteriocin sakacin-A Proteins 0.000 description 1
- 241001453380 Burkholderia Species 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 241000186031 Corynebacteriaceae Species 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000194031 Enterococcus faecium Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 206010017533 Fungal infection Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000202368 Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis Species 0.000 description 1
- 241000186839 Lactobacillus fructivorans Species 0.000 description 1
- 241000186685 Lactobacillus hilgardii Species 0.000 description 1
- 241000186612 Lactobacillus sakei Species 0.000 description 1
- 244000025090 Lactobacillus sanfrancisco Species 0.000 description 1
- 235000013864 Lactobacillus sanfrancisco Nutrition 0.000 description 1
- 241000194036 Lactococcus Species 0.000 description 1
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 1
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 1
- 241000192132 Leuconostoc Species 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000004909 Moisturizer Substances 0.000 description 1
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 1
- 231100000678 Mycotoxin Toxicity 0.000 description 1
- RHYBFKMFHLPQPH-UHFFFAOYSA-N N-methylhydantoin Chemical compound CN1CC(=O)NC1=O RHYBFKMFHLPQPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 241000192001 Pediococcus Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- JYVXNLLUYHCIIH-ZCFIWIBFSA-N R-mevalonolactone, (-)- Chemical compound C[C@@]1(O)CCOC(=O)C1 JYVXNLLUYHCIIH-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000221662 Sclerotinia Species 0.000 description 1
- 241000194017 Streptococcus Species 0.000 description 1
- 235000019486 Sunflower oil Nutrition 0.000 description 1
- 244000126014 Valeriana officinalis Species 0.000 description 1
- 235000013832 Valeriana officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 1
- 238000010564 aerobic fermentation Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000787 affinity precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001046 anti-mould Effects 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 239000002546 antimould Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 239000007799 cork Substances 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 239000008150 cryoprotective solution Substances 0.000 description 1
- 235000015140 cultured milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 1
- 230000000855 fungicidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001408 fungistatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 235000021472 generally recognized as safe Nutrition 0.000 description 1
- 230000004077 genetic alteration Effects 0.000 description 1
- 230000005017 genetic modification Effects 0.000 description 1
- 235000013617 genetically modified food Nutrition 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 235000020603 homogenised milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 150000001261 hydroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002555 ionophore Substances 0.000 description 1
- 230000000236 ionophoric effect Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O SURQXAFEQWPFPV-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 235000013622 meat product Nutrition 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229940057061 mevalonolactone Drugs 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000001333 moisturizer Effects 0.000 description 1
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002636 mycotoxin Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000004108 pentose phosphate pathway Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000003016 pheromone Substances 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 235000013324 preserved food Nutrition 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 108020004418 ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 1
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002453 shampoo Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 229940075554 sorbate Drugs 0.000 description 1
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004763 spore germination Effects 0.000 description 1
- 229940032147 starch Drugs 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 239000002600 sunflower oil Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004408 titanium dioxide Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 235000016788 valerian Nutrition 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
- A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
- A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
- A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
- A23C9/123—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt
- A23C9/1234—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes using only microorganisms of the genus lactobacteriaceae; Yoghurt characterised by using a Lactobacillus sp. other than Lactobacillus Bulgaricus, including Bificlobacterium sp.
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K10/00—Animal feeding-stuffs
- A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
- A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
- A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
- A23L29/065—Microorganisms
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L3/00—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs
- A23L3/34—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals
- A23L3/3454—Preservation of foods or foodstuffs, in general, e.g. pasteurising, sterilising, specially adapted for foods or foodstuffs by treatment with chemicals in the form of liquids or solids
- A23L3/3463—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
- A23L3/3571—Microorganisms; Enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
- A61K35/747—Lactobacilli, e.g. L. acidophilus or L. brevis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
- A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
- A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
- A61K8/99—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/10—Antimycotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
- A61Q19/00—Preparations for care of the skin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
- A23V2400/11—Lactobacillus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
- A23V2400/11—Lactobacillus
- A23V2400/121—Brevis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2400/00—Lactic or propionic acid bacteria
- A23V2400/11—Lactobacillus
- A23V2400/169—Plantarum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
- A61K2800/10—General cosmetic use
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
- A61K2800/80—Process related aspects concerning the preparation of the cosmetic composition or the storage or application thereof
- A61K2800/85—Products or compounds obtained by fermentation, e.g. yoghurt, beer, wine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/225—Lactobacillus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/225—Lactobacillus
- C12R2001/24—Lactobacillus brevis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/225—Lactobacillus
- C12R2001/25—Lactobacillus plantarum
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Birds (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Physiology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Agronomy & Crop Science (AREA)
- Pest Control & Pesticides (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Dentistry (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
Abstract
Изобретение относится к молочнокислой бактерии Lactobacillus brevis, предназначенной для использования в качестве пищевого консерванта. Указанная молочнокислая бактерия депонирована в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур под регистрационным номером DSM 22721. Указанная бактерия является гетероферментативной и ингибирует рост по меньшей мере одного грибного организма. Изобретение может быть использовано для консервации продуктов питания, корма для животных, фармацевтических и/или косметических составов. 2 з.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 3 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к новым штаммам Lactobacillus и их применениям, в частности для консервации продуктов питания, корма для животных, фармацевтических составов и/или косметических составов.
Уровень техники и предпосылки создания изобретения
Продукты питания и корм для животных, благодаря составу питательных веществ, являются хорошими субстратами для микроорганизмов. Аналогичные соображения касаются фармацевтических и косметических составов, так как в них часто содержатся галеновые препараты или носители и вспомогательные вещества. Многие из этих микроорганизмов, в частности грибы, являются одной из наиболее частых причин порчи продуктов питания и корма для животных, а также фармацевтических или косметических составов. Особо опасными являются, главным образом, образуемые микроорганизмами токсичные и канцерогенные микотоксины, которые опасны для здоровья людей. Помимо этого, порча продуктов питания ежегодно имеет серьезные экономические последствия. Считается, что каждый день из-за бактериальной порчи уничтожается приблизительно 5-10% продуктов питания.
Чтобы избежать порчи, например, продуктов питания и корма для животных, их делают более долговечными посредством обработки химическими или биологическими консервантами или посредством добавления таких консервантов. В особенности увеличивается спрос на биологические консерванты, так как многие потребители стремятся избегать химических консервантов.
К таким биологическим консервантам относятся, например, молочнокислые бактерии. Эти бактерии обычно безвредны для человека и традиционно в течение веков используются для консервации продуктов питания. Их безопасность и безвредность определяется так называемым GRAS-статусом (в целом признан безопасным) американского FDA (Управление по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств). Кроме того, во многих продуктах питания естественным образом уже присутствуют молочнокислые бактерии.
Механизм биоконсервации может быть обусловлен либо конкурентным ростом, либо биосинтезом антагонистических или антибактериальных метаболитов. В основном, консервирующее действие молочнокислых бактерий является следствием образования органических кислот, таких как молочная кислота. Благодаря этому, уменьшается величина pH, что ингибирует рост многих микроорганизмов.
Кроме молочной кислоты, имеется ряд других метаболитов, таких как уксусная кислота, перекись водорода, диацетил, реутерин и так называемые бактериоцины, которые играют важную роль в консервации продуктов питания и корма для животных.
Некоторые из этих метаболитов, такие как уксусная кислота и реутерин, ингибируют рост бактерий и грибов, некоторые вещества, такие как бактериоцины, ингибируют только рост бактерий, а другие вещества действуют только против грибов. В процессе исследований, касающихся противогрибковой активности молочнокислых бактерий, были идентифицированы многочисленные ингибирующие вещества: капроновая, пропионовая, масляная, уксусная, муравьиная и валериановая кислоты (Corsetti, A.G., Antimould activity of sourdough lactic acid bacteria: identification of a mixture of organic acids produced by Lactobacillus sanfrancisco CB1, Applied Microbiology and Biotechnology (50), pp. 253-256, (1998)), метилгидантоин и мевалонолактон (Niku-Paavola, M.L., New types of antimicrobial compounds produced by Lactobacillus plantarum, Journal of Applied Microbiology (86), pp. 29-35, (1999)), различные жирные гидроксикислоты (Sjögren, J.M., Antifungal 3-hydroxy fatty acids from Lactobacillus plantarum MiLAB 14, Applied and Environmental Microbiology (69), pp. 7554-7557, (2003)), 3-фенилмолочная кислота (Lavermicocca, P.V., Purification and characterization of novel antifungal compounds from the sourdough Lactobacillus plantarum strain 21B, Applied and Environmental Microbiology (66), pp. 4084-90, (2000)) и дикетопиперазины (Niku-Paavola, см. выше). Однако некоторые белковые компоненты с противогрибковой активностью не смогли идентифицировать (Magnusson, J., Lactobacillus coryniformis subsp.coryniformis strain Si3 produces a broad-spectrum proteinaceous antifungal compound, Applied and Environmental Microbiology (67), pp. 1-5, (2001)).
В то время как многие метаболиты образуются во время роста клеток молочнокислых бактерий, известно, что другие образуются только после индукции. Этот механизм в целом назван аутоиндукция или "чувство кворума". Данный эффект уже известен для некоторых бактериоцинов, таких как продуцируемые Carnobacterium piscicola (Kleerebezem, М.К., A two-component signal transduction cascade in Carnobacterium piscicola LV17B: two signaling peptides and one sensor-transmitter, Peptides (22), pp. 1597-1601, (2003)), Lactobacillus sakei (Diep, D.B., The synthesis of the bacteriocin sakacin A is a temperature-sensitive process regulated by a pheromone peptide through a three-component regulatory system, Microbiology (146), pp. 2155-2160, (2000)), Lactobacillus plantarum (Maldonado, A.J. - D., Induction of Plantaricin Production in Lactobacillus plantarum NC8 after Coculture with Specific Gram-Positive Bacteria Is Mediated by an Autoinduction Mechanism, J. Bacteriol., 5 (186), pp.1556-1564 (2003)) и Enteroccoccus faecium (Nilsen, T.I., An exported inducer peptide regulates bacteriocin production in Enterococcus faecium CTC 492, J. Bacteriol. (180), pp. 1848-1854, (1998)).
Бактерии видов Burkholderia и Pseudomonas, однако, не имеют GRAS-статуса и поэтому не могут использоваться в продуктах питания или корме для животных.
Patra Falguni и др. ("Productions of proteinaceous antifungal substances form Lactobacillus brevis NDCD 02", International Journal of Dairy Technology vol. 63, No. 1, 1 February 2010, pages 70-76) описали штамм Lactobacillus brevis, обладающий широким противогрибковым спектром действия, который может использоваться как эффективный биоконсервант и незаквасочные LAB (молочнокислые бактерии) в продуктах питания. Основным недостатком этого штамма является то, что для продуцирования противогрибковых веществ он нуждается в богатой питательными веществами среде. Например, в обезжиренном молоке продуцирование противогрибковых веществ было незначительным. Следовательно, данный штамм Lactobacillus brevis не подходит для использования в качестве пищевого консерванта в молочных продуктах.
