KR20140012411A

KR20140012411A - 장류의 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스 ｓｃｋｂ１１ 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20140012411A
Application number: KR1020120079232A
Authority: KR
Inventors: 정도연; 김용상; 엄태붕
Original assignee: 순창군; 재단법인 순창군발효미생물관리센터
Priority date: 2012-07-20
Filing date: 2012-07-20
Publication date: 2014-02-03
Also published as: KR101379230B1

Abstract

본 발명은 장류에서 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주(KCCM 11276P), 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장류 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제의 제조 방법, 상기 균주를 포함하는 식품 및 상기 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법을 제공한다.

Description

장류의 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스 ＳＣＫＢ１１ 균주 및 이의 용도{Bacillus licheniformis strain SCK B11 having antimicrobial activity against pathogenic microorganism of soy sauce and degrading activity of biogenic amine and uses thereof}

본 발명은 장류의 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스(Bacillus l icheniformis) SCK B11 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 장류에서 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스 SCK B11 균주(KCCM 11276P), 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장류 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제의 제조 방법, 상기 균주를 포함하는 식품 및 상기 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법에 관한 것이다.

한국의 장류 식품인 청국장, 된장 및 간장은 우리 조상으로부터 수백년 동안 섭취해온 음식으로서 특별한 부작용이 없는 식품이며, 항산화 효과, 혈전용해 효과, 혈압강하 효과 등을 유발하는 각종 유익한 생리활성 물질들이 포함된 것으로 알려져 있다.

장류는 한국인의 식탁에 필수적인 부식으로서 식품으로 안전성 확보는 무엇보다도 중요한 과제이다. 장류의 발효과정에서 식품 안전을 좌우하는 3가지 주요 인자는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)와 같은 유해 미생물, 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus ) 등이 생산하는 아플라톡신(aflatoxin) 및 발효 미생물에 의해 생산되는 바이오제닉 아민(biogenic amine)이 있다(Shalaby, A. R., 1996 Food Research Int. 29, 675-690).

전통 방식에 의해 제조하는 장류는 필연적으로 자연 환경에 노출되는 상태로 발효가 이루어지기 때문에 발효나 숙성과정 동안 토양이나 대기의 유해 미생물들에 의해 독소들이 생성될 가능성이 높다. 장의 발효에 관여하는 주된 미생물 중의 하나는 바실러스(Bacillus) 속이다. 세균으로서 바실러스 서브그룹(Bacillus subgroup) 1에 속하는 바실러스 마이코이드(B. mycoides ), 바실러스 튜린지엔시스(B. thuringiensis), 바실러스 안트라시스(B. anthracis) 또는 바실러스 세레우스(B. cereus)는 유해균으로 알려져 있다. 특히 바실러스 세레우스는 HBL(haemolysin BL), NHE(non-hemolytic enterotoxin) 또는 cytK(cytotoxin K)와 같은 설사나 장염을 일으키는 단백질을 생산할 수 있다. 또한, 식품에 오염된 바실러스 세레우스 균이 증식하여 생산한 독소(cereulide) 및 구토를 일으키는 펩티드 형태의 안트락스(anthrax)와 유사한 호흡 질환을 유발하는 세트락스(certhrax)를 생산한다.

바이오제닉 아민(biogenic amine)은 아미노산의 탈탄산 작용, 아미노기 전이작용 등의 화학적 작용에 의해 주로 생성되는 질소화합물로서, 단백질 함유 식품 내에서 미생물 또는 생화학적 활성에 의해 발생된다. 바이오제닉 아민은 미생물의 아미노산 디카복실라제(amino acid decarboxylase) 작용에 의해 형성되며 세균에서는 아크로모나스(Acromonas), 바실러스(Bacillus), 시트로박터(Citrobacter), 클로스트리디움(Clostridium), 에스케리키아(Escherichia), 크렙시엘라(Klebsiela), 락토바실러스(Lactobacillus), 페디오코커스(Pediococcus), 프로테우스(Proteus) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 속 등이 아미노산 디카복실라제를 가지는 것으로 알려져 있다(Taylor et al ., 1983 Mar. Fish. Rev. 45, 35-39). 대표적인 바이오제닉 아민으로는 퓨트레신(putrescine), 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 카다베린(cadaverine), 스퍼미딘(spermidine) 및 세로토닌(serotonin) 등이 있다. 바이오제닉 아민은 체내에서 신경전달 물질로 직·간접적으로 작용하고 혈압조절 및 혈류 등의 심혈관계 질환에도 영향을 미치므로, 바이오제닉 아민 함유 식품의 섭취로 여러가지 약리적인 현상이 나타날 수 있다. 이들 중 인체의 분해 한도를 넘어서는 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine)을 식품에서 섭취하는 경우에는 발진, 국소적 피부염증, 알레르기, 구토, 오심, 설사 등의 증상을 유발한다. 또한, 바이오제닉 아민에 의해 혈관 수축 및 심박 활동이 증가되어 혈압 상승을 유발하고, 동공과 눈꺼풀 조직을 확장시켜 눈물의 분비를 촉진하고, 타액의 과다분비, 호흡 증가 및 혈당 상승을 가져오며 편두통을 유발하기도 하는 것으로 보고되었다.

