KR102154255B1 - 유산균을 함유하는 미세먼지 자극에 의한 호흡기 질환 또는 염증 질환 치료용 조성물 - Google Patents

유산균을 함유하는 미세먼지 자극에 의한 호흡기 질환 또는 염증 질환 치료용 조성물 Download PDF

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김재영
김현수
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Abstract

본 발명은 호흡기 질환 치료 또는 개선 효과가 우수한 신규한 수탁번호 KCCM12698P로 기탁된 Lactobacillus plantarum GCWB1001 균주, 수탁번호 KCCM12699P로 기탁된 Pediococcus acidilactici GCWB1085 균주, 또는 수탁번호 KCCM12700P로 기탁된 Lactobacillus rhamnosus GCWB1156 균주를 제공한다.
또한, 상기 신규한 균주 중 어느 하나를 포함하는 염증 질환 또는 호흡기 질환의 치료 또는 개선효과가 있는, 약학적 조성물, 건강기능성 식품 조성물 및 프로바이오틱스를 제공한다.

Description

유산균을 함유하는 미세먼지 자극에 의한 호흡기 질환 또는 염증 질환 치료용 조성물{Composition for prevention or treatment of respiratory diseases or inflammation induced by particulate matter comprising novel lactic acid bacteria}
본 발명은 호흡기 질환 또는 염증질환의 치료 또는 예방 효과를 갖는 신규한 유산균 및 이를 포함하는 약학적 조성물, 건강기능성 식품 조성물 및 프로바이오틱스에 관한 것이다.
미세먼지는 대기 중에 떠다니거나 흩날려 내려오는 10 ㎛ 이하의 입자상 물질로 먼지 직경에 따라 구분하는 PM10은 1,000분의 10 ㎜보다 작은 입자이고, PM2.5는 1,000분의 2.5 ㎜보다 작은 입자를 의미한다.
미세먼지의 발생원인으로는 사업장 연소, 자동차 연료 연소 과정 등의 인위적 배출원에서 직접 배출되거나, 황산화물(SOx), 질소산화물(NOx), 암모니아(NH3), 휘발성유기화합물(VOCs) 등의 물질이 대기 중에서 수증기 등과 반응하여 생성되는 2차 생성 과정에 의해 생성된다.
미세먼지는 입자가 미세하여 코점막을 통해 걸러지지 않고 흡입 시 폐포 또는 뇌까지 직접 침투가 가능하다고 알려져 있고, 천식, 폐질환 유병률 및 조기사망률을 증가시킨다고 알려져 있다.
특히 세계보건기구(WHO) 산하 국제암연구소(IARC)에서는 2013년 미세먼지를 벤젠, 석면 등과 함께 인간에게서 암을 일으키는 것으로 확인된 1군 발암물질로 분류하였다.
사람을 포함한 동물의 위장관 내에서 숙주의 장내 미생물 환경을 개선하여 숙주의 건강에 유익한 영향을 주는 살아있는 미생물을 통칭하여 프로바이오틱스라고 한다.
프로바이오틱스의 일종인 유산균(lactic acid bacteria)은 인체의 소화계에 공생하면서 섬유질 및 복합 단백질들을 분해하여 중요한 영양 성분으로 만드는 역할을 수행한다. 유산균은 탄수화물을 분해하고, 이를 이용하여 유산을 만드는 세균으로서, 산소가 적은 곳에서 잘 증식하는 혐기성균이다. 유산균은 크게 5개 속으로 구분할 수 있는데, 스트렙토코커스(Streptococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 루코노스탁(Leuconostoc), 비피도박테리아(Bifidobacteria) 그리고 페디오코커스(Pediococcus)로 분류된다. 최근 유산균을 이용한 다양한 질환에 대한 치료효과를 확인하고, 이를 이용한 치료제 개발이 시도되고 있다.
미세먼지는 종래 세균이나 일시적인 중독 또는 다른 물질의 기도 유입에 의한 호흡기 및 폐 손상과 달리 인체 면역력으로 퇴치할 수 없고,　미세먼지가 호흡기를 통해 유입되면 강제로 배출할 방법도 없다. 또한, 이러한 손상으로 언제 어떤 문제가 발생할지 정확히 알지 못하고 있으므로,　미세먼지로 인해 유도된 기도와 폐의 손상을 예방, 완화, 치료 또는 개선할 수 있고, 이를 통해 유도된 호흡기 질환을 치료할 수 있는 새로운 치료제에 대한 요구가 절실한 실정이다.
1. 대한민국 등록특허 제10-1912258호(2018.10.29.) 락토바실러스 카세이 균주를 포함하는 미세먼지 독성에 대한 세포 및 조직 보호용 조성물. 2. 대한민국 등록특허 제10-2021881호(2019.09.17.) 스트렙토코커스 써모필러스 LM1012 균주 및 이를 포함하는 염증 질환 또는 대사 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
본 발명은, 수탁번호 KCCM12698P로 기탁된 신규한 락토바실러스 플란타럼 GCWB1001(Lactobacillus plantarum GCWB1001) 균주, 수탁번호 KCCM12700P로 기탁된 락토바실러스 람노서스 GCWB1156(Lactobacillus rhamnosus GCWB1156) 균주, 수탁번호 KCCM12699P로 기탁된 페디오코커스 에시디락티시 GCWB1085(Pediococcus acidiclactici GCWB1085) 균주, 및 이를 포함하는 염증 질환 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여
본 발명은, 수탁번호 KCCM12698P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼 GCWB1001(Lactobacillus plantarum GCWB1001) 균주를 제공한다.
본 발명은 수탁번호 KCCM12700P로 기탁된 락토바실러스 람노서스 GCWB1156(Lactobacillus rhamnosus GCWB1156) 균주를 제공한다.
본 발명은 수탁번호 KCCM12699P로 기탁된 페디오코커스 에시디락티시 GCWB1085(Pediococcus acidiclactici GCWB1085) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 수탁번호 KCCM12698P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼 GCWB1001(Lactobacillus plantarum GCWB1001) 균주, KCCM12700P로 기탁된 락토바실러스 람노서스 GCWB1156(Lactobacillus rhamnosus GCWB1156) 균주, 또는 수탁번호 KCCM12699P로 기탁된 페디오코커스 에시디락티시 GCWB1085(Pediococcus acidiclactici GCWB1085) 균주 또는 이의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물 및 파쇄물을 포함하는 염증 질환 또는 호흡기 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 수탁번호 KCCM12698P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼 GCWB1001(Lactobacillus plantarum GCWB1001) 균주, KCCM12700P로 기탁된 락토바실러스 람노서스 GCWB1156(Lactobacillus rhamnosus GCWB1156) 균주, 또는 수탁번호 KCCM12699P로 기탁된 페디오코커스 에시디락티시 GCWB1085(Pediococcus acidiclactici GCWB1085) 균주 또는 이의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물 및 파쇄물을 포함하는 염증 질환 또는 호흡기 질환의 예방 또는 완화용 건강기능성 식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 수탁번호 KCCM12698P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼 GCWB1001(Lactobacillus plantarum GCWB1001) 균주, KCCM12700P로 기탁된 락토바실러스 람노서스 GCWB1156(Lactobacillus rhamnosus GCWB1156) 균주, 또는 수탁번호 KCCM12699P로 기탁된 페디오코커스 에시디락티시 GCWB1085(Pediococcus acidiclactici GCWB1085) 균주를 포함하는 프로바이오틱스를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 락토바실러스 플란타럼 GCWB1001(KCCM12698P), 락토바실러스 람노서스 GCWB1156(KCCM12700P), 및 페디오코커스 에시디락티시 GCWB1085(KCCM12699P) 균주는 항염 효과를 가지고, 실제 동물모델에서 진해/거담 효과 및 만성호흡기 질환에서의 폐기능을 개선하는 효과를 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 락토바실러스 플란타럼 GCWB1001(KCCM12698P), 락토바실러스 람노서스 GCWB1156(KCCM12700P), 및 페디오코커스 에시디락티시 GCWB1085(KCCM12699P) 균주는 각각 김치, 치즈 및 유아의 분변에서 분리되었으며, 각 균주는 마우스 폐 대식세포(MH-S 세포주)에서 세포 독성을 나타내지 않으며, 사이토카인인 TNF-α 및 TGF-β의 분비를 감소시키는 효과가 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 본 발명의 모든 균주는 미세먼지에 의해 증가된 염증인자인 NO (일산화질소), ROS(활성산소종) 생산을 감소시켰을 뿐 아니라, 염증성 전사인자인 NF-κB 및 iNOS, COX2의 promoter 활성도 감소시켰다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 본 발명의 모든 균주는 실제 동물모델에서 기침 증상을 완화시키고, 진해/거담 효능을 가질 뿐 아니라, 미세먼지로 인한 만성호흡기질환 동물모델의 다양한 증상을 완화시키는 효과를 보였다.