В ЕР 2543246 раскрыто противогрибковое действие жизнеспособных бактерий штамма Lactobacillus plantarum против Penicillium и Aspergillus в покрытии сыра. Следовательно, противогрибковое действие имело место в аэробных условиях. Противогрибковое действие в анаэробных условиях не было показано. Но для использования в качестве пищевого консерванта в молочных продуктах, важно, чтобы противогрибковое действие имело место при аэробных и анаэробных условиях.
Принимая во внимание данный уровень техники, было бы желательно иметь GRAS-признанные микроорганизмы, которые образуют противогрибковые метаболиты, ингибируют рост грибов и, следовательно, могут использоваться в качестве консервантов без ограничений и недостатков современного уровня техники.
Техническая цель изобретения
Таким образом, технической целью изобретения является обеспечение микроорганизмами, которые ингибируют рост грибов и могут использоваться в продуктах питания, корме для животных, фармацевтических и/или косметических составах.
Общая характеристика изобретения и предпочтительные варианты
Указанная проблема решается с помощью признаков независимых пунктов формулы изобретения. Предпочтительные варианты настоящего изобретения представлены зависимыми пунктами формулы изобретения.
Для достижения данной технической цели в изобретении предложен микроорганизм, принадлежащий к группе молочнокислых бактерий, или его фрагмент для использования в качестве пищевого консерванта, причем молочнокислая бактерия является гетероферментативной молочнокислой бактерией и ингибирует рост по меньшей мере одного грибного организма.
С таксонометрической точки зрения, молочнокислые бактерии делятся на подгруппы Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus и Lactococcus. Предпочтительно, микроорганизм по настоящему изобретению является видом Lactobacillus. У представителей группы молочнокислых бактерий обычно отсутствуют порфирины и цитохромы, не происходит фосфорилирование с переносом электронов и, поэтому, они получают энергию только посредством субстратного фосфорилирования. То есть АТФ молочнокислых бактерий синтезируется в результате ферментации углеводов. Все молочнокислые бактерии растут в анаэробных условиях, однако, в отличие от многих анаэробов, большинство молочнокислых бактерий нечувствительны к кислороду и поэтому могут расти в его присутствии так же, как и при его отсутствии. Соответственно, бактерии по настоящему изобретению предпочтительно являются аэротолерантными анаэробными молочнокислыми бактериями, принадлежащими к роду Lactobacillus.
Способность расти в анаэробных условиях является главным преимуществом, по сравнению со штаммами, известными в настоящее время. Поэтому, теперь возможно использовать молочнокислые бактерии по настоящему изобретению в качестве пищевого консерванта не только в покрытии молочных продуктов, но также в самих продуктах, таких как молоко, йогурт или домашний сыр.
Молочнокислые бактерии по настоящему изобретению не нуждаются в какой-либо специальной питательной среде для проявления противогрибковой активности. Эксперименты показали, что молочнокислые бактерии по настоящему изобретению также способны ингибировать рост по меньшей мере одного грибного организма в обезжиренном молоке. Следовательно, молочнокислые бактерии по настоящему изобретению могут использоваться в молочных продуктах различного вида без добавления каких-либо дополнительных питательных веществ, что было бы препятствием для использования в качестве пищевого консерванта. Благодаря этому факту микроорганизм по настоящему изобретению намного лучше по сравнению с известными микроорганизмами, в частности описанными Patra Falguni и др.
Микроорганизм, принадлежащей к группе молочнокислых бактерий по настоящему изобретению, предпочтительно имеет палочковидную форму, варьирующуюся от длинной и тонкой до короткой изогнутой палочки, кроме того, он предпочтительно является неподвижным и/или неспорообразующим. Предпочтительно, молочнокислые бактерии по настоящему изобретению расположены поодиночке или попарно. Они предпочтительно продуцируют молочную кислоту как основной или единственный продукт ферментативного метаболизма. Предпочтительно, молочнокислые бактерии по настоящему изобретению продуцируют молочную кислоту, предпочтительно DL-изомер молочной кислоты в количестве по меньшей мере 50% от глюкозы посредством пентозофосфатного пути. Молочнокислые бактерии по настоящему изобретению могут также продуцировать диоксид углерода и этанол. Предпочтительно, рост молочнокислых бактерий при температурах 15 или 45°C различен. Кроме того, предпочтительно, они содержат глицеринтейхоевую кислоту в клеточной стенке.
На основании вышеуказанных характеристик, молочнокислые бактерии по настоящему изобретению можно классифицировать как принадлежащие к роду Lactobacillus. С помощью классических систематик, например, со ссылкой на соответствующее описание в "Определителе бактерий Берджи" (Williams & Wilkins Co., 1984), можно определить, что молочнокислые бактерии по настоящему изобретению принадлежат к роду Lactobacillus. Кроме того, молочнокислые бактерии по настоящему изобретению можно классифицировать как принадлежащие к роду Lactobacillus с помощью известных способов, например, по характерным признакам их метаболизма, то есть посредством сравнительного анализа способности микроорганизма(ов) по настоящему изобретению метаболизировать сахара, или другими способами, описанными, например, в Schleifer et al., System. Appl. Microb., 18 (1995), 461-467 or Ludwig et al., System. Appl. Microb., 15 (1992), 487-501. Микроорганизмы no настоящему изобретению способны к метаболизированию источников Сахаров, которые являются обычными и известными для микроорганизмов, принадлежащих к роду Lactobacillus. В предпочтительном варианте, однако, молочнокислая бактерия по настоящему изобретению имеет характерные признаки метаболизма, выбранные из группы, состоящей из:
(i) она метаболизирует D-лактозу, но не метаболизирует L-сорбозу и/или D-сахарозу и/или D-инулин,
(ii) она метаболизирует инулин,
(iii) она метаболизирует L-сорбозу, но не метаболизирует D-лактозу и/или D-сахарозу и/или инулин, и
(iv) она метаболизирует L-сорбозу, D-лактозу и инулин.
Предпочтительно, молочнокислая бактерия по настоящему изобретению имеет характерные признаки метаболизма, выбранные из группы, состоящей из:
(i) она метаболизирует D-лактозу, но не метаболизирует L-сорбозу, D-сахарозу и инулин,
(ii) она метаболизирует L-сорбозу, D-лактозу и инулин, но не метаболизирует D-сахарозу,
(iii) она метаболизирует L-сорбозу, но не метаболизирует D-лактозу, D-сахарозу и инулин, и
(iv) она метаболизирует L-сорбозу, D-лактозу, D-сахарозу, но не метаболизирует инулин.
Конечно, молочнокислая бактерия по настоящему изобретению не ограничивается метаболизированием Сахаров, указанных в вышеприведенном наборе характерных признаков метаболизма, а может обладать способностью метаболизировать другие сахара, которые обычно метаболизируются видами Lactobacillus.
Принадлежность микроорганизмов по настоящему изобретению к роду Lactobacillus можно также определить с помощью других известных способов, например, с помощью электрофореза в геле SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) общего белка определяемых видов, и сравнения их с известными и уже охарактеризованными штаммами рода Lactobacillus. Способы получения профиля общего белка, как указано выше, а также численный анализ таких профилей хорошо известны специалистам. Однако, результаты достоверны только в случаях, когда каждая стадия процесса полностью стандартизирована. В связи с требованием обеспечения точности при определении принадлежности микроорганизма к роду Lactobacillus, стандартизованные процедуры регулярно представляются сведению публики их авторами, такими как Pot и др., как например представленные во время "семинара", организованного Европейским союзом в Гентском университете в Бельгии 12-16 сентября 1994 г. (Способы "отпечатков пальцев" для классификации и идентификации бактерий, SDS-PAGE общего клеточного белка). Программное обеспечение, используемое для анализа электрофореза в геле SDS-PAGE, имеет большое значение, так как степень корреляции между видами зависит от параметров и алгоритмов, используемых в данном программном обеспечении. Не вдаваясь в теоретические подробности, количественное сравнение зон, измеренных денситометром и нормализованных посредством компьютера, предпочтительно осуществляют с использованием коэффициента корреляции Пирсона. Полученную таким образом матрицу подобия можно преобразовать с помощью алгоритма UPGMA (метод попарного невзвешенного среднего), который позволяет не только сгруппировать вместе наиболее сходные профили, но также построить дендрограмму (см. Kersters, Numerical methods in the classification and identification of bacteria by electrophoresis, in Computer-assisted Bacterial Systematics, 337-368, M. Goodfellow, A.G. O'Donnell Ed., John Wiley and Sons Ltd, 1985).
Альтернативно, принадлежность указанных микроорганизмов по настоящему изобретению к роду Lactobacillus можно определить в отношении рибосомной РНК в так называемом Riboprinter.RTM. Более предпочтительно, принадлежность вновь идентифицируемых видов по настоящему изобретению к роду Lactobacillus подтверждена посредством сравнения нуклеотидной последовательности рибосомной 16S РНК бактерий по настоящему изобретению или их геномной ДНК, которая кодирует рибосомную 16S РНК, с последовательностями других известных в настоящее время родов и видов молочнокислых бактерий. Другой предпочтительной альтернативой для определения принадлежности вновь идентифицируемых видов по настоящему изобретению к роду Lactobacillus является использование видоспецифичных PCR-праймеров (PCR-полимеразная цепная реакция), которые нацелены на спейсерную область 16S-23S рРНК. Другой предпочтительной альтернативой является RAPD-PCR (PCR с произвольно амплифицируемой полиморфной ДНК) (Nigatu et al. in Antonie van Leenwenhoek (79), 1-6, 2001), в результате которой получают штаммоспецифическую ДНК-последовательность, которая позволяет определить принадлежность идентифицируемых микроорганизмов по настоящему изобретению к роду Lactobacillus. Другими способами, которые могут использоваться для определения принадлежности микроорганизмов по настоящему изобретению к роду Lactobacillus, являются полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (RFLP) (Giraffa et al., Int. J. Food Microbiol. 82 (2003), 163-172), определение "отпечатков пальцев" повторяющихся элементов (Gevers et al., FEMS Microbiol. Lett. 205 (2001) 31-36) или анализ набора метиловых эфиров жирных кислот (FAME) бактериальных клеток (Heyrman et al., FEMS Microbial. Lett. 181 (1991), 55-62). Кроме того, лактобактерии можно определять посредством определения типа лектинов (Annuk et al., J. Med. Microbiol. 50 (2001), 1069-1074) или посредством анализа белков клеточной стенки (Gatti et al., Lett. Appl. Microbiol. 25 (1997), 345-348).
Особенно предпочтительный вариант настоящего изобретения относится к выделенной молочнокислой бактерии или ее фрагменту, полученной способом, включающим в себя:
a) обеспечение субстрата,
b) обеспечение препарата, содержащего исследуемые молочнокислые бактерии,
c) добавление препарата, содержащего молочнокислые бактерии, к субстрату с последующей факультативной стадией ферментации,
d) добавление заданного количества спор грибов к продукту стадии с),
e) инкубирование анализируемого образца, полученного на стадии d), в течение заданного периода времени при заданной температуре,
f) контроль с последующей факультативной оценкой роста грибов,
g) выделение по меньшей мере одной молочнокислой бактерии.
Если рост грибов не наблюдается, то молочнокислая бактерия является молочнокислой бактерией по настоящему изобретению. Поэтому, предпочтительно, чтобы стадия g) осуществлялась, когда рост грибов не наблюдается.
