FI77056C - Vektorplasmid som laempar sig foer syrningsmedel, speciellt foer mejerisyrningsmedel. - Google Patents

Description

1 77056

Hapatteille, erityisesti meijerihapatteille soveltuva vektoriplasmidi

Keksinnössä on kyse yhdistelmä-DNA-tekniikan sovelta-5 misesta hapatebakteereihin, erityisesti meijeriteollisuuden hapatebakteereihin, joille on kehitetty uusi kloonaus-vektori.

Maitohappobakteereilla on laaja käyttö hapatteissa sekä elintarviketeollisuudessa että maataloudessa. Maatalou-10 dessa hapateymppejä käytetään eräissä maissa erityisesti rehun säilöntään. Elintarviketeollisuudessa hapatteiden käyttäjiä ovat erityisesti meijeri-, leipomo- ja lihan-jalostusteollisuus. Suomessa meijeriteollisuus on ylivoimaisesti suurin hapatteiden käyttäjä.

15 Meijerihapatteita käytetään voin, piimän, jogurtin, kefiirin ja etenkin kypsytettyjen juustojen valmistukseen. Hapatteen tärkein tehtävä on tällöin maitosokerin (laktoosin) tehokas fermentoiminen maitohapoksi. Tämän lisäksi eräät hapatebakteerit tuottavat aromiaineita (diasetyyliä, 20 asetoiinia yms.). Hapatebakteereista vapautuvilla entsyymeillä (proteaasit, peptidaasit) on myös ilmeisesti merkitystä juuston kypsymisprosessissa.

Yhdistelmä-DNA-tekniikalla on paljon sovellutusmahdollisuuksia hapatetutkimuksessa ja -tuotekehittelyssä. Py-25 rittäessä kehittämään ominaisuuksiltaan optimoituja, stabiileja ja ennustettavasti toimivia hapatteita, on tärkeää selvittää esim. keskeisiä hapateominaisuuksia koodaavien geenien kopioluvun tai aktiivisuuden vaikutus haluttuun prosessiin. Muistaen hapatebakteerien vakiintuneen elintar-30 vikekäytön ja tunnustetun turvallisuuden tulisi myös harkita niiden käyttöä uusiin teollisiin prosesseihin, esim. vierasproteiinien tuottoon.

Yhdistelmä-DNA-tekniikan edellytyksenä on sekä toimiva transformaatiosysteemi että sopiva vektoriplasmidi.

35 Transformaatiosysteemin tulisi olla niin tehokas, että kloonaus haluttuun isäntäorganismiin ligaatioseoksia käyttäen 2 77056 onnistuu. Hyvällä vektorilla puolestaan tulee olla seuraa-vat ominaisuudet: - pieni koko - korkea kopioluku 5 - helppo esim. antibioottiresistenssigeeneihin perustuva selektoitavuus - kloonaukseen sopivat restriktioentsyymien leikkauskohdat, mieluiten ns. insertioinakti-vaatiokohtina selektiogeenien sisältä 10 - kyky kahdentua ja ekspressoida selektiogeenit eri isännissä Tärkeistä hapatebakteeriryhmistä ns. N-ryhmän streptokokit (Streptococcus lactis, Str. lactis subsp. diacetylactis ja Str. cremoris) ovat geneettisiltä ominaisuuksiltaan parhai-15 ten tunnettuja. Näillä bakteereilla tärkeimmät hapateomi-naisuudet (laktoosin käyttö, tietyt proteinaasit, aromiaineiden tuotto) ovat hyvin yleisesti plasmidien koodaamia (10). N-ryhmän streptokokeilla esiintyy myös runsaasti kryptisiä plasmideja.

20 N-ryhmän streptokokeille on äskettäin kehitetty toi miva protoplastitransformaatiotekniikka (15). Myös näille bakteereille soveltuvia kloonausvektoreita on pyritty kehittämään.