이에 따라 결과적으로 본 발명의 락토바실러스 플란타럼 GCWB1001(KCCM12698P), 락토바실러스 람노서스 GCWB1156(KCCM12700P), 및 페디오코커스 에시디락티시 GCWB1085(KCCM12699P) 균주는 염증 질환 또는 호흡기 질환에 대하여 완화, 예방 또는 치료효과를 나타낸다.
도 1은 마우스 폐 대식세포주(MH-S)에서 7종의 균주 시료들에 의한 TGF-β 생성량을 측정(실험예 1-2)하여 나타낸 그래프이다.
도 2 및 3은 마우스 폐 대식세포주(MH-S)에서 7종의 균주 시료들에 의한 NO 및 ROS 생성량을 측정(실험예 1-3 및 1-4)하여 나타낸 그래프이다.
도 4 내지 도 6은 마우스 폐 대식세포주(MH-S)에서 7종의 균주 시료들에 의한 염증성 전사조절인자 활성도(iNOS, COX2 및 NF-κB promoter 활성도)를 측정(실험예 1-5)하여 나타낸 그래프이다.
도 7 및 도 8은 마우스 기침모델에서 GCWB1001, GCWB1085 및 GCWB1156 균주의 진해 및 거담 작용(실험예 2-2 및 2-3)을 나타낸 그래프이다.
도 9는 만성호흡기질환 동물모델에서의 GCWB1001, GCWB1085 및 GCWB1156 균주 처리 후 체중, 간, 비장 및 폐 무게(실험예 3-2)를 나타낸 그래프이다.
도 10은 만성호흡기질환 동물모델에서 GCWB1001, GCWB1085 및 GCWB1156 균주 처리 후 BALF(Broncoalveolar lavage fluid) 에서의 다양한 면역세포 수를 측정(실험예 3-3)한 그래프이다.
도 11은 만성호흡기질환 동물모델에서 GCWB1001, GCWB1085 및 GCWB1156 균주 처리 후 BALF(Broncoalveolar lavage fluid) 에서의 OVA 특이 IgE 양을 측정(실험예 3-4)한 그래프이다.
도 12는 만성호흡기질환 동물모델에서 GCWB1001, GCWB1085 및 GCWB1156 균주 처리 후 BALF(Broncoalveolar lavage fluid) 에서의 사이토카인(TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-4, IL-13, MCP-1)양을 측정(실험예 3-5)한 그래프이다.
도 13은 만성호흡기질환 동물모델에서 GCWB1001, GCWB1085 및 GCWB1156 균주 처리 후 폐 조직에 침투한 염증세포를 염색(실험예 3-6)한 폐 조직사진 및 그래프이다.
도 14는 만성호흡기질환 동물모델에서 GCWB1001, GCWB1085 및 GCWB1156 균주 처리 후 점액질 단백질을 염색(실험예 3-7)한 폐 조직사진 및 그래프이다.
도 15는 만성호흡기질환 동물모델에서 GCWB1001, GCWB1085 및 GCWB1156 균주 처리 후 폐 조직 내 caspase 3 활성 및 전체 콜라겐 함량(실험예 3-8)을 나타낸 그래프이다.
도 16은 만성호흡기질환 동물모델에서 GCWB1001, GCWB1085 및 GCWB1156 균주 처리 후 폐 조직 내 MMP-9 활성(실험예 3-9)을 분석한 사진이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.
본 발명은, 수탁번호 KCCM12698P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼 GCWB1001(Lactobacillus plantarum GCWB1001) 균주에 관한 것이다.
상기 신규한 균주인 락토바실러스 플란타럼 GCWB1001(Lactobacillus plantarum GCWB1001) 균주는 상기 이름으로 명명하여 2020년 4월 17일에 한국미생물보존센터에 기탁하였다. 수탁번호는 KCCM12698P이다.
상기 균주는 각 지역에서 수집한 김치로부터 분리 및 동정할 수 있다. 본 발명의 발명자들은 각 지역에서 수집한 김치로부터 다양한 신규 균주를 분리 및 동정하고, 분리 및 동정된 균주 중에서 락토바실러스 플란타럼 GCWB1001(Lactobacillus plantarum GCWB1001) 균주가 종래의 알려진 유산균들과 비교하여 현저히 우수한 항염 효과 및 호흡기 질환 예방 또는 치료효과를 제공함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은, 수탁번호 KCCM12700P로 기탁된 락토바실러스 람노서스 GCWB1156(Lactobacillus rhamnosus GCWB1156) 균주에 관한 것이다.
상기 신규한 균주인 락토바실러스 람노서스 GCWB1156(Lactobacillus rhamnosus GCWB1156) 균주는 상기 이름으로 명명하여 2020년 4월 17일에 한국미생물보존센터에 기탁하였다. 수탁번호는 KCCM12700P이다.
상기 균주는 각 지역에서 수집한 치즈로부터 분리 및 동정할 수 있다. 본 발명의 발명자들은 각 지역에서 수집한 치즈로부터 다양한 신규 균주를 분리 및 동정하고, 분리 및 동정된 균주 중에서 락토바실러스 람노서스 GCWB1156(Lactobacillus rhamnosus GCWB1156) 균주가 종래의 알려진 유산균들과 비교하여 현저히 우수한 항염 효과 및 호흡기 질환 예방 또는 치료 효과를 제공함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은, 수탁번호 KCCM12699P로 기탁된 페디오코커스 에시디락티시 GCWB1085(Pediococcus acidiclactici GCWB1085) 균주에 관한 것이다.
상기 신규한 균주인 페디오코커스 에시디락티시 GCWB1085(Pediococcus acidiclactici GCWB1085) 균주는 상기 이름으로 명명하여 2020년 4월 17일에 한국미생물보존센터에 기탁하였다. 수탁번호는 KCCM12699P이다.
상기 균주는 영아의 분변으로부터 분리 및 동정할 수 있다. 본 발명의 발명자들은 영아의 분변으로부터 다양한 신규 균주를 분리 및 동정하고, 분리 및 동정된 균주 중에서 페디오코커스 에시디락티시 GCWB1085(Pediococcus acidiclactici GCWB1085) 균주가 종래의 알려진 유산균들과 비교하여 현저히 우수한 항염 효과 및 호흡기 질환 예방 또는 치료효과를 제공함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
즉, 상기 락토바실러스 플란타럼 GCWB1001(Lactobacillus plantarum GCWB1001) 균주, 락토바실러스 람노서스 GCWB1156(Lactobacillus rhamnosus GCWB1156) 균주, 및 페디오코커스 에시디락티시 GCWB1085(Pediococcus acidiclactici GCWB1085) 균주는 염증 유도 물질인 LPS 및 미세먼지(DEP; diesel exhaust particles)를 처리한 마우스 폐 대식세포주인 MH-S 세포주에서 NO, ROS 및 염증성 전사조절인자의 활성도(iNOS, COX2 및 NF-κB promoter 활성)를 억제시켰다.