Кроме того, если по сравнению с контрольным анализируемым образцом, для которого пропущена стадия с), наблюдается уменьшенный рост грибов, то молочнокислая бактерия также является видом по настоящему изобретению. В настоящем изобретении, выражение "уменьшенный" означает уменьшение роста грибов по меньшей мере на 20%, лучше по меньшей мере на 50%, предпочтительно по меньшей мере на 90%.
Также предпочтительно, молочнокислая бактерия по настоящему изобретению характеризуется тем, что ее можно определить в соответствии со следующими стадиями:
A) обеспечивают субстрат,
B) обеспечивают препарат, содержащий исследуемые молочнокислые бактерии,
C) препарат, содержащий молочнокислые бактерии, добавляют к субстрату с последующей факультативной стадией ферментации,
D) продукт стадии С) помещают в емкости для образцов, в которых формируют анализируемые образцы,
E) по меньшей мере к одному анализируемому образцу добавляют заданное количество спор грибов,
F) осуществляют инкубирование анализируемого образца, полученного на стадии Е), в течение заданного периода времени при заданной температуре,
G) контроль с последующей факультативной оценкой роста грибов. Предпочтительно, рост грибов определяют посредством съемки фотоаппаратом или
визуального осмотра анализируемого образца после стадии F) и оценки роста грибов.
Если рост грибов не наблюдается, то молочнокислая бактерия является молочнокислой бактерией по настоящему изобретению. Кроме того, если по сравнению с анализируемым контрольным образцом, для которого пропущена стадия С), наблюдается уменьшенный рост грибов, то молочнокислая бактерия также является видом по настоящему изобретению. В настоящем изобретении, выражение "уменьшенный" означает уменьшение роста грибов по меньшей мере на 20%, лучше по меньшей мере на 50%, предпочтительно по меньшей мере на 90%. Количественное определение можно проводить с помощью фотосъемки при заданной настройке контраста и автоматического подсчета пикселей, относящихся к покрытой грибами поверхности, при этом находится отношение количества пикселей, относящихся к покрытой грибами поверхности, к общему количеству пикселей фотоснимка анализируемого образца. Фотоснимок предпочтительно должен быть черно-белым. В некоторых случаях может оказаться полезным окрашивание субстрата темным пигментом или красителем (который предпочтительно является микробиологически инертным), чтобы увеличить контраст грибов на субстрате, например, если субстратом является йогуртовый субстрат белого цвета и у грибов также белый цвет. В частности, анализ образцов можно проводить так, как изложено в примере 1.2, последний абзац. В качестве фотоаппарата можно использовать систему FluorChem® FC2 Imaging System (Alpha Innotech/Cell Biosciences), Santa Clara, USA) со следующими настройками: время экспозиции: 100-150 мс, диафрагма: 8, настройки контраста: уровень черного: 55000, уровень белого: 60000, гамма (коэффициент контрастности): 3,0, настройки освещения: проходящий свет "включено", отраженный свет "включено", автоматическая регулировка контраста (chemi display): "включено", скорость/разрешение: нормальная/ультра. Изображения анализировали с помощью программного обеспечения AlphaEaseFC.
В качестве альтернативного или дополнительного контрольного образца может использоваться образец, в который на стадии с), в отличие от вышеописанной стадии с), добавляют сорбат калия в заданном количестве, которое обычно используется в области консервации продуктов питания (например 0,2 мг на грамм). Данный контрольный образец затем может служить в качестве эталона, то есть молочнокислые бактерии по настоящему изобретению влияют на ингибирование роста грибов по меньшей мере в той же степени, что и данный контрольный образец.
Клетки являются жизнеспособными, если они удовлетворяют требованиям теста на жизнеспособность DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Немецкая коллекция микроорганизмов и клеточных культур) GmbH, Braunschweig, Germany, при совместном культивировании в предусмотренных случаях с соответствующим субстратом, к которому клетки должны добавляться или на который они должны наноситься.
Предпочтительно, молочнокислая бактерия является живой молочнокислой бактерией. Неожиданностью было то, что живой микроорганизм по настоящему изобретению проявлял сильную противогрибковую активность, не оказывая неблагоприятного воздействия на продукт питания.
Особенно предпочтительно, молочнокислая бактерия является бактерией Lactobacillus brevis, Lactobacillus hilgardii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus fructivorans или Lactobacillus parafarraginis.
Согласно настоящему изобретению, микроорганизмы являются молочнокислыми бактериями, принадлежащими к роду Lactobacillus, более предпочтительно к описанным в настоящем изобретении видам Lactobacillus. Еще более предпочтительно, Lactobacillus по настоящему изобретению является Lactobacillus brevis; другим предпочтительным видом Lactobacillus является L. parafarraginis. Однако, виды Lactobacillus не ограничиваются указанными. В особенно предпочтительном варианте микроорганизмы по настоящему изобретению "выделены" или "очищены". Термин "выделены" означает, что материал извлечен из его исходной окружающей среды, например из природной среды, если он имеет природное происхождение. Например, природный микроорганизм, предпочтительно вид Lactobacillus, отделенный от части или всех сопутствующих в природной системе материалов, является выделенным. Такой микроорганизм может быть частью состава и тем не менее должен считаться выделенным, если состав не является частью его природной окружающей среды.
Термин "очищены" не требует абсолютной чистоты; скорее, он служит в качестве относительного определения. Отдельные микроорганизмы, получаемые из коллекции микроорганизмов, обычно очищены до микробиологической гомогенности, то есть когда их известными способами высевают штрихом на чашках с агаром, они растут как единые колонии. Предпочтительно, чашки с агаром, которые используются для этой цели, являются селективными по отношению к видам Lactobacillus. Такие селективные чашки с агаром известны в данной области техники.
Особенно предпочтительной является молочнокислая бактерия, зарегистрированная под номером DSM 22721, или ее фрагмент, мутант и/или производное, при этом указанные фрагмент, мутант или производное сохраняют способность к ингибированию роста грибного организма.
В особенно предпочтительном варианте настоящего изобретения молочнокислая бактерия по настоящему изобретению выбрана из группы, состоящей из Lactobacillus brevis, имеющей DSMZ-регистрационный номер DSM 22721, или ее мутанта или производного, при этом указанные мутант или производное сохраняют способность ингибировать рост грибных организмов. Термин "Lactobacillus brevis, имеющая DSMZ-регистрационный номер" относится к клеткам микроорганизма, принадлежащего к виду Lactobacillus brevis, депонированного в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур (DSMZ) 26 июня 2009 г. и имеющего регистрационный номер DSM 22721. DSMZ расположена по адресу: Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Germany. Вышеупомянутое DSMZ-депонирование было организовано в соответствии с условиями Будапештского договора о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры.
Основной проблемой пищевой промышленности является грибковое заражение продуктов питания. Известные к настоящему времени в данной области способы консервации продуктов питания, такие как использование химических веществ, могут придать продуктам питания нежелательные свойства. Кроме того, такие способы могут вызывать обеспокоенность у потребителей. Поэтому, необходимость в альтернативных способах консервации стала важной проблемой для пищевой промышленности. Следовательно, изобретение, в частности молочнокислая бактерия, зарегистрированная под номером DSM 22721, особенно важно, поскольку оно обеспечивает возможность альтернативного эффективного способа консервации продуктов питания без каких-либо побочных эффектов.
"Мутант или производное" молочнокислых бактерий по настоящему изобретению, предпочтительно депонированных Lactobacillus brevis, имеет предпочтительно те же свойства, что и соответствующий депонированный штамм, то есть сохраняет способность ингибировать рост грибных организмов и, предпочтительно, имеет такие же ингибирующие свойства, как описано в настоящем изобретении выше. Например, указанное производное может быть создано методами генной инженерии. В контексте настоящего изобретения термин "созданный методами генной инженерии" используется в самом широком смысле в отношении известных специалистам методов модификации требуемых нуклеиновых кислот in vitro и in vivo, в которых генетическая модификация и изменение генов осуществляется посредством технологии рекомбинантных ДНК. В связи с этим указанные методы предпочтительно содержат клонирование, секвенирование и трансформацию рекомбинантных нуклеиновых кислот. Для этой цели, используются подходящие векторы, включая экспрессионные векторы для видов Lactobacillus такие как, например, описаны в ЕР-В1 506789, ЕР-В1 316677, ЕР-В1 251064, ЕР-В1-218230, ЕР-В1 133046 или WO 89/01970.
В контексте настоящего изобретения термин "молочнокислые бактерии по настоящему изобретению" также включает в себя производные, мутанты, аналоги или фрагменты, указанных микроорганизмов, например, описанную в настоящем изобретении мембранную фракцию, которые сохраняют вышеуказанную способность ингибировать рост грибных организмов. Термины "производное", "мутанты", "аналоги" и "фрагменты" описаны в другом месте настоящего изобретения.
Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутант или производное отличаются следующими характеристиками. Микроорганизмы показывают оптимальный рост при 30-37°С в аэробных или анаэробных условиях. При температуре выше 42°С рост не наблюдается.
Аэробное брожение Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутанта или производного приводит к увеличению плотности клеток.
Культивирование Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутанта или производного в стандартных условиях (например, среда MRS (Мозера-Рогоза-Шарпа), 37°С, анаэробные условия) приводит к повышению кислотности до рН 3,5-3,7.
Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутант или производное присутствуют в виде отдельных палочек или пар или иногда в виде коротких цепочек (2-10 мкм). В стандартных условиях они имеют тенденцию образовывать колонии, имеющие цвет от белого до кремового, с немного матовым внешним видом и слегка структурированной поверхностью.
Неожиданно, добавление молочнокислых бактерий по настоящему изобретению, предпочтительно Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутанта или производного, не изменяет текстуру или цвет продукта питания, в частности йогурта.
Предпочтительно, молочнокислые бактерии по настоящему изобретению, предпочтительно Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутант или производное, содержат 16S рДНК со следующей последовательностью 1 (SEQ ID NO 1):
Другим преимуществом молочнокислых бактерий по настоящему изобретению, предпочтительно Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутанта или производного, состоит в том, что возможно глубокое замораживание штамма на срок по меньшей мере 6 месяцев примерно при -20°С или примерно -80°С. Бактерии остаются стабильными и не теряют своей способности ингибировать рост грибных организмов. Также возможно хранить молочнокислые бактерии по настоящему изобретению после лиофилизации (см. также фиг. 2).
Одним из преимуществ является то, что молочнокислая бактерия по настоящему изобретению, в частности зарегистрированная под номером DSM 2272, или ее фрагмент, мутант и/или производное, ингибирует рост грибов рода penicillium, в частности penicillium commune или penicillium roqueforti, рода aspergillus и рода alternaria, в частности alternaria alternata, penicillium expansum, penicillium citrinum, penicillium digitatum, penicillium italicum, scopulariopsis breviacaulis, aspergillus flavus, aspergillus parasiticus, botrytis cinerea, rhizopus sp., mucor sp., eurotium herbariorum, geotrichum candidum, cladosporium herbarum, fusarium sambucinum, phytophora infestans и sclerotinia scerotiorum.