단백질 함량이 높은 콩, 프로테아제(proteases) 활성이 높은 바실러스(Bacillus) 및 아스퍼질러스(Aspergillus) 속에 의한 발효, 미혐기적 환경 및 적당한 발효 온도를 고려할 때 장류는 바이오제닉 아민을 생산하기 적당한 환경이라고 할 수 있다. 2006년 국내 유통 발효 식품 중에 바이오제닉 아민 분포를 조사한 결과에 따르면, 한국인의 주 부식인 전통 된장에서 퓨트레신(putrescine)은 99.6∼1453.7 mg/kg(평균 462.6), 히스타민(histamine)은 260.1∼952 mg/kg(평균 569.4), 티라민(tyramine)은 284.7∼1430.7 mg/kg(평균 669.5), 카다베린(cadaverine)은 4.6-65.4 mg/kg(평균 23.5)으로 한국인들이 주로 섭취하는 34종의 식품 가운데 평균적으로 가장 높았다. 다음으로 멸치 젓갈, 시판 간장, 전통 간장, 현대식 된장 순이었다. 상기 결과는 바이오제닉 아민 함량이 가장 높은 식품 7종 중 4종이 장류라는 점과 한국인의 음식 섭취 특성상 젓갈보다 장류가 많다는 것을 고려하면, 장류는 식품 섭취 시 바이오제닉 아민의 주 공급원으로 건강에 위해를 줄 수 있는 수준임을 나타낸다.

앞으로 전통 장류의 지향점은 전통적인 장류의 맛과 풍미는 유지하되 발효 미생물 제어를 통한 식품 위생상의 안전성을 동시에 확보할 수 있어야 한다. 이를 위해 발효 동안 유해 균주들의 증식을 억제하며, 바이오제닉 아민을 생산하지 않고 동시에 분해도 가능한 발효 균주의 선발은 필수적이다.

한편, 한국등록특허 제0506721호에는 '바실러스 리케니포미스 N1 및 이를 포함하는 식물병원성 진균 방제용 미생물 제제'가 개시되어 있으나, 본 발명의 장류의 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스 SCK B11 균주 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 전통 장류에서 유해 미생물에 대해 강한 항균 활성을 지니고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으며 바이오제닉 아민의 높은 분해 활성을 가지는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주를 분리하였다. 상기 균주를 장류에 처리한 경우 유해 미생물의 증식이 억제되고, 바이오제닉 아민이 효과적으로 분해되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 장류에서 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주(KCCM 11276P)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장류 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주를 포함하는 식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법을 제공한다.

본 발명에서는 전통 장류에서 분리한 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주가 장류의 발효 과정 동안 발생하는 유해 미생물의 증식을 억제하고, 바이오제닉 아민을 효과적으로 분해하는 것을 확인하였다. 본 발명의 바실러스 리케니포미스 SCK B11 균주를 이용하여 독성이 없는 안전한 장류 식품 생산 효과를 가져올 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

도 1은 SCK B11 균주의 집락 형태(A) 및 field emission scanning electron micrograph(B)를 나타낸다. 막대(bar)는 1 ㎛를 나타낸다.
도 2는 SCK B11 균주 및 다른 연관 균주들의 관계를 보여주는 16S rRNA 유전자 서열 비교 분석을 통해 구축한 계통수를 나타낸다. 계통수는 근연접합법(neighbor-joining method)을 이용하여 구축하였다. 연관된 분류군의 부트스트랩 분석에서 1000개의 반복체에 대한 % 값은 분지 옆에 나타냈다. 막대(bar)는 1 뉴클레오티드 위치당 0.02 치환을 나타낸다.
도 3은 바실러스 세레우스 독성(A) 및 바실러스 리케니포미스 항균물질 및 계면활성제(B)의 검출을 위한 PCR 생성물의 전기영동 결과를 나타낸다. (A) 레인 1은 nheA , 레인 2는 nheB , 레인 3은 nheC, 레인 4는 hblA, 레인 5는 hblC, 레인 6은 hblD, 레인 7은 cytK, 레인 8은 plcR - papR, 레인 9는 cesA, 레인 10은 crx 및 레인 11은 16S rRNA 유전자를 나타낸다. (B) 레인 1은 lchAA , 레인 2는 lchAB , 레인 3은 lchAC, 레인 4는 licM1, 레인 5는 licM2, 레인 6은 srfAA, 레인 7은 srfAB, 레인 8은 srfAC 및 레인 9는 16S rRNA 유전자를 나타낸다.
도 4는 SCK B11 균주를 0.22 ㎛ 마이크로필터로 여과한 배양액을 유해균의 배양액에 넣고 추가 배양한 후 전자현미경으로 관찰한 결과이다. 배양된 유해균 세포(200 ㎕)를 SCK B11 균주의 배양 여과액(100 ㎕)과 함께 20시간 반응시켰다. (A) 및 (B)는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) KACC 11240(ATCC 14579)를 나타내고, (C) 및 (D)는 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) KACC 10764를 나타낸다. (E) 및 (F)는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) KACC 13821을 나타내고, (G) 및 (H)는 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) KACC 1025를 나타낸다. (I) 및 (J)는 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis) KACC 11304를 나타내고, (K) 및 (L)은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) KCTC 1621을 나타낸다. (A), (C), (E), (G), (I) 및 (K)는 SCK B11 균주의 배양 여과액을 처리하지 않은 세포를 의미하며, (B), (D), (F), (H), (J) 및 (L)은 SCK B11 균주의 배양 여과액을 처리한 세포를 의미한다.
도 5는 미생물의 바이오제닉 아민 생성에 의해 pH 변화가 생겨 미생물 선택 배지에 포함된 크레졸 레드(cresol red)의 색이 적자색으로 변한 것을 나타낸다. 화살표는 SCK B11 균주의 집락을 나타내며, SCK B11 균주의 집락 주변에는 크레졸 레드 색의 변화가 나타나지 않았다.
도 6은 삶은 콩의 발효 기간 동안, SCK B11 균주 처리에 의한 바이오제닉 아민의 농도 변화를 나타낸다. 각각 티라민(사각형), 히스타민(원), 퓨트레신(삼각형) 및 카다베린(마름모)을 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 장류에서 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주(KCCM 11276P)를 제공한다.

