KR102653994B1 - 숙성 육류에서 분리된 신규 유산균 및 이의 용도 - Google Patents

숙성 육류에서 분리된 신규 유산균 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 분해 활성, 면역증강 활성 및 프로바이오틱스 특성을 갖는 숙성 육류에서 분리한 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주는 단백질 분해 활성 및 면역 증강 효과를 나타내면서, 용혈 활성을 나타내지 않으면서 유해물질 및 유해효소 관련 유전자를 보유하지 않는 것으로 확인됨에 따라, 상기 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주는 다양한 프로바이오틱스, 기능성 식품 조성물 미 약학 조성물의 소재로 활용될 수 있다.

Description

숙성 육류에서 분리된 신규 유산균 및 이의 용도{Novel lactic acid bacteria isolated from aged meat and their use}
본 발명은 단백질 분해 활성, 면역증강 활성 및 프로바이오틱스 특성을 갖는 숙성 육류에서 분리한 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
유산균은 탄수화물을 이용하여 젖산을 생성하는 미생물로서 오랫동안 산업에 이용되어 왔으며, 발효공정을 통해 탄수화물과 단백질 및 지방성분 등을 분해하여 풍미를 증진시키고, 영양학적 가치를 높여준다. 락토바실러스(Lactobacillus)로 발효된 발효유의 섭취가 장수의 요인임이 밝혀진 이후로 유산균 및 프로바이오틱스의 기능성에 대한 연구가 지속되고 있다. 프로바이오틱스(Probiotics) 유산균은 체내에 들어가서 정장효과를 포함하는 유익한 기능성을 가지는 살아있는 균으로, 장내에서 젖산을 생성하여 장내환경을 산성으로 만들어 산성에 견디지 못하는 유해균을 억제시키고, 산성에서 생육이 잘 되는 유익균의 증식 여건을 조성하여 정상장내 세균총의 균형을 유지하고, 배변활동이 원활하게 도움을 줄 뿐 아니라 면역활성 증진, 항암 작용, 혈청 콜레스테롤 저하 등의 작용이 보고되고 있다.
또한, 발효공정을 통해서는 추가적으로 유당불내증을 개선하고, 면역기능 개선 등 다양한 효능을 기대할 수 있어 소비자들의 관심이 높으며, 이에 대한 다양한 연구가 진행되고 있다. 이와 같이 다양화되고 있는 제품 유형과 소비자 성향을 충족시켜주기 위해서는 우수한 프로바이오틱스의 지속적인 개발이 필요하다.
국내에서 사용되고 있는 유산균 종균의 경우, 대부분 수입에 의존하고 있는 실정으로 덴마크, 미국, 프랑스 및 독일 등 낙농선진국으로부터 수입하고 있는 실정이다. 이는 서구유럽의 유산균주 개량기술이 크게 앞서고 있기 때문으로 볼 수 있으며, 또한 국내적으로 산업적 이용가능한 유산균의 개발이 부족한 것도 유산균의 경쟁력 저하 요인으로 볼 수 있다.
한편, 2018 식품연감에 따르면 생활수준의 향상과 의료기술의 발달은 고령화 사회를 급속하게 구성시키고 있으며, 우리나라의 경우에도 2026년에 65세 이상의 노인인구의 비율은 전체 인구의 20.8%로 5명 중 1명이 노인이 되는 초고령사회에 도달할 것으로 예측되고 있다. 고령인구는 노화가 진행됨에 따라 인체를 구성하는 조직 및 기관의 생리적 기능은 성숙기에 비해 비가역적으로 저하되며, 이러한 신체변화에 따라 만성 퇴행성질환의 위험률이 증가하며, 저작장애, 연하장애, 소화흡수율 저하, 미각감소 등의 현상이 나타나게 된다. 이중 저작능력 저하는 섭취할 수 있는 음식에 제한이 생기고, 식사의 양과 질이 떨어질 수도 있는데, 발효유 소재는 섭취 용이성과 함께 영양을 효과적으로 제공해 줄 수 있을 것이며 특히, 단백질 분해특성이 우수한 유산균을 이용한 발효는 단백질과 같은 고분자물질의 저분자화로 소화용이성을 제공할 수 있을 것이다.
