KR101853116B1 - 항아토피 활성이 우수한 청국장 제조를 위한 스타터용 바실러스 서틸리스 srcm 100169 균주 및 이의 용도 - Google Patents

항아토피 활성이 우수한 청국장 제조를 위한 스타터용 바실러스 서틸리스 srcm 100169 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항아토피 활성이 우수한 청국장 제조를 위한 스타터용 바실러스 서틸리스 SRCM 100169 균주에 관한 것으로, 본 발명을 통해 분리한 글루타메이트 생성능, 글루타민 생성능, 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 분비능, 항산화활성능, 항혈전능 및 항비만능이 우수한 바실러스 서틸리스 SRCM 100169 균주(기탁번호: KCCM11956P)를 이용하여 제조한 청국장이 아토피에 매우 효과적인 점을 확인함으로써, 본 발명은 아토피 피부염을 앓고 있는 피부질환자들에게 매우 유용할 것으로 기대된다.

Description

항아토피 활성이 우수한 청국장 제조를 위한 스타터용 바실러스 서틸리스 SRCM 100169 균주 및 이의 용도{Bacillus subtilis SRCM 100169 strain for making Cheongkukjang having excellent antiatopic activity as starter and uses thereof}
본 발명은 항아토피 활성이 우수한 청국장 제조를 위한 스타터용 바실러스 서틸리스 SRCM 100169 균주에 관한 것이다.
우리나라의 전통적인 발효음식 중 하나인 청국장은 푹 삶은 콩을 더운 방에 띄워서 만든 된장의 일종으로서, 그 발효과정에서 고초균이 단백질 분해효소를 분비하여 소화 흡수율이 매우 우수한 식품으로 알려져 있다. 이러한 청국장은 영양학적으로 항산화 작용이 우수한 비타민 E가 풍부하여 인체의 노화를 방지하는 효과가 있고, 그 외에도 비타민 B2, 레시틴 및 이소플라본 등이 다량 함유되어 있어서 당뇨병이나 동맥경화, 심장병 등과 같은 성인병 예방에도 뛰어난 효능이 있으며, 특히 점성물질인 폴리감마 글루탐산은 우수한 항암작용을 나타내는 것으로 보고되어 있다.
한편, 아토피 피부질환이 자주 발생하는 연령은 대체로 생후 2 ~ 6개월 이내이며, 특히 1세 미만의 영아에게서 가장 많이 나타나고, 85%가 만 5세 전에 나타난다. 아토피 피부염은 주로 유아기에 자주 발생하지만, 최근에는 사춘기 이후의 환자가 증가하고 있고, 그 병력도 매우 길어지고 있는 추세이다. 아토피 피부염의 치료에는 높은 약리효과를 기대할 수 있는 부신피질 호르몬 등의 약제가 사용되고 있다. 하지만, 부신피질 호르몬제는 그 부작용이 문제가 되고 있고, 환자는 치료기간 중에 다양한 부작용의 위험에 노출된다. 더욱이, 부신피질 호르몬제를 사용하다 중단할 경우에는 약물의 사용중지 후에 일어나는 극적인 환부의 병세 악화를 칭하는 리바운드 현상이 자주 발생한다. 이와 같은 부작용의 대책으로서, 부신피질 호르몬 등의 호르몬을 포함하지 않는 비스테로이드계 항염증제 또는 항히스타민제 등이 사용되고 있으나, 역시 질환 자체를 완치하는데는 어려움이 있다. 따라서, 부작용이 없는 아토피 피부염의 완화 또는 치료제의 개발이 시급하다.
한편, 한국등록특허 제1583549호에서는 '자연 산야초가 함유된 아토피 개선을 위한 청국장환 및 그 제조 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명에서와 같이, '항아토피 활성이 우수한 청국장 제조를 위한 스타터용 바실러스 서틸리스 SRCM 100169 균주'에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명을 통해 분리한 바실러스 서틸리스 SRCM 100169 균주(기탁번호: KCCM11956P)가 글루타메이트 생성능, 글루타민 생성능, 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 분비능, 항산화활성능, 항혈전능 및 항비만능이 우수한 균주임을 확인하였고, 상기 바실러스 서틸리스 SRCM 100169 균주를 이용하여 제조한 청국장이 아토피에 매우 효과적인 점을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 글루타메이트 생성능, 글루타민 생성능, 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 분비능, 항산화활성능, 항혈전능 및 항비만능이 우수한 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM 100169 균주(기탁번호: KCCM11956P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM 100169 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 항아토피 활성이 우수한 청국장 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 청국장 제조용 스타터(starter) 조성물로 제조된 항아토피 활성이 우수한 청국장을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항아토피 활성이 우수한 청국장을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명을 통해 분리한 글루타메이트 생성능, 글루타민 생성능, 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 분비능, 항산화활성능, 항혈전능 및 항비만능이 우수한 바실러스 서틸리스 SRCM 100169 균주(기탁번호: KCCM11956P)를 이용하여 제조한 청국장이 아토피에 매우 효과적인 점을 확인함으로써, 본 발명은 아토피 피부염을 앓고 있는 피부질환자들에게 매우 유용할 것으로 기대된다.