Alankomaissa J. Kok tutkimusryhmineen on kehittänyt 25 Str. cremoriksen kryptiseen pWVOI plasmidiin perustuvan vektorin, jossa selektiogeeneinä ovat Staphylococcus aureus plasmidien pEl94 ja pC194 erytromysiini- ja kloramfeni-koliresistenssigeenit. Ensiksimainittu sisältää Bell restriktioentsyymin tunnistuskohdan. Tämän pGK12-nimisen 30 vektorin koko on 4,9 kb (1 kb = 1000 emäsparia), ja se sisältää resistenssialueiden ulkopuolella vielä yksittäiset Clal ja Hpall entsyymien leikkauskohdat. Vektori replikoi-tuu, N-ryhmän streptokokkien lisäksi, myös Bacillus subti-liksessa ja Escherichia collssa (6). Vektoria käyttäen on 35 pystytty kloonaamaan Str. cremoriksen plasmidiperäinen pro-teaasigeeni (7).

3 77056

Englannissa M. Gasson ryhmineen on kehittänyt toisen vektorikonstruktion käyttäen pohjana Str. lactis plasmidia ja pSH71. Tähän plasmidiin on liitetty kloramfenikoli- ja kanamysiiniresistenssigeenit sisältävä B. subtilis plasmi-5 din pBD64 fragmentti. Syntyneissä rekombinanttiplasmideissa (pCK1, pCKl7 ja pCK21) on Bglll tunnistuskohta kanamysiini-resistenssialueella ja lisäksi muualla BämHI, EcoR1, PvuII ja Xbal tunnistuskohdat. Näiden ohella on plasmideissa pCK17 ja pCK21 vielä Clal tunnistuskohta. Plasmidien koot 10 vaihtelevat 5,5 - 5,9 kb:hen. Vektorit pystyvät, pGK12:n tavoin, replikoitumaan myös B. subtiliksessa ja E. colissa (4) .

Tämän hakemuksen kohteena on N-ryhmän streptokokeille kehitetty uusi kloonausvektori, joka eroaa edelläkuvatuista 15 niitä huomattavasti monipuolisempien kloonausmahdollisuuk- siensa suhteen. Vektoriplasmidilla on laaja isäntäspektri (N-ryhmän streptokokit, E. coli, B. subtilis), ja siihen pystytään kloonaamaan sekä streptokokeista että muista bakteereista peräisin olevia geenejä ja siten tutkimaan niiden 20 ekspressoitumista eri isännissä. Näin on mahdollista eristää tärkeitä hapateominaisuuksia koodaavat geenit, ja tutkia niiden geenituotteet. Hapatekäytön kannalta parhaiksi havaitut geenivariantit voidaan palauttaa hapatekantoihin ja siten optimoida käyttöhapatteiden geneettinen koostumus.

25 Vektoria voidaan myös soveltaa vierasproteiinien tuottoon joko N-ryhmän streptokokeissa tai perinteellisemmissä tuo-tantoisännissä. Viimeksimainittuja (lähinnä B. subtilista tai E. colia) voidaan myös käyttää streptokokkiperäisten hyötykäyttöön soveltuvien geenituotteiden massatuotantoon.

30 Keksinnön kohteena olevan plasmidin pVS2:n pohjana on

Str. lactis kryptisen plasmidin pSH71 (3) 1,7 kb:n suuruinen Clal-fragmentti. Tähän on liitetty kloramfenikoliresis-tenssigeeni Str. sanguis plasmidista pGB301 (1) sekä ery-tromysiiniresistenssigeeni Staph, aureus plasmidista pE194 35 (14). Näiden resistenssialueiden välissä on E. coli vekto rista pBR322 (12) saatu 0,35 kb:n fragmentti. Koko plasmidin suuruus on 5,0 kb.

4 77056

Plasmidi pVS2 sisältää yksittäisinä seuraavat re-striktiokohdat: Clal, Bell, Hindlll ja BstEII. Lisäksi Hindlll:n ja BstEII:n välissä on kaksi Hpall-kohtaa 9 emäs-parin päässä toisistaan muodostaen siten käytännössä yhden 5 restriktiokohdan. Bell tn leikkauskohta sijaitsee erytromy-siiniresistenssigeenissä ja BstEII-kohta kloramfenikoli-resistenssigeenissä, joten nämä kaksi kohtaa ovat insertio-inaktivaatiokohtia.

