KR102654005B1 - 항염증 효능이 있는 락티플랜티바실러스 플란타룸 km2 균주 발효 배양상등액의 마이크로바이옴 조성물 - Google Patents

항염증 효능이 있는 락티플랜티바실러스 플란타룸 km2 균주 발효 배양상등액의 마이크로바이옴 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항염증 효능이 있는 락티플랜티바실러스 플란타룸 KM2(Lactiplantibacillus plantarum KM2) 균주 발효 배양상등액의 마이크로바이옴 조성물에 관한 것으로, 상기 균주의 발효 배양상등액이 산화질소(nitric oxide) 활성을 억제하고, 염증성 사이토카인 발현을 조절하는 등 항염증 활성을 나타내는 것을 확인함으로써, 염증성 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물로써 유용하게 활용될 수 있다.

Description

항염증 효능이 있는 락티플랜티바실러스 플란타룸 KM2 균주 발효 배양상등액의 마이크로바이옴 조성물{Microbiome composition of Lactiplantibacillus plantarum KM2 strain fermented culture supernatant with anti-inflammatory effect}
본 발명은 항염증 효능이 있는 락티플랜티바실러스 플란타룸 KM2(Lactiplantibacillus plantarum KM2) 균주 발효 배양상등액의 마이크로바이옴 조성물에 관한 것이다.
염증은 물리적인 외상, 유해한 화학물질, 미생물에 의한 감염이나 생체 내 대사산물 중의 자극성 물질에 의하여 야기되는 조직손상에 반응해 국소적으로 나타나는 정상적이고 보호적인 생체 내 방어기전의 발현이다. 이러한 염증은 손상조직과 이동하는 세포(migrating cells)로부터 생산되는 다양한 화학매개인자에 의하여 촉발되며, 이들 화학매개인자들은 염증과정의 형태에 따라 매우 다양한 종류가 있는 것으로 알려져 있다. 정상적인 경우에 생체는 염증 반응을 통하여 발병 요인을 중화하거나 제거하고 상한 조직을 재생하여 정상적인 구조와 기능을 회복한다.
그러나 이러한 염증 반응이 비정상적으로 발생될 경우에는 만성 염증과 같은 질환으로 진행되기도 하며, 꽃가루와 같이 무해한 물질이나 천식, 류마티스성 관절염과 같은 자가 면역반응에 의해 부적절하게 염증이 촉발되는 경우에는 방어반응 자체가 오히려 조직을 손상시켜 다양한 질병을 일으킨다.
현재 염증 질환을 치료하기 위한 가장 일반적인 염증성 질환 예방 또는 치료제로 크게 스테로이드성 및 비스테로이드성 치료제가 사용되고 있으나, 대부분 부작용이 나타난다는 문제점이 있어, 상기 문제점을 극복한 염증성 질환 치료제 개발이 활발히 진행 중인 상황이다.
1. 대한민국 공개특허 KR 10-2022-0039617(2022.03.29. 공개)
본 발명의 목적은 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 염증성 질환 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) 균주의 발효 배양상등액, 이의 농축액, 이의 건조물, 이의 발효 대사산물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주의 발효 배양상등액, 이의 농축액, 이의 건조물, 이의 발효 대사산물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 정상군과 비교해서, 웨이즈만니아 코아굴란스(weizmannia coagulans), 클로스트리디움 스포로제니스(clostridium sporogenes) 및 클로스트리디움 부티리쿰(clostridium butyricum)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균주 수가 감소한 염증성 질환 환자군; 또는 정상군과 비교해서, 비피도박테리움 슈도롱검(bifidobacterium pseudolongum) 균주 수가 증가한 염증성 질환 환자군에 제1항의 약학 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 락티플랜티바실러스 플란타룸 KM2(Lactiplantibacillus plantarum KM2) 균주의 발효 배양상등액이 산화질소(nitric oxide) 활성을 억제하고, 염증성 사이토카인 발현을 조절하는 등 항염증 활성을 나타내는 것을 확인함으로써, 염증성 질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물로써 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 대식세포에서 락티플랜티바실러스 플란타룸 KM2(Lactiplantibacillus plantarum KM2) 균주의 발효 배양상등액(이하 샘플이라 함)의 세포독성을 분석한 결과이다.
도 2는 대식세포에서 샘플이 산화질소(nitric oxide; 이하 NO라 함) 생성에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 3은 대식세포에서 샘플이 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2; 이하 PGE2라 함) 생성에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 4는 대식세포에서 샘플이 iNOS(Inducible nitric oxide synthase) 및 COX-2(Cyclooxygenase-2) 발현에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 5는 대식세포에서 샘플이 전염증성 및 항염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 6은 장내 상피세포에서 샘플이 TEER(Trans-epithelial electrical resistance)에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 7은 장내 상피세포에서 샘플이 세포주위 투과성(paracellular permeability)에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 8은 대식세포에서 샘플이 장 접합 단백질 발현에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 9는 동물모델에서 샘플이 체중 및 질병 활성도에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 10은 동물모델에서 샘플이 대장 길이에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 11은 동물모델에서 샘플이 염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 12는 동물모델에서 샘플이 장 조직에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
도 13은 동물모델에서 샘플이 장내 미생물에 미치는 영향을 분석한 결과이다.