Другой предпочтительный вариант настоящего изобретения относится к применению указанных молочнокислых бактерий или их фрагмента для получения пищевой композиции, корма для животных, фармацевтического или косметического состава, при этом молочнокислые бактерии, предпочтительно живые молочнокислые бактерии, или их фрагмент добавляют к продукту питания, корму для животных, фармацевтическому или косметическому составу.
Общеизвестно, что Lactobacillus brevis использует гетероферментативный метаболизм и, следовательно, является гетероферментативной молочнокислой бактерией. Гетероферментативный метаболизм, как правило, характеризуется образованием газа и кислоты. Оба эффекта являются неблагоприятными для производства продуктов питания, фармацевтических препаратов или косметических средств. Поэтому, было очень неожиданным, что молочнокислые бактерии по настоящему изобретению, в частности Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или их мутант или производное, проявляют гомоферментативные свойства при культивировании в косметических или фармацевтических составах или продуктах питания, например, в молочных продуктах, предпочтительно йогурте.
Галеновый препарат фармацевтического состава по настоящему изобретению можно изготовить обычным в данной технологии способом. Приемлемыми твердыми или жидкими формами галеновых препаратов являются, например, гранулы, порошки, драже, таблетки, (микро)капсулы, суппозитории, сиропы, соки, суспензии или эмульсии, для изготовления которых обычно используются такие средства, как носители, разрыхлители, связующие, покрывающие, набухающие, скользящие или смазывающие агенты, вкусовые агенты, подсластители и промежуточные растворы. В качестве вспомогательных веществ могут использоваться карбонат магния, диоксид титана, лактоза, маннит и другие сахара, тальк, молочный белок, желатин, крахмал, целлюлоза и производные, животные и растительные масла, такие как рыбий жир, подсолнечное масло, арахисовое масло или кунжутное масло, полиэтиленгликоли и растворители, такие как стерильная вода и одноатомные или многоатомные спирты, например, глицерин. Фармацевтический состав по настоящему изобретению может быть изготовлен посредством смешивания заданной дозы молочнокислых бактерий по настоящему изобретению с фармацевтически приемлемым и физиологически хорошо переносимым носителем, а также возможно с приемлемыми активными, дополнительными или вспомогательными веществами, и изготавливается в виде требуемой лекарственной формы. Носителями, в частности, являются вещества, которые выбраны из группы, содержащей мальтодекстрин, микрокристаллическую целлюлозу, крахмал, в частности кукурузный крахмал, фруктозу, лактозу, декстрозу и смеси этих веществ. Состав может содержать или состоять из 0,1-95 вес. % носителя и 5-99,9 вес. % лиофилизированных молочнокислых бактерий относительно общего количества клеток и носителей.
Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутант или производное является гетероферментативной в стандартных условиях (например, среда для ферментации или среда MRS в анаэробных условиях). Это означает, что при культивировании в стандартных условиях организмы в процессе ферментации производят газ.
Поэтому, было очень неожиданным, что Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутант или производное проявила гомоферментативные свойства при культивировании в молочных продуктах, предпочтительно йогурте. "Стандартный йогурт" был изготовлен с использованием стандартной закваски для сбраживания при 43°C, рН 4,5-4,7, а также с использованием обезжиренного молока, в которое было добавлено сухое обезжиренное молоко. После этого йогурт хранили при 7°C. Когда к йогурту добавили Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутант или производное, образование газа (пузырьки газа или выпуклая поверхность) не наблюдалось. Через 30 дней посредством HPLC (высокоэффективной жидкостной хроматографии) или анализа равновесного пара определили наличие постороннего привкуса. Неожиданное проявление гомоферментативных свойств в молочных продуктах имеет преимущество в том, что в продукте отсутствует посторонний привкус.
Другим свойством Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутанта или производного является то, что эти организмы не производят Н2О2 ни в стандартных условиях (среда MRS), ни в условиях ферментации. Это было проверено с помощью Н2О2-индикаторных полосок.
Другим преимуществом является то, что в йогурте, в который добавлена Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутант или производное, состав органических кислот очень стабильный. Практически не наблюдается изменение рН. Это особенно важно для использования в продуктах питания.
Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутант или производное показывает в йогурте статический рост."Стандартный йогурт" был изготовлен с использованием стандартной закваски для сбраживания при 43°C и с использованием обезжиренного молока, в которое было добавлено сухое обезжиренное молоко, конечная величина рН составляла 4,5-4,7. Была добавлена Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721. Полученный йогурт хранили при 7°C в течение 3 недель. Через 3 недели не наблюдалось увеличения бактерий по настоящему изобретению.
При использовании в фармацевтических или косметических составах, конечно, необходимо, чтобы состав не содержал каких-либо веществ, в частности активных веществ, которые существенно снижают жизнеспособность клеток и/или активность клеток, соединений, их фрагментов или супернатантов, используемых в соответствии с изобретением. Специалист в области соответствующих веществ или активных веществ может легко определить это с помощью теста на жизнеспособность, например, как предложено DSMZ, который осуществляют только при совместном культивировании с соответствующим веществом или активным веществом в концентрации, в которой оно присутствует в соответствующем составе. Если данный тест положительный, то клетки по настоящему изобретению могут с успехом использоваться. Если данный тест отрицательный, применение соответствующего состава исключается, так как эффект по настоящему изобретению не достигается или достигается в меньшей степени. Что касается активности, можно, например, провести анализ фармацевтического или косметического состава для определения ингибирующей активности, как описано выше, который используется для определения микроорганизма по настоящему изобретению.
Косметическими составами являются, например, шампунь, увлажняющий крем, увлажняющий лосьон, гликолевый крем, гликолевый лосьон, очищающее средство, тональный крем, тональная пудра или корректор для лица.
Молочнокислые бактерии по настоящему изобретению могут использоваться как материал для прямого внесения. Следовательно, бактерии могут добавляться к продуктам питания, косметическим или фармацевтическим составам без каких-либо предшествующих стадий обработки. Предпочтительно, бактерии по настоящему изобретению подвергнуты криоконсервации в супернатанте, образующемся при их ферментации. Это облегчает получение продуктов и, следовательно, способствует экономии времени и снижению расходов.
Еще один предпочтительный вариант изобретения относится к пищевой композиции, содержащей продукт питания и указанные молочнокислые бактерии или их фрагменты.
Предпочтительно, пищевая композиция, корм для животных, фармацевтический состав или косметический состав содержит от 102 до 1015, предпочтительно от 106 или 108 до 1012, в частности от 108 до 1010 клеток молочнокислых бактерий или их фрагментов в абсолютном количестве или на 100 г продукта питания, корма для животных или фармацевтического состава, содержащего клетки. Эти количества особенно предпочтительны, так как они позволяют очень эффективно ингибировать рост грибов, не оказывая какого-либо неблагоприятного воздействия.
Предпочтительно, молочнокислые бактерии присутствуют в концентрации 0,0001% или более. Эти концентрации особенно предпочтительны, так как они обеспечивают эффективное ингибирование роста грибов в продуктах питания.
Также предпочтительно, пищевая композиция является мясным продуктом или молочным продуктом, предпочтительно йогуртом, молоком, сыром, сливками и/или творожным сыром. Эти продукты обычно подвержены плесневению, из-за чего использование молочнокислых бактерий по настоящему изобретению, предпочтительно Lactobacillus brevis с DSMZ-регистрационным номером DSM 22721 или ее мутанта или производного, особенно предпочтительно. Дополнительным преимуществом является то, что эффект ингибирования роста грибов не зависит от типа заквасочной культуры и/или сухого обезжиренного молока, используемого для изготовления молочного продукта, в частности йогурта. Поэтому молочнокислые бактерии по настоящему изобретению могут использоваться в различных продуктах питания, не утрачивая полезного действия.
Другой предпочтительный вариант изобретения относится к способу консервации продукта питания, корма для животных, фармацевтического или косметического состава, при этом указанные молочнокислые бактерии добавляют к продукту питания, корму для животного или фармацевтическому составу.
Для консервации с помощью молочнокислых бактерий по настоящему изобретению могут использоваться практически все продукты питания, корм для животных, фармацевтические или косметические составы, которые могут содержать грибные организмы, занесенные либо при изготовлении, либо в результате заражения во время хранения.
Предпочтительно, на 100 г продукта питания, корма для животных, фармацевтического или косметического состава добавляют от 102 до 1015, предпочтительно от 106 или 108 до 1012, в частности от 108 до 1010 клеток молочнокислых бактерий или их фрагментов.
Также предпочтительно, молочнокислые бактерии добавляют в концентрации от 0,0001% до 0,01%, предпочтительно 0,001%. Эти концентрации особенно предпочтительны, так как они обеспечивают эффективное ингибирование роста грибов в продуктах питания. При добавлении молочнокислых бактерий в концентрации 0,0001% или более, предпочтительно 0,001%, рост грибов ингибируется постоянно, так что продукт питания, корм для животных, фармацевтический или косметический состав может храниться длительное время без утраты возможности предотвращать рост грибов.
Особенно предпочтительно, добавляется от 0,0001% до 0,01%, предпочтительно 0,001% гранулированной глубокозамороженной культуры Lactobacilli по настоящему изобретению, предпочтительно для ферментации йогурта. Использование гранулированной глубокозамороженной культуры Lactobacilli удобно для промышленного производства.
Также предпочтительно, 1 мл глубокозамороженной культуры лактобактерий содержит 0,5×1010 КОЕ (колониеобразующих единиц).
Другой предпочтительный вариант изобретения относится к способу идентификации указанной молочнокислой бактерии, содержащему
h) обеспечение субстрата,
i) обеспечение препарата, содержащего исследуемые молочнокислые бактерии,
j) добавление препарата, содержащего молочнокислые бактерии, к субстрату с последующей факультативной стадией ферментации,
k) добавление заданного количества спор грибов к продукту стадии j),
l) инкубирование анализируемого образца, полученного на стадии l), в течение заданного периода времени при заданной температуре,
m) контроль с последующей факультативной оценкой роста грибов.
Другим аспектом настоящего изобретения является аналог или фрагмент указанной молочнокислой бактерии, которая термически инактивирована или лиофилизирована, при этом указанный аналог или фрагмент сохраняет способность ингибировать рост грибных организмов. Аналог или фрагмент может, в частности, присутствовать в супернатанте культуры микроорганизмов по настоящему изобретению или фрагмента такого микроорганизма. Эту способность определяют как указано выше для определения свойств микроорганизма по настоящему изобретению.
В качестве дополнительной альтернативы для определения свойств микроорганизмов по настоящему изобретению, можно использовать анализ биорегулирования, описанный в статье P. Raspor et al., Food Technol. Biotechnol. 48 (3): 336-343 (2010), согласно которой данный анализ проводят с использованием исследуемых микроорганизмов в сравнении с контрольными экспериментами при отсутствии микроорганизма и/или контрольными экспериментами, в которых микроорганизм заменен традиционным химическим противогрибковым соединением в заданной концентрации.