Koska erytromysiiniresistenssialue sijaitsee Clal ja 10 Hindlll kohtien välissä, voidaan erytromysiiniresistenssi- geeni inaktivoida tai poistaa, paitsi yksinkertaisella Bcll-digestiolla, myös Clal-Bcll, Bcll-Hindlll, Clal-Hindlll, Clal-Hpall ja BclI-Hpall kaksoisdigestiolla.

Koska Clal ja Hpall restriktiokohtiin voidaan liittää 15 entsyymeillä Clal, Hpall, TagI, Accl ja Acyl pilkottua DNA:ta ja BclI-restriktiokohtaan vastaavasti entsyymeillä BamHI,

Bell, Bglll, Mbol, SauIIIA ja XhoII aikaansaatuja DNA-frag-mentteja, on pVS2:n erytromysiiniresistenssialue erittäin sovelias ns. "forced cloning" kloonaukseen. Tässä menetel-20 mässä sekä kloonattavan fragmentin että kloonausvektorin vapaat DNA:n päät on muodostettu kahdella eri entsyymillä. Vektori voidaan esimerkiksi katkaista entsyymeillä Clal ja Bell kloonattavan fragmentin päiden ollessa muotoa Hpall ja BamHI. Haluttaessa voidaan "forced cloning"-menetelmää so-25 veltaa myös kloramfenikoliresistenssialueelle käyttäen hy väksi BstEII-Hpall tai BstEII-Hindlll kaksoisdigestioita. Streptococcus lactis-kanta VS 135, joka sisältää vektoriplas-midin pVS2 on talletettu numerolla DSM 3749 talletus-laitokseen Deutsche Sammlung von Mikroorganismen.

30 Talletuspäivämäärä 2.6.1986.

Kuvion selitys

Kuviossa on esitetty plasmidi pVS2:n kokoaminen. (Plasmideihin on merkitty työn kannalta oleelliset rest-riktioentsyymien tunnistuskohdat. Tunnistuskohdat perustu-35 vat plasmideista ennestään julkaistuihin restriktiokarttoi- hin (viitteet 1, 3, 12 ja 14) plasmidien pGB301 ja pSH71 Clal-kohtia lukuunottamatta, jotka määritettiin työn aikana).

5 77056

Aineisto ja menetelmät 1) Plasmidit ja niiden eristys

Plasmidi pVS2:n kokoamiseen käytetyt plasmidit ja niiden isäntäkannat on esitetty taulukossa 1. Plasmidit eris-5 tettiin streptokokeista Gassonin (3), E. colista Birnboimin (2) ja Staph, aureuksesta Guerry ym:n (5) menetelmiä käyttäen.

2) Alustat

Streptokokkien kasvualustana oli glukoosilla supple-10 mentoitu M17-liemi tai -agar (13). Protoplasteja käsiteltäessä käytettiin 0,4 M sakkaroosia osmoottisena stabilaatto-rina. E, coli kasvatettiin Maniatis ym:n (8) mukaan valmistetussa LB-liemessä tai LB-agarilla.

15 3. Restriktioentsyymit ja DNA-ligaasi Käytetyt restriktioentsyymit ja T-4-DNA-ligaasi oli hankittu Boehringer-Mannheimilta (FRG), ja niitä käytettiin Maniatis ym:n (8) ohjeiden mukaan.