상기 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주(KCCM 11276P)는 전통 장류에서 분리하였으며, 독소 유전자가 없고, 유해 미생물에 길항 능력을 가지며 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 균주이다. 상기 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2012년 06월 08일자로 기탁하였다(기탁번호 : KCCM 11276P)

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 유해 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 아스퍼질러스 플라부스((Aspergillus flavus), 아스퍼질러스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus), 아스퍼질러스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 바이오제닉 아민은 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 퓨트레신(putrescine) 또는 카다베린(cadaverine)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 균주는 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 바이오제닉 아민(biogenic amine)은 미생물의 아미노산 디카복실라제 작용에 의해 아미노산으로부터 형성되며, 인체의 분해 한도를 넘어서는 바이오제닉 아민을 식품에서 섭취하는 경우에는 발진, 국소적 피부염증, 알레르기, 구토, 오심, 설사 등의 증상을 유발한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장류 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 미생물 제제에서, 상기 유해 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 아스퍼질러스 플라부스((Aspergillus flavus), 아스퍼질러스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus), 아스퍼질러스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 중 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 미생물 제제는 장류로부터 분리된 유해 미생물에 대해 항균 활성 및 바이오제닉 아민 분해 활성을 가지는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주를 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명에 의한 미생물 제제는 액상 형태로 제조될 수 있으며 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다.

본 발명은 또한, 본 발명의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주를 배양하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제의 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 바실러스 리케니포미스 균주를 배양하는 방법은 당업계에 알려진 통상의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주를 포함하는 식품을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식품에서, 상기 식품은 장류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식품에서, 상기 장류는 메주, 한식된장, 된장, 조미된장, 고추장, 조미고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 한식간장, 양조간장 및 혼합간장으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 식품일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 상기 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 균주를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 발명의 균주는 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 바람직하게는 식품은 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주를 함유하는 형태일 수 있으며, 또한 다른 식품의 첨가물로서도 이용될 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법을 제공한다.

상기 장류 유해 미생물 제어는 본 발명의 바실러스 리케니포미스 SCK B11 균주를 장류에 처리함으로써, 유해 미새물의 성장을 지연시키거나 저해시키는 것을 의미한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

균주 선발 및 배양

전통 방법에 따라 제조한 83종의 된장, 고추장 및 청국장을 구입 후 5 g을 취해 0.3 mM 인산 완충액(pH 7.2)으로 희석하였다. 영양한천 배지(nutrient agar, NA) 및 바실러스 세레우스 선택 배지(chromogenic polymyxin B-methoprim agar, CPMA) 표면에 희석된 균액을 각각 200 ㎕씩 도포하고 30℃에서 24시간 배양한 후, NA에서 자란 집락수에 비해 CPMA에서 자란 집락수의 비율이 낮았던 장류들을 선발하였다. NA에서 배양한 상기 선발 장류의 집락들을 이쑤시개로 찍어 미리 만들어둔 NA 및 CPMA 배지의 같은 위치에 각각 접종하고, 24시간 후에 CPMA에 자라지 않은 균들만을 수집하였다. 수집한 균들을 대상으로 PCR을 수행하여 바실러스 세레우스 독소 유전자 유무를 검사하여 균을 선발하였다. 선발한 균들을 영양 배지(nutrient broth, NB)에 37℃에서 78시간 동안 배양하고 1,000 rpm에서 3분간 원심분리 후 상층액만을 모아 -20℃에 보관하였다.

표준 균주인 바실러스 세레우스 KACC 11240(ATCC 14579)과 바실러스 세레우스 JBE 0001(GenBank 등록번호 FJ 982655), JBE 0002(FJ 982656), JBE 0004(FJ 982654), JBE 0005(FJ 982657), JBE 0006(FJ 982658) JBE 0008(FJ 982659) 및 JBE 0011(FJ 982661)을 NB에서 37℃에서 21시간 동안 배양하였다. 그 후 배양액 100 ㎕를 각 NA 표면에 골고루 도포하고 배지 중앙에 4 mm 페이퍼 디스크(paper disc, 3M)를 올려놓았다. 냉동 보관했던 원심분리 상층액을 녹여 페이퍼 디스크 중앙에 20 ㎕를 분주하고 37℃에서 21시간 배양한 뒤, 투명 환 크기를 측정하여 8 종의 바실러스 세레우스 모두에 대해 길항 능력을 가진 종들을 분리하였다.

바실러스 세레우스(B. cereus ), 바실러스 리케니포미스(B. licheniformis ), 바실러스 서브틸리스(B. subtilis ), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli ), 마이크로코커스 루테우스(ococcus luteus ), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 배양은 영양한천 배지(NA)를 사용하였다. 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis ), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis ), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes) 배양은 각각 MRS(Lactobacilli MRS agar), TSA(trypticase soy agar) 및 LOA(Listeria Oxford agar)를 사용하였다. 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus ), 아스퍼질러스 푸미가투스(A. fumigatus ), 아스퍼질러스 오크라세우스(A. ochraceus ) 및 아스퍼질러스 파라시티쿠스(A. parasiticus)는 감자한천 배지(potato dextrose agar, PDA)를 사용하였고, 캔디아 알비캔스(Candida albicans)는 효모추출 배지(yeast extract agar, YEA)를 사용하였다. 표 3에 나타낸 사용한 장류 유해 균주들은 생명자원센터(KCTC) 및 한국농업미생물자원센터(KACC)로부터 분양을 받았다. 배양온도로 아스퍼질러스 오크라세우스는 25℃, 락토바실러스 브레비스는 28℃, 아스퍼질러스 및 캔디아 알비캔스는 30℃에서 배양하였고, 나머지 균들은 37℃에서 배양하였다. 상기 균주 증식에 대한 SCK B11 균의 길항력은 각 균의 최적 온도에서 배양한 뒤 4 mm 페이퍼 디스크 주변에 생성된 투명 환 직경으로 비교하였다.