한국등록특허 제10-1750948호 (2017. 06. 26. 공고)
상기와 같은 문제점을 해결하기 위해, 본 발명의 목적은 단백질 분해 활성 및 면역 증강 효과를 나타내면서, 용혈 활성을 나타내지 않으면서 유해물질 및 유해효소 관련 유전자를 보유하지 않아 안전하여 프로바이오틱스, 기능성 식품 조성물, 및 약학 조성물의 소재로 활용할 수 있는 균주를 제공하는 것이다.
본 발명은 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주(수탁번호: KCTC 14637BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 면역증진용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 면역증진을 위한 건강기능 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 면역세포의 면역 활성을 증진시키는 시약 조성물을 제공한다.
본 발명에 따르면, 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주는 단백질 분해 활성 및 면역 증강 효과를 나타내면서, 용혈 활성을 나타내지 않으면서 유해물질 및 유해효소 관련 유전자를 보유하지 않는 것으로 확인됨에 따라, 상기 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주는 다양한 프로바이오틱스, 기능성 식품 조성물 미 약학 조성물의 소재로 활용될 수 있는 있다.
도 1은 숙성 육류 유래 단백질 분해 효소를 생산하는 저온 생육이 가능한 유산균을 분리한 결과이다.
도 2는 10% skim milk 액체 배지를 사용하여 숙성 육류 유래 단백질 분해 효소를 생산하는 저온 생육이 가능한 유산균을 분리한 결과이다.
도 3은 숙성 육류 유래 단백질 분해 효소를 생산하는 저온 생육이 가능한 유산균의 종명을 동정하기 위해 작성된 계통수이다.
도 4는 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주의 유전자 지도를 나타내는 그림이다.
도 5는 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주의 용혈성을 평가한 결과이다.
도 6은 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주의 항생제 감수성을 평가한 결과이다.
도 7은 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주의 면역 증진 효과를 평가한 결과이다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명자들은 이와 같은 점을 감안하여 본 발명자들은 저온 숙성된 육류에서 분리된 균주들 중에서 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주가 단백질 분해 활성 및 면역 증강 효과를 나타내면서, 용혈 활성을 나타내지 않으면서 유해물질 및 유해효소 관련 유전자를 보유하지 않는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주(수탁번호: KCTC 14637BP)를 제공한다.
상기 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주는 2021년 7월 14일 한국생명공학연구원 생물자원세터(KCTC)에 기탁하여 기탁번호 KCTC 14637BP를 부여받았다.
상기 균주는 단백질 분해 효소 유전자를 보유하고 있으면서 유해물질 및 유해효소 관련 유전자를 보유하지 않는 것을 특징으로 하며, 상기 단백질 분해 효소는 프로테아제(Protease)이다. 상기 프로테아제(protease)는 단백질분해효소로 단백질을 이루고 있는 아미노산간의 펩티드 결합을 가수분해하는 효소이며, 어떤 단백질 분해효소의 경우 단백질의 아미노 말단이나 (aminopeptidase), 카르복실 말단을 (carboxypeptidase) 자르는 엑소펩티다아제(exopeptidase) 가 있고, 어떤 경우는 단백질의 중간을 자르는 엔도펩티다아제(endopeptidase, 예, 트립신, 케모트립신, 펩신, 파페인, 엘라스테아제) 가 있다.
상기 유해 물질 및 유해 효소는 획득형 항생제내성 유전자, 독성유전자, 및 용혈소 유전자이며, 상기 균주는 이러한 유해 물질 및 유해 효소를 암호화하는 유전자를 보유하지 않는 것으로 확인되었다.