또한, 본 발명의 GCWB1001, GCWB1156 및 GCWB1085 균주는 MH-S 세포주에서 LPS 및 DEP에 의해 유도된 사이토카인(TNF-α) 분비를 감소시켜 항염 효과를 확인할 수 있었다.
산화성 스트레스(oxidative stress)는 생체 내 생체 분자, 세포, 조직에서 활성산소종 또는 활성질소종 생산과 항산화 방어기전이 균형을 잃고 활성산소종 또는 활성질소종의 생산이 상대적으로 과다해지는 현상을 의미하며, 이때 통상적으로 조직 손상이 야기된다.
이러한 활성산소종 또는 활성질소종은 화학적으로 매우 불안하고 반응성이 크기 때문에 생체 내에서 효소 촉매 반응, 미토콘드리아 내 전자 전달, 세포 신호 전달계와 유전자 발현, 전사인자의 활성화 및 생체 분자, 세포, 조직 등에 광범위한 산화적 손상을 줌으로써 주위에 염증 반응을 유발하고 조직섬유화의 주요인자로 관여한다. 이러한 산화적 손상은 인체 전 조직에서 각종 질병을 유발하게 된다. 구체적으로는 피부, 신장, 심장, 관절, 폐, 뇌, 혈관, 장관, 눈 등의 조직에서의 암 발생 및 발생된 암의 진행에 관여한다는 것이 알려져 있을 뿐 아니라, 심혈관 질환, 염증, 섬유화 질환, 당뇨병 등 거의 모든 질병에서 중요하게 작용하는 것으로 알려지고 있다.
LPS 등과 같은 염증성 물질을 대식세포에 처리하는 경우 염증성 사이토카인(IL-6, TNF-α, IL-1β 등) 및 NO 등과 같은 염증성 매개 물질(산화성 스트레스)들이 생성되어 염증반응이 일어난다. NO는 iNOS(induced nitric oxide synthase)에 의해 생성되고, 염증반응이 일어나면서 NF-κB 전사인자가 활성화됨과 동시에 COX-2(cyclooxygenase-2)에 의해 염증반응에 관여하는 프로스타글란딘(PGs)을 생산하여 염증반응을 가속시키게 된다.
따라서, 본 발명의 GCWB1001, GCWB1156 및 GCWB1085 균주는 LPS 및 DEP에 의해 유도되는 염증성 물질인 NO, ROS, 염증성 사이토카인인 TNF-α, 및 염증성 전사조절인자(iNOS, COX2 및 NF-κB promoter)의 활성을 모두 억제시킴에 따라, 상기 균주들은 염증을 억제할 수 있는 항염 효과를 가진다.
본 발명의 GCWB1001, GCWB1156 및 GCWB1085 균주는 시트르산 유도된 기침 모델에서 기침을 억제하고, 객담 배출을 증가시켰다.
진해제는 원인에 관계없이 기침을 가라앉히는 약으로 작용기전에 따라 중추에 작용하는 약물과 말초에 작용하는 약물로 나눌 수 있는데, 중추에 작용하는 약제들은 마약류, 마약유도체 및 비마약류로 나눌 수 있다. 마약류의 약제로 대표적인 것은 코데인(codein), 하이드로코돈(hydrocodone), 모르핀(morphin) 등으로 제한적인 기침 억제 효과가 증명되었지만 결과가 일정하지 않고, 적정 용량에서 졸음, 변비, 소화장애, 남용이나 의존의 위험이 있다. 말초에 작용하는 진해제 중 국내에서 가장 흔히 사용되는 약제는 레보드로프로피진(Levodropropizine)으로 기도의 감각 신경펩타이드 정도를 조절하여 효과를 나타내는 것으로 생각되고 있다. 이 외에도 테오브로민(Theobromine)이 이에 해당한다.
객담의 주성분은 점액으로 구성되어 있는데, 기관지 점액은 정상적으로 기관지 점막에 분포해 있는 점액선과 점막하선을 구성하는 점액성 세포와 장액선 세포로부터 분비된다. 점액은 95%가 수분, 나머지 5%정도는 당단백질, 지질 및 무기질 등으로 이루어져 있는데 당단백질의 구조가 선형중합제 이중구조로 되어 있는 겔 형태이기 때문에 끈적이는 양상을 보인다. 이러한 객담을 제거하는 거담제는 객담의 수분함량을 증가시키는 작용을 하는 약물과 객담단백질의 S-S 결합을 끊어 점성을 감소시키는 점액분해제로 구분된다. 이러한 거담제로는 N-아세틸시스테인(N-acetylcysteine)과 카르보시스테인(carbocysteine)과 같은 시스테인 유도체가 사용되고 있는데 이러한 시스테인 유도체들은 장기간 사용시 기관지 연축 등의 부작용의 우려가 있다. 따라서 부작용 및 독성이 적으면서 거담효과가 우수한 거담제의 개발이 요구되고 있다.
또한 천연물 소재의　진해거담제로 아이비엽 추출물 및 아이비엽과 황련 추출물의 복합제인 시네츄라가 많이 사용되고 있다.
본 발명의 GCWB1001, GCWB1156 및 GCWB1085 균주는 시트르산 유도된 기침 모델에서 기침 횟수를 감소시키고, 진해/거담 효능을 보이므로, 호흡기 질환 증상을 호전시키는 효과를 가진다.
추가적으로 본 발명의 균주는 오브알부민(ovalbumin; OVA) 및 디젤 배기 입자(DEP)를 이용한 만성호흡기 질환 모델에서 기관지 폐포 세포액(BALF)에서의 면역세포를 유의하게 줄였을 뿐 아니라, 폐 조직 내 침투된 면역세포 역시 감소하였으며, OVA 특이적인 IgE를 줄였고, BALF에서 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-4, MCP-1, IL-13은 감소시켰고, 항염성 사이토카인인 IFN-γ는 유의하게 증가시켰다.
따라서, 본 발명의 GCWB1001, GCWB1156 및 GCWB1085 균주는 그 자체가 진해/거담 작용을 할 뿐 아니라, MMP9의 활성을 억제하여 기관지 폐포 세포액 및 폐 조직 내 염증세포의 침투를 막고, 염증성 사이토카인의 분비를 막고, 항염성 사이토카인의 분비를 늘리고, 알레르기 증상에서 증가되는 IgE 이뮤노글로불린의 양을 감소시킴으로써, 호흡기 기관에서의 알레르기 반응 및 염증반응을 감소시키는 효과를 가지는 것으로 파악된다.
천식, 폐렴, 만성폐쇄성폐질환, 알레르기비염, 급만성기관지염, 세기관지염, 인후염, 편도염, 후두염, 기관지 확장증, 특발성 폐섬유화증, 낭포성섬유증, 폐기종, 폐결핵 후유증, 하기도 감염증, 부비강염, 급성 상기도감염증, 알레르기성 폐질환 등은 호흡기질환의 대표적인 질환이다. 천식(asthma)은 기도, 특별히, 기관지에 생기는 만성　염증을 일컫는다. 천식으로 인해 유발되는　염증은 매연, 알레르기성 항원, 찬바람, 운동, 호흡기 감염 등 매우 다양한 소인에 의하여 악화될 수 있으며, 지속적인　염증은 기도의 변형 및 기도의 과민성(hyper-responsiveness)을 야기한다.