균주 동정

생화학적 동정을 위해 균을 새로운 NA 배지에 접종하고 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 형성된 집락은 NA 배양액에 희석 후 46종 건조 배지 및 생화학 반응물로 구성된 BCL ID 카드(bioMerieux Vitek Inc., Hazelwood, USA)에 주입하였고, 15분 간격으로 결과들이 VITEK 2 Compact 소프트웨어(bioMerieux Vitek)에 통합적으로 저장 분석된 뒤 14시간 후 동정이 완료되었다.

16S rRNA 유전자의 염기서열에 의한 균 동정을 위해 일반적인 프라이머로서 518F(5'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3'; 서열번호 2) 및 800R(5'-TACCAGGGTATCTAATCC-3'; 서열번호 3)을 이용하여 16S rRNA 유전자를 PCR로 증폭하였다. 그 후 동정에 중요한 50∼900 bp 염기서열을 포함하는 1,443 bp 부위(서열번호 1)를 BigDye Terminator v3.1 Cycle 시퀀싱 키트(Applied Biosystems Inc., USA)를 사용하여 해독하였다. 상기 염기서열은 NCBI 데이터베이스로부터 BLASTN 프로그램 및 RDP(Ribosomal Database Project)의 서열매치(Seqmatch) 프로그램(version 3)을 사용하여 표준 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열들을 얻은 후, 염기서열들 간의 상호 비교를 위해 CLUSTALW 프로그램을 사용하였다. 계통수 분석은 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열들을 정렬하고 시각적 관찰과 수작업을 통해 갭(gap)이 최소화되도록 보정한 후, Kimura's two-parameter 방법 및 maximum parsimony 방법을 사용하여 작성하였다. 산출한 각각의 계통수에서 각 분지에 대한 통계학적 신뢰도를 산출하기 위해 부트스트랩(bootstrap) 분석을 1,000회 실행하였으며 계통 분석과 부트스트랩 분석은 PAUP(version 4.0b)을 사용하였다.

PCR 수행

SCK B11 균주가 바실러스 세레우스의 설사 독소 유전자(nheABC , hblACD 및 cytK), 구토 독소 세레울라이드(cereulide) 합성 효소 유전자(cesA 및 cesB), 설사독소 발현 전사조절 유전자인 plcR - papR 및 호흡 독소인 세트락스(certhrax)를 갖는지 확인하기 위하여 PCR을 실시하였다. 상기 독소 검출용 프라이머 서열은 표 1에 나타내었으며, PCR 조건은 94℃에서 2분간 초기 변성 후, 94℃에서 1분간 변성, 56℃에서 1분간 결합 및 72℃에서 1분간 증폭 과정을 30회 반복하고 72℃에서 5분간 마지막 증폭을 실시하였다.

항균물질 유전자 유무를 확인하기 위해 바실러스 리케니포미스의 리케니신(lichenysin) 합성 효소 유전자인 lchAA, lchAB 및 lchAC , 란티바이오틱(lantibiotic) 수식 효소 유전자인 licM1 및 licM2, 바실러스 서브틸리스의 서팩틴(surfactin) 합성효소 유전자인 srfAA , srfAB 및 srfAC를 선택하여 PCR을 수행하였다. 프라이머 서열은 표 1에 나타내었으며, PCR 조건은 94℃에서 2분간 초기 변성 후, 94℃에서 1분간 변성, 56℃에서 1분간 결합 및 72℃에서 1분간 증폭과정을 30회 반복하고 72℃에서 5분간 마지막 증폭을 실시하였다.

본 발명에 사용한 PCR 프라이머

Primer pair	Sequence (5' -> 3')	Target sequence (GenBank accession no)	Size (bp)
nheAF nheAR	ATATGCGCAAAATGTAATTGCTCCA (서열번호 4) TGCCTTCTTCAACATTTGTTTGAATTT (서열번호 5)	Non-hemolytic enterotoxin, nheA (AY835995)	935
nheBF nheBR	ACTTATGGCAGTATTTGCAGCAGGA (서열번호 6) TGCAACGCTGTAATTGCAGTATCAA (서열번호 7)	Non-hemolytic enterotoxin, nheB (AY835995)	972
nheCF nheCR	GACCAGCAGGATTCCCAGATGTAAT (서열번호 8) CCACGCCTTCATGTAATTTTTCTGT (서열번호 9)	Non-hemolytic enterotoxin, nheC (AY835995)	930
hblAF hblAR	ACCAGTAGCGACTTTTGCAAGTGAA (서열번호 10) TTTTGAGCTGCATTCTCAATATGCC (서열번호 11)	Hemolytic enterotoxin, hblA (AY822584)	909
hblCF hblCR	ATCAATACTCTCGCAACACCAATCG (서열번호 12) ATGTGCTCGTTGCTCTGCTGTTAAT (서열번호 13)	Hemolytic enterotoxin, hblC (AY822584)	957
hblDF hblDR	GACTGAAGACAGCATTGGCTCAAAC (서열번호 14) CGATGTCTTTCGAAATGAATTCTGC (서열번호 15)	Hemolytic enterotoxin, hblD (AY822584)	1,059
cytKF cytKR	CCGCTGTTTTTGCTAGTAGTGCTGT (서열번호 16) ACGTCTTTTACGTTGTTTCCAACCC (서열번호 17)	Cytotoxin K, cytK (DQ019311)	901
plcRF plcRR	CRGGYGCRGTATACCCAAGT(서열번호 18) TGAAATACCCCATGYCATYG(서열번호 19)	Phospholipase C regulatory protein, plcRpapR(DQ153391)	888
cesAF cesAR	GTTGGCGTGTTATGTGATCG(서열번호 20) GGTGAAACAGCTTCTCCTGC(서열번호 21)	Cereulide synthetase A, cesA (AB248763)	662
ctxF ctxR	TGCTAAAGGAGGGAAGGAACCGT (서열번호 22) AGCCCCATGTACCCCTTCTGGA (서열번호 23)	Certrax, ctx (AAEK01000004)	1,000
lchAF lchAR	ACGGCCGATCAGGAGCTTTC(서열번호 24) TCTCAGCGCCTTCGATCTGC(서열번호 25)	Lichenysin synthetase, lchAA(AJ005061)	557
lchBF lchBR	TTTGACCCGGAGCTCGTTGA(서열번호 26) CTGAGGGCGGAAAGCAGGAT(서열번호 27)	Lichenysin synthetase, lchAB(AJ005061)	706
lchCF lchCR	CATGTATACGGGCCGACGGA(서열번호 28) CTGAAGGCCGGAGATGGCTT(서열번호 29)	Lichenysin synthetase, lchAC(AJ005061)	1,173
lanM1F lanM1R	TCGCTGACCACCGAGGAAAA(서열번호 30) CGCTTTCTGCATGGTCCCAG(서열번호 31)	Lantibiotic modification enzyme1, licM1 (NC006270)	571
lanM2F lanM2R	CGACAGCGCACTACGCCTCT(서열번호 32) TCCCGCATGCTGCAGAAAAT(서열번호 33)	Lantibiotic modification enzyme2, licM2 (NC006270)	776
srfAF srfAR	CGGTGTGTCATGGCGGATTT(서열번호 34) TCGAAAGCGGACGGTTCAAA(서열번호 35)	Surfactin synthetase A, srfAA(NC000964)	1,025
srfBF srfBR	CGGTGTGTCATGGCGGATTT(서열번호 36) TCGAAAGCGGACGGTTCAAA(서열번호 37)	Surfactin synthetase AB, srfAB (NC000964)	696
srfCF srfCR	TTCACTGTCGGAGGCGGAAA(서열번호 38) ACCGGCAGATAGGCTGCTCC(서열번호 39)	Surfactin synthetase AC, srfAC (NC000964)	933