Рост грибных организмов ингибируется, если при культивировании грибных организмов в отсутствие клеток по настоящему изобретению рост грибных организмов увеличивается по меньшей мере на 10%, предпочтительно по меньшей мере на 50%, по сравнению с совместным культивированием грибных организмов и клеток по настоящему изобретению в идентичных условиях культивирования, этот рост считают по плотности колоний через заданное время на среде для культивирования грибных организмов. Дополнительный специфический анализ описан выше только в качестве примера.
Могут использоваться известные специалистам праймеры, ферменты, дополнительные клетки-хозяева для клонирования промежуточных конструкций и т.п. Предпочтительно, мутанты, полученные методами генной инженерии, содержат клетки микроорганизма по настоящему изобретению, предпочтительно депонированного вида Lactobacillus, в которые введены рекомбинантные нуклеиновые кислоты, содержащиеся либо в бактериальной хромосоме, либо в плазмиде(ах) или содержащиеся в бактериальной хромосоме и/или в плазмиде(ах). Указанные рекомбинантные нуклеиновые кислоты предпочтительно являются чужеродными для микроорганизма по настоящему изобретению. "Чужеродные" означает, что молекула полинуклеотида или нуклеиновой кислоты является либо гетерологичной по отношению к клетке-хозяину, то есть выделенной из клетки или микроорганизма с другим генетическим окружением, либо гомологичной по отношению к клетке-хозяину, но расположенной в другом генетическом окружении по сравнению с природным аналогом указанной молекулы нуклеиновой кислоты. Это означает, что если молекула нуклеиновой кислоты является гомологичной по отношению к клетке-хозяину, она не находится в месте природного расположения в геноме указанной клетки-хозяина, в частности, она окружена другими генами. В этом случае полинуклеотид может находиться либо под контролем своего собственного промотора, либо под контролем гетерогенного промотора. Вектор или молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению, которая присутствует в клетке-хозяине, может быть интегрированной в геном клетки-хозяина или в некоторой форме находиться вне хромосомы. В связи с этим, также должно быть понятно, что молекула нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению может использоваться для восстановления или создания мутантного гена посредством гомологичной рекомбинации.
Мутант микроорганизма по настоящему изобретению, предпочтительно мутант депонированного штамма Lactobacillus, предпочтительно получен в результате искусственной мутации. Согласно настоящему изобретению термин "получен в результате мутации" означает длительную(ые) модификацию(и) генетического материала, то есть нуклеиновых кислот, возникшую(ии), например, естественным образом или вызванную(ые) физическими средствами или химическими соединениями/веществами/агентами, такими как EMS (этилметансульфонат) или ENU (N-этил-N-нитрозомочевина). Указанные модификации включают в себя точечные мутации, такие как транзиции или трансверсии, делеции/вставки/добавление одного или нескольких оснований в нуклеиновую кислоту/ген/хромосому, в результате чего происходит модификация нуклеиновой кислоты/гена/хромосомы, что может привести, помимо прочего, к экспрессии/транскрипции/трансляции аберрантного гена или образованию неактивных генных продуктов, конститутивных активных/неактивных генных продуктов, которые могут быть причиной, например, доминантно-негативных эффектов. Предпочтительно, мутация приводит к увеличению способности к ингибированию роста грибных организмов. Таким образом, также предпочтительны мутантные клетки депонированного микроорганизма, которые содержат мутацию(ии) в требуемом(ых) гене(ах) или в которых мутация(ии) в требуемом гене(ах) индуцирована(ы) известными специалистам способами. Также известно, что мутантные или полученные методами генной инженерии бактериальные клетки можно отбирать любыми подходящими способами/по фенотипу. В контексте настоящего изобретения мутант, обладающий повышенной способностью к ингибированию роста грибных организмов, может быть исследован в соответствии со способами, описанными далее в примерах. Термин "мутант", однако, также включает в себя клетки микроорганизма по настоящему изобретению, предпочтительно клетки депонированного микроорганизма, которые содержат естественные, спонтанные мутации в своем геноме, то есть в бактериальной хромосоме. "Спонтанные мутации" это мутации, которые возникают естественным образом, то есть без прямой генетической манипуляции человека, или под воздействием мутагена. Отбор спонтанных мутантов можно осуществлять посредством культивирования штамма и отбора требуемых вариантов, например, в соответствии с различной способностью бактерий к улучшенному росту. Способы отбора спонтанных мутантов хорошо известны (см., например, Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (2001); Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)). Например, такие мутации могут возникать во время культивирования, например, во время нормального процесса клеточного деления, сопровождаемого репликацией ДНК, или во время пассирования и/или консервации мутанта микроорганизма по настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к аналогу или фрагменту микроорганизма по настоящему изобретению, который термически инактивирован или лиофилизирован, при этом указанный аналог сохраняет способность к ингибированию роста грибных организмов.
В соответствии с настоящим изобретением термин "аналог микроорганизма по настоящему изобретению" включает в себя также мертвую или инактивированную клетку микроорганизма по настоящему изобретению, предпочтительно раскрытого в настоящем изобретении вида Lactobacillus, которая больше не способна образовывать отдельную колонию на чашке, специфичной для микроорганизмов, принадлежащих к роду Lactobacillus. Указанная мертвая или инактивированная клетка может иметь либо неповрежденную, либо разрушенную клеточную мембрану. Способы киллинга или инактивации клеток микроорганизма по настоящему изобретению известны в технике. В статье EI-Nezami et al., J. Food Prot. 61 (1998), 466-468 описан способ инактивации вида Lactobacillus посредством УФ-излучения. Предпочтительно, клетки микроорганизма по настоящему изобретению термически инактивированы или лиофилизированы. Лиофилизация клеток по настоящему изобретению имеет преимущество в том, что клетки можно удобно хранить и использовать, при этом сохраняется их способность к ингибированию роста грибных организмов. Кроме того, лиофилизированные клетки могут снова расти при внесении их в соответствующую жидкую или твердую среду при известных в технике условиях. Лиофилизацию осуществляют известными в технике способами. Предпочтительно, ее проводят в течение по меньшей мере 2 часов при комнатной температуре, то есть при любой температуре между 16°С и 25°С. Кроме того, лиофилизированные клетки микроорганизма по настоящему изобретению являются стабильными в течение по меньшей мере 4 недель при температуре 4°С, сохраняя способность ингибировать грибной организм, как описано выше. Термическая инактивация может быть достигнута путем инкубирования клеток микроорганизма по настоящему изобретению в течение по меньшей мере 2 часов при температуре 170°С. Кроме того, термической инактивации предпочтительно достигают путем обработки указанных клеток в автоклаве при температуре 121°С в течение по меньшей мере 20 минут в присутствии насыщенного пара при давлении атмосферы 2 бара. Альтернативно, термической инактивации клеток микроорганизма по настоящему изобретению достигают путем их замораживания клеток в течение по меньшей мере 4 недель, 3 недель, 2 недель, 1 недели, 12 часов, 6 часов, 2 часов или 1 часа при минус 20°С. Предпочтительно, по меньшей мере 70%, 75% или 80%, более предпочтительно 85%, 90% или 95%, особенно предпочтительно по меньшей мере 97%, 98%, 99%, еще более предпочтительно 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% или 99,9% и наиболее предпочтительно 100% клеток аналога микроорганизма по настоящему изобретению являются мертвыми или инактивированными, однако, они все еще обладают способностью к ингибированию роста грибных организмов. Является ли аналог или фрагмент микроорганизма по настоящему изобретению действительно мертвым или инактивированным, можно определить известными способами, например с помощью теста на жизнеспособность.
Термин "аналог микроорганизма по настоящему изобретению" охватывает лизаты или фракции микроорганизма по настоящему изобретению, предпочтительно раскрытого в настоящем изобретении вида Lactobacillus. Согласно настоящему изобретению термин "лизат" означает раствор или суспензию в водной среде клеток микроорганизма по настоящему изобретению, которые разрушены. Однако, термин не должен истолковываться как каким-либо образом ограничивающий. Клеточный лизат содержит, например, макромолекулы, такие как ДНК, РНК, белки, пептиды, углеводы, липиды и т.п. и/или микромолекулы, такие как аминокислоты, сахара, жирные кислоты и т.п., или их фракции. Кроме того, указанный лизат содержит осколки клеток, которые могут иметь гладкую или зернистую структуру. Способы приготовления клеточных лизатов микроорганизма известны в технике, например, с использованием френч-пресса, мельницы для разрушения клеток со стеклянными или железными шариками или ферментативного лизиса клеток и т.п. Кроме того, лизирование клеток относится к различным известным способам раскрытия/разрушения клеток. Способ лизирования клеток не имеет большого значения, и может применяться любой способ, который позволяет осуществить лизис клеток микроорганизма по настоящему изобретению. Соответствующий способ может быть выбран специалистом, например, раскрытие/разрушение клеток может осуществляться ферментативно, химически или физически. Неограничивающими примерами ферментов и смесей ферментов являются протеазы, такие как протеиназа К, липазы или гликозидазы; неограничивающими примерами химических веществ являются ионофоры, поверхностно-активные вещества, такие как додецилсульфат натрия, а также кислоты или основания; а неограничивающими примерами физических средств являются высокое давление, например обработка с помощью френч-пресса, а также осмотическое давление и температура, например высокая или низкая. Кроме того, может также применяться способ, в котором используется подходящее сочетание фермента (не являющегося протеолитическим ферментом), кислоты, основания и т.п. Например, клетки микроорганизма по настоящему изобретению лизировали замораживанием и размораживанием, более предпочтительно замораживанием при температурах ниже минус 70°С и размораживанием при температурах выше 30°С, в частности, замораживанием предпочтительно при температурах ниже минус 75°С и размораживанием предпочтительно при температурах выше 35°С, а наиболее предпочтительны температура замораживания ниже минус 80°С и температура размораживания выше 37°С. Также предпочтительно, что указанное замораживание/размораживание повторяют по меньшей мере 1 раз, более предпочтительно по меньшей мере 2 раза, еще более предпочтительно по меньшей мере 3 раза, особенно предпочтительно по меньшей мере 4 раза и наиболее предпочтительно по меньшей мере 5 раз.
Соответственно, специалисты могут приготовить нужные лизаты, руководствуясь вышеизложенными общими пояснениями и, если необходимо, соответствующим образом модифицируя или изменяя эти способы. Предпочтительно, водная среда, используемая для описанных лизатов, является водой, физиологическим раствором или буферным раствором. Преимуществом лизата бактериальных клеток является то, что его можно легко получать и хранить с меньшими затратами, так как при этом требуется меньше технических средств.
Согласно изобретению лизатами являются также препараты или фракции молекул из вышеуказанных лизатов. Эти фракции можно получать известными специалистам способами, например, посредством хроматографии, включая, например, аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, эксклюзионную хроматографию, обращенно-фазовую хроматографию и хроматографию с другим хроматографическим материалом в колонке или периодические методы, а также посредством других методов фракционирования, таких как фильтрация, например, ультрафильтрация, диализ, диализ и концентрирование с разделением по размеру центрифугированием, центрифугирование в матриксе с градиентом плотности или ступенчатом матриксе, осаждение, например, аффинное осаждение, всаливание или высаливание (осаждение сульфатом аммония), осаждение спиртом, или другие методы химии белков, молекулярной биологии, биохимические, химические или физические методы разделения вышеуказанных компонентов лизатов.