또한, 호흡기 감염 바이러스에 의해서도 호흡기 질환이 발생될 수 있다. 호흡기 질환을 일으키는 바이러스의 종류로는 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 헤르페스 단순 바이러스(herpes simplex virus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 라이노 바이러스(rhinovirus), 수두 바이러스(varicella Zoster Virus), 홍역 바이러스(measle virus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 뎅기바이러스(Dengue virus), HIV(human immunodeficiency virus), 인플루엔자 바이러스, 코로나바이러스(coronavirus), 중증급성 호흡기 증후군 바이러스(severe acute respiratory syndrome associated virus; SARS-associated virus), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(middle east respiratory syndrome coronavirus; MERS-CoV) 등이 있다.
호흡기도는 크게 점막과 기관지평활근이라는 근육으로 이루어져 있고 점막에는 많은 분비샘들이 있어 필요한 분비물을 계속 분비하고 있으며 기관지 평활근이 수축하면 호흡기도가 좁아지게 된다. 매연, 알레르기성 항원, 찬바람, 운동, 호흡기 감염 등 매우 다양한 소인에 의하여　염증반응이 일어나면 분비샘에서 나오는 분비물이 더욱 증가하게 된다. 이때 분비되는 분비물은 염증으로 인한 삼출성 반응에 의한 것으로 염증성 매개물질 및 뮤신(점액소)의 혼합물로 이루어진 끈적끈적한 점액성 분비물이 대부분이다.
통상 뮤신이 생체를 방어하는 역할을 수행하지만, 천식, COPD, 만성기관지염 등의 만성 염증성 호흡기 질환에서는 끈끈한 분비물의 과다생성 또는 과다분비가 관찰된다. 이 분비물의 양과 질 이상은 병리 요인으로 작용하여 분비물 축적으로 인해 기관내강 폐쇄, 기도 공기 유입 저해 등을 일으키고, 이로 인해 천명을 동반한 발작적인 기침과 호흡곤란이 심하게 나타나며, 발작 시에는 마른기침이 발생되고 흉부압박감을 느끼게 된다. 바이러스성 호흡기 질환으로 인한 폐손상도 이 점액질에 의한 것으로 보고 있다.
만성호흡기질환 동물 모델에서 본 발명의 GCWB1001, GCWB1156 및 GCWB1085 균주는 폐 조직 내 점액질 단백질의 침착을 억제하고, 폐포 내 세포사멸인자인 caspase 3의 활성을 감소시키고, 콜라겐 침착을 낮추고, MMP-9 활성을 감소시켰다. 상기 MMP-9의 활성 감소는 폐 조직 내 염증 세포 침착을 막아서 궁극적으로 폐섬유화를 막을 수 있다.
폐섬유증은 호흡기 질환의 마지막 단계로서, 병리적, 생리적 과정이 복잡한데, 초기에 폐 염증을 중심으로 대량의 염증세포가 침윤하며 폐포벽이 만성적으로 두꺼워지고, 중기/말기에 콜라겐과 같은 세포외기질 요소의 섬유아세포(fibroblast)에 의한 과잉 침착으로 발생되는 폐조직의 과성장, 폐포 변형, 경화 및 흉터로 인해 정상 폐 조직구조가 파괴되어 기능이 상실된다.
섬유아세포는 염증과 조직 손상 부위로의 면역세포 모집(recruitment)에 역할을 한다. 게다가 섬유아세포는 많은 염증성 사이토카인을 생성하며 그에 반응한다. 따라서, 섬유아세포는 만성 염증에 기여할 수 있으며, 역으로 염증성 사이토카인은 섬유아세포의 근섬유아세포로의 전환을 촉진시켜 섬유증을 촉진한다. 따라서 폐조직의 부상이나 염증은 폐섬유증으로 이어질 수 있다.
폐섬유화가 진행되는 환자의 폐조직에서 TGF-β 자극은 ROS 생성 증가를 유발하고 섬유화에 중요한 콜라겐(collagen)과 α-SMA(a-smooth muscle actin)의 발현이 증가됨이 보고되었으며, 특발성 폐섬유증 환자의 폐조직에서 ROS로 인해 폐섬유화증이 악화되는 것으로 보고되어 있다.
따라서, 본 발명의 균주는 기침 모델 마우스에서 진해/거담 작용을 유도할 뿐 아니라, 만성 호흡기 질환 동물 모델에서 산화 스트레스를 억제함으로써, 염증성 사이토카인의 발현을 억제하고, MMP-9 발현을 억제함으로써 염증반응에 관여하는 면역세포의 폐 조직 및 기관지 폐포 세척액 내 침착을 막고, 점액질 단백질 생성 및 콜라겐 생성을 억제하여 궁극적으로는 폐섬유증 개선효과를 보였다.
본 발명은 상기 수탁번호 KCCM12698P로 기탁된, 락토바실러스 플란타럼 GCWB1001 균주, 수탁번호 KCCM12700P로 기탁된 락토바실러스 람노서스 GCWB1156 균주, 또는 수탁번호 KCCM12699P로 기탁된 페디오코커스 에시디락티시 GCWB1085 균주, 이의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물 또는 파쇄물을 포함하는 염증질환 또는 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
상기 염증성 질환으로는 만성 및 급성 비염, 만성 및 급성 위염, 장염, 궤양성 위염, 급성 및 만성 신장염, 급성 및 만성 간염, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐섬유증, 과민성 대장 증후군, 염증성 대장 질환, 장내 장염, 류마티스성 관절염, 골관절염, 폐렴, 간염, 사구체 신염, 위염, 혈관염, 췌장염, 복막염, 기관지염, 심근육염, 뇌염, 후 허혈 재관류 손상((postischemic reperfusion injury)에 있어서의 염증, 조직 및 기관의 이식 후 면역 거부 현상에서 일어나는 염증, 화상, 건선, 알레르기성 접촉성 피부염 등 피부에 발생하는 다양한 염증, 허리 통증, 근막 질환, 통풍, 관절염, 류머티즘성 관절염, 강직성 척추염, 호지킨병, 췌장염, 결막염, 홍채염, 공막염, 포도막염, 피부염, 아토피성 피부염, 습진, 당뇨성 염증, 바이러스 또는 박테리아 감염으로 인한 감염성 염증, 또는 루푸스, 건선, 죽상경화증 등의 자가 면역성 질환일 수 있다.
상기 호흡기 질환은 미세먼지, 바이러스 감염, 폐렴 중 어느 하나에 의한 것이다. 상기 호흡기 질환은 호흡기 염증성 폐질환, 천식, 기관지 확장증, 특발성폐섬유화증, 만성폐쇄성 폐질환(COPD; chronic obstructive pulmonary disease), 낭포성섬유증, 폐기종, 폐결핵 후유증, 만성기관지염, 알레르기 비염, 진해 거담, 하기도 감염증, 기관지염, 세기관지염, 급성상기도감염증, 알레르기성 폐질환, 기관지 확장증, 폐렴, 급만성기관지염, 부비강염, 인후염, 편도염, 후두염 및 폐섬유증으로 이루어진 군에서 선택된다.
상기 바이러스는 아데노바이러스(adenovirus), 백시니아 바이러스(vaccinia virus), 헤르페스 단순 바이러스(herpes simplex virus), 파라인플루엔자 바이러스(parainfluenza virus), 라이노 바이러스(rhinovirus), 수두 바이러스(varicella Zoster Virus), 홍역 바이러스(measle virus), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 뎅기바이러스(Dengue virus), HIV(human immunodeficiency virus), 인플루엔자 바이러스, 코로나바이러스(coronavirus), 중증급성 호흡기 증후군 바이러스(severe acute respiratory syndrome associated virus; SARS-associated virus), 중동 호흡기 증후군 코로나바이러스(middle east respiratory syndrome coronavirus; MERS-CoV)에서 선택될 수 있다.