상기 균주는 면역세포의 활성을 증진시키는 활성을 나타내며, 상기 면역세포는 대식세포, B 세포, T 세포, 수지상 세포 등을 포함할 수 있으며, 상기 면역세포의 활성을 증진시키는 것은 각 면역세포가 면역 반응을 수행하기 위해 분비하는 사이토카인의 양을 증진시키는 것일 수 있으며, 구체적으로, 상기 면역세포는 대식세포이고, 사이토카인의 종류는 TNF-α 및 INF-β일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제를 제공한다.
상기 프로바이오틱스는 살아 있는 균 즉, 사람이나 동물이 섭취했을 때 위장관에 머물러 생존할 수 있는 미생물로서 특정 병리 상태를 예방하거나 치료할 수 있는 효과가 있는 미생물 제제를 말한다. 일반적으로 프로바이오틱스는 장내 세균 총의 이상 발효에 의하여 야기되는 제반 증상을 치료하고 개선하는 효과가 있으며 사람 및 동물에 투여되면 장내의 소화관 벽에 밀집, 정착하여 유해 미생물이 정착하지 못하게 하는 작용을 하며 유산을 생성하여 장내 pH를 낮추어서 유해 미생물의 증식을 억제한다.
상기 프로바이오틱스 제제는 상기 균주 배양액에는 균주가 생산해 낸 여러 항균성 유기산 및 비단백질성 항균 물질들이 포함되어 있어 생균제 조성물의 유효성분으로 포함되었을 때 균주를 포함한 조성물과 동등한 효과를 나타낼 수 있다.
상기 프로바이오틱스 제제는 당업계에 공지된 방법에 따라 다양한 제형과 방법으로 제조 및 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 락토바실러스 플란타룸 JDFM LP11 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 또는 그의 건조물은 약제학적 분야에서 통상적으로 사용되는 담체와 혼합하여 산제(powder), 액제(liquids and solutions), 정제(tablet), 캡슐(capsule), 시럽(syrup), 현탁제(suspension) 또는 과립제(granule) 등의 형태로 제조되어 투여될 수 있다. 상기 담체로는 예를 들어, 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소 및 향료 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 투여 용량은 체내에서의 활성 성분의 흡수도, 불활성률, 배설속도, 피투여자의 연령, 성별, 축종, 상태 및 질병의 중증 정도 등에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 배양액은 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주를 배양한 인공 배지일 수 있고, 상기 인공배지는 유산균 및 세균을 배양할 수 있는 상업적으로 제조되는 합성 배지일 수 있으며, 예컨대, TBS(Tryptic Soy Broth), TSB(Tryptic Soy Broth) NB(Nutrient Broth), LB(Luria-Bertani broth)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 발효물은 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주를 이용하여 발효된 천연 배지일 수 있으며, 상기 천연 배지는 유산균 및 세균으로 발효될 수 있는 천연물을 의미하며, 예컨대 감자, 토마토, 우유와 같은 자연산물을 이용한 배지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배양액의 농축액은 상기 배양액 자체로부터 파생되는 가공물을 포함하며, 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체 및 기능성 성분만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 포함하는 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있는 과정을 수행하여 농축된 물질을 의미한다.
상기 배양액의 건조물은 상기 배양액 자체로부터 파생되는 가공물을 포함하며, 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체 및 기능성 성분만을 회수하기 위해 원심분리, 여과과정, 및 동결건조 등의 당업자가 필요에 따라 수행할 수 있는 과정을 수행하여 건조된 물질을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 면역증진용 조성물을 제공한다.