도 1은 아토피 피부염 병변이 유발된 마우스에 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스 SRCM100169를 이용하여 제조한 청국장을 처리한 후, 아토피 피부염 병변의 형태학적 변화를 확인한 결과이다. DNFB; 0.3% DNFB + D.W, CM-169; 0.3% DNFB + 바실러스 서틸리스 SRCM100169 이용 청국장, CKJ; 0.3% DNFB + 시판 Cheongkukjang.
도 2는 상기 도 1에서 확인된 아토피 피부염의 여러 증상들을 종합하여 관찰결과를 점수로 비교한 결과를 나타낸다. 0 (증상없음), 1 (증상경미), 2 (증상중증), 3 (증상심각). DNFB; 0.3% DNFB + D.W, CM-169; 0.3% DNFB + 바실러스 서틸리스 SRCM100169 이용 청국장, CKJ; 0.3% DNFB + 시판 Cheongkukjang. * DNFB 군에 대한 P < 0.05.
도 3은 아토피 피부염 병변이 유발된 마우스에 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스 SRCM100169를 이용하여 제조한 청국장을 처리한 후, 마우스의 귀 두께를 측정한 결과이다. DNFB; 0.3% DNFB + D.W, CM-169; 0.3% DNFB + 바실러스 서틸리스 SRCM100169 이용 청국장, CKJ; 0.3% DNFB + 시판 Cheongkukjang.
도 4는 아토피 피부염 병변이 유발된 마우스에 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스 SRCM100169를 이용하여 제조한 청국장을 처리한 후, 마우스의 귀 두께 변화를 측정한 결과이다. DNFB; 0.3% DNFB + D.W, CM-169; 0.3% DNFB + 바실러스 서틸리스 SRCM100169 이용 청국장, CKJ; 0.3% DNFB + 시판 Cheongkukjang.
도 5는 아토피 피부염 병변이 유발된 마우스에 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스 SRCM100169를 이용하여 제조한 청국장을 처리한 후, 면역반응을 확인하기 위해 비장 수치를 비교한 결과이다. DNFB; 0.3% DNFB + D.W, CM-169; 0.3% DNFB + 바실러스 서틸리스 SRCM100169 이용 청국장, CKJ; 0.3% DNFB + 시판 Cheongkukjang. * DNFB 군에 대한 P < 0.05.
도 6은 아토피 피부염 병변이 유발된 마우스에 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스 SRCM100169를 이용하여 제조한 청국장을 처리한 후, 혈청 내 IFN-γ 측정 결과를 나타낸 것이다. DNFB; 0.3% DNFB + D.W, CM-169; 0.3% DNFB + 바실러스 서틸리스 SRCM100169 이용 청국장, CKJ; 0.3% DNFB + 시판 Cheongkukjang. * DNFB 군에 대한 P < 0.05.
도 7은 아토피 피부염 병변이 유발된 마우스에 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스 SRCM100169를 이용하여 제조한 청국장을 처리한 후, 혈청 내 IL-4 농도를 측정한 결과를 나타낸 것이다. DNFB; 0.3% DNFB + D.W, CM-169; 0.3% DNFB + 바실러스 서틸리스 SRCM100169 이용 청국장, CKJ; 0.3% DNFB + 시판 Cheongkukjang. * DNFB 군에 대한 P < 0.05.
도 8은 아토피 피부염 병변이 유발된 마우스에 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스 SRCM100169를 이용하여 제조한 청국장을 처리한 후, 귀 두께 변화를 나타낸 것이다. NOR; 정상군, DNFB; 0.3% DNFB + D.W, CM-169; 0.3% DNFB + 바실러스 서틸리스 SRCM100169 이용 청국장, CKJ; 0.3% DNFB + 시판 Cheongkukjang. * DNFB 군에 대한 P < 0.05.
도 9는 아토피 피부염 병변이 유발된 마우스에 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스 SRCM100169를 이용하여 제조한 청국장을 처리한 후, 귀 두께 변화에 대한 병리조직학적 관찰 결과를 나타낸다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 글루타메이트 생성능, 글루타민 생성능, 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 분비능, 항산화활성능, 항혈전능 및 항비만능이 우수한 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM 100169 균주(기탁번호: KCCM11956P)를 제공한다.