본 발명의 균주는 1ⅹ101 ~ 1ⅹ1013 CFU/g의 생균 함량을 갖는 것이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 수탁번호 KCCM12698P로 기탁된, 락토바실러스 플란타럼 GCWB1001 균주, 수탁번호 KCCM12700P로 기탁된 락토바실러스 람노서스 GCWB1156 균주, 또는 수탁번호 KCCM12699P로 기탁된 페디오코커스 에시디락티시 GCWB1085 균주, 이의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물 또는 파쇄물을 포함하는 염증 질환 또는 호흡기 질환 예방용 식품 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 수탁번호 KCCM12698P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼 GCWB1001 균주, 수탁번호 KCCM12700P로 기탁된 락토바실러스 람노서스 GCWB1156 균주, 또는 수탁번호 KCCM12699P로 기탁된 페디오코커스 에시디락티시 GCWB1085 균주, 이의 배양물, 농축물, 페이스트화물, 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 액상물, 희석물 또는 파쇄물을 포함하는 염증 질환 또는 호흡기 질환 예방용 건강 기능성 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 기술된 식품 조성물 또는 건강기능성 식품 조성물은 상기 유효성분 이외에, 식품 제조시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제, 감미제 및 향미제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어, 말토스, 슈크로스, 올리고당 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어, 덱스트린, 사이클로 덱스트린 등; 과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 들 수 있다. 상기 감미제로는 천연 감미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 레바우디오시드 A, 글리시리진 등) 및 합성 감미제(사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 추가적으로 상기 균주의 먹이가 될 수 있는 프락탄, 갈락탄, 저상헝 녹말, 펙틴, 베타 글루칸, 자일로올리고당 등의 식물 유래 올리고당을 프리바이오틱스로 포함할 수 있다.
그러나 이들로 한정되는 것은 아니며, 이 분야에서 공지된 성분들로서 본 발명의 효과를 저해하지 않는 성분들은 모두 사용될 수 있다.
상기 식품 조성물 또는 건강기능성 식품 조성물의 예로는 환자영양식, 육류, 곡류, 카페인 음료, 일반음료, 유제품, 초콜렛, 빵류, 스넥류, 과자류, 피자, 젤리, 면류, 껌류, 아이스크림류, 알코올성 음료, 술, 비타민 복합제, 그 밖의 건강보조식품류 등을 들 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 상기와 같은 식품 조성물 또는 건강기능성 식품 조성물의 형태로 제조될 경우, 편하고 쉽게 복용할 수 있어서 바람직하다.
본 발명에 있어서 상기 건강기능성 식품 조성물 및 약학 조성물은 과립제(granules), 리모나데제(lemonades), 산제(powders), 시럽제(syrups), 액제(liquids and solutions), 엑스제(extracts), 엘릭실제(elixirs), 유동엑스제(fluidextracts), 현탁제(suspesions), 전제(decoctions), 침제(infusions), 정제(tablets), 주정제(spirits), 캅셀제(capsules), 트로키제(troches), 환제(pills), 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제 형태로 제조될 수 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 수탁번호 KCCM12698P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼 GCWB1001 균주, 수탁번호 KCCM12700P로 기탁된 락토바실러스 람노서스 GCWB1156 균주, 또는 수탁번호 KCCM12699P로 기탁된 페디오코커스 에시디락티시 GCWB1085 균주를 포함하는 프로바이오틱스에 관한 것이다.
상기 프로바이오틱스는 하기 기탁 균주 3종 선택되는 1종 이상을 포함할 수 있으며, 실시예에서 분리된 7종의 유산균 균주 중에서 선택되는 1종 이상을 더 포함할 수 있으며, 이 밖에 본 발명의 목적에 도움이 되는 공지의 균주를 더 포함할 수 있다.
상기 프로바이오틱스는 1Х101 ~ 1Х1013 CFU/g의 생균 함량을 갖는 것을 사용할 수 있으며, 상기 프로바이오틱스는 항염 또는 호흡기 질환 예방 또는 완화용으로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 GCWB1001, GCWB1156 및 GCWB1085 균주의 투여량은 투여방법, 복용자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중증도 등을 고려하여 결정하는 것이 좋다.
일 예로, 상기 GCWB1001, GCWB1156 및 GCWB1085 균주는 1일 1ⅹ101 ~ 1ⅹ1013 CFU/g의 생균 함량을 1회 또는 2회 이상으로 분할하여 투여할 수 있다.
또한, 상기 성분들을 포함하는 약학적 조성물, 식품 조성물, 건강기능성 식품 조성물, 프로바이오틱스는 유효성분을 기준으로 하였을 때 1일 1ⅹ101 ~ 1ⅹ1013 CFU/g의 생균 함량을 1회 또는 2회 이상으로 분할하여 투여할 수 있다.
그러나 상기의 투여량은 일 예에 불과하며, 복용자의 상태에 따라 의사의 처방에 의해 변화될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의거하여 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 락토바실러스 플란타럼( Lactobacillus plantarum ) GCWB1001 균주의 분리 및 동정
(1) 균주의 분리
각 지역에서 수집한 김치를 그의 10배가 되는 양의 멸균된 생리식염수에 넣고 균질화하였다. 균질화된 시료는 멸균된 생리식염수에 10 단계씩 희석하여 평판희석법(Dilution plating method)으로 균주를 분리하였다. 희석한 균주 샘플을 MRS 배지(MRS broth agar; BD Difco)에 도말 접종 후, 37℃에서 72시간 혐기 배양하였다. MRS agar plate에서 나타난 콜로니를 pH indicator인 0.005% BCP(bromocresol purple)를 포함한 PCA 배지(MBcell, South Korea)에 2차 접종하여 보라색 배지가 노란색으로 변하는 콜로니를 MRS agar plate에 3차 접종하여 프로바이오틱스를 순수 분리하였다.
(2) 락토바실러스 플란타럼 GCWB1001 균주의 동정
상기 (1)에서 순수 분리된 균주에 대해 DNA 추출 및 정제를 수행하였다. 두 개의 유니버셜 프라이머(Universal primers)인 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') 및 1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하여 16s rRNA 유전자 증폭을 수행한 후, 증폭된 16s rRNA 유전자의 시퀀싱 분석을 수행하였다. 분석한 16s rRNA 시퀀스 데이터와 EzTaxon server(http://www.ezbiocloud.net)을 이용하여 GRAS(Generally Recognized as Safe)에 해당하는 2종의 균주만 선별하여 하기 표 1에 나타내었다.
동정된 균주
Lactobacillus plantarum GCWB1001
Leuconostoc mesenteroides GCWB1031
상기 Lactobacillus plantarum GCWB1001의 16S rRNA 염기서열 분석 결과는 다음과 같다.
<16S rRNA sequence of Lactobacillus plantarum GCWB1001>
Figure 112020052031467-pat00001
실시예 2: 페디오코쿠스 에시디락티시( Pediococcus acidilactici ) GCWB1085 균주의 분리 및 동정
(1) 균주의 분리
각 지역에서 수집한 치즈를 그의 10배가 되는 양의 멸균된 생리식염수에 넣고 균질화하였다. 균질화된 시료는 멸균된 생리식염수에 10 단계씩 희석하여 평판희석법(Dilution plating method)으로 균주를 분리하였다. 희석한 균주 샘플을 MRS 배지(MRS broth agar; BD Difco)에 도말 접종 후, 37℃에서 72 시간 혐기 배양하였다. MRS agar plate에서 나타난 콜로니를 pH indicator인 0.005% BCP(bromocresol purple)를 포함한 PCA 배지(MBcell, South Korea)에 2차 접종하여 보라색 배지가 노란색으로 변하는 콜로니를 MRS agar plate에 3차 접종하여 프로바이오틱스를 순수 분리하였다.