상기 면역증진용 조성물은 당업자가 필요에 따라 약학적 조성물에 포함할수 있으며, 상기 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물에 포함되는 첨가제의 함량은 특별히 한정되는 것은 아니며 통상의 제제화에 사용되는 함량 범위 내에서 적절하게 조절될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 정제, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 외용제 형태로 제형화될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 제형화를 위해 추가로 있는 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 전분, 당, 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 및 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제, 포비돈, 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 및 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체 및 희석제는 대상체에게 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제의 예로는 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다. 경구 투여일 경우, 정제, 트로키제 (troches), 로젠지 (lozenge), 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭시르제 등으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여일 경우, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등으로 제형화 될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태 및 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이 체질 특이성, 제제의 성질, 질병의 정도, 조성물의 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율, 및 약물 형태에 따라 그 범위가 다양할 수 있으며, 이 분야 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대, 약 0.1 내지 10,000 mg/kg의 범위일 수 있으나 이제 제한되지 않으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여되거나 비경구 투여(예를 들면, 정맥 내, 피하 내, 복강 내 또는 국소에 적용)될 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 약학적 유효량, 유효 투여량은 약학적 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간 및/또는 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 면역증진을 위한 건강기능 식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 통상적으로 이용되는 식품으로써 일반적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 "건강기능 식품"이라 함은 건강기능 식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 "식품 첨가물"로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 "식품 첨가물 공전"에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
예를 들어, 캡슐 형태의 건강기능 식품 중 경질캡슐제는 통상의 경질캡슐에 본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합 및 충진하여 제조할 수 있으며, 연질캡슐제는 본 발명에 따른 조성물의 부형제 등의 첨가제와 혼합하고 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질캡슐제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 면역세포의 면역 활성을 증진시키는 시약 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 숙성된 육류로부터 유산균의 분리
충청남도 공주시의 식당으로부터 숙성 전 한우와 4℃에서 60일간 저온 숙성된 한우를 수집하였다. 각각의 소고기를 멸균수에 혼합하여 마쇄한 후 멸균 생리식염수(0.85% NaCl)를 이용하여 단계적으로 희석한 후, 100μL를 취해 MRS(Lactobacilli MRS agar, Difco) 평판배지에 도말하여 20℃와 37℃에서 배양하였다. 배양 후에 형성된 콜로니는 pH indicator인 0.006% BCP(Bromocresol Purple, Sigma, St. Louis, MO, USA)가 첨가된 MRS 평판배지에 1차적으로 도말하여 20℃와 37℃에서 24시간 동안 배양하여 BCP의 보라색 배지가 노란색으로 변하는 콜로니 23종을 유산균으로 선별하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 선별된 유산균 중 저온에서 생육이 가능하며, 단백질 분해 효소를 생산하는 유산균을 선별하기 위하여 분리 균주들을 BCP와 Skim milk가 혼합된 평판배지에 도말하여 4℃와 20℃에서 24시간 동안 배양 후 4℃와 20℃에서 생육이 가능하고 노란색으로 변하며 투명환을 형성하는 콜로니 8종을 선별하였다.
도 2에 나타난 바와 같이, 선별된 8종의 유산균 중에서 단백질 분해 효소를 생산하는 유산균을 선별하기 위하여 3차적으로 10% Skim milk 액체배지에 접종하여 4℃와 20℃에서 배양하며 4℃와 20℃에서 Skim milk를 응고 또는 분해하는 L13 균주를 최종적으로 선별하였다.
실시예 2. 분리 균주의 동정
상기 실시예 1에서 분리 선별된 균주의 분자학적 동정 및 계통수 작성을 위해, ㈜마크로젠에 의뢰하여 16S rRNA 염기서열을 분석하였다. 염기서열 분석결과를 NCBI(National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA)의 뉴클레오티드 BLAST를 사용하여 GeneBank에 등록된 염기서열과 상동성을 비교하였다. 염기서열은 표준균주의 염기서열을 확보하여 Genetyx program을 사용하여 염기서열간 상호비교 후 Kimura 2-parameter method와 Neighbor-joining 알고리즘을 사용하여 계통도를 작성하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 선별된 L13 균주는 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)으로 동정되었다. 상기 동정 과정은 2020년 유전체 기반으로 Lactobacillus 속에 속하는 종들에 대해서 재분류한 자료를 기반하였으며, 2021년 03월 30일 식품의약품안전처에서 식품의 기준 및 규격 일부개정고시에 따라 수행되었으며, 최종적으로 선별된 L13 균주를 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2로 명명하였고, 2021년 7월 14일 한국생명공학연구원 생물자원세터(KCTC)에 기탁하여 기탁번호 KCTC 14637BP를 부여받았다.