"Фрагмент микроорганизма по настоящему изобретению" включает в себя любую часть клетки микроорганизма по настоящему изобретению. Предпочтительно, указанным фрагментом является мембранная фракция, полученная посредством приготовления препаратов мембран. Препараты мембран микроорганизмов, принадлежащих к роду Lactobacillus, могут быть получены известными способами, например способом, описанным в статьях Rollan et al., Int. J. Food Microbiol. 70 (2001), 303-301; Matsuguchi et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10 (2003), 259-266 или Stentz et al, Appl. Environ. Microbiol. 66 (2000), 4272-4278 или Varmanen et al., J. Bacteriology 182 (2000), 146-154. В качестве альтернативы, также возможен цельноклеточный препарат. Предпочтительно, описанное в настоящем изобретении производное или фрагмент микроорганизма по настоящему изобретению сохраняет способность к ингибированию роста грибных организмов, что подробно описано в настоящем изобретении.
Изобретение прежде всего основано на обнаружении штаммов Lactobacillus, которые способны продлить срок хранения йогурта посредством ингибирования роста грибов. Путем использования такого штамма Lactobacillus можно заменить применяемый до настоящего времени консервант сорбат калия. В экспериментах исследовалась ингибирующая активность клеток Lactobacillus по отношению к грибам видов penicillium, aspergillus и alternaria. Сначала, для определения противогрибковой активности использовались живые клетки Lactobacillus. Был идентифицирован штамм Lactobacillus (Lactobacillus brevis), который способен ингибировать рост исследуемых штаммов грибов. Бактерия была названа "антиплесневой Lactobacillus" и подана 26 июня 2009 г. в DSMZ (Немецкую коллекцию микроорганизмов и клеточных культур) под номером DSM 22721.
В другом эксперименте штамм Lactobacillus тестировали в продуктах питания. Для этой цели штамм Lactobacillus вместе с йогуртовой заквасочной культурой добавили в исходную среду для приготовления йогурта. После ферментации йогурта добавили споры грибов, и хранили йогурт при 7°С. В сравнении с контрольными культурами с добавлением или без добавления сорбата калия в качестве консерванта, было обнаружено, что в культуре с Lactobacillus по настоящему изобретению достигнуто значительное увеличение срока годности, то есть рост грибов можно ингибировать на протяжении более длительного периода времени, чем с помощью сорбата калия.
Использование такого штамма Lactobacillus для консервации продуктов питания, корма для животных, фармацевтических или косметических составов имеет очевидное преимущество перед обычными способами консервации. Этот штамм является биологическим консервантом, который не изменяет запах или текстуру продукта питания.
Изобретение относится также к применению клеток микроорганизма по настоящему изобретению для получения консервированного продукта питания, корма для животных, фармацевтического или косметического состава, когда в продукт питания, корм для животных, фармацевтический или косметический состав добавляют клетки микроорганизма, а также к способу консервации продукта питания, корма для животных, фармацевтического или косметического состава, когда в продукт питания, корм для животных, фармацевтический или косметический состав добавляют клетки микроорганизма по настоящему изобретению
Применение клеток микроорганизма по настоящему изобретению отличается простой. В случае продуктов питания (живые) клетки или фрагменты или аналоги бактерий по настоящему изобретению добавляют в продукт питания в заданном количестве. То же относится и к корму для животных или фармацевтическим составам.
Примеры
Далее изобретение более подробно описано в Примерах, не будучи ограничено ими.
Фиг. 1 - показаны результаты Примера 2.
Фиг. 2 - показана стабильность лиофилизированных молочнокислых бактерий по настоящему изобретению; стабильность измеряли в колониеобразующих единицах (кое) на грамм.
Фиг. 3 - показана стабильность глубокозамороженных молочнокислых бактерий по настоящему изобретению после хранения при минус 20°С.
Фиг. 4 - показана стабильность глубокозамороженных молочнокислых бактерий по настоящему изобретению после хранения при минус 80°C.
Пример 1. Ингибирование грибов в продуктах питания.
Используемые материалы:
Используемые культуры: йогуртовая заквасочная культура Yo-Mix 401 (Danisco, Denmark), Lactobacillus DSM 22721, penicillium commune, penicillium roqueforti, anternaria alternata и другие собственные изоляты, такие как aspergillus.
Используемые реагенты и среды:
Обработанное при сверхвысокой температуре гомогенизированное молоко, 1,5% жира, например, от Campina Mark Brandenburg,
Сухое обезжиренное молоко "frema Reform" от Granovita GmbH, D-87751 Heimertingen (доступен у Reformhaus Demski),
Раствор сорбата калия 20 мг/мл (VWR International GmbH, Darmstadt), стерилизованный фильтрацией,
Питательная среда YDA (дрожжевой экстракт PTU (Ohly GmbH) 25,0 г/л, D(+)-глюкозы моногидрат (Merck, Darmstadt) 20,0 г/л, Tween 80 (Merck, Darmstadt) 1,0 г/л, аммоний лимоннокислый двузамещенный (Merck, Darmstadt) 2,0 г/л, ацетат натрия (Merck, Darmstadt) 5,0 г/л, гептагидрат сульфата магния (Merck, Darmstadt) 0,1 г/л, моногидрат сульфата марганца (II) (Sigma-Aldrich, Seelze) 0,05 г/л, калий фосфорнокислый двузамещенный (Merck, Darmstadt) 2,0 г/л, автоклавирование при 121°C в течение 20 мин, после автоклавирования рН 5,7,
Искусственная йогуртовая среда (среда YH), D(+)-глюкозы моногидрат (Merck, Darmstadt) 22,0 г/л, дрожжевой экстракт Biospringer 0207/0-MG-L (Biospringer, Maisons-Afort Cedex, France) 15 г/л, сухое обезжиренное молоко (Granovita GmbH, Heimertingen) 20 г/л, Tween 80 (Merck, Darmstadt) 1,0 г/л, аммоний лимоннокислый двузамещенный (Merck, Darmstadt) 2,0 г/л, ацетат натрия (Merck, Darmstadt) 5,0 г/л, гептагидрат сульфата магния (Merck, Darmstadt) 0,1 г/л, моногидрат сульфата марганца (II) (Sigma-Aldrich, Seelze) 0,05 г/л, калий фосфорнокислый двузамещенный (Merck, Darmstadt) 2,0 г/л,
Йогуртовая среда (обработанное при сверхвысокой температуре молоко (1,5% жира) + 2,0% масса/масса обезжиренного молока Bio),
Среда MRS (бульон MRS для лактобактерий (BD Difco, Augsburg) 55 г/л, рН 6,5),
Картофельно-декстрозный агар (картофельно-декстрозный бульон (BD Difco, Augsburg) 24 г/л, агар гранулированный (BD Difco, Augsburg) 1,5 г/л, рН 5,1), и
Криозащитный раствор (моногидрат глюкозы (Merck, Darmstadt) 80 г/л, пептон триптиказа (BD Difco, Augsburg) 2 г/л, гептагидрат сульфата магния (Merck, Darmstadt) 10 г/л, калий фосфорнокислый двузамещенный (Merck, Darmstadt) 4 г/л, нитрат натрия (Merck, Darmstadt) 6 г/л, хлорид калия (Merck, Darmstadt) 1 г/л, гептагидрат сульфата железа (II) (Merck, Darmstadt) 0,02 г/л, глицерин (85%) (Merck, Darmstadt) 200 г/л, pH 5,6).
Применяемые способы:
Приготовили заквасочные культуры посредством растворения 1 г лиофилизированной йогуртовой заквасочной культуры (Yo-Mix 401, Danisco, Denmark) в 500 мл обработанного при сверхвысокой температуре молока с низким содержанием жира и оставили ее набухать в течение 20 мин при температуре окружающей среды.
Осуществили предварительное культивирование Lactobacillus по настоящему изобретению посредством внесения 1,5 мл глубокозамороженной культуры в 9 мл питательной среды YDA с последующим инкубированием в анаэробных условиях при 37°C в течение 48 ч.
Основное культивирование Lactobacillus по настоящему изобретению осуществили посредством введения осадка из 8 мл предварительной культуры в 30 мл питательной среды YDА с последующим инкубированием в анаэробных условиях при 37°C в течение 24 ч.
Ферментацию Lactobacillus по настоящему изобретению осуществили посредством центрифугирования 28 мл основной культуры в течение 5 мин при 4500 об/мин и удалили супернатант. Полученный осадок ресуспендировали в 5 мл стерильного 0,9% раствора NaCl и полностью перенесли в колбу Эрленмейера объемом 1 л с 0,5 л среды YH. После этого осуществили инкубирование в анаэробных условиях при 37°С в течение 24 ч на перемешивающем устройстве при 150 об/мин. После ферментации, величину pH довели до 5,5±0,1 с помощью 2 М раствора КОН.
Для изготовления йогурта 100 мл обработанного при сверхвысокой температуре молока (1,5% жира) + 2,0 г сухого обезжиренного молока (2% масса/масса) поместили во флакон Schott. Затем смесь нагрели до 110°C в течение 15 мин в автоклаве. После охлаждения до 42°С, добавили 0,5 мл свежеприготовленной йогуртовой заквасочной культуры. После этого осуществили инкубирование в анаэробных условиях при 42°С до достижения величины рН 4,6±0,1. Хранение до дальнейшего использования осуществлялось при 7°С.
Для получения криогенной суспензии спор грибов образец грибов нанесли на картофельно-декстрозный агар, после чего культивировали в течение 1-4 недель при 25-30°С в аэробных условиях до спорообразования. Затем культуру погрузили в 10 мл криозащитной культуры, жидкий супернатант удалили и перенесли в криопробирки. Хранение криокультур осуществляли при минус 80°С.
Для приготовления грибов для биоанализа 0,1 мл криогенной суспензии спор грибов нанесли на картофельно-декстрозный агар, после чего культивировали в течение 1-4 недель при 25-30°С в аэробных условиях до спорообразования. Затем культуру погрузили в 10 мл 0,1% раствора Tween 80. Жидкий супернатант перенесли в пробирки Falcon и хранили при 4-6°C. Разведение суспензии осуществляли с помощью дистиллированной H2O до 250 спор/мл.
Биоанализ ингибирования грибов бактериями Lactobacillus на картофельно-декстрозном агаре проводили посредством нанесения 200 мкл суспензии спор с 250 спор/мл на пластинку из картофельно-декстрозного агара. После сушки в агаровой пластинке с помощью пробочного сверла просверлили 5 отверстий. С помощью пипетки внесли 40 мкл каждой из следующих смесей:
1) 24 часовая культура Lactobacillus в среде MRS,
2) супернатант 24 часовой культуры Lactobacillus в среде MRS,
3) Lactobacillus из 24 часовой культуры в MRS, гранулированные и ресуспендированные в буферном растворе PBS (→ клетки в PBS),
4) Среда MRS,
5) PBS (фосфатно-солевой буферный раствор).
Затем осуществили культивирование пластинки а анаэробных условиях при температуре окружающей среды в течение периода до 14 дней.