(2) 페디오코쿠스 에시디락티시 GCWB1085 균주의 동정
상기 (1)에서 순수 분리된 균주에 대해 염색체 DNA 추출 및 정제를 수행하였다. 두 개의 유니버셜 프라이머(Universal primers)인 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') 및 1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하여 16s rRNA 유전자 증폭을 수행한 후, 증폭된 16s rRNA 유전자의 시퀀싱 분석을 수행하였다. 분석한 16s rRNA 시퀀스 데이터와 EzTaxon server(http://www.ezbiocloud.net)를 이용하여 GRAS(Generally Recognized as Safe)에 해당하는 4종의 균주만 선별하여 하기 표 2에 나타내었다.
동정된 균주
Pediococcus acidilactici GCWB1085
Lactobacillus paracasei GCWB1084
Bifidobacterium longum GCWB1136
상기 Pediococcus acidilactici GCWB1085의 16S rRNA 염기서열 분석 결과는 다음과 같다.
<16S rRNA sequence of Pediococcus acidilactici GCWB1085>
Figure 112020052031467-pat00002
실시예 3: 락토바실러스 람노서스( Lactobacillus rhamnosus) GCWB1156 균주의 분리 및 동정
(1) 균주의 분리
자연분만으로 태어난 건강한 유아의 분변을 멸균된 생리식염수에 10 단계씩 희석하여 평판희석법(Dilution plating method)으로 균주를 분리하였다. 희석한 분변 샘플을 BSM agar배지(Bifidus Selective Medium Agar; Sigma, USA)에 도말 접종 후, 37℃에서 72시간 혐기 배양하였다. BSM agar plate에서 나타난 콜로니를 pH indicator인 0.005% BCP(bromocresol purple)를 포함한 PCA 배지(MBcell, South Korea)에 2차 접종하여 보라색 배지가 노란색으로 변하는 콜로니를 BL agar 배지(MBcell, South Korea)에 3차 접종하여 프로바이오틱스를 순수 분리하였다.
(2) 락토바실러스 람노서스 GCWB1156 균주의 동정
상기 실시예 1에서 순수 분리된 균주에 대해 염색체 DNA 추출 및 정제를 수행하였다. 두 개의 유니버셜 프라이머(Universal primers)인 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3') 및 1492R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3')을 사용하여 16s rRNA 유전자 증폭을 수행한 후, 증폭된 16s rRNA 유전자의 시퀀싱 분석을 수행하였다. 분석한 16s rRNA 시퀀스 데이터와 EzTaxon server(http://www.ezbiocloud.net)을 이용하여 GRAS(Generally Recognized as Safe)에 해당하는 1종의 균주만 선별하여 하기 표 3에 나타내었다.
동정된 균주
Lactobacillus rhamnosus GCWB1156
Bifidobacterium breve GCWB1144
상기 Lactobacillus rhamnosus GCWB1156의 16S rRNA 염기서열 분석 결과는 다음과 같다.
<16S rRNA sequence of Lactobacillus rhamnosus GCW1156 >
Figure 112020052031467-pat00003
실험예 1: 마우스 폐 대식세포에서의 항염 효과분석
1-1) 균주의 세포 독성 평가(LDH leakage and CCK-8 assay)
마우스 폐 대식세포주 MH-S 세포주(mouse alveolar macrophage cell line)를 미국세포주은행(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 분양받아 세포 농도가 5Х105 cells/㎖이 되도록 현탁하고, 96-well plate에 100 ㎕씩 분주하여 각 시료를 농도 별로 처리한 후 48시간 배양하였다.
세포 독성은 MTT assay kit 및 Cytotoxicity LDH Assay Kit를 이용하여 측정하고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
구분 용량
(㎍/ml)		 LDH(fold of control)
(24hr)		 MTT(% of control)
(24hr)
정상군(No treatment) 0 1.00±0.04 100.0±2.12
부형제(100% 말토덱스트린) 1000 0.99±0.02 99.6±3.13
Lactobacillus plantarum GCWB1001 10 0.99±0.03 101.7±3.4
100 1.01±0.03 102.3±4.17
1000 0.60±0.02* 101.5±3.2
GCWB1031 10 1.00±0.02 104.8±8.9
100 1.03±0.06 100.9±2.88
1000 0.85±0.02* 98.2±3.8
GCWB1084 10 1.01±0.03 96.4±1.94
100 1.18±0.26 100.0±1.57
1000 1.20±0.03 93.4±0.4
Pediococcus acidilactici GCWB1085 10 0.98±0.02 108.95±5.31
100 0.95±0.03 113.06±4.63**
1000 0.58±0.03* 102.03±1.39
Lactobacillus rhamnosus GCWB1156 10 0.87±0.03 99.9±1.26
100 0.82±0.02* 98.3±0.63
1000 0.90±0.01 93.5±4.8
GCWB1136 10 1.01±0.00 101.4±3.08
100 0.87±0.02 99.1±3.14
1000 0.81±0.02* 97.1±3.92
GCWB1144 10 0.87±0.04 102.3±4.03
100 0.82±0.02** 96.4±1.56
1000 0.79±0.02* 95.7±2.88
*P < 0.001 vs. normal group. **P < 0.01 vs. normal group.
(1) LDH assay 결과
상기 표 3의 7종의 유산균을 마우스 MH-S 폐 대식세포에 1 내지 1,000㎍/㎖의 농도로 24 시간 처리 후 LDH assay를 수행한 결과, 7종 모두 세포독성이 나타나지 않았다. 다만, GCWB1001, GCWB1085, GCWB1176, 및 GCWB1156 균주의 1,000㎍/㎖ 농도에서는 LDH 값이 유의적으로 감소된 것으로 보아, 모든 균주는 세포독성이 없는 것으로 확인되었다.
(2) MTT assay 결과
상기 표 4의 7종의 유산균을 마우스 MH-S 폐 대식세포에 1 내지 1,000㎍/㎖의 농도로 24 시간 처리 후 MTT assay를 수행한 결과, 7종 모두 100㎍/㎖ 이하의 농도에서는 세포독성이 나타나지 않았다. 다만, GCWB1085 균주의 100㎍/㎖ 농도에서는 세포독성이 확인되었다.
1-2) 사이토카인 분비능 측정(TNF-α, TGF-β)
MH-S 세포주에 시료를 1시간 전처리한 후 LPS(10ng/㎖)또는 ConA(10㎍/㎖) 와 DEP(200㎍/㎖)를 각각 3시간, 26시간 동안 처리한 후 배양배지로 분비된 사이토카인(TNF-α, TGF-β)의 양을 ELISA kit(R&D system, USA)를 이용하여 측정하고, 그 결과를 하기 표 5 및 도 1에 나타내었다.
1-2) 사이토카인 분비능 측정(TNF-α, TGF-β)
MH-S 세포주에 시료를 1시간 전처리한 후 LPS(10ng/㎖)또는 ConA(10㎍/㎖) 와 DEP(200㎍/㎖)를 각각 3시간, 26시간 동안 처리한 후 배양배지로 분비된 사이토카인(TNF-α, TGF-β)의 양을 ELISA kit(R&D system, USA)를 이용하여 측정하고, 그 결과를 하기 표 5 및 도 1에 나타내었다.
구분 용량(㎍/㎖) TNF-α 억제율(%)
정상군(No treatment) - - 52.4
대조군
(LPS10 ng/㎖ +DEP 200 ㎍/㎖)		 - - 100 ##
LPS10 ng/ml + DEP 200 ㎍/㎖ Lactobacillus plantarum GCWB1001 10 58.1*
100 74.2*
1000 89.7**
GCWB1031 10 86.8**
100 130.0
1000 157.4
Pediococcus acidilactici GCWB1085 10 90.2***
100 60.0*
1000 54.8*
Lactobacillus rhamnosus GCWB1156 10 66.7*
100 66.9**
1000 105.6
GCWB1136 10 304.7
100 370.4
1000 1270.8
GCWB1144 10 449.1
100 1573.7
1000 3401.6
##P < 0.01 vs. normal group. *P<0.001 vs LPS 10ng/㎖+DEP 200㎍/㎖, **P < 0.01 vs. LPS 10ng/㎖+DEP 200㎍/㎖. ***P < 0.05 vs. LPS 10ng/ml+DEP 200㎍/㎖.