상기 균주는 순창전통 고추장에서 분리하였으며, 본 발명을 통해 글루타메이트 생성능, 글루타민 생성능, 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 분비능, 항산화활성능, 항혈전능 및 항비만능이 우수한 점을 확인하였고, 마지막으로 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCGB 159 균주로 동정하여 한국미생물보존센터(KCCM)에 2016년 12월 12일에 기탁하였다(기탁번호: KCCM11956P).
또한, 본 발명은 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM 100169 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 항아토피 활성이 우수한 청국장 제조용 스타터(starter) 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 청국장 제조용 스타터(starter)란 청국장 제조를 위해 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제 또는 조성물을 의미한다. 청국장 제조 시에 첨가함으로써 발효된 청국장에서 생장할 수 있는 미생물 또는 우점종으로 생장할 수 있는 미생물을 제공하기 위하여 사용된다. 상기 청국장 발효용 스타터를 사용하여 청국장를 제조하는 경우, 상기 청국장 발효용 스타터에 포함된 미생물에 의하여, 청국장의 품질을 일정하게 조절하거나, 특정한 목적, 일 예로 청국장에서 이취를 발생시키지 않거나, 감소시키는 목적 또는 청국장에서 구수한 맛이나 단맛을 강화시키기 위한 목적을 달성할 수 있다.
본 발명의 균주를 배양하는 방법은 당업계에 통상적으로 이용되는 방법에 따라 배양할 수 있으며, 특별한 방법에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 균주를 배양하는 단계에서 얻어지는 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 첨가제로 사용할 경우, 상기 균주 또는 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 배양액의 농축액을 그대로 첨가하거나 다른 첨가제를 함께 사용할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 청국장 제조용 스타터(starter) 조성물로 제조된 항아토피 활성이 우수한 청국장을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 항아토피 활성이 우수한 청국장을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 바람직하게는 건강기능식품은 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM 100169 균주를 함유하는 형태일 수 있으며, 또한 다른 식품의 첨가물로서도 이용될 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 식품은 기능성 식품을 포함할 수 있는데, 본 발명의 기능성 식품에는 상기 유효성분 외에도 필요에 따라 다양한 보조성분을 추가로 함유할 수 있다. 본 발명의 기능성 식품의 경우, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B12, 엽산 (folic acid), 비타민 C, 비타민 D3, 비타민 E 등의 비타민류와, 구리, 칼슘, 철, 마그네슘, 칼륨, 아연 등의 미네랄 또는 유산균 등을 포함할 수 있다.
또한 본 발명의 기능성 식품 중, 건강음료는 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 향미제로는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 들 수 있다. 천연 탄수화물로는 포도당, 과당 등의 단당류, 말토스, 수크로오스 등의 이당류, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등의 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알코올류 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험재료 및 방법
1. 바실러스 서틸리스 SRCM100169 의 특성 분석
(1) 아밀라제(Amylase) 및 프로테아제(protease) 활성 측정
전통 고추장 0.1g을 NB(Nutrient broth) 배지 1 mL에 현탁하였다. 시료 현탁액을 연속희석법(10-1~10-3)으로 희석한 후 NA(Nutrient agar) 배지에 도말하고, 37℃에서 18시간 동안 정치 배양한 뒤 배양된 플레이트로부터 특이적 콜로니를 임의 선별한 후 획선 도말에 의한 단일 콜로니를 분리하였다. 분리된 단일 콜로니는 NB 액체배지에 접종 후 37℃, 200 rpm, 18시간동안 진탕배양한 배양액과 멸균된 50% 글리세롤을 1:1 (v/v) 비율로 혼합 후 -80℃에서 보관하였다. 분리 균주의 동정은 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 위해 마크로젠(Macrogen)에 16S rRNA 유전자 염기서열 해독을 의뢰하고 유니버셜 프라이머인 27F(5'-GTT TGA TCC TGG CTC AG-3' : 서열번호 1)와 1492R(5'-TAC CTT GTT ACG ACT T-3' : 서열번호 2)을 사용하여 16S rRNA 염기서열 증폭한 후 Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit(Applied Biosystems Inc., USA)를 이용하여 염기서열 해독하여 크로마토그램을 이용해 갭(gap)을 최소화 후 BLASTN 검색과 RDP(Ribosomal Database Project), NCBI(National Center for Biotechnology Information)에서 서열 일치도가 높은 표준 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열을 얻었다. 서열 간의 상호 비교를 위해 CLUSTAL W를 사용하고, MEGA 프로그램에서 계통도 분석은 Tamura-Nei 모델에 기초한 Maximum Likelihood 방법을 사용하여 작성, 부트스트랩 분석을 1,000회 실행하였다.