모든 도면에서 서로 다른 알파벳(ex. a, b 등)으로 표시된 처리군 간에는 95% 신뢰수준에서 통계적으로 차이가 있음을 나타낸다. 예를 들어, a로 표시된 1그룹, b로 표시된 2그룹 및 ab로 표시된 3그룹이 있는 경우, 1그룹 및 3그룹 간에는 95% 수준에서 통계적 차이가 있고, 1그룹 및 2그룹 간; 및 2그룹 및 3그룹 간에는 통계적 차이가 없음을 의미한다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) 균주의 발효 배양상등액, 이의 농축액, 이의 건조물, 이의 발효 대사산물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 균주는 기탁번호 KCTC 14637BP로 기탁된 락티플랜티바실러스 플란타룸 KM2(Lactiplantibacillus plantarum KM2) 균주일 수 있다.
상기 염증성 질환은 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 궤양성 십이지장염(ulcerative duodenitis), 크론병(Crohn's disease), 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome), 장형 베체트병(Intestinal Behcet's disease), 출혈성 직장 궤양(hemorrhagic rectal ulcer), 회장낭염(pouchitis), 장염(enteritis), 허혈성 대장염(ischemic colitis), 여드름, 장외증상(extra-intestinal manifestations) 피부염, 아토피 피부염, 알레르기 피부염, 지루성 피부염, 구진상 두드러기, 습진, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 홍채염, 인후염, 편도염, 폐렴, 췌장염, 위염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 루프스, 섬유근통, 건선, 류마티스 관절염, 골관절염, 골다공증, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 락티플랜티바실러스 플란타룸 KM2(Lactiplantibacillus plantarum KM2) 균주의 사균 또는 포자를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 웨이즈만니아 코아굴란스(weizmannia coagulans), 클로스트리디움 스포로제니스(clostridium sporogenes), 클로스트리디움 부티리쿰(clostridium butyricum) 및 비피도박테리움 슈도롱검(bifidobacterium pseudolongum)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 장내 미생물을 조절할 수 있다.
또한, 상기 약학 조성물은 프로스타글란딘 E2(Prostaglandin E2), iNOS(Inducible nitric oxide synthase), COX-2(Cyclooxygenase-2), IL-1β(Interleukin-1β), TNF-α(tumor necrosis factor-α) 및 IL-6(Interleukin-6)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생성 또는 발현을 억제하거나, ZO-1, Occludin, Claudin-1 및 IL-10(Interleukin-10)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 생성 또는 발현을 촉진할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물에 포함되는 첨가제의 함량은 특별히 한정되는 것은 아니며 통상의 제제화에 사용되는 함량 범위 내에서 적절하게 조절될 수 있다.
상기 약학 조성물은 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 정제, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 피부 외용제 형태로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 제형화를 위해 추가로 있는 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제는 전분, 당 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌글리콜과 같은 윤활제, 포비돈 및 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제는 대상체에게 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제의 예로는 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다. 경구 투여일 경우, 정제, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽, 엘릭시르제 등으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여일 경우, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등으로 제형화 될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이 체질 특이성, 제제의 성질, 질병의 정도, 조성물의 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율 및 약물 형태에 따라 그 범위가 다양할 수 있으며, 이 분야 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대, 약 0.1 내지 10,000mg/kg의 범위일 수 있으나 이제 제한되지 않으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여되거나 비경구 투여(예를 들면, 정맥 내, 피하 내, 복강 내 또는 국소에 적용)될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 약학적 유효량 및 유효 투여량은 약학 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간, 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다.
또한, 본 발명은 락티플랜티바실러스 플란타룸(Lactiplantibacillus plantarum) 균주의 발효 배양상등액, 이의 농축액, 이의 건조물, 이의 발효 대사산물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 균주는 기탁번호 KCTC 14637BP로 기탁된 락티플랜티바실러스 플란타룸 KM2(Lactiplantibacillus plantarum KM2) 균주일 수 있다.
본 발명은 통상적으로 이용되는 식품으로써 일반적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 “건강기능식품”이라 함은 건강기능 식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, “기능성”이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
상기 건강기능식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 “식품 첨가물”로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다. 예를 들어, 캡슐 형태의 건강기능 식품 중 경질 캡슐제는 통상의 경질 캡슐에 본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합 및 충진 하여 제조할 수 있으며, 연질 캡슐제는 본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합하고 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캡슐제 는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의 는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 통상적인 의미에서의 건강 기능식품을 모두 포함한다.