(1) TNF-α측정 결과
표 5에 나타난 바와 같이 MH-S 세포에 LPS, DEP처리에 의한 사이토카인 TNF-α 분비는 GCWB1001, GCWB1084 및 GCWB1156의 모든 균주에서 대부분의 처리 농도에서 감소되었다. 따라서, 본 발명의 균주는 미세먼지에 의한 전염증성 사이토카인인 TNF-α의 분비를 농도 의존적으로 감소시켰다.
(2) TGF-β 측정 결과
도 1에 나타난 바와 같이 GCWB1001, GCWB1085 및 GCWB1156 균주 1㎍/㎖ 및 10㎍/㎖ 처리시 모두 미세먼지에 의한 TGF-β 분비량이 감소되었다.
1-3) Nitric oxide(NO) 측정
마우스 폐 대식세포주 NH-S 세포주는 세포 농도가 5Х105 cells/㎖이 되도록 현탁하고, 96-well plate에 100㎕씩 분주하였다. 시료인 상기 표 6의 균주 7종을 각각 1㎍/㎖ 및 10㎍/㎖의 농도로 1 시간 전처리한 후 LPS 100ng/㎖을 24시간 동안 처리하였다. 이후, 배양액 50㎕를 96-well plate 옮겨 담고 Griess reagent I(NED solution)과 Griess reagent II(Sulfanilamide solution)를 동량으로 혼합한 후, 암실에서 10분간 반응시킨 후, 30분 이내에 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 측정하였다.
구분 용량 용량(㎍/㎖) NO(μM)
정상군(No Treatment) - - 0.42±0.00
대조군
(LPS 10ng/㎖+ DEP 200 ㎍/㎖)		 - - 4.88±0.32#
LPS 10ng/㎖+ DEP 200 ㎍/㎖ Lactobacillus plantarum GCWB1001 1 4.26±0.44
10 4.47±0.60
GCWB1031 1 3.91±0.24**
10 5.16±0.74
GCWB1084 1 2.90±0.36*
10 8.30±0.12*
Pediococcus acidilactici GCWB1085 1 3.20±0.32*
10 5.51±1.058
Lactobacillus rhamnosus GCWB1156 1 4.19±0.21***
10 4.47±0.12
GCWB1136 1 5.37±0.99
10 7.74±0.21
GCWB1144 1 5.09±0.48
10 8.44±0.53*
#P < 0.001 vs. normal group. *P < 0.001 vs. LPS 10ng/㎖+DEP 200㎍/㎖ treated group. **P < 0.01 vs. LPS 10ng/㎖+DEP 200㎍/㎖ treated group. ***P < 0.05 vs. LPS 10ng/㎖+DEP 200㎍/㎖ treated group.
상기 실험결과는 도 2에 그래프로 도시하였다. 표 6 및 도 2로부터 확인되는 바와 같이, 본 발명의 GCWB1001, GCWB1085 및 GCWB1156 균주 모두 1㎍/㎖의 농도에서 미세먼지에 의한 NO 생성량을 유의하게 감소시키는 것으로 확인하였다. 다만 10 ㎍/㎖ 농도에서는 미세먼지에 의한 NO 생산량을 유의하게 감소시키진 않았다.
1-4) 활성산소종(reactive oxygen species; ROS) 측정
마우스 폐 대식세포주 NH-S 세포주는 세포 농도가 5Х105 cells/㎖이 되도록 현탁하고, 96-well plate에 100㎕씩 분주하였다. 시료인 상기 표 6의 균주 7종을 각각 1㎍/㎖ 및 10㎍/㎖의 농도로 1 시간 전처리한 후 LPS 100ng/ml을 6시간 동안 처리한 후 HBSS로 세척한 후 배양액에 DCF-DA(2´,7´-Dichlorofluorescein diacetate)/HBSS를 well 당 25μM로 처리하여 30분간 배양한 후 excitation 파장 485㎚, emission 파장 530㎚에서 형광값을 측정하였다.
상기 실험결과는 도 3에 그래프로 도시하였다. 본 발명의 GCWB1001, GCWB1085 및 GCWB1156 균주 모두 NO 분석과 마찬가지로 1㎍/㎖의 농도에서 미세먼지에 의한 ROS 생성량을 유의하게 감소시키는 것으로 확인하였다.
1-5) 염증성 전사조절인자 활성도 측정(iNOS-Luc, COX2-Luc, NF-κB-Luc; luciferase promoter activity 분석)
MH-S 세포를 1X106 cells/㎖로 분주한 후 iNOS-Luc, COX2-Luc, NF-κB-Luc가 각각 삽입된 플라스미드 벡터를 LipofectAMINE 2000 reagent(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 이용하여 세포 내로 도입하였다. 시료를 농도별로 24시간 처리한 후 세포를 수거하여 luciferase 활성도를 측정하였다.
도 4 내지 도 6에 의하면, GCWB1001, 1085 및 1156 균주 1㎍/㎖ 처리시 미세먼지에 의한 염증성 전사인자인 iNOS, COX2, 및 NF-κB의 프로모터 활성을 감소시켰다. 종합해보면, 본 발명의 균주는 염증 관련 유전자의 발현을 유도하는 NF-κB 전사인자 및 염증 유전자로 알려진 iNOS, COX 유전자의 프로모터 활성을 억제함으로써 염증과 관련된 유전자들의 발현을 억제할 수 있다.
실험예 2: 동물모델에서의 진해/거담 효능 연구( in vivo assay)
2-1) 실험조건 및 사육조건
실험동물은 6주령 male BALB/c mice(체중: 20±2 g)를 (주) 샘타코로부터 공급받아 온도 23 ± 1oC 상대습도 55 ± 15% 및 300-500 Lux의 조도로 12 시간 간격으로 명암이 조절되는 동물 사육실에서 7 일 이상 순화시킨 후 육안적 증상을 관찰하여 정상적인 동물만을 실험에 사용하며, 실험 동물용 고형사료(㈜ 샘타코) 및 물은 자유롭게 섭취시킨다. 모든 동물 실험은 한국국제대학교 실험동물 윤리 위원회의 승인을 얻어 진행하며, 미국 National Institutes of Health(NIH publication No. 86-23, revised 1985)의 가이드라인에 따라 수행하였다.
2-2) 진해작용 효능 연구
실험군은 1M 시트르산 단독 투여군(control), 시트르산 + Synatura 200 mg/kg(양성대조군), 시트르산+시료처치군(1X107), 시트르산+시료처치군(1X 109)등 4군으로 했고, 각 시험군 당 동물 수는 8 마리(n=8)로 하였다(표 7).
No 실험군(n=8) 농도
1 시트르산(control) 1 M
2 시트르산+Synatura 200 mg/kg
3 시트르산+시료처치군 1 x107 cfu
4 시트르산+시료처치군 1 x109 cfu
시료를 1시간 동안 경구투여 후 기침 유도제인 1M 시트르산을 비강(intranasal)으로 투여 후 각 실험군들을 챔버 안에 넣고, 10분간 기침 횟수를 측정하였다. 그 결과는 도 7에 나타난 바와 같이 GCWB1001, GCWB1085 균주 모두 1X109 cfu 투여 후 시트르산에 의한 기침 횟수를 유의하게 감소시켰다.