С целью проведения биоанализа для проверки ингибирования грибов бактериями Lactobacillus в йогурте 40 мл йогуртовой среды поместили в пробирки Falcon. Затем добавили 0,2 мл заквасочной культуры. Были подготовлены образцы:
1) с добавлением 1×108 клеток Lactobacillus,
2) контрольный образец А без Lactobacillus, и
3) контрольный образец В без Lactobacillus, в который после ферментации добавили 0,4 мл раствора сорбата калия.
После этого, образцы подвергли ферментации, каждый при 42°С до достижения рН=4,6±0,1 с последующим охлаждением до 7°С, 8 мл каждого из образцов поместили в 6-луночные планшеты, добавили 50 спор на образец (контрольный образец без спор), инкубировали при 7°С и осуществляли ежедневный визуальный контроль роста грибов. В качестве альтернативы визуальному контролю может осуществляться автоматизированная оценка с использованием цифрового фотоаппарата, в котором используются такие предварительно установленные настройки контраста, которые позволяют отличать грибы от нижележащего субстрата. Это позволяет осуществлять подсчет таких пикселей, яркость которых ниже или выше заданной пороговой яркости и которые, таким образом, связаны с ростом грибов. Затем, можно определить отношение количества пикселей к общему количеству пикселей, относящихся к образцу, которое является количественным показателем количества грибов, присутствующих в исследуемом образце. В качестве фотоаппарата может использоваться система FluorChem® FC2 Imaging System (Alpha Innotech/Cell Biosciences), Santa Clara, USA) со следующими настройками: время экспозиции: 100-150 мс, диафрагма: 8, настройки контраста: уровень черного: 55000, уровень белого: 60000, гамма (коэффициент контрастности): 3,0, настройки освещения: проходящий свет "включено", отраженный свет "включено", автоматическая регулировка контраста (chemi display) "включено", скорость/разрешение: нормальная/ультра. Изображения анализировали с помощью программного обеспечения AlphaEaseFC.
Ингибирование роста грибов клетками Lactobacillus по настоящему изобретению.
Биоанализ для проверки ингибирования роста грибов клетками Lactobacillus по настоящему изобретению в йогурте был проведен со следующими результатами. Через 7 дней при визуальном контроле наблюдался рост грибов в образцах без Lactobacillus или без сорбата калия (контрольный образец А). Через 9 дней при визуальном контроле также наблюдался рост грибов в образцах с сорбатом калия (контрольный образец В). И только через 28 дней рост грибов также наблюдался в образцах с клетками Lactobacillus по настоящему изобретению. В результате, с помощью клеток Lactobacillus по настоящему изобретению достигнуто заметное уменьшение роста грибов и, следовательно, значительное увеличение срока годности йогурта.
Пример 2.
С зараженных поверхностей йогурта собрали споры грибов и культивировали на оптимальной для грибов среде (картофельно-декстрозный агар) в оптимальных условиях (25°С, аэробные условия, 5 дней). Использование 0,1% Lactobacillus brevis DSM 22721 имело результатом полное отсутствие роста грибов (см. фиг. 1, позицию 13). Действие Lactobacillus brevis DSM 22721 является фунгицидным, а не фунгистатическим. Эксперимент также показал, что Lactobacillus brevis DSM 22721 эффективнее, чем сорбат калия (см. фиг. 1: поз. 11 - с сорбатом калия 11, поз. 10 - без сорбата калия).
Пример 3.
Приготовление суспензии спор:
Для получения криогенной суспензии спор грибов образец грибов нанесли на картофельно-декстрозный агар, после чего культивировали в течение 1-4 недель при 25-30°С в аэробных условиях до спорообразования. Затем культуру погрузили в 10 мл криозащитной культуры, жидкий супернатант удалили и перенесли в криопробирки. Хранение криокультур осуществляли при минус 80°С.
С целью приготовления спор для биоанализа приготовили суспензию спор 5×106/мл в картофельно-декстрозном бульоне.
Приготовление клеток Lactobacillus:
Культуру Lactobacillus культивировали в среде YDA в течение 24 ч при 37°С. Затем клетки отделили посредством центрифугирования при 4000 х g, после чего клетки промыли дистиллированной водой ((dH2O). После этого получили 10-кратный концентрат клеток в dH2O.
Проведение анализа совместного инкубирования:
Для анализа совместного инкубирования 980 мкл суспензии спор P. commune, содержащей 5×106 спор/мл и 20 мкл 10-кратного концентрата Lactobacillus совместно инкубировали при 25°С в течение 24 ч в 24-луночном планшете. Скорость прорастания спор определяли в различные моменты времени посредством микроскопии образцов в камере Тома. Соответственно, оценивалось по меньшей мере 100 спор и вычислялся процент проросших спор. Споры считались проросшими в случае, когда длина проростка превышала диаметр споры.
Результаты представлены в нижеследующей Таблице в виде скорости прорастания (%) спор P. commune после совместного инкубирования с клетками Lactobacillus и без них. Ингибирование прорастания считалось значительным, если было ингибировано прорастание по меньшей мере 10% спор.
Claims (3)
1. Молочнокислая бактерия Lactobacillus brevis, депонированная в Немецкой коллекции микроорганизмов и клеточных культур под регистрационным номером DSM 22721, для использования в качестве пищевого консерванта, причем молочнокислая бактерия является гетероферментативной и ингибирует рост по меньшей мере одного грибного организма.
2. Молочнокислая бактерия по п.1, отличающаяся тем, что молочнокислая бактерия является живой молочнокислой бактерией.
3. Молочнокислая бактерия по п.1 или 2, отличающаяся тем, что грибной организм выбран из группы, содержащей род Penicillium, в частности Penicillium commune или Penicillium roqueforti, род Aspergillus и род Alternaria, в частности Alternaria alternata, Penicillium expansum, Penicillium citrinum, Penicillium digitatum, Penicillium italicum, Scopulariopsis breviacaulis, Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Botrytis cinerea, Rhizopus sp., Mucor sp., Eurotium herbariorum, Geotrichum candidum, Cladosporium herbarum, Fusarium sambucinum, Phytophora infestans и Sclerotinia scerotiorum.
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361779246P | 2013-03-13 | 2013-03-13 | |
EP13159061.4 | 2013-03-13 | ||
EP13159061.4A EP2777405B1 (en) | 2013-03-13 | 2013-03-13 | Novel Lactobacillus strains and the uses thereof |
US61/779,246 | 2013-03-13 | ||
PCT/EP2014/054879 WO2014140123A1 (en) | 2013-03-13 | 2014-03-12 | Novel lactobacillus strains and the uses thereof |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2015137764A RU2015137764A (ru) | 2017-04-17 |
RU2681437C2 true RU2681437C2 (ru) | 2019-03-06 |
Family
ID=47845850
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2015137764A RU2681437C2 (ru) | 2013-03-13 | 2014-03-12 | Новые штаммы молочнокислых бактерий и их применения |
Country Status (14)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US11053474B2 (ru) |
EP (2) | EP2777405B1 (ru) |
JP (2) | JP6263205B2 (ru) |
KR (1) | KR101831040B1 (ru) |
CN (1) | CN105357979B (ru) |
AU (1) | AU2014230777B2 (ru) |
BR (1) | BR112015022833B1 (ru) |
CA (1) | CA2903940C (ru) |
DK (1) | DK2777405T3 (ru) |
ES (1) | ES2710435T3 (ru) |
MX (1) | MX2015012379A (ru) |
PL (1) | PL2777405T3 (ru) |
RU (1) | RU2681437C2 (ru) |
WO (1) | WO2014140123A1 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2817320C1 (ru) * | 2023-08-31 | 2024-04-15 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Штамм Levilactobacillus brevis - продуцент антибактериальных веществ |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107410463A (zh) * | 2017-04-09 | 2017-12-01 | 湖南易科生物工程有限公司 | 一种果菜类保鲜剂的配制方法 |
CN106942355A (zh) * | 2017-04-09 | 2017-07-14 | 湖南易科生物工程有限公司 | 一种果菜类保鲜剂的配制方法 |
CN106819094A (zh) * | 2017-04-09 | 2017-06-13 | 湖南易科生物工程有限公司 | 一种果菜类保鲜剂的配制方法 |
CN107027877A (zh) * | 2017-04-09 | 2017-08-11 | 湖南易科生物工程有限公司 | 一种果菜类保鲜剂的配制方法 |
CN107079983A (zh) * | 2017-04-09 | 2017-08-22 | 湖南易科生物工程有限公司 | 一种果菜类保鲜剂的配制方法 |
CN107079984A (zh) * | 2017-04-09 | 2017-08-22 | 湖南易科生物工程有限公司 | 一种果菜类保鲜剂的配制方法 |
CN107047746A (zh) * | 2017-04-24 | 2017-08-18 | 湖南易科生物工程有限公司 | 一种水果保鲜剂的配制方法 |
KR102100367B1 (ko) * | 2019-03-18 | 2020-04-14 | 재단법인 발효미생물산업진흥원 | 장 부착능이 우수하고, 항노화 활성 및 프로바이오틱스 특성을 가지는 락토바실러스 브레비스 srcm103306 균주 및 이의 용도 |
US20220151267A1 (en) * | 2019-04-16 | 2022-05-19 | Locus Ip Company, Llc | Microbe-Based Emulsifying Food Additives |
CN109971687B (zh) * | 2019-05-05 | 2020-12-08 | 西南大学 | 一株乳酸菌Lactobacillus sucicola及其应用 |
CN110331104B (zh) * | 2019-07-05 | 2020-12-18 | 四川大学 | 一种植物乳杆菌cv10d1及其应用 |
CN110200899B (zh) * | 2019-07-05 | 2022-03-25 | 欧诗漫生物股份有限公司 | 一种防腐剂及其制备方法和应用 |
WO2021099655A1 (es) * | 2019-11-19 | 2021-05-27 | Inbiolev, S.L. | Procedimiento para el tratamiento de mostos y vinos y producto para la puesta en práctica del mismo |
CN111334455B (zh) * | 2020-03-13 | 2022-04-15 | 江南大学 | 一种丝状真菌抑制剂及其应用 |
CN114774327B (zh) * | 2022-05-12 | 2023-08-15 | 河北科技大学 | 一种植物乳杆菌hb13-2及其应用 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1997883A1 (en) * | 2001-11-06 | 2008-12-03 | Eidgenössische Technische Hochschule Zürich | Mixture of propionibacterium jensenii and lactobacillus SP. with antimicrobial activities for the use as natural preservation system |
US20120070536A1 (en) * | 2009-04-15 | 2012-03-22 | Wakamoto Pharmaceutical Co., Ltd. | Lactobacillus strain and food having antifungal activity |
EP2543246A1 (en) * | 2011-07-04 | 2013-01-09 | CSK Food Enrichment B.V. | Cheese coating compositions having biopreservative properties |
Family Cites Families (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS6030686A (ja) | 1983-07-30 | 1985-02-16 | Yakult Honsha Co Ltd | 乳酸桿菌属の細菌に供与dνaを導入する方法 |