실시예 3. 분리 균주의 유전체 수준의 안전성 검증
상기 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주가 유전체 수준에서 안전성이 있는지 확인하기 위해 ㈜천랩에 의뢰하여 전장유전체를 분석하였다. 분리균주의 유전체를 PacBio_20K와 MiSeq을 활용하여 염기서열을 분석하고, 분석 결과를 MaSuRCA-3.3.9를 이용하여 어셈블리 수행하였다. 도 4 및 표 1에 나타난 바와 같이, 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주의 전장 유전체 분석 결과 GC 함량 44.24% 및 3,418,157 bp의 크로모좀 DNA(chromosomal DNA)를 가지며 5개의 플라스미드로 구성되어 있는 것으로 확인되었다. 또한, 표 2에 나타난 바와 같이, 13개의 단백질 분해 효소 유전자를 보유하는 것으로 확인되었다. 또한, 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주의 유전체 수준에서 유해인자를 확인한 결과, 획득형 항새제내성 유전자를 보유하고 있지 않았으며, 독성유전자 및 용혈인자 유전자를 보유하고 있지 않은 것으로 확인되었다.
Features Value
Genome size (bp) 3,418,157
G+C content (%) 44.24
Open reading frames 3,219
CDS assigned by COG 2,809
rRNA genes 16
tRNA genes 69
Feature name Product Length EC
KM2_00434 Protease HtpX like protein 900 3.4.24.-
KM2_00464 ATP-dependent zinc metalloprotease FtsH 2238 3.4.24.-
KM2_00824 ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit ClpC1 2505
KM2_00990 ATP-dependent protease 744
KM2_01056 ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit ClpA like protein CD4A, chloroplastic 2067
KM2_01370 Rhomboid protease 684 3.4.21.105
KM2_01603 ATP-dependent protease ATPase subunit HslU 1419
KM2_01766 Probable protease eep 1278 3.4.24.-
KM2_01884 ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit ClpX 1266
KM2_02065 Probable inactive metalloprotease YmfF 1266 3.4.24.-
KM2_02777 Putative membrane protease YugP 699
KM2_03019 ATP-dependent Clp protease ATP-binding subunit ClpL 2115
KM2_03309 ATP-dependent protease 309
실시예 4. 분리 균주의 용혈성 확인
상기 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주의 용혈성을 확인하기 위해, TSA(Tryptic soy agar; BD, Difco)에 5% 토끼 혈액(MB Cell, Korea) 또는 5% 양 혈액(MB Cell, Korea)을 첨가하여 혈액 아가 배지를 제조하였다. 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주를 획선 도말하여 37℃에서 24시간 배양 후 균체 주위에 생기는 투명환의 형성으로 용혈성을 확인하였다. 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) USA300 균주는 양성대조군으로 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus) RN4220 균주는 음성대조군으로 사용하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주는 혈액배지에서 용혈현상을 나타내지 않는 것으로 확인되었다.
실시예 5. 분리 균주의 항생제 감수성 확인
상기 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주의 항생제 감수성을 임상 및 실험실 표준 연구소(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)의 지침에 따라 Muller-Hinton 한천배지(BD, Difco)에서 디스크 확산법(diffusion method)을 사용하여 평가하였다. Muller-Hinton 한천배지에 8종류의 항생제가 포함된 디스크를 올려놓고 30℃에서 24 시간 배양하였다. 각 항생제에 대한 억제환 크기를 측정하고 CLSI(Clinical Laboratory Standards Institute)에 의해 감수성과 내성을 확인하였다. 사용한 항생제는 Oxoid사(Basingstoke, Hants, UK)의 암피실린 (ampicillin, 10 ug), 클로람페니콜 (chloramphenicol, 30 ug), 클린다마이신(clindamycin, 10 ug), 에리스로마이신(erythromycin, 15 ug), 겐타마이신(gentamicin, 30 ug), 페니실린 G(penicillin G, 10 ug), 스트렙토마이신(streptomycin, 300 ug), 및 테트라마이신(tetracycline, 30 ug) 총 8종을 사용하였다. 도 6에 나타난 바와 같이, 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주는 암피실린 (ampicillin), 클로람페니콜 (chloramphenicol), 클린다마이신(clindamycin), 에리스로마이신(erythromycin), 겐타마이신(gentamicin), 페니실린 G(penicillin G), 스트렙토마이신(streptomycin), 및 테트라마이신(tetracycline) 총 8종의 항생제에 대해서 민감성을 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 6. 분리 균주의 면역증강 활성 평가
상기 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주의 면역증강 효과를 확인하기 위해, 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주가 면역세포의 사이토카인 분비에 미치는 영향을 평가하였다.