선별된 균주의 아밀라제 및 프로테아제 효소활성을 확인하기 위해 전분(starch) 또는 스킴 밀크(skim milk)가 함유된 효소 활성 측정 배지(표 1)를 만들었다. 프로테아제 활성 측정 배지의 경우 스킴 밀크와 박토 아가(bacto agar)를 따로 제조하여 멸균한 뒤 혼합하여 사용하였다. 각각의 배지에 6mm 페이퍼 디스크 (ADVANTEC. 일본)를 올리고, NB 배지에서 37℃, 18시간 진탕 배양한 선별된 균주 배양액을 페이퍼 디스크 중앙에 20 ㎕ 분주하였다. 이를 37℃에서 48시간 배양한 후 균 집락의 지름과 투명환의 지름을 측정하여 아밀라제 및 프로테아제의 상대 활성도를 확인하였다.
아밀라제(또는 프로테아제) 상대 활성도 = 투명환의 지름/균 집락의 지름
아밀라제 또는 프로테아제 활성 측정용 배지 조성
배지 배지 조성 농도 (g/L)
전분 배지 전분 20
영양배지 4
박토 아가 15
스킴 밀크 배지 스킴 밀크 10
박토 아가 15
(2) 셀룰라제 ( Cellulase ) 효소 생산 균주 선발
셀룰라제 활성측정용 평판배지 조성은 다음과 같다: CMC(카르복시메틸 셀룰로스) (Sigma, USA) 1 g + 트립톤(Duchefa, The Netherlands) 2 g + 효모 추출물 (Duchefa, The Netherlands) 0.5 g + NaCl (Duchefa, The Netherlands) 1 g+ 아가 (BD. USA) 1.5 g + D.W. 100 mL.
균주는 NB에 접종하여 37℃, 200 rpm에서 18시간 동안 진탕배양한 후 16,000 x g에서 15분 동안 원심분리하여 상층액을 새로운 멸균 튜브에 취해서 조효소액으로 사용하였다. 상기 배지의 지정된 위치에 6 mm 페이퍼 디스크를 부착하여 지정된 위치의 디스크 중앙에 시험균주 배양 상층액을 20㎕를 분주하고 클린 밴치에서 30분간 두었다가 뒤집어서 37℃에서 18시간 정치배양 후 0.1% 콩고 레드 용액으로 15분 염색하고, 반응하지 않은 콩고 레드 용액을 제거 후, 배지를 증류수로 세척하였다. 세척 후 표면의 물기만 살짝 제거하고 투명환 크기를 측정하여 균 집락의 직경에 대한 투명환의 비율을 상대 활성도(>1 활성보유)로 하여 셀룰라제 활성을 평가하였다.
셀룰라제 효소 생산 검출 배지의 조성
배지 배지 조성 농도 (g/L)
셀룰라제 검출배지 CMC 10
트립톤 10
효모 추출물 5
NaCl 10
아가 15
(3) 글루타메이트 (Glutamate) 정량분석
글루타메이트는 다양한 식품에 존재하고, 식품 산업의 풍미 증강제로 사용되고 있다. 선발된 균의 산업적 이용을 위한 연구의 일환으로 글루타메이트 고생산능을 보유한 균주를 선발하고자 글루타메이트 분석 키트(K629-100, BioVision)를 사용하여 측정하였다. 원료 대두를 선별하여 이물질을 제거한 후 수세하여 물에 침지해서 불리고, 불린 콩 10알을 121℃에서 30분간 살균하여 사용하였다. 선발된 균주는 NB 배지에 접종하여 37℃에서 18시간 진탕배양한 후 콩 10알에 100㎕를 접종하여 37℃, 24시간 동안 배양하였다. 배양된 청국장에 5ml의 NB를 접종하고, 1ml을 취해 스핀다운한 액의 상등액을 실험원료로 사용하였다. 상등액 50 ㎕를 취해 96 웰 플레이트에 분주하였으며, 글루타메이트 표준용액을 농도별 희석하여 50 ㎕씩 분주하였다. 각각의 웰에 반응 버퍼 믹스(Assay Buffer 90 ㎕, Glutamate developer 8 ㎕, Glutamtate enzyme mix 2 ㎕) 100 ㎕를 분주한 뒤 37℃, 30분 동안 빛을 차단하며 반응시켰다. 반응 산물을 마이크로플레이트 리더에서 450㎚로 흡광도를 측정하고, 표준곡선에 비례하여 샘플의 글루타메이트 생성량을 정량 분석하였다.
(4) 글루타민( Glutamine ) 정량분석
글루타민 분석 키트 (EGLN-100, BioAssay Systems)를 사용하여 측정하였고, 방법은 위와 같다.