전자현미경 관찰 37℃에서 21시간 동안 배양한 바실러스 세레우스 KACC 11240(ATCC 14579) 배양액 1 ㎖에 동일 조건에서 배양한 SCK B11 배양액을 직경 0.2 ㎛ 필터(Satorius, Germany)로 여과한 여과액 2 ㎖을 넣고 37℃에서 8시간 추가 배양시켰다. 배양액을 1,000 rpm에서 3분간 원심분리한 후 상층액을 제거하고, 9% NaCl로 2번 펠렛을 세척한 뒤 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 1차 고정하고, 1% 4산화오스뮴(osmium tetroxide)으로 2차 고정 및 에탄올 탈수과정을 수행하였다. 100% 에탄올에 탈수된 균을 커버 글라스 위에 떨어뜨린 뒤 80℃에서 12시간 건조시키고, 이온 증착기(ion sputter)로 20분간 오스뮴(osmium)을 코팅시켜 전계방사형 주사전자현미경(SUPRA 40VP, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 관찰하였다.

바이오제닉 아민(Biogenic amine)의 검출

선발 균주 SCK B11의 바이오제닉 아민 분해 능력을 관찰하기 위해 HPLC를 수행하였다. 증기 멸균한 삶은 콩가루 0.3 g에 각각 16 mg의 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 퓨트레신(putrescine) 및 카다베린(cadaverine)을 녹인 0.8 ㎖ NB 배지를 첨가하고, SCK B11 균주 배양액 0.2 ㎖을 접종하였다. 대조군에는 바이오제닉 아민이 없는 NB를 첨가하였다. 47℃에서 시간별로 배양한 후 10,000 x g에서 10분간 원심분리하여 얻은 0.1 ㎖ 상층액, 80 ㎕ 아세톤 용해 1% 댄실염화물(dansyl chloride), 50 ㎕ 포화 Na₂CO₃ 및 50 ㎕ 내부 표준 용액을 섞어 45℃에서 1시간 동안 유도체화 시켰다. 유도체화한 시료용액에 10% 프롤린(proline) 50 ㎕를 첨가하여 여분의 댄실염화물을 제거한 뒤, 0.5 ㎖ 에테르(ether)를 넣고, 3분 후 상층액만 분리하여 건조시킨 후, 0.1 ㎖ 아세토니트릴(acetonitrile)에 용해시켰다. HPLC 분석으로 역상 컬럼은 C18(Capcell pak, 4.6 mm x 150 mm, 5 ㎛)을 사용하였다. 이동상은 증류수에 녹인 0.1% 포름산(formic acid, A) 및 아세토니트릴에 녹인 0.1% 포름산(B)을 사용하였고, 농도 경사는 0∼10분, A:B=45:55; 11∼15분, A:B=35:65; 16∼25분, A:B=20:80; 26∼30분, A:B=10:90, 30분, 유속은 1 ㎖/분으로 하고 10 ㎕ 시료를 주입하였다.

실시예 1. SCK B11 균주의 동정 및 특성

NA에서 배양 후 SCK B11 균주의 형태는 백색의 집락 주위로 반투명의 광택 환을 형성하였다(도 1A). SCK B11 균주는 1,500x 배율의 광학 현미경 하에서 관찰하였을 때 움직임이 매우 활발했고 그람(gram) 염색에서 양성을 나타냈다. 50,000x 배율로 확대한 주사전자현미경으로 관찰 결과 균의 형태는 간균으로 0.8∼0.9 ㎛ x 2.0∼3.0 ㎛의 크기를 보였으며, 편모를 가진 것이 확인되었다(도 1B). BCL 카드를 이용하여 46 종류의 생화학적 검사 결과를 Vitec 2 Compact 소프트웨어로 분석한 결과, 96%의 확률로 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 종으로 분류되었다(표 2). RDP에 등록된 모든 바실러스 표준 균주들을 사용하여 계통수를 분석한 결과, SCK B11 균주는 바실러스 리케니포미스 ATCC 14589 균주와 가장 가까운 근연 관계를 보였고, 16S rDNA 유전자 서열 상동성은 99.93%(1,399 bp/1,400 bp)를 나타냈다(도 2).