6 77056

CU

P

-H G Xl to x: -ph CU- LO U -H o

O H (Τ' <— -H -P >H

•H iti C rH tn <C

-P (U -H :t0 X» C £ W

tö tn T3 -en 3 H <U 20 2 (i) m to en ft z

:nj Ph 1) 4J CU XJ

H CU Ph C CU CU U HH Xi

<D Xl H fö -P XI H O H

p ΟηΕηο-λ;-ρε-ι(Οο

to 3 P &1 -H <U>1>H

C Xl - e to -H - tn -p e rH e cu ή £ > x: eu -h s

<Ö etj O -P >1 "H O O PS U CU

XI en 3 H -P 3 Ή 2 :t0 C tn -P -H C C-P > XI <1) -P (0 (0-Ht0t0 O-P O-PjC- C CO-PQ-H-HtOZrH-P· :to C tn t3 ή > tou

en (0 · G G C iO 3 · CU Ή G

H « SH-Hpq > Xi PS K O H

e

CU

td <N

•H ^ •r| W »3·

G CD CO CN

ro Z

to h- r- PS

•ro o w oo S > en r- -P 3 co •h to en en cu

Ό -P ·Η -H HZ

•H C-P -P G PS

£ tO U O to

en M ro to -H

tO etO f—i i—i · i—I

rH -P XI O

ft G · ft U

:iti H H fö

-P tn -p -P -P

>i h to www -P — <U en -P —- >1 :td (U tr,

Xi -P m

•rl CO H— HS· <N «N

G -H r- T- ffl CU > < <u tn -h

-H rH

e l e H O

tO O <U -P -H U

O -H G H CU tn -H -rt x; 4J.P-H £ E-t h en eo to

OxI-hx» w tncentnw x; eucft h in 0) e e

rH CU >, H H ft C-PCUCU G

cn eueuH £ ££ a) en u u o w wtjiw u w< -p -h tn tn > tn tn -h -h to a -h tu en tn e tn h cu eu to C (U -H H H ·η H C — H r-H -H -H xl

H -H XJ -H O G G O

o Ό x; C X ή -h ft -p -H '— t— ΓΟ ΓΟ ·Η -H ·Η -rt y q -- h h h -H e tn r—i e CU tnOCN ΟΊ ΓΟ·<3· rH <U >h xl

> (0 Xi i—I M-t £ ί>Η CO

rH o -h £ o tn r- CU XI tn tO H (0 ro . -H H -P H ^ <- ft O >1 -P z E rH h eu as

o -H to X CU -P

Xi Ό -H

x; -rl r- CN II II II II rH

3 £ T- o HT CN O

rH enr- ro σι ro H H U

3 tOK CQ r- OS OH H -P

(0 rH W U WCQ £££<!)·

Eh ft ft ft ftft «3 U W Eh W

7 77056 4) Transformaatio

Transformaatiokokeissa käytettiin resipienttikantoi-na E. coli AB259:ää (9) ja Str. lactis MG1614:ta (3). AB259 oli saatu The Public Health Research Institute of the City 5 of New York Incrstä ja MG1614 The National Institute for

Research in Dairying -tutkimuslaitoksesta (Reading, Englanti) . Kummassakaan kannassa ei ennestään ole omia plasmideja.

E. coli -transformaatiossa käytettiin Mandelin ja Higan standardimenetelmää Maniatis ym:n mukaan (8). Selek-10 tioalustat sisälsivät ampisilliinia (50 yug/ml) sekä joko kloramfenikolia (5 yug/ml) tai erytromysiiniä (50 yug/ml) .

Str. lactis -transformaatiot suoritettiin v. Wright ym:n (15) kuvaamalla tavalla. Selektioon käytettiin joko kloramfenikolia (5 yug/ml) tai erytromysiiniä (2,5 yug/ml).

15 Keksintöä valaistaan tarkemmin seuraavien esimerkkien avulla.

Esimerkki 1

Antibioottiresistenssigeenien kloonaus Str, lactis plasmideihin ja vektori pVS2:n kokoaminen 20 Työn eri vaiheita on esitetty kuviossa.

Plasmidista pGB301 liitettiin n. 5 kb:n suuruinen kloramfenikoliresistenssigeenin sisältävä fragmentti E. coli vektorin pBR322 Clal-kohtaan. Tuloksena oli n. 8,3 kb:n plasmidi pVC5.

25 Plasmidi pVC5 kaksoiddigestoitiin Clal ja Hpall ent syymeillä. Saatu n. 3,8 kb:n kloramfenikoliresistenssigee-nin sisältävä fragmentti liitettiin Clal-digestjolla pSH71:stä saatuun 1,7 kb:n fragmenttiin ja saatu rekombi-nanttiplasmidi transformoitiin Str. lactikseen. Saadulle 30 5,5 kb:n plasmidille annettiin nimeksi pVSl.