(5) 항산화활성( DPPH ) 분석
DPPH법에 의한 전자 공여능의 측정: 전자공여능(Electron donating ability, EDA)은 Blois 방법에 따라 측정, 각 시료 용액 100μL에 0.15mM로 에탄올 희석한 DPPH(2,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액 100μL을 넣고 교반한 후 30분간 방치한 다음 마이크로플레이트 리더를 이용해 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 전자공여능은 시료용액의 첨가군과 무첨가군의 흡광도 차이를 백분율로 나타내었다.
2. 바실러스 서틸리스 SRCM100169 를 이용한 청국장 제조 및 일반성분분석
(1) 청국장 제조
국산 대두(백태)를 구입하여 제조하였으며, 구입한 콩을 선별하여 물에 12시간 동안 수침시킨 후, 121℃, 30분간 멸균하여 40~45℃ 정도로 냉각 후 각 병에 균주를 대두량의 1%(v/v, OD 600nm, 0.3))가 되게 접종하였다. 항온 항습기에서 37℃, 습도 90%에서 48시간 발효시킨 후 이화학적 특성을 분석하였다. 또한 항비만, 항혈전 활성은 50℃에서 24~48시간 건조한 후 시료로 사용하였다.
(2) 일반성분 분석
수분함량은 수분측정기(FD-720, Kett Co., Japan)를 이용하여 측정하였고, pH는 시료 5g을 증류수 45ml에 희석하여 진탕시킨 후 pH 미터(Mettler Toledo GmbH, Swizerland)를 이용하여 측정하였다.
(3) 바실러스 세레우스 함량 분석
식약청 식품 공전법에 준하여 실험을 진행하였는데, 검체 50g에 450ml의 멸균 인산완충 희석액을 가하여 균질화시킨 후 시험용액으로 사용하였다. 멸균 인산완충 희석액을 사용하여 단계적으로 10배씩 희석하여 희석액을 만든 후 MYP 한천 평판배지에 시험용액 및 희석액을 0.1ml을 취하여 넣고 멸균된 유리봉을 사용하여 배지 표면에 고루 퍼지도록 분산시킨 후 30℃에서 24시간 배양한 후, 50~150개의 집락 주변에 레시티나아제(lecithinase)를 생성하는 혼탁한 환이 있는 분홍색 집락의 선별하여 균수를 계산하였다.
(4) 유리아미노산 분석
유리아미노산은 시료 2g을 취하여 3차 증류수 30ml을 넣고 교반한 후 50ml로 정용한 후 초음파를 이용하여 20분간 추출한 후 원심분리(3000rpm, 10분)한 다음 상등액 2ml을 5% TCA 2ml을 넣은 후 원심분리(10,000rpm, 10분)한 후 상등액을 취하여 0.02N-HCL로 희석한 후 0.2㎛ 시린지 필터에 통과시킨 후 아미노산 분석기로 분석하였다.
3. 바실러스 서틸리스 SRCM100169 및 청국장의 항비만 항혈전 특성
균주는 배양 상등액을 0.2㎛ 시린지 필터를 이용하여 여과액을 사용하였으며, 청국장은 증류수에 10배 희석 후 진탕배양기에서 30℃, 150rpm에서 1시간 동안 진탕시킨 후 원심분리하여 0.2㎛ 시린지 필터를 이용하여 여과액을 시료로 사용하였다.
(1) 항혈전 특성
Flbrin plate법을 이용하여 분석하였는데, 5 ml의 아가로스(2.0%)에 0.6% 피브리노겐 5 ml, 100 ㎕의 트롬빈(100 유닛)을 가하여 페트리디쉬에 분주하여 실온에서 30분간 방치하여 혈전용해효소 활성 측정에 사용하였다. 활성측정은 제조한 피브린 플레이트 표본에 멸균한 팁을 이용하여 5 mm의 구멍을 만든 후 구멍 안에 균주배양액을 60 ㎕를 분주하여 37℃에서 24시간 동안 반응시킨 후 구멍 주위에 생성되는 투명환의 직경을 측정하여 확인하였다.
(2) 항비만 활성
스피리트 블루 아가(Spirit blue agar)를 이용한 리파아제(lipase) 저해 활성을 분석하였는데, 35 g의 스피리트 블루 아가 배지(Difco)를 증류수 1 L에 녹여 멸균시킨 후 배지의 온도가 약 55~55℃가 되었을 때, 30 mL의 리파아제 용액을 혼합하였고, 각 배지 25 ml씩 플레이트에 분주하여 평판 배지를 제조하였다. 시료는 배양 상등액 100 ㎕를 접종하여 37℃에서 72시간 동안 배양한 후 리파아제 저해 활성을 확인하였다.