마우스 대식세포(RAW 264.7)를 사용하여 초기 면역반응에서 중요한 역할을 하는 사이토카인인 TNF-α(tumor necrosis factor-α)와 바이러스 및 미생물 감염에 대한 방어 면역 반응에서 중요한 역할을 하는 INF-β(Interferon-β)의 분비능을 측정하였다. 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주의 배양 상등액은 1% FBS(Fetal Bovine Serum) 및 1% 항생제(Antibiotics)가 함유된 DMEM 배지를 사용하여 최종 농도가 4%가 되도록 희석하여 세포에 처리하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 24 시간 배양하였다. 배양 후에 상등액으로 분비된 TNF-α와 INF-β의 양을 OptEIATM ELISA kit (BD Biosciences, SanDiego, CA, USA)을 이용하여 측정하였다. 측정시료는 SpectraMax 190 Microplate Reader (Molecular Devices, US)를 이용하여 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 450 nm에서 흡광도를 측정하여 얻어진 O.D 값을 표준물질을 이용해 작성한 표준곡선과 비교하여 TNF-α 및 INF-β의 양을 측정하였다. 표준물질로는 recombinant mouse TNF-α 및 INF-β를 사용하였으며 얻은 표준곡선과 비교하여 계산하였다. TNF-α 및 INF-β 분비능의 양성대조구 물질로는 lipopolysaccharide (LPS)를 사용하였다.
도 7에 나타난 바와 같이, 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주의 배양 상등액을 대식세포에 처리한 경우, 대식세포에서 분비되는 사이토카인인 TNF-α 및 INF-β의 분비량이 처리 상등액 농도의 의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
한국생명공학연구원 KCTC14637BP 20210714

Claims (7)

  1. 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주(수탁번호: KCTC 14637BP)로서,
    상기 균주는 숙성된 육류로부터 분리되어 4℃에서 생육 및 단백질 분해능이 있는 것을 특징으로 하는 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 단백질 분해 효소 유전자를 보유하는 것을 특징으로 하는 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주(수탁번호: KCTC 14637BP).
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주는 면역세포의 활성을 증진시키는 것을 특징으로 하는 락티플랜티바실러스 플란타룸 (Lactiplantibacillus plantarum) KM2 균주(수탁번호: KCTC 14637BP).
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 제제로서,
    상기 균주는 숙성된 육류로부터 분리되어 4℃에서 생육 및 단백질 분해능이 있는 것을 특징으로 하는 프로바이오틱스 제제.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 면역증진용 조성물로서,
    상기 균주는 숙성된 육류로부터 분리되어 4℃에서 생육 및 단백질 분해능이 있는 것을 특징으로 하는 면역증진용 조성물.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 면역증진을 위한 건강기능 식품 조성물로서,
    상기 균주는 숙성된 육류로부터 분리되어 4℃에서 생육 및 단백질 분해능이 있는 것을 특징으로 하는 건강기능 식품 조성물.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주, 이의 배양액, 이의 발효물, 상기 배양액의 농축액, 상기 배양액의 건조물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 면역세포의 면역 활성을 증진시키는 시약 조성물로서,
    상기 균주는 숙성된 육류로부터 분리되어 4℃에서 생육 및 단백질 분해능이 있는 것을 특징으로 하는 시약 조성물.
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