Erytromysiiniresistenssigeeni eristettiin pE194:stä pilkkomalla kyseinen plasmidi Clal-Hpall kaksoisdigestiolla ja liittämällä saatu n. 1,2 kb:n fragmentti pBR322:n Clal-kohtaan. Saatu plasmidi nimettiin pVC6:ksi.

35 Lopuksi pVSl digestoitiin entsyymeillä Clal ja Bell ja pVC6 vastaavasti entsyymeillä Clal ja BamHI. Saatu pVC6:n s 77056 n. 1,6 kb:n Cläl-BamHI-fraqmentti, joka sisältää erytro-mysiiniresistenssialueen, liitettiin pVS1:n replikaatio-geenit ja kloramfenikoliresistenssigeenin sisältävään 3,3 kb:n fragmenttiin. Saadulla hybridiplasmidilla transformoi-5 tiin Str. lactis. Tuloksena oli n. 5,0 kb:n kloramfenikoli-erytromysiini-kaksoisresistenssiplasmidi pVS2.

Esimerkki 2

Vektori pVS2:n siirto eri isäntäbakteereihin

Transformaatio E. coliln suoritettiin standardimene- 10 telmin käyttäen selektioon erytromysiini-kloramfenikolimal-joja.

Transformaatiossa B. subtilikseen käytettiin resipient-teinä kompetentteja BD170-kannan soluja (saatu The Public Health Research Institute of the City of New York Inc:stä).

15 Selektioon käytettiin kloramfenikolia (5 μg/ml).

Sekä E. coli että B. subtilis transformoituivat hyvin plasmidilla pVS2, ja kumpikin plasmidin resistenssigeeneistä ekspressoitui näissä isännissä.

Esimerkki 3 20 Str. lactis plasmidin pLP7l2 laktoosinhajotusgee- nien kloonaus

Kloonausta varten pVS2 digestoitiin Bell:llä ja Str. lactis laktoosinhajotusplasmidi pLP712 (3) Bglll:11a. Saadut B£lII-fragmentit "shot gun" kloonattiin pVS2:n Bell-kohtaan.

25 Saadut kloramfenikoliresistentit, mutta erytromysiinisensi-tiiviset, transformantit testattiin laktoosinhajotuskyvyn suhteen. Kaikki laktoosipositiiviset transformantit sisälsivät n. 20 kb:n kokoisen plasmidin. Tämän mukaan laktoosinha jotusgeenit plasmidissa pLP712 sijaitsevat n. 15 kb Bglll 30 fragmentissa B. Tämä sopii hyvin plasmidista julkaistuun alustavaan restriktiokarttaan (3).

Esimerkki 4

Staph, aureus termonukleaasigeenin kloonaus E. coliin ja Str. lactikseen 35 Staph, aureuksen termonukleaasigeenin sisältävä E. coli plasmidi pFOG301 (11) digestoitiin Hpall-entsyymillä.

9 77056 ja saatu n. 1,4 kb termonukleaasigeenin sisältävä fragmentti "shot gun" kloonattiin pVS2:n Clal-kohtaan. Ligaatio-seoksella transformoitiin E, coli, ja transformantit poimittiin erytromysiini-kloramfenikoli-kaksoisdigestiolla.

5 Saadut transformantit testattiin termonukleaasiaktiivisuu- den suhteen. Kahdesta positiivisesta transformantista eristettiin DNA, ja saaduilla plasmideilla (molemmat n. 6,5 kb) transformoitiin Str. lactis. Termonukleaasiaktiivisuus todettiin kaikissa tuloksessa saaduissa transformanteissa.