본 발명에서 용어“예방”은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 염증성 질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어 “치료”는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 염증성 질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.
본 발명에서 용어 “개선”은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 염증성 질환의 나쁜 상태를 좋게 하는 모든 행위를 말한다.
또한, 본 발명은 정상군과 비교해서, 웨이즈만니아 코아굴란스(weizmannia coagulans), 클로스트리디움 스포로제니스(clostridium sporogenes) 및 클로스트리디움 부티리쿰(clostridium butyricum)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균주 수가 감소한 염증성 질환 환자군; 또는 정상군과 비교해서, 비피도박테리움 슈도롱검(bifidobacterium pseudolongum) 균주 수가 증가한 염증성 질환 환자군에 상기 약학 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
[실험예 1] 샘플 제조
본 실험의 샘플인 KM2 균주(Lactiplantibacillus plantarum KM2)의 발효 배양상등액을 제조하기 위해, -70℃에 보관중인 KM2 stock 균주를 활성화하여 test tube 및 플라스크에서 1차 종배양을 거친 후, 50L 발효조에서 20L 작업용적(working volume)에 2%(v/v) 접종하여 6시간 동안 2차 종배양을 수행하였다. 본 배양은 500L 발효조에서 350L 작업용적에 2%(v/v) 접종하여 12시간 배양을 수행하였고, 배양 6시간 시점에 글루코스(glucose)를 1회 추가 피딩(feeding)하였다. 배양 종료 후 디스크(disk) 원심분리기에서 7200rpm 및 2L/min 조건으로 1차 원심분리하여 cell slurry를 제거하고, 상등액은 tubular 원심분리기로 15000rpm 및 1.5L/min 조건으로 2차 원심분리하여 cell cake를 제거하고 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액은 0.2μm 제균 필터를 통해 여과하여 최종적으로 균체를 제거한 KM2 균주의 발효 배양상등액을 얻었다. 상기 제균한 발효 배양상등액에 트레할로스(trehalose)를 부형제로 3%(w/v) 첨가하여 96~120시간 동결건조하여 분말화한 발효 배양상등액을 얻었다.
[실험예 2] 세포 배양
마우스 유래 대식세포주인 Raw 264.7 세포는 한국세포주은행(Korean cell line bank, KCLB)에서 분양받아 사용하였다. 세포를 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin; 이하 P/S라 함)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지를 이용하여 5% CO2 및 37℃ 조건의 배양기에서 2일에 한 번씩 계대 배양하였다.
돼지 장내 상피세포인 IPEC-J2 세포는 독일생물자원센터(the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, DSMZ)에서 분양받아 사용하였다. 세포를 10% FBS 및 1% P/S를 첨가한 DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle's Medium-Nutrient-Mixture F-12 medium) 배지를 이용하여 5% CO2 및 37℃ 조건의 배양기에서 2일에 한 번씩 계대 배양하였다.
[실험예 3] 동물모델 준비
C57BL/6 마우스를 오리엔트바이오에서 구입하였다. 마우스 개체수 확인, 일반증상 관찰, 체중측정 및 동물공급업체에서 제공한 검사성적서 확인을 통해 건강한 동물을 실험에 사용하였다. 모든 동물은 이상 여부를 확인하고, 동물실 환경에 적응하기 위해 7일 간 순화(적응) 기간을 두었다. 순화 기간에 모든 동물을 매일 1회 일반증상을 관찰하고, 순화종료일에 체중변화를 확인하여 동물의 건강상태를 평가하였다. 각 실험군의 평균체중이 균등하도록 각 군당 9마리씩 총 4군으로 분리하였다. 동물의 꼬리에 오색 유성펜을 이용하여 개체표시를 하고, 사육상자에는 개체 식별카드를 부착하였다. 동물모델을 온도 20~26℃, 상대습도 30~70% 및 명암주기 12시간/일(오전 9시~오후 9시) 조건에서 사육하였고, 사료 및 음수를 공급하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(Lab DFiet #5053 PMI Nutrition International, U.S.A.)를 자유 급여하였다. 동물실험은 한국식품산업클러스터진흥원 동물실험윤리위원회(IACUC-22-014)의 승인을 받아 수행하였다.
[실험예 4] 통계 분석
모든 실험 결과는 평균±표준오차(mean±SEM)으로 표시하였고, 모든 통계분석은 SAS(release 9.4 SAS Institute Inc., Cary, NC, USA) 프로그램을 사용하였다. 실험군 간의 유의적 차이(p<0.05)는 one-way ANOVA 및 Duncan's multiple range test를 사용하여 분석하였다.