4. 바실러스 서틸리스 SRCM100169 균주를 이용한 청국장의 항아토피 효과
(1) 실험방법
가. 실험재료
본 실험에 사용한 청국장 국산 대두를 사용하였으며, 대두에 2배의 물을 첨가하고 24시간 침지한 후 121℃ 30분 증자한 후 방냉하여 균주를 대두 양의 0.5% (w/v)로 접종한 후 37℃ 온도, 80%의 습도에서 24시간 발효하였다. 발효된 각 청국장은 60℃에서 12시간 건조한 후 분쇄하여 사용하였다.
나. 실험동물
본 실험에서 사용한 실험동물은 4주령 수컷 Balb/c 마우스를 샘타코(Osan, Korea)에서 구입하여 일주일 간 순화기간을 거친 다음 사용하였다. Balb/c 마우스의 평균 무게는 17.83 ± 1.04 g으로 시료를 매일 1회 경구로 투여하였다. 실험동물 사육실은 12시간 간격으로 명암을 조절하였고, 온도는 23 ± 2℃, 습도는 50 ~ 60%를 유지하였다. 본 동물실험은 원광대학교 동물실험가이드(Guide for Animal Experimentation)를 준수하여 시행되었으며, 원광대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 시행하였다(Approval NO. WKU15-17).
다. 군 구성
실험동물은 4개 군으로 분류되었으며 어떤 처리도 하지 않은 왼쪽 귀를 정상군(NOR)으로 설정하고 오른쪽 귀에 DNFB를 도포하고 D.W를 경구 투여한 대조군(DNFB), 오른쪽 귀에 DNFB를 도포하고 시료투여군 바실러스 서틸리스 투여군( CM-169)와 시판되어 판매되는 청국장 투여군(CKJ)으로 분류하였다(표 3). 군 구성 마리수의 산정은 3R의 원칙에 준하여 통계적 의미를 가리는 최소수를 사용하였다. NOR 군과 DNFB 군은 D.W를 투여하였고, 각 시료를 1일 1회씩 경구투여하였다.
Group Left Right Meterial n
1 NOR Normal 0.3% DNFB1 ) D.W2 ) 3
2 DNFB Normal 0.3% DNFB D.W 3
3 CM-169 Normal 0.3% DNFB Bacillus subtilis 3
4 CKJ3 ) Normal 0.3% DNFB - 3
1) DNFB : 1-플루오로-2,4-디니트로벤젠
2) DW: 증류수
3) CKJ: 청국장
라. DNFB 제조 및 아토피 피부염 유발
Balb/c 마우스를 일주일간 순화 후 등(back) 부위를 제모하여 3일간 적응시켰다. DNFB(1-fluoro-2,4-dinitrobenzene; sigma, USA) 시약은 아세톤 : 올리브 오일 (4;1) 안에 0.5% DNFB를 희석시켜서 준비하였다. 제모 후 4일째 되는 날 등(back) 부위에 0.5% DNFB 20 ㎕ 4일간 도포하여 피부 감작(sensitization)을 유도하였다. 도포 후 4일째 되는 날 0.2% DNFB 귀(ear)에 20 ㎕ 도포(Challenge)하여 아토피 피부염을 유발시켰다.
마. 육안 평가
육안 평가는 아토피 피부염에서 일반적으로 사용되는 임상적 평가방법으로써 아토피 피부염 증상의 심각성 정도를 측정하기 위해 5가지 항목을 각각 평가한 점수의 총 합으로 나타내었다. 평가 항목은 홍반(erythema), 가려움과 피부건조(pruritus & dry skin), 부종과 혈종(edema & excoriation), 짓무름(erosion) 그리고 태선화(lichenification)이며 각각의 항목에 대해 증상 없음(0점), 약함(1점), 보통(2점), 심함(3점)으로 채점한 후, 합산하여 최소 0점에서 최고 15점 사이의 점수를 부여하였다.
바. 귀 두께 측정
DNFB 도포 후 피부조직의 변화를 측정하기 위해 마우스의 양쪽 귀를 측정하였다. 귀 두께는 vernier caliper (Mitutoyo Co., Japan)를 사용하여 도포(Challenge) 후 각각 12시간, 24시간, 48시간 시간 단위별 귀 두께 변화를 측정 하였다.
사. 비장 지수 (Spleen Index) 측정
귀 두께 측정 후 Balb/c 마우스를 희생시켜 비장을 적출하고 무게를 측정하였다. 비장 지수(spleen index)는 Balb/c 마우스의 비장 무게(mg)를 체중(g)으로 나누어 산출하였다.