따라서 생화학 분석과 계통학적 분류를 고려하여 SCK B11 균주를 바실러스 리케니포미스(B. licheniformis)로 동정하였다. SCK B11 균주가 독소 유전자를 함유하는지 확인하기 위해 바실러스 세레우스 독소인 NheABC, HblACD, CytK, cereulide, certhrax 및 단백질 독소 발현조절 인자인 plcR - papR의 유전자들을 대상으로 PCR을 수행한 결과 상기 유전자가 전혀 발견되지 않았다. 상기 결과로서 SCK B11 균주는 독소 유전자를 함유하지 않는 것을 확인하였다(도 3A).

본 발명의 SCK B11 균주의 생화학적 특성

Test	Reaction	Test	Reaction
ß-Xylosidase	(+)	Phenylalanine arylamidase	+
L-Lysine arylamidase	-	L-Proline arylamidase	-
L-Aspartate arylamidase	-	ß-Galactosidase	+
D-Mannose	+	L-Pyrrolydonyl arylamidase	+
D-Melezitose	-	a-Galactosidase	-
N-Acetyl-D-glucosamine	+	Alanine arylamidase	-
Palatinose	+	Tyrosine arylamidase	+
L-Rhammose	-	ß-N-Acetyl-glucosaminidase	-
ß-Glucosidase	+	Ala-Phe-Pro arylamidase	-
ß-Mannosidase	-	Cyclodextrin	+
Phosphorylcholine esterase	-	D-Galactose	-
Pyruvate	-	Glycogen	-
a-Glucosidase	+	Myoinositol	+
D-Tagatose	+	Methyl-a-D-glucopyranose	+
D-Trehalose	+	Ellman	+
Inulin	-	Methyl-D-xylosidase	-
D-Glucose	+	a-Mannosidase	-
D-Ribose	+	Maltotriose	+
Putrescine assimilation	-	Glycine arylamidase	+
Growth in 6.5% NaCl	+	D-Mannitol	+
Kanamycin resistance	-	Esculin hydrolase	+
Oleandomycin resistance	+	Tetrazolium red	-
Leucine arylamidase	+	Polymyxin B resistance	+

실시예 2. SCK B11 균주의 항균 작용

SCK B11 균주의 병원성 세균 및 곰팡이에 대한 항균 효과는 표 3에 나타내었다. 증식 억제 수준의 차이는 있었으나 SCK B11 균주는 실험에 사용한 바실러스 세레우스 6종 모두 증식을 억제하였다. 하지만 장류 유익 발효 균주들인 바실러스 서브틸리스 및 바실러스 리케니포미스 2종에 대해서는 전혀 증식 저해를 나타내지 않았다. 따라서 SCK B11 균주는 좋은 발효 특성을 가진 다른 바실러스 서브틸리스 균들과 함께 고추장을 발효하는 것이 가능할 것으로 판단되었다. SCK B11 균주는 효모인 캔디다 알비캔스(Candida albicans)를 제외하고 곰팡이들에 대해 항진균 특성을 나타냈고, 아플라톡신(aflatoxin) B, G 및 M을 생산하는 아스퍼질러스 플라부스(A. flavus ) 및 아스퍼질러스 파라시티쿠스(A. parasiticus)의 증식 저해 효과를 보였다. 또한, 오크라톡신(ochratoxin) A 생산균인 아스퍼질러스 오크라세우스(A. ochraceus)에 대해서도 효과적인(투명 환 직경 5∼6 mm) 증식 저해를 나타냈다. 전통 장류 발효 시 마이코톡신(mycotoxin)의 생성 여부는 식품 안전상 중요하며 이들 독소들은 간암이나 신장 독성을 유발할 수 있기 때문에 항진균 효과를 가진 SCK B11 균주의 사용은 숙성과정에서 위생 발효를 위해 가치가 있을 것으로 예상된다.

또한 SCK B11 균주는 병원성 또는 기회 감염성 세균들인 에스케리키아 콜라이(E. coli ), 리스테리아 모노사이토제네스(L. monocytogenes), 마이크로코커스 루테우스(M. luteus ) 및 슈도모나스 에루지노사(P. aeruginosa)에 대해 저해 능력(투명 환 직경 5∼12 mm)을 나타냈다. 특히 식중독 및 염증 반응에 관여하는 병원성 균인 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus)에 대해서는 사용한 5 균주 모두에 대해 증식 억제 효과를 나타냈다. SCK B11 균주가 분비하는 항균 물질이 일부 바실러스 리케니포미스가 생산하는 펩타이드성 항균제인 리케니시딘(lichenicidin)이나 계면활성제인 리케니신(lichenysin) 또는 바실러스 서브틸리스가 생산하는 서팩틴(surfactin)인지 확인하기 위하여 상기 합성 유전자에 대한 PCR을 수행하였다. 그러나 SCK B11 균주는 리케니신 합성효소 유전자(lchAA , lchAB 및 lchAC), 리케니시딘 합성을 위한 란티바이오틱 수식효소 유전자(licM1 및 licM2) 및 서팩틴 합성효소 유전자(srfAA , srfAC 및 srfAD)를 함유하고 있지 않아, 앞으로 상기 항균 물질의 특성을 규명해야 할 필요가 있다(도 3B).