[실시예 1] 샘플의 생리활성 분석( in vitro )
1-1. 세포독성 분석
대식세포 및 장내 상피세포에서 샘플의 세포독성을 확인하기 위해, EZ-Cytox kit(DAEIL lab, Korea)를 이용하여 대조군(샘플 미처리군; control)에 대한 샘플 처리농도별 흡광도의 감소를 기반으로 세포생존율에 영향을 미치는 샘플의 농도를 결정하였다. Raw 264.7 및 IPEC-J2 세포를 각각 96 웰 플레이트에 1×104 cells/well 밀도로 시딩(seeding)하고, 5% CO2 및 37℃ 조건의 배양기에서 24시간 배양한 후, 샘플를 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 그 후, 배양액을 제거하고 DMEM 90μL 및 EZ-Cytox 시약 10μL를 혼합하여 분주하고, 암실 상태에서 5% CO2 및 37℃ 조건의 배양기에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 마이크로플레이트리더를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하고, 하기 수학식 1을 이용하여 세포생존율을 측정하였다.
[수학식 1]
세포 생존율 = (대조군의 흡광도) / (샘플 처리군의 흡광도) × 100
그 결과, 도 1과 같이, Raw 264.7 세포의 경우, 0.1~50㎕/㎖ 샘플 처리군에서 유의한 세포독성이 나타나지 않았고, IPEC-J2 세포의 경우, 0.1~10㎕/㎖ 샘플 처리군에서 유의한 세포독성이 나타나지 않았다. 상기 결과를 토대로, 세포독성이 나타나지 않은 농도 구간에서 샘플의 생리활성에 대한 실험을 수행하였다.
1-2. NO 생성 분석
샘플이 NO(Nitric oxide) 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해, NO(nitric oxide) assay kit(Promega Corp, USA, Cat.#G2930)를 이용하여 NO 활성을 측정하였다. Raw 264.7 세포를 24 웰 플레이트에 2.5×105 cells/well 밀도로 시딩(seeding)하고, 5% CO2 및 37℃ 조건의 배양기에서 24시간 배양한 후, 1% FBS 및 1% P/S를 첨가한 DMEM 배지를 사용하여 (Escherichia coli 055:B5 유래의) LPS(Lipopolysaccharides, Sigma-Aldrich, USA) 1㎍/㎖ 및 샘플을 농도별로 희석하여 24시간 배양하였다. 그 후, 세포 배양 시 생성되는 NO 양을 측정하였다. NO 생성량은 kit 프로토콜에 따라 세포 배양액 50μL 및 Griess reagent(Sigma-Aldrich Co.) 100μL를 혼합하여 실온에서 10분간 반응시켰다. 발색된 반응액의 흡광도를 마이크로플레이트리더를 이용하여 520nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선을 이용하여 아질산염 농도를 계산하였다.
그 결과, 도 2와 같이, 대조군(LPS 및 샘플 미처리군) 대비 LPS 단독 처리군에서 NO 생성이 유의하게 증가하였고, LPS 단독 처리군 대비 샘플 처리군에서 NO 생성이 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다.
1-3. PGE2 생성 억제 활성 분석
샘플이 PGE2(Prostaglandin E2) 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해, Raw 264.7 세포를 24 웰 플레이트에 2.5×105 cells/well 밀도로 시딩(seeding)하고, 5% CO2 및 37℃ 조건의 배양기에서 24시간 배양한 후, 1% FBS 및 1% P/S를 첨가한 DMEM 배지를 이용하여 (Escherichia coli 055:B5 유래의) LPS(Lipopolysaccharides, Sigma-Aldrich, USA) 1μg/ml 및 샘플을 농도별로 희석하여 24시간 배양하였다. 그 후, 각 세포배양액을 취하여 13000rpm에서 10분 원심분리하고, 원심분리를 통해 얻은 상층액의 PGE2 함량을 측정하였다. 모든 샘플은 정량 전까지 -20℃에서 냉동보관하였고, PGE2는 mouse enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit(Cat.# KGE004B, R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 정량하였으며 standard에 대한 표준곡선의 R2값은 0.99 이상이었다.
그 결과, 도 3과 같이, 대조군(LPS 및 샘플 미처리군) 대비 LPS 단독 처리군에서 PGE2 생성이 유의하게 증가하였고, LPS 단독 처리군 대비 샘플 처리군에서 PGE2 생성이 유의하게 감소하였다.