10 Esimerkki 5

Isäntäspektri

Uusina koeisäntinä N-ryhmän streptokokkien joukosta käytettiin Streptococcus cremoris SSC179 ja Str. lactis subsp diacetylactis SSD194 kantoja. Plasmidi pVS2 siirret-15 tiin kyseisiin kantoihin protoplastitransformaation avulla käyttäen samoja menetelmiä kuin Str. lactis MGl614-kannalle. Selektioon käytettiin kloramfenikoliresistenssiä. Transfor-maatiofrekvenssit olivat alhaiset ( 100/ug DNA SSDl94-kan-nalla, 10 ug/DNA SSCl79-kannalla). Kaikki transformantit 20 olivat erytromysiiniresistenttejä, ja pVS2:ta kooltaan vastaava uusi plasmidi pystyttiin osoittamaan elektroforeetti-sesti sattumanvaraisesti valikoiduista transformanteista.

.:: Esimerkki 6 "Forced cloning" erytromysiiniresistenssialueella 25 Plasmidi pVS2 digestoitiin restriktioentsyymeillä

Clal ja Bell. Vastaavasti viilihapatekannasta peräisin oleva limanmuodostusplasmidi pVS2 kaksoisdigestoitiin entsyymeillä Clal ja Bglll. DNA:t sekoitettiin 1:3 ja ligoitiin. Ligaatioseoksella transformoitiin S. lactis MG1614. Selek-30 tio perustui kloramfenikoliresistenssiin. Transformantit testattiin myös erytromysiiniresistenssin suhteen. Kaksi kloramfenikoliresistenttiä-erytromysiinisensitiivistä transformanttia valittiin jatkotutkimuksiin. Toinen sisälsi n. 7,2 kb plasmidin ja toinen n. 10,5 kb plasmidin.

35 Restriktiokokein voitiin osoittaa kummankin sisältävän in-sertoitunutta DNA:ta plasmidi pVS2:n Clal ja Bell tunnis-tuskohtien välisellä alueella.

10 77056

Esimerkki 7

Kloramfenikoliresistenssigeenin inaktivaatio inser-tiolla BstEII-kohtaan

Plasmidi pVS2 digestoitiin restriktioentsyymeillä 5 HpuII (tunnistuskohdat kloramfenikoliresistenssialueen ul kopuolella) ja Bstll (tunnistuskohta kloramfenikoliresis-tenssialueen sisällä). Streptococcus lactis SSLl35-kannan kromosomaalista DNA:ta digestoitiin vastaavasti entsyymeillä Clal ja BstEII (kaksoisdigestiot, koska BstEII on suh-10 teellisen harvinainen restriktiokohta). DNA:t sekoitettiin 1:3 ja ligoitiin. Ligaatioseoksella transformoitiin E. coli selektion perustuessa erytromysiiniresistenssiin. Saadut transformantit testattiin myös kloramfenikoliresistenssin suhteen. Kuusi erytromysiiniresistenttiä kloramfenikoli-15 sensitiivistä transformanttia valittiin jatkotutkimuksiin.

Kukin sisälsi insertin pVS2 plasmidin Hpall ja BstEII kohtien välisellä alueella. Inserttien koot vaihtelivat välillä 0,6 - 5,0 kb.

Kirjallisuusviitteet 20 1. Behnke, D. ja Gilmore, M.S. (1981) Location of antibiotic resistance determinants, copy control and replication functions of the double selective streptococcal cloning vector pGB301. Mol. Gen. Genet. 184, 115-120.

2. Birnboim, H.C. (1983) A rapid alkaline extraction 25 method for the isolation of plasmid DNA. In Wu, R., Grossman, L., and Moldave, K. (editors) Methods in Enzymology 100, 243-255, Academic Press Inc., New York.

3. Gasson, M.J. (1983) Plasmid complements of Streptococcus lactis NCD0712 and other lactic streptococci 30 after protoplast induced curing. J. Bacteriol. 154, 1-9.

4. Gasson, M.J. ja Anderson, P.H. (1985) High copy number plasmid vectors for use in lactic streptococci, FEMS Microbiol. Lett. 30, 193-196.

5. Guerry, P., Le Blanc, D.J. ja Falkow, S. (1973) 35 General method for isolation of plasmid deoxyribonucleic acid. J. Bacteriol. 116, 1064-1066.