US4918014A (en) | 1985-10-11 | 1990-04-17 | Microlife Technics, Inc. | Method for producing mucoid and phage resistant group N streptococcus strains from non-mucoid and phage sensitive parent strains |
FI77056C (fi) | 1986-06-24 | 1989-01-10 | Valio Meijerien | Vektorplasmid som laempar sig foer syrningsmedel, speciellt foer mejerisyrningsmedel. |
EP0311469A3 (en) | 1987-09-02 | 1990-05-30 | Plant Genetic Systems N.V. | Transformed lactic acid bacteria |
EP0316677A3 (en) | 1987-11-13 | 1990-04-25 | Miles Inc. | Method for cloning in lactic acid bacteria |
FI82354C (fi) | 1988-11-14 | 1991-03-11 | Valio Meijerien | Konservering av faerskfoder. |
WO1991009131A1 (en) | 1989-12-20 | 1991-06-27 | Valio Finnish Cooperative Dairies Association | Cloning vector for use in lactic acid bacteria |
JPH08507497A (ja) * | 1993-03-10 | 1996-08-13 | コモンウェルス・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ・オーガニゼイション | 農業用生体制御剤 |
JP3040293B2 (ja) * | 1993-10-27 | 2000-05-15 | 多聞酒造株式会社 | 食品用保存剤 |
JP3587219B2 (ja) * | 1995-04-20 | 2004-11-10 | アサマ化成株式会社 | 食品用保存剤 |
DE19947620A1 (de) | 1999-10-04 | 2001-04-05 | Valeo Auto Electric Gmbh | Wischeinrichtung |
EP1251064B1 (en) | 2000-01-19 | 2006-03-08 | Bridgestone Corporation | Rubber crawler |
EP1133046A3 (en) | 2000-03-02 | 2002-02-27 | Moriyama Kogyo Kabushiki Kaisha | Multipolar magnet type generator for internal combustion engines |
US6612809B2 (en) | 2001-11-28 | 2003-09-02 | General Electric Company | Thermally compliant discourager seal |
US20050125036A1 (en) | 2003-08-14 | 2005-06-09 | Mark Roby | Heterogeneous yarns for surgical articles |
CA2557834C (en) * | 2004-03-04 | 2012-05-22 | E-L Management Corporation | Skin treatment method with lactobacillus extract |
CA2633657A1 (en) * | 2005-09-19 | 2007-04-12 | Basf Aktiengesellschaft | Microorganisms inhibiting the formation of foot malodor |
EP1972208A1 (en) | 2007-03-16 | 2008-09-24 | Kirin Holdings Kabushiki Kaisha | Composition for improving intestinal microflora |
FR2924307B1 (fr) * | 2007-12-04 | 2010-08-27 | Gervais Danone Sa | Utilisation de l. casei ssp. paracasei comme antifongique |
JP4182145B1 (ja) * | 2008-04-03 | 2008-11-19 | オリエンタル酵母工業株式会社 | ラクトバチルス・プランタラムの新菌株、並びに、それを含む飲食品、それを用いた製パン用種及び製パン法 |
JP2010004787A (ja) | 2008-06-26 | 2010-01-14 | Kaneka Corp | ラクトバチルス・ブレビス菌の培養方法 |
CN102093965B (zh) * | 2010-11-26 | 2012-10-03 | 中国农业科学院农产品加工研究所 | 一株乳酸菌及其应用 |
EP2592158A1 (en) * | 2011-11-14 | 2013-05-15 | University College Cork, National University of Ireland, Cork | Lactobacillus plantarum species possessing broad spectrum anti-fungal activity and exhibiting high heat tolerance and osmotolerance |
CN102747009B (zh) * | 2012-04-18 | 2014-07-30 | 北京和美科盛生物技术有限公司 | 一株植物乳杆菌及其在发酵乳制品中的使用方法 |
-
2013
- 2013-03-13 EP EP13159061.4A patent/EP2777405B1/en active Active
- 2013-03-13 DK DK13159061.4T patent/DK2777405T3/en active
- 2013-03-13 PL PL13159061T patent/PL2777405T3/pl unknown
- 2013-03-13 ES ES13159061T patent/ES2710435T3/es active Active
-
2014
- 2014-03-12 KR KR1020157027979A patent/KR101831040B1/ko active IP Right Grant
- 2014-03-12 BR BR112015022833-0A patent/BR112015022833B1/pt active IP Right Grant
- 2014-03-12 EP EP14709662.2A patent/EP2967120A1/en not_active Withdrawn
- 2014-03-12 JP JP2015562132A patent/JP6263205B2/ja active Active
- 2014-03-12 MX MX2015012379A patent/MX2015012379A/es active IP Right Grant
- 2014-03-12 WO PCT/EP2014/054879 patent/WO2014140123A1/en active Application Filing
- 2014-03-12 CN CN201480015059.6A patent/CN105357979B/zh active Active
- 2014-03-12 US US14/774,713 patent/US11053474B2/en active Active
- 2014-03-12 AU AU2014230777A patent/AU2014230777B2/en active Active
- 2014-03-12 RU RU2015137764A patent/RU2681437C2/ru active
- 2014-03-12 CA CA2903940A patent/CA2903940C/en active Active
-
2017
- 2017-12-15 JP JP2017240626A patent/JP6709208B2/ja active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP1997883A1 (en) * | 2001-11-06 | 2008-12-03 | Eidgenössische Technische Hochschule Zürich | Mixture of propionibacterium jensenii and lactobacillus SP. with antimicrobial activities for the use as natural preservation system |
US20120070536A1 (en) * | 2009-04-15 | 2012-03-22 | Wakamoto Pharmaceutical Co., Ltd. | Lactobacillus strain and food having antifungal activity |
EP2543246A1 (en) * | 2011-07-04 | 2013-01-09 | CSK Food Enrichment B.V. | Cheese coating compositions having biopreservative properties |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
FALGUNI Р. ET AL. Production of proteinaceous antifungal substances from Lactobacillus brevis NCDC 02 // International Journal of Dairy Technology, 2010, Vol 63, No 1, рр. 70-76. * |
FALGUNI Р. ET AL. Production of proteinaceous antifungal substances from Lactobacillus brevis NCDC 02 // International Journal of Dairy Technology, 2010, Vol 63, No 1, рр. 70-76. СТОЯНОВА Л. Г. И ДР. Антимикробные метаболиты молочнокислых баткреий: разнообразие и свойства (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология, 2012, том 48, номер 3, с. 259-275. * |
СТОЯНОВА Л. Г. И ДР. Антимикробные метаболиты молочнокислых баткреий: разнообразие и свойства (обзор) // Прикладная биохимия и микробиология, 2012, том 48, номер 3, с. 259-275. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2817320C1 (ru) * | 2023-08-31 | 2024-04-15 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кубанский государственный аграрный университет имени И.Т. Трубилина" | Штамм Levilactobacillus brevis - продуцент антибактериальных веществ |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2710435T3 (es) | 2019-04-25 |
JP6263205B2 (ja) | 2018-01-17 |
MX2015012379A (es) | 2016-11-14 |
BR112015022833A2 (pt) | 2017-11-07 |
JP2016510985A (ja) | 2016-04-14 |
AU2014230777A1 (en) | 2015-09-24 |
KR101831040B1 (ko) | 2018-02-21 |
EP2777405A1 (en) | 2014-09-17 |
DK2777405T3 (en) | 2019-03-11 |
RU2015137764A (ru) | 2017-04-17 |
CA2903940C (en) | 2018-01-02 |
CN105357979B (zh) | 2020-10-23 |
JP2018078895A (ja) | 2018-05-24 |
US11053474B2 (en) | 2021-07-06 |
CA2903940A1 (en) | 2014-09-18 |
PL2777405T3 (pl) | 2019-05-31 |
EP2967120A1 (en) | 2016-01-20 |
US20160024459A1 (en) | 2016-01-28 |
CN105357979A (zh) | 2016-02-24 |
KR20150126931A (ko) | 2015-11-13 |
EP2777405B1 (en) | 2018-11-21 |
WO2014140123A1 (en) | 2014-09-18 |
BR112015022833B1 (pt) | 2021-09-21 |
JP6709208B2 (ja) | 2020-06-10 |
AU2014230777B2 (en) | 2017-03-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2681437C2 (ru) | Новые штаммы молочнокислых бактерий и их применения | |
Ogunbanwo et al. | Influence of cultural conditions on the production of bacteriocin by Lactobacillus brevis OG1 | |
Verón et al. | Isolation and selection of potential probiotic lactic acid bacteria from Opuntia ficus-indica fruits that grow in Northwest Argentina | |
Hemme et al. | Leuconostoc, characteristics, use in dairy technology and prospects in functional foods | |
Arasu et al. | In vitro antifungal, probiotic and antioxidant properties of novel Lactobacillus plantarum K46 isolated from fermented sesame leaf | |
Joshi et al. | Production, purification, stability and efficacy of bacteriocin from isolates of natural lactic acid fermentation of vegetables | |
Nora et al. | Antifungal activity of newly isolates of lactic acid bacteria | |
Nithya et al. | Characterization of bacteriocin producing lactic acid bacteria and its application as a food preservative | |
Ngea et al. | Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides LB7 isolated from apple surface inhibits P. expansum in vitro and reduces patulin in fruit juices | |
Behare et al. | Evaluation of lactic acid bacteria strains isolated from fructose-rich environments for their mannitol-production and milk-gelation abilities | |
Golod et al. | Adaptation of lactic acid bacteria to unfavorable growth conditions | |
Nallala et al. | Probiotic evaluation of antimicrobial Lactobacillus plantarum VJC38 isolated from the crop of broiler chicken | |
Tharmaraj et al. | Antimicrobial effects of probiotic bacteria against selected species of yeasts and moulds in cheese‐based dips | |
Nallala et al. | Molecular characterization of bacteriocinogenic, antifungal and probiotic lactic acid bacteria isolated from chicken gastrointestinal tract | |
Nee et al. | Lactic acid bacteria isolated from locally produced vinegars and their antibacterial activity against foodborne bacteria | |
Danilova et al. | Propionibacterium freudenreichii strains as antibacterial agents at neutral pH and their production on food‐grade media fermented by some lactobacilli | |
Elsanhoty | Screening of some lactobacillus strains for their antifungal activities against aflatoxin producing aspergilli in vitro and maize | |
Romero-Luna et al. | Tepache: A Pre-Hispanic Fermented Beverage as a Potential Source of Probiotic Yeasts | |
Zahid et al. | Determination of biopreservative effects of bacteriocins isolated from lactic acid producing bacteria against food spoiling fungi | |
Nagayasu et al. | Analysis of hemin effect on lactate reduction in Lactococcus lactis | |
Klewicka | Antifungal activity of lactic acid bacteria of genus Lactobacillus sp. in the presence of polyols | |
Nillian et al. | Detection of Beneficial Lactic Acid Bacteria (LAB) and Yeast In Sarawak Fermented Food | |
Kalam | THERMAL STABILITY AND PH TOLERANCE OF AN ANTIMICROBIAL PRODUCING BACTERIA ISOLATED FROM SPOILED FOOD | |
EP1402779B1 (en) | Novel biofungicide bacterial strain and the preparation method and applications thereof | |
Abhyankar et al. | Antifungal Activity of Plant Isolate of Lactic Acid Bacteria against Fusarium Sp. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HZ9A | Changing address for correspondence with an applicant |