아. 혈청 내 사이토카인 측정
혈청 내 사이토카인은 ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, USA)을 이용하여 IFN-γ, IL-4의 생성을 측정하였다. 항체가 붙어있는 각 웰 (R&D system, Mineapolis, USA)에 각 ADS[assay diluent solution] 50 μL를 첨가 후, 시료 50 μL를 각각 첨가하여 실온에 2시간 방치한 후, 세척 버퍼 400 μL로 4회 세척하였다. 세척 후 각 웰에 항체로 마우스 IFN-γ 및 IL-4 100 μL를 넣고 상온에서 2시간 배양 후, 제거하고 4회 세척하였다. 각 웰에 기질용액(Substrate solution) 100 μL를 넣고 30분 상온에 방치 후, 반응정지액(Stop solution) 100 μL를 첨가하여 Molecular Devices사의 ELISA reader(SPECTRA max M2, St. California, US)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
자. 병리조직학적 검사
시험 종료일에 채취한 귀(ear) 조직을 적출하여 생리식염수로 세척한 다음 여과지로 수분을 제거한 후 병리조직학적 검사를 위하여 적출된 간 조직의 일부를 10% 중성 포르말린에 고정하고, 병리조직학적 검사를 위한 통상적인 방법을 사용하여 파라핀 포매한 후, 4㎛의 두께로 절편한 뒤 슬라이드 제작한 후 H&E(hematoxyline & eosin) 염색을 마친 뒤 Olympus DP70 (Olympus optical. co, Japan) 광학 현미경으로 확인하였다.
차. 통계처리
본 실험에 얻어진 결과분석은 SPSS사(Chicago, St. IL, USA)의 SPSS(Statistical Package for Social Science, win 12.0 version) 프로그램을 이용하여 기술적인 통계치를 산출하였다. 평균±표준편차 (mean ± SD)로 나타내었다. 각 실험군별 평균±표준편차로 표시하였으며, 평균 간의 유의성은 Student's t-test와 One way ANOVA 검증을 통한 Duncan's multiple range test로 P < 0.05 수준에서 검증하였다
실시예 1. 바실러스 서틸리스 SRCM100169 균주 및 이를 이용하여 제조한 청국장의 다양한 활성 분석
본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스 SRCM100169 균주는 하기 표 4와 같이, 글루타메이트 생성능, 글루타민 생성능, 아밀라제, 프로테아제, 셀룰라제 분비능이 있으며, DPPH 활성, 항혈전 활성 및 항비만 활성을 가지는 것을 확인하였다.
바실러스 서틸리스 SRCM100169의 특성 분석 결과
SRCM NO. 바실러스 서틸리스 100169
동정명 바실러스 서틸리스
분리원 순창 고추장
글루타메이트 생성능(mg/g) 3594
글루타민 생성능(mg/g) 537.07
아밀라제(mm) 1.26
프로테아제(mm) 2.55
셀룰라제(mm) 2.85
DPPH 활성(%) 15.00
항혈전(cm) 1.0
항비만(cm) 1.0
또한, 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스 SRCM100169 균주를 이용하여 제조한 청국장의 특성을 살펴본 결과, 하기 표 5와 같이, 수분함량이 57.20%, pH 7.72, 적정산도는 1.47ml이며, 바실러스 세레우스는 검출되지 않았다 또한, 본 발명에서 분리한 바실러스 서틸리스 SRCM100169 균주를 이용하여 제조한 청국장의 유리아미노산 분석 결과는 표 6과 같으며, 항혈전 활성은 표 7과 같이 확인되었다.
바실러스 서틸리스 SRCM100169를 이용하여 제조한 청국장의 특성
균주 No. 바실러스 서틸리스 100169
수분(%) 57.20
pH 7.72
적정산도 (mL) 1.47
바실러스 세레우스 (CFU/g) ND
바실러스 서틸리스 SRCM100169를 이용하여 제조한 청국장의 유리아미노산 분석결과
Amino acid 100169 (mg/L)
1 Phosphoserine 37.0
2 Threonine 36.6
3 Glutamic Acid 160.1
4 Alanine 8.7
5 Valine 37.7
6 Cystine 212.6
7 Leucine 54.2
8 Phenylalanine 139.7
9 Ammonia 127.6
10 Lysine 1,697.7
11 Carnosine 1,797.4
12 Arginine 299.2
Total 4,608.5
바실러스 서틸리스 SRCM100169를 이용하여 제조한 청국장의 항혈전 활성
균주 No. A B C D 100169
항혈전(cm) - 0.5 - - 1.0
A: 순창콩청국장환, B: 낫또, C: 분말청국장환, D: 발효낫또환
실시예 2. 바실러스 서틸리스 SRCM100169 균주를 이용한 청국장의 항아토피 효과
(1) 육안 평가 결과
실험 종료 후 각 실험군별 시료를 처리한 오른쪽 귀 부위를 관찰하여 아토피 피부염 병변의 형태학적 변화를 확인하였다. DNFB를 처리한 대조군에서는 아무것도 처리하지 않은 왼쪽 귀에 비해 홍반, 피부건조, 짓무름, 부종과 혈종 등의 아토피성 피부 변화가 확인되었다(도 1). 아토피 피부염의 여러 증상들을 종합하여 관찰결과를 점수로 비교한 결과 대조군(DNFB) 4.80 ± 0.22, 시판청국장 투여군(CKJ) 3.89 ± 1.09로 대조군에 비해 육안점수가 감소되었으며, CM169 군의 경우 3.33 ± 0.78로 대조군에 비해 점수가 유의적으로 감소되었음을 확인하였다(도 2).