1-4. iNOS 및 COX-2 발현 억제 활성 분석
샘플이 iNOS(Inducible nitric oxide synthase) 및 COX-2(Cyclooxygenase-2) 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해, qPCR을 수행하였다. Raw 264.7 세포로부터 총 RNA를 분리하기 위해, Trizol reagent kit(Invitrogen, USA)를 사용하였고, 100% 이소프로판올(Isopropanol)을 사용하여 RNA를 침전시킨 후 75% 에탄올로 세척하였다. 추출한 RNA는 핵산분해효소를 제거한 증류수에 용해한 후, 나노분광광도계를 사용하여 농도를 측정하였다. cDNA는 Maxime RT pre-Mix(Oligo dt 15 Primer) (iNtRON Biotechnology, Korea)를 사용하여 제조사가 제공한 방법에 따라 합성하였다. iNOS(NCBI Gene ID : 396859) 및 COX-2(NCBI Gene ID : 808504)의 유전자 발현을 분석하기 위해, KAPA SYBR fast qPCR Kit(KAPA biosystems, USA)를 사용하였다. qPCR 조건은 95℃에서 5분간 1사이클(cycle), 96℃에서 20초 동안 35사이클, 60℃에서 20초, 72℃에서 20초 및 72℃에서 5분간 1사이클로 설정하였다. 데이터 분석에는 제조업체(Roche Applied Science)에서 제공한 Light Cycler 96 소프트웨어를 사용하였다. 정량 결과는 2-ΔΔCT 법(Livak & Schmittgen, 2001)을 이용하여 참조 mRNA(GAPDH)와 비교하여 나타냈다.
그 결과, 도 4와 같이, 대조군(LPS 및 샘플 미처리군) 대비 LPS 단독 처리군에서 iNOS 및 COX-2 발현이 유의하게 증가하였고, LPS 단독 처리군 대비 샘플 처리군에서 iNOS 및 COX-2 발현이 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다.
1-5. 전염증성 및 항염증성 사이토카인 생성 분석
샘플이 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 및 항염증성 사이토카인(anti-inflammatory cytokine) 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해, IL-1β(NCBI Gene ID : 16176)(Interleukin-1β, Cat.# MLB00C), TNF-α(NCBI Gene ID : 21926)(tumor necrosis factor-α, Cat.# MTA00B), IL-6(NCBI Gene ID : 16193)(Interleukin-6, Cat.# DY406-05) 및 IL-10(NCBI Gene ID : 16153)(Interleukin-10, Cat.# M1000B-1) ELISA kit를 이용하여 상기 사이토카인의 생성량을 측정하였다. kit의 프로토콜대로 Raw 264.7 세포 배양상등액을 사용하여 실험을 실시하였다. 발색된 반응액의 흡광도를 마이크로플레이트 리더를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준곡선을 이용하여 각 사이토카인 농도를 계산하였다.
그 결과, 도 5와 같이, 대조군(LPS 및 샘플 미처리군) 대비 LPS 단독 처리군에서 IL-1β, IL-6 및 TNF-α 생성이 유의하게 증가하였고, LPS 단독 처리군 대비 샘플 처리군에서 상기 3종의 사이토카인 생성이 유의하게 감소하였다. 또한, LPS 단독 처리군 및 샘플 처리군에서 IL-10 생성이 유의하게 증가하였고, LPS 단독 처리군 대비 샘플 처리군에서 IL-10 생성 증가가 더 유의하게 나타났다.
1-6. TEER(Trans-epithelial electrical resistance) 분석
샘플이 TEER(Trans-epithelial electrical resistance)에 미치는 영향을 확인하기 위해, Millicell-ERS-2 장비(Millipore, MA, USA)를 사용하여 0.4μm 트랜스웰(transwell) 멤브레인(Corning, NY,USA)에서 배양된 IPEC-J2 세포 단층의 TEER을 분석하였다. IPEC-J2 세포를 2×105 세포/웰 밀도로 24 트랜스웰에 분주하고, 24시간 동안 37℃ 및 5% CO2 조건에서 배양하였다. 그 후, 상단 웰은 500μL의 농도별 샘플로 교체하고, 하단 웰은 1.5mL 배지로 대체한 후, 플레이트를 24시간(37℃, 5% CO2 및 95% 습도) 동안 추가로 배양했다. 그 후, HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)에 용해된 (Escherichia coli 055:B5 유래의) LPS(Lipopolysaccharides, Sigma-Aldrich, USA) 1㎍/mL 농도로 처리하고, TEER은 Miller-ERS 장비(Millipore, MA, USA)를 사용하여 샘플 처리 직후부터 시간별로 TEER 값을 각각 측정하였다. TEER 값은 하기 수학식 2를 이용하여 계산하였다.
[수학식 2]
TEER = resistance(Ohm) × filter area(㎠) = Ω × ㎠
그 결과, 도 6과 같이, 모든 실험군에서 시간 경과에 따라 TEER 값이 감소하였고, LPS 단독 처리군에서 TEER 값 감소가 가장 유의하게 나타났으며, LPS 단독 처리군 대비 샘플 처리군에서 TEER 값 감소가 억제되는 것을 확인하였다.
1-7. 세포주위 투과성 분석
샘플이 세포주위 투과성(paracellular permeability)에 미치는 영향을 확인하기 위해, IPEC-J2 세포에 48시간 동안 LPS 1㎍/mL를 처리한 후, 4kDa FITC-dextran(Sigma-Aldrich, USA)을 사용하여 세포주위 투과성을 측정하였다. 상기 LPS를 처리한 세포에 FITC-dextran을 HBSS에 녹여 1mg/ml의 농도로 상단 웰에 분주하고, 4시간 동안 배양한 후, Tecan Reader(excitation, 492nm; emission, 520nm, Tecan Group Ltd., Switzerland)를 사용하여 세포주위 투과성을 측정하였다.