전통 장류 발효에 다양한 항 유해균 스펙트럼을 가진 SCK B11 균주의 사용은, HACCP(Hazard Analysis & Critical Control Point) 시스템의 도입이 어려운 장류 업체에서 유해균들의 오염 문제를 해결할 수 있는 효과적 대안이 될 수 있을 것이다. 이러한 항균 특성으로부터 SCK B11 균주는 장류 발효 이외에 동물 사료, 의료, 공중위생 분야에서 사용 가능성을 고려해 볼 수 있으며, 특히 메티실린(methicillin) 저항 균주(MRSA)를 포함하는 스타필로코커스 아우레우스균들에 대해서는 항균 물질로서 사용 가능성을 조사할 필요가 있다.

항균 작용은 SCK B11 균주의 배양 후 무균 상층액 100 ㎕를 취해 200 ㎕의 유해균 배양액에 넣고 37℃에서 20시간 추가 배양 후, 전계방사형 주사전자현미경을 이용하여 확인하였다(도 4). 도 4A, C, E, G, I 및 K에 나타낸 바와 같이, SCK B11 균주의 무균 상층액을 첨가하지 않은 유해균들은 표면이 깨끗한 간균과 구균 형태를 보였다. 그러나 무균 상층액을 첨가한 후에는 세포막이 부풀어오른 형태(도 4D), 막이 터져 내용물이 흘러나오거나(도 4D, J 및 L), 세포막 껍질만 있는 형태(도 4F, H)들이 관찰되었다. 전체적으로 SCK B11 균주를 처리한 유해균 표면은 비처리군에 비해 세포막 표면이 거칠며 부분적으로 녹아있는 형태를 나타냈고, 유해균의 크기도 변화되어 있었다. 따라서 SCK B11 균주의 항균 성분은 막 구조 또는 막 대사에 영향을 미쳐 막 투과조절 능력의 상실 또는 세포막 합성 저해를 일으키는 것으로 여겨진다.

박테리아 및 곰팡이에 대한 SCK B11 균주의 항균 활성

Test strain	Antimicrobial Activity^a	Culture condition^b ^{, c}
Aspergillus ochraceus KACC 41859	+	PDA, 25℃
Aspergillus fumigatus KACC 41186	+	PDA, 30℃
Aspergillus flavus KACC 41403	+	PDA, 30℃
Aspergillus parasiticus KACC 40074	+	PDA, 30℃
Bacillus cereus KACC 10004(ATCC 27348)	++	NA, 37℃
Bacillus cereus KACC 10097(ATCC 11778)	+++	NA, 37℃
Bacillus cereus KACC 11240(ATCC 14579)	++	NA, 37℃
Bacillus cereus KACC 13752	+++	NA, 37℃
Bacillus cereus KACC 13764	++	NA, 37℃
Bacillus cereus KACC 13766	+++	NA, 37℃
Bacillus licheniformis KACC 121034	-	NA, 37℃
Bacillus licheniformis KACC 121035	-	NA, 37℃
Bacillus subtilis KCTC 10112	-	NA, 37℃
Bacillus subtilis KCTC 1023	-	NA, 37℃
Candida albicans KACC 30062	-	YEA, 30℃
Enterococcus faecalis KACC 11304	+++	TSA, 37℃
Escherichia coli KACC 13821	+	NA, 37℃
Lactobacillus brevis KACC 11433	-	MRS, 28℃
Listeria monocytogenes KACC 10764	+	LOA, 37℃
Micrococcus luteus KACC 13377	+++	NA, 37℃
Pseudomonas aeruginosa KACC 10259	+++	NA, 37℃
Staphylococcus aureus KACC 10778	++	NA, 37℃
Staphylococcus aureus KCTC 1621	+	NA, 37℃
Staphylococcus aureus KCTC 1916	++	NA, 37℃
Staphylococcus aureus KCTC 1927	+++	NA, 37℃
Staphylococcus aureus KCTC 3881	+	NA, 37℃

^a+++는 투명 환 크기(halo size) > 10 mm을 나타내고, ++는 7-9 mm, +는 5-6 mm, -는 검출되지 않음을 나타낸다.

^bPDA(Potato dextrose agar)는 감자한천 배지를 나타내고, NA(Nutrient agar)는 영양한천 배지, YEA(Yeast extract agar)는 효모 추출물 한천 배지, TSA(Trypticase soy agar)는 트립티카제 소이 한천 배지, MRS는 Lactobacilli MRS 한천 배지, LOA는 Listeria Oxford 한천 배지를 나타낸다.

^c박테리아 및 곰팡이는 각각 18-21시간 및 4일 동안 한천 배지에서 키웠다.

실시예 3. SCK B11 균주의 바이오제닉 아민의 분해

전통 장류 발효 시 높은 티라민(tyramine) 및 히스타민(histamine)의 농도를 최소화하기 위해 바이오제닉 아민 선택 배지 및 HPLC를 이용하여 SCK B11 균주의 바이오제닉 아민 생산 여부를 조사했다. 아미노산 디카복실라제(Amino acid decarboxylase)를 분비하는 미생물은 선택 배지에 첨가된 아미노산을 염기로 전환하며, 이 때 변화된 pH 때문에 크레졸 레드(cresol red)는 적자색으로 바뀐다. 전통 소시지에서 분리한 일부 스타필로코커스 및 바실러스 속들이 바이오제닉 아민을 생산하는 것이 발견되었다. 하지만 SCK B11를 배양한 선택 배지에서 색의 변화는 없었으며, 배양액의 HPLC 분석에서도 아민들은 생성되지 않았다(도 5).