(2) 귀 두께 측정 결과
DNFB에 의해 아토피 피부염이 유발된 마우스 귀 두께를 측정한 결과는 다음과 같다(도 3 및 도 4). 대조군의 경우 DNFB 도포 후 48시간 후 처음과 비교하였을 때 귀 두께가 2.8배 증가하였다. 그러나, 대조군에 비해 CM169 군에서 귀 두께가 감소하였음을 알 수 있다.
(3) 비장지수 측정 결과
아토피 피부염 유발 후 시료 투여 후 면역반응을 확인하기 위해 비장 수치를 비교해 본 결과는 다음과 같다(도 5). 대조군(DNFB)은 0.36 ± 0.03으로 시료 투여군(CM169)보다 수치가 낮았으며, 시료 투여군(CM169)과 시판청국장 투여군(CKJ)에서 각각 0.41 ± 0.03, 0.40 ± 0.03으로 나타났다.
(4) 혈청 내 IFN 측정 결과
아토피 피부염 환자에서는 IFN-γ를 생성하는 T-cell의 손상에 의하여 IFN-γ 농도가 감소하는 것으로 알려져 있다. 혈청 내 IFN-γ 측정 결과는 다음과 같다(도 6). 시료 투여군(CM-169)에서 대조군인 DNFB군과 비교하였을 때 유의적인 혈청 내 IFN-γ의 농도의 증가를 나타내었다.
(5) 혈청 내 IL-4 측정 결과
DNFB를 통한 아토피성 피부염을 유발시킨 마우스에서의 혈청 내 IL-4의 농도를 측정한 결과는 다음과 같다(도 7). 시료 투여군(CM-169)에서 대조군인 DNFB군과 비교하였을 때 유의적인 혈청 내 IL-4의 농도의 감소를 나타내었다.
(6) 병리조직학적 분석 결과
DNFB를 통한 아토피성 피부염을 유발시킨 마우스에서 귀 두께 변화에 대한 병리조직학적 관찰 결과는 다음과 같다(표 8, 도 8 및 도 9). 시료 투여군(CM-169)에서 대조군인 DNFB군과 비교하였을 때 유의적인 귀 두께가 감소를 나타내었다.
아토피성 피부염을 유발시킨 마우스에서 바실러스 서틸리스 처리 청국장에 의한 귀 두께 변화에 대한 병리조직학적 관찰 결과
Group Ear thickness
NOR 76.12 ± 8.13
DNFB 1309.22 ± 53.41
CM-169 612.98 ± 25.79*
CKJ 1221.53 ± 45.16
NOR; 정상군, DNFB; 0.3% DNFB + D.W, CM-169; 0.3% DNFB + 바실러스 서틸리스 SRCM100169, CKJ; 0.3% DNFB + 청국장. * DNFB 군에 대한 P < 0.05.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11956P 20161212
<110> Microbial Institute for Fermentation Industry General Nature Co., Ltd. <120> Bacillus subtilis SRCM 100169 strain for making Cheongkukjang having excellent antiatopic activity as starter and uses thereof <130> PN16494 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gtttgatcct ggctcag 17 <210> 2 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 taccttgtta cgactt 16

Claims (4)

  1. 글루타메이트 생성능, 글루타민 생성능, 아밀라제, 프로테아제 및 셀룰라제 분비능, 항산화활성능, 항혈전능 및 항비만능이 우수한 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM 100169 균주(기탁번호: KCCM11956P).
  2. 제1항의 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SRCM 100169 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 항아토피 활성이 우수한 청국장 제조용 스타터(starter) 조성물.
  3. 제2항의 청국장 제조용 스타터(starter) 조성물로 제조된 항아토피 활성이 우수한 청국장.
  4. 제3항의 항아토피 활성이 우수한 청국장을 유효성분으로 함유하는 아토피 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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