그 결과, 도 7과 같이, 대조군(LPS 및 샘플 미처리군) 대비 LPS 단독 처리군에서 FITC-dextran의 flux가 유의하게 증가하였고, LPS 단독 처리군 대비 샘플 처리군에서 FITC-dextran의 flux가 농도 의존적으로 유의하게 감소하였다.
1-8. 장 접합 단백질 발현 분석
샘플이 장 접합 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해, LPS로 48시간 배양한 IPEC-J2 세포를 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)로 1회 세척하고, 각 웰당 PRO-PREP 시약 100~150㎕를 분주한 후, 스크래퍼(scraper)를 사용하여 세포를 튜브(tube)에 회수하였다. 회수한 세포는 얼음 위에서 30분 동안 방치 후 13000rpm 및 4℃ 조건에서 5분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 그 후, 상기 상등액을 Bradford assay를 통해 단백질을 정량하고, 50㎍ 단백질을 8% SDS-PAGE를 이용하여 분리한 후, PVDF 멤브레인(Polyvinylidene Fluoride membrane)으로 transfer하였다. 그 후, Blocking buffer(4% nonfat dry milk, 10mM Tris, 100mM NaCl 및 0.1% Tween 20, pH 7.5)를 이용하여 1시간 동안 블로킹(blocking)하고, 1% Tween 20-PBS로 15분씩 3회 세척하였다. ZO-1(NCBI Gene ID : 100736682), Occludin(NCBI Gene ID : 397236), Claudin-1(NCBI Gene ID : 100625166) 및 β-actin 항체(1차 항체)로 실온에서 3시간 동안 처리하고, 1% Tween 20-PBS로 세척하였다. 그 후, 2차 항체로 1~2시간 동안 처리하고, 세척 후 detection을 위해 ECL(enhanced chemiluminenscence) kit를 사용하여 LAS 4000 기기로 ZO-1(Zonula occludens-1), Occludin 및 Claudin-1의 단백질 발현 정도를 측정하였다.
그 결과, 도 8과 같이, 대조군(LPS 및 샘플 미처리군) 대비 LPS 단독 처리군에서 ZO-1, Occludin 및 Claudin-1의 단백질 발현이 감소하였고, LPS 단독 처리군 대비 샘플 처리군에서 상기 3종의 단백질 발현이 농도 의존적으로 증가하였다.
[실시예 2] 샘플의 생리활성 분석( in vivo )
2-1. 장염 유도 동물모델 제작
장염 유도 동물모델을 제작하기 위해, 상기 실험예 3의 동물모델에 3% DSS(Dextran sulfate sodium salt)를 음수로 제공하여 장염을 유도하였다. 양성대조군으로 5-ASA(5-aminosalicyclic acid) 50mg/kg을 사용하였고, 샘플 및 5-ASA는 경구투여용 존데를 부착한 일회용 주사기(1㎖)를 이용하여 3% DSS 섭취 개시일로부터 매일 1회씩 5주 동안 동물모델의 위 내에 경구투여하였다. 실험군은 구체적으로 하기와 같이 설정하였다.
1) 정상군(CON)
2) 음성대조군(DSS) : 3% DSS 섭취
3) 양성대조군(DSS+ASA) : 3% DSS 섭취 + 5-ASA 50mg/kg 경구투여
4) 샘플 처리군(DSS+KM2) : 3% DSS 섭취 + 샘플 2g/kg 경구투여
2-2. 체중 및 질병 활성도 분석
샘플이 체중 및 질병 활성도(DAI score; Disease activity index score)에 미치는 영향을 확인하기 위해, 5주(DSS 섭취 기간) 동안 매일 1회/일 동물모델의 체중을 측정하고, 혈변키트를 사용하여 변 상태(분변 형태 및 혈변의 색)를 확인하여 질병 활성도(분변 형태, 혈변의 색 및 체중감소)를 측정하였다.
그 결과, 도 9와 같이, 대조군(CON) 대비 음성대조군(DSS)에서 체중이 감소하였고, 음성대조군 대비 양성대조군(DSS+ASA) 및 샘플 처리군(DSS+KM2)에서 체중이 증가하였다. 또한, 장염 유도(DSS 섭취) 5일 차부터 음성대조군, 양성대조군 및 샘플 처리군에서 체중감소 및 혈변 발생이 유의하게 증가하여 대조군 대비 질병 활성도가 증가하였고, 음성대조군 대비 양성대조군 및 샘플 처리군에서 질병 활성도가 감소하였다.