발효 숙성 동안 여러 미생물들로 오염되는 전통 장류의 특성을 고려해 볼 때 전통 장류에 적용할 수 있는 가장 효율적인 균주 선발 전략은 항균 특성 및 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서 바이오제닉 아민을 분해하는 균을 찾는 방법이다. 미생물이 분비하는 모노아민 옥시다제(monoamine oxidase) 및 다이아민 옥시다제(diamine oxidase)에 의해 바이오제닉 아민이 분해되는 것으로 알려져 있다. 바이오제닉 아민 분해 여부를 확인하기 위하여, 탄소원 및 질소원으로 2% 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 푸트레신(putrescine) 및 카다베린(cadaverine) 만을 사용한 최소합성 배지에서 SCK B11 균을 배양했을 때 원활한 증식을 나타냈다. 또한 HPLC 분석 결과, 삶은 콩 g당 각 53 mg의 히스타민, 티라민, 퓨트레신 및 카다베린을 첨가한 배지에서 2일 후 SCK B11 균주는 상기 아민을 각각 53%, 45%, 62% 및 70%, 10일 후에는 72%, 66%, 75% 및 79%를 분해하였다(도 6). 전통적인 청국장 제조는 삶은 콩에 볏짚을 넣고 47℃에서 2일 동안 발효과정을 거치는 점을 고려할 때 특히 발효 2일 안에 약 50%의 바이오제닉 아민을 제거하는 SCK B11 균주를 접종하는 경우 볏짚 내 다른 미생물들에 의해 생성된 바이오제닉 아민을 효율적으로 제거할 것으로 보인다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11276P

20120608

<110> Sunchang Research Center for Fermentation Microbes(SRCM) SUNCH'ANG <120> Bacillus licheniformis strain SCK B11 having antimicrobial activity against pathogenic microorganism of soy sauce and degrading activity of biogenic amine and uses thereof <130> PN12165 <160> 39 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1400 <212> DNA <213> Bacillus licheniformis SCK B11 <400> 1 gtcgagcgga ccgacgggag cttgctcctt taggtcagcg gcggacgggt gagtaacacg 60 tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac cggggctaat accggatgct 120 tgattgaacc gcatggttca atcataaaag gtggctttta gctaccactt acagatggac 180 ccgcggcgca ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcgacgat gcgtagccga 240 cctgagaggg tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca 300 gcagtaggga atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg 360 aaggttttcg gatcgtaaaa ctctgttgtt agggaagaac aagtaccgtt cgaatagggc 420 ggtaccttga cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta 480 atacgtaggt ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagcgcgcgc aggcggtttc 540 ttaagtctga tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact 600 tgagtgcaga agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga 660 ggaacaccag tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg acgctgaggc gcgaaagcgt 720 ggggagcgaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg 780 ttagagggtt tccgcccttt agtgctgcag caaacgcatt aagcactccg cctggggagt 840 acggtcgcaa gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg 900 tggtttaatt cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tgacaaccct 960 agagataggg cttccccttc gggggcagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc 1020 gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag 1080 cattcagttg ggcactctaa ggtgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac 1140 gtcaaatcat catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg gcagaacaaa 1200 gggcagcgaa gccgcgaggc taagccaatc ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag 1260 tctgcaactc gactgcgtga agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt 1320 gaatacgttc ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg 1380 aagtcggtga ggtaaccttt 1400 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ccagcagccg cggtaatacg 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 taccagggta tctaatcc 18 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 atatgcgcaa aatgtaattg ctcca 25 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tgccttcttc aacatttgtt tgaattt 27 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 acttatggca gtatttgcag cagga 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tgcaacgctg taattgcagt atcaa 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 gaccagcagg attcccagat gtaat 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 ccacgccttc atgtaatttt tctgt 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 accagtagcg acttttgcaa gtgaa 25 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ttttgagctg cattctcaat atgcc 25 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 atcaatactc tcgcaacacc aatcg 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 atgtgctcgt tgctctgctg ttaat 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 gactgaagac agcattggct caaac 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 cgatgtcttt cgaaatgaat tctgc 25 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 ccgctgtttt tgctagtagt gctgt 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 acgtctttta cgttgtttcc aaccc 25 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 crggygcrgt atacccaagt 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 tgaaataccc catgycatyg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 gttggcgtgt tatgtgatcg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 ggtgaaacag cttctcctgc 20 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 tgctaaagga gggaaggaac cgt 23 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 agccccatgt accccttctg ga 22 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 acggccgatc aggagctttc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 tctcagcgcc ttcgatctgc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 tttgacccgg agctcgttga 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 ctgagggcgg aaagcaggat 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 catgtatacg ggccgacgga 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 ctgaaggccg gagatggctt 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 tcgctgacca ccgaggaaaa 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 cgctttctgc atggtcccag 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 cgacagcgca ctacgcctct 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 tcccgcatgc tgcagaaaat 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 cggtgtgtca tggcggattt 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 35 tcgaaagcgg acggttcaaa 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 36 cggtgtgtca tggcggattt 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 37 tcgaaagcgg acggttcaaa 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 38 ttcactgtcg gaggcggaaa 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 39 accggcagat aggctgctcc 20

Claims

장류에서 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주(KCCM 11276P).
제1항에 있어서, 상기 유해 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 아스퍼질러스 플라부스((Aspergillus flavus), 아스퍼질러스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus), 아스퍼질러스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주.
제1항에 있어서, 상기 바이오제닉 아민은 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 퓨트레신(putrescine) 또는 카다베린(cadaverine)인 것을 특징으로 하는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 것을 특징으로 하는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장류 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제.
제5항에 있어서, 상기 유해 미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 아스퍼질러스 플라부스((Aspergillus flavus), 아스퍼질러스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus), 아스퍼질러스 오크라세우스(Aspergillus ochraceus), 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 중 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 미생물 제제.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주를 배양하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물에 대한 항균용 미생물 제제의 제조 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주를 포함하는 식품.
제8항에 있어서, 상기 식품은 장류인 것을 특징으로 하는 식품.
제9항에 있어서, 상기 장류는 메주, 한식된장, 된장, 조미된장, 고추장, 조미고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 한식간장, 양조간장 및 혼합간장으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 식품.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) SCK B11 균주 또는 이의 배양액을 장류에 처리하는 단계를 포함하는 장류 유해 미생물 제어 방법.