77056 11 6. Kok, J., van der Vossen, J.M.B.M. ja Venema, G. (1984) Construction of plasmid cloning vector for lactic streptococci which also replicate in Bacillus subtilis and Escherichia coli. Appi. Environ. Microbiol. £8, 726-731.

5 7. Kok, J., von Dijl, J.M., van der Vossen, J.M.B.M.

ja Venema, G. (1985) Cloning and expression of a Streptococcus cremoris proteinase in Bacillus subtilis and Streptococcus lactis. Appi. Environ. Microbiol. 50, 94-101.

8. Maniatis, T., Fritsch, E.F. ja Sambrook, J.

10 (1982) Molecular cloning, a laboratory manual, Cold Spring

Harbor Laboratory.

9. Marinus, M.G.(1973) Location of DNA methylation genes of the Escherichia coli K-12 genetic map. Mol. Gen. Genet. 127, 47-55.

15 10. McKay, L.L. (1983) Functional properties of plas mids in lactic streptococci. Antoine van Leeuwenhoek 49, 259-274.

11. Shortle, D. (1983) A genetic system for analysis of staphylococcal nuclease. Gene 22, 181-189.

.. . 20 12. Sutcliffe, J.G. (1978) pBR322 restriction map marked from the DNA requence: Accurate DNA size markers up to 4361 nucleotide pairs long. Nucleic Acids Res. 5, 2721.

13. Terzaghi, B.E. ja Sandine, W.E. (1975) Improved .’·! medium for lactic streptococci and their bacteriophages.

25 Appi. Microbiol. 29_, 807-813.

- - 14. Weisblum, B., Graham, M.Y. ja Dubnau, D. (1979)

Plasmid copy number control: Isolation and characterization of high copy-number mutants of plasmid pE194. J. Bacteriol. 137, 635-643.

30 15. von Wright, A., Taimisto, A.-M. ja Sivelä, S.

- (1985) Effect of Ca2+ ions on the plasmid transformation of Streptococcus lactis protoplasts. Appi. Environ. Microbiol. 50, 1100-1102.

Claims (3)

12 77056

1. Kloonausvektori, jonka avulla voidaan siirtää vierasta DNA:ta N-ryhmän streptokokkeihin, Escherichia 5 coliin ja Bacillus subtilikseen, tunnettu siitä, että vektorin kantaosa on Streptococcus lactis plasmidin pSH71 1,7 kb:n kokoinen Clal-fraqmentti, johon on liitetty erytromysiiniresistenssigeeni Staphylococcus aureus plas-midista pEl94 ja kloramfenikoliresistenssigeeni Strepto-10 coccus sanguis plasmidista pGB301, ja näiden väliin plasmi-dista pBR322 peräisin oleva 0,35 kb:n Clal-BamHI-fragment-ti, jolloin kloonausvektorin koko on 5,0 kb, ja se sisältää järjestyksessä seuraavat restriktioentsyymien leikkaus-kohdat: Clal, Bell, Hindlll, kaksi 9 emäsparin toisistaan 15 erottamaa Hpall-kohtaa ja BstEII-kohdan siten, että Bell inaktivoi erytromysiiniresistenssigeenin, ja että erytromysiiniresistenssigeeni sijaitsee restriktioentsyymien Clal ja Hindlll leikkauskohtien välissä, ja jolloin vektori sisältää kaksi antibioottiresistenssigeeniä, joista kumpikin 20 inaktivoituu yhdellä, mutta toisiinsa verrattuna erilaisella restriktioentsyymillä, joiden leikkauskohdat yhdessä resistenssigeenien ulkopuolisten restriktioentsyymien leikkauskohtien kanssa mahdollistavat "forced cloning"-mene-telmän käytön, ja jolloin vieras DNA näihin kohtiin liit-25 tyneenä saadaan ekspressoitumaan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen kloonausvektori, tunnettu siitä, että mihin tahansa vektorissa olevaan restriktioentsyymileikkauskohtaan on liitetty vierasta DNA:ta.

3. Streptococcus lactis VS 135, DSM 3749.