2-3. 대장 길이 분석
샘플이 대장 길이에 미치는 영향을 확인하기 위해, 동물모델을 24시간 절식하여 희생시키고, 해부하여 심장에서 채혈한 후 육안적으로 외관, 복강 및 흉강을 관찰하였다. 그 후, 대장을 적출하여 대장 길이를 측정하였다.
그 결과, 도 10과 같이, 대조군(CON) 대비 음성대조군(DSS)에서 대장 길이가 유의하게 감소하였고, 음성대조군 대비 양성대조군(DSS+ASA) 및 샘플 처리군(DSS+KM2)에서 대장 길이가 증가하였다.
2-4. 혈액생화학적 분석(염증성 사이토카인 생성 분석)
샘플이 염증성 사이토카인 생성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 동물모델을 희생시키고, 심장에서 혈액을 채취하여 즉시 원심분리하고 혈청을 분리한 후, 분리한 혈청은 분석 전까지 -80℃의 초저온 냉동고에서 보관하였다. 그 후, 분광광도계(spectrophotometer) 및 분석 키트를 이용하여 사이토카인 함량을 측정하였다.
그 결과, 도 11과 같이, 대조군(CON) 대비 음성대조군(DSS)에서 IL-6, IL-1β 및 TNF-α 생성이 유의하게 증가하였고, IL-10 생성이 유의하게 감소하였다. 반면, 음성대조군 대비 양성대조군(DSS+ASA) 및 샘플 처리군(DSS+KM2)에서 IL-6, IL-1β 및 TNF-α 생성이 유의하게 감소하였고, IL-10 생성이 유의하게 증가하였다.
2-5. 조직학적 분석
샘플이 장 조직에 미치는 영향을 확인하기 위해, 동물모델의 대장조직을 10% 포름알데하이드(formaldehyde)로 고정하고, 파라핀 블록을 제작하여 H&E(Hematoxylin & Eosin) 염색을 수행하였다. 염색된 조직 슬라이드를 촬영 후 이미지 정량 분석을 수행하였다. 또한, 알리샨 블루(alcian blue) 염색을 수행하여 장의 점액 분비 정도를 분석하였다.
그 결과, 도 12와 같이, 대조군(CON) 대비 음성대조군(DSS)에서 결장 표면을 형성하는 상피조직의 구조 및 크기가 불규칙하게 변하고, 염증세포의 침윤이 증가하였다. 반면, 음성대조군 대비 양성대조군(DSS+ASA) 및 샘플 처리군(DSS+KM2)에서 상기 음성대조군에서 나타나는 증상이 개선되는 것을 확인하였다. 또한, 점막층이 파란색으로 염색된 대조군 대비 음성대조군에서는 파란색으로 염색된 정도가 감소한 반면, 음성대조군 대비 양성대조군 및 샘플 처리군에서는 파란색으로 염색된 정도가 증가하였다.
2-6. 장내 미생물 분석
샘플이 장내 미생물에 미치는 영향을 확인하기 위해, 동물모델을 희생시키고, 맹장을 적출한 후, shotgun metagenome sequencing을 이용하여 장내 미생물 변화를 분석하였다.
그 결과, 도 13과 같이, 한 샘플 내 존재하는 미생물의 다양성을 확인할 수 있는 α-diversity 분석 결과에서 Shannon index는 실험군간 유의한 차이가 나타나지 않음을 확인하였다. 또한, 염증 수치인 F/B(Firmicutes/Bacteroidetes) 비율도 실험군간 유의한 차이가 나타나지 않았다. 미생물 군집 방식을 확인할 수 있는 unweighted UniFrac 주 좌표 분석(principal coordinate analysis; PCA) 기반의 β-diversity 분석 결과에서는 실험군간 유의한 차이가 나타났다. 각 실험군간 유의하게 다른 마이크로바이옴을 식별하기 위해, 선형판별분석(linear discriminant analysis; LDA) 및 KEGG pathway 분석을 수행한 결과, 도 13과 같이, 음성대조군(DSS) 대비 샘플 처리군(DSS+KM2)에서 웨이즈만니아 코아굴란스(weizmannia coagulans), 클로스트리디움 스포로제니스(clostridium sporogenes) 및 클로스트리디움 부티리쿰(clostridium butyricum) 균주 수가 유의하게 증가하였다. 또한, 샘플 처리군 대비 음성대조군에서 비피도박테리움 슈도롱검(bifidobacterium pseudolongum) 균주 수가 유의하게 증가하였다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.
한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC14637BP 20210714

Claims (8)

  1. 기탁번호 KCTC 14637BP로 기탁된 락티플랜티바실러스 플란타룸 KM2(Lactiplantibacillus plantarum KM2) 균주의 발효 배양상등액, 이의 농축액, 이의 건조물, 이의 발효 대사산물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로써,
    상기 염증성 질환은 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 궤양성 십이지장염(ulcerative duodenitis), 크론병(Crohn's disease), 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome), 장형 베체트병(Intestinal Behcet's disease), 출혈성 직장 궤양(hemorrhagic rectal ulcer), 회장낭염(pouchitis), 장염(enteritis), 허혈성 대장염(ischemic colitis), 여드름, 장외증상(extra-intestinal manifestations) 피부염, 아토피 피부염, 알레르기 피부염, 지루성 피부염, 구진상 두드러기, 습진, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 홍채염, 인후염, 편도염, 폐렴, 췌장염, 위염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 루프스, 섬유근통, 건선, 류마티스 관절염, 골관절염, 골다공증, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이고,
    상기 약학 조성물은 웨이즈만니아 코아굴란스(weizmannia coagulans), 클로스트리디움 스포로제니스(clostridium sporogenes) 및 클로스트리디움 부티리쿰(clostridium butyricum)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균주의 장 내 상대적 풍부도(relative abundance)를 증가시키거나, 비피도박테리움 슈도롱검(bifidobacterium pseudolongum) 균주의 장 내 상대적 풍부도(relative abundance)를 감소시키는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 약학 조성물은 락티플랜티바실러스 플란타룸 KM2(Lactiplantibacillus plantarum KM2) 균주의 사균 또는 포자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  5. 삭제
  6. 기탁번호 KCTC 14637BP로 기탁된 락티플랜티바실러스 플란타룸 KM2(Lactiplantibacillus plantarum KM2) 균주의 발효 배양상등액, 이의 농축액, 이의 건조물, 이의 발효 대사산물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 염증성 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로써,
    상기 염증성 질환은 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 궤양성 십이지장염(ulcerative duodenitis), 크론병(Crohn's disease), 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome), 장형 베체트병(Intestinal Behcet's disease), 출혈성 직장 궤양(hemorrhagic rectal ulcer), 회장낭염(pouchitis), 장염(enteritis), 허혈성 대장염(ischemic colitis), 여드름, 장외증상(extra-intestinal manifestations) 피부염, 아토피 피부염, 알레르기 피부염, 지루성 피부염, 구진상 두드러기, 습진, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 홍채염, 인후염, 편도염, 폐렴, 췌장염, 위염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 루프스, 섬유근통, 건선, 류마티스 관절염, 골관절염, 골다공증, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상이고,
    상기 건강기능식품 조성물은 웨이즈만니아 코아굴란스(weizmannia coagulans), 클로스트리디움 스포로제니스(clostridium sporogenes) 및 클로스트리디움 부티리쿰(clostridium butyricum)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균주의 장 내 상대적 풍부도(relative abundance)를 증가시키거나, 비피도박테리움 슈도롱검(bifidobacterium pseudolongum) 균주의 장 내 상대적 풍부도(relative abundance)를 감소시키는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
  7. 삭제
  8. 정상군과 비교해서, 웨이즈만니아 코아굴란스(weizmannia coagulans), 클로스트리디움 스포로제니스(clostridium sporogenes) 및 클로스트리디움 부티리쿰(clostridium butyricum)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균주 수가 감소한 인간을 제외한 염증성 질환을 가진 포유류; 또는 정상군과 비교해서, 비피도박테리움 슈도롱검(bifidobacterium pseudolongum) 균주 수가 증가한 인간을 제외한 염증성 질환을 가진 포유류에 제1항의 약학 조성물을 처리하는 단계를 포함하는, 염증성 질환 예방 또는 치료 방법으로써,
    상기 염증성 질환은 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 궤양성 십이지장염(ulcerative duodenitis), 크론병(Crohn's disease), 과민성 대장 증후군(irritable bowel syndrome), 장형 베체트병(Intestinal Behcet's disease), 출혈성 직장 궤양(hemorrhagic rectal ulcer), 회장낭염(pouchitis), 장염(enteritis), 허혈성 대장염(ischemic colitis), 여드름, 장외증상(extra-intestinal manifestations) 피부염, 아토피 피부염, 알레르기 피부염, 지루성 피부염, 구진상 두드러기, 습진, 천식, 결막염, 치주염, 비염, 중이염, 홍채염, 인후염, 편도염, 폐렴, 췌장염, 위염, 치질, 통풍, 강직성 척추염, 루프스, 섬유근통, 건선, 류마티스 관절염, 골관절염, 골다공증, 간염, 방광염, 신장염, 쇼그렌 증후군 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 염증성 질환 예방 또는 치료 방법.
KR1020230138331A 2022-10-18 2023-10-17 항염증 효능이 있는 락티플랜티바실러스 플란타룸 km2 균주 발효 배양상등액의 마이크로바이옴 조성물 KR102654005B1 (ko)

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KR20220039617A (ko) 2020-09-21 2022-03-29 국민바이오 주식회사 숙성 육류에서 분리된 신규 유산균 및 이의 용도
KR20220135180A (ko) * 2021-03-26 2022-10-06 서울대학교산학협력단 유산균의 생리활성 효능 증진용 조성물

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