2-3) 거담작용 효능 연구
실험군은 1M 페놀레드(phenol-red) 투여군, 페놀레드+ Synatura 200 ㎎/㎏(양성대조군), 페놀레드 +시료처치군(1X107), 시트르산+시료처치군(1X109) 등 4군으로 했고, 각 시험군 당 동물 수는 8 마리(n=8)로 하였다(표 8).
No 실험군 농도
1 Phenol red+Saline 10mg/kg
2 Phenol red+Synatura 200 mg/kg
3 Phenol red+시료처치군 1x107 cfu
4 Phenol red+시료처치군 1x109 cfu
시료를 경구투여 후 1시간 후 0.2㎖ 페놀레드(10㎎/㎖)을 복강 내(intraperitoneal) 주사한 후 30분 후 실험동물을 희생한 후 기관(trachea)을 적출하였다.
적출한 기관의 무게를 측정한 후 0.5㎖, 0.9% Saline(w/v)을 첨가하여 vortex한다. 발색 기질인 1M NaOH를 100㎕ 첨가한 후 550㎚에서의 흡광도를 측정하였다.
도 8에 나타난 바와 같이 GCWB1001, GCWB1085 균주 모두 1X109 cfu 투여 후 페놀 레드의 배출양이 유의적으로 증가하였다.
종합해보면, 본 발명의 균주는 기침횟수를 감소시키고, 거담작용을 증가시키므로, 호흡기 질환의 증상을 호전시킬 수 있다.
실험예 3: 만성호흡기질환 동물모델에서의 폐기능 개선효과 분석( in vivo assay)
3-1) 실험조건 및 사육조건
실험동물은 6주령 male BALB/c mice(체중: 20±2 g)를 (주) 샘타코로부터 공급받아 온도 23 ± 1 oC 상대습도 55 ± 15% 및 300-500 Lux의 조도로 12 시간 간격으로 명암이 조절되는 동물 사육실에서 7 일 이상 순화시킨 후 육안적 증상을 관찰하여 정상적인 동물만을 실험에 사용하며, 실험 동물용 고형사료(㈜ 샘타코) 및 물은 자유롭게 섭취시켰다. 모든 동물 실험은 한국국제대학교 실험동물 윤리 위원회의 승인을 얻어 진행하며, 미국 National Institutes of Health(NIH publication No. 86-23, revised 1985)의 가이드라인에 따라 수행하였다.
3-2) 만성호흡기질환 동물모델 확립 및 실험물질 투여
수컷 6주령 BALB/c 마우스에 Day 1, Day 12(감작; Sensitization)에 각각 1회 200 ㎕의 aluminum hydroxide(Al(OH)3)와 saline의 1:1 혼합물에 100㎍의 오브알부민(ovalbumin; OVA)을 복강으로 투여하였다. 실험시작 19, 20일 째에 50㎍의 OVA(Challenge)를 1회 비강투여 하였다. 마지막 OVA를 비강으로 투여한 후(20일), 400㎍의 디젤배기입자(DEP)를 3 시간 간격으로 3회 비강투여 하고, 21일 째에 실험을 종료하였다.
마지막 시료 투여 24 시간 후에 urethane(Sigma-Aldrich, UK, USA)을 복강투여(0.020㎖/g weight)하여 마취시킨 후 bronchoalveolar lavage fluid(BALF)를 확보한다. 본 발명의 균주는 Day 0~Day 20일 동안 매일 1회 경구투여 하였다. GCWB1001, GCWB1085, GCWB1156 시료를 각각 마리당 1X107 cfu, 1X109 cfu를 경구투여하였다. Synatura(200㎎/㎏)는 양성대조군으로 사용하였고, 각 실험군 당 동물 수는 8 마리(n=8)로 하였다(표 9).
No. 실험군(n=8) 농도
1 NA(control) -
2 OVA(Ovalbumin) 100 ㎍
3 OVA+ DEP(Diesel exhaust particles) 400 ㎍
4 OVA+DEP+GCWB1001 1x107 cfu
5 OVA+DEP+GCWB1001 1x109 cfu
6 OVA+DEP+GCWB1085 1x107 cfu
7 OVA+DEP+GCWB1085 1x109 cfu
8 OVA+DEP+GCWB1156 1x107 cfu
9 OVA+DEP+GCWB1156 1x109 cfu
10 OVA+DEP+Synatura 200 mg/kg
3-3) 체중 및 장기무게 측정
마지막 시료 투여 24 시간 후에 urethane(Sigma-Aldrich, UK, USA)을 복강투여(0.020 ㎖/g weight)하여 마취시킨 후 bronchoalveolar lavage fluid(BALF)를 확보한 후 폐를 적출하여 무게를 측정하였다. 또한, 추가로 몸무게, 간장 및 비장 무게를 측정하였다.
체중은 모든 군에서 변화가 없었으며, OVA 및 OVA+DEP 처리군에서 폐의 무게가 무처리군과 비교하여 증가하였으며, GCWB1001(1X109 cfu), GCWB1085(1X109 cfu), GCWB1156(1X109 cfu), Synatura 처리군에서 OVA+DEP 처리에 의해서 증가한 폐조직의 무게가 유의성 있게 감소하였다. 비장 역시 GCWB1001(1X107 cfu), GCWB1085(1X109 cfu), GCWB1156(1X109 cfu)에서 OVA+DEP 처리에 의해서 증가한 비장, 폐 조직의 무게가 유의성 있게 감소하였다.
3-4) 만성호흡기질환 동물모델에서 본 발명 균주의 폐기능 개선 평가-기관지폐포세포액 분석
마지막 시료 투여 24 시간 후에 urethane(Sigma-Aldrich, UK, USA)을 복강투여(0.020 ㎖/g weight)하여 마취 후 기관지폐포세척액(bronchoalveolar lavage fluid; BALF)을 확보한 후, BALF에서 면역세포 프로파일(Total cells, Macrophages, Eosinophils, Neutrophils, Lymphocytes)을 측정하였다.
도 10에 의하면, 정상군과 비교하여 OVA 처리군에서 측정한 모든 면역세포들의 세포 수가 유의성 있게 증가하였고, OVA 처리군과 비교하여 OVA+DEP 처리군에서도 전체 세포 수를 포함하는 면역세포들이 세포 수가 유의성 있게 증가하였다. 하지만, OVA+DEP 처리에 의해서 증가한 면역세의 세포수는 시료인 GCWB1001, GCWB1085, GCWB1156, Synatura 처리군에서 세포수가 유의성 있게 감소하였다.
특히 각 균주를 1X109 cfu를 처리한 경우 모든 면역세포의 세포 수는 양성 대조군인 synatura와 필적할만한 세포 수 감소를 보였고, 1X107 cfu를 처리했을 때에도 Lymphocytes를 제외한 나머지 세포 수(Total cells, Macrophages, Eosinophils, Neutrophils)는 유효하게 감소하였다.
따라서, 본 발명의 균주는 폐 조직 내의 면역 세포의 침투를 감소시키므로, 호흡기 질환의 진행을 막을 수 있을 것이다.
3-5) 만성호흡기질환 동물모델에서 본 발명 균주의 폐기능 개선 평가-OVA 특이적 IgE 측정(BALF, serum)
마지막 시료 투여 24 시간 후에 urethane(Sigma-Aldrich, UK, USA)을 복강투여(0.020 ㎖/g weight)하여 마취시킨 후 bronchoalveolar lavage fluid(BALF) 및 serum을 확보한 후 염증반응의 일종인 알레르기 반응의 지표인 OVA-specific-IgE의 양을 측정하였다.
도 11에 나타난 바와 같이 정상군과 비교하여 OVA 처리군의 BALF(도 11A) 및 serum(도 11B)에서 OVA-특이적-IgE가 유의성 있게 증가하였으며, OVA 처리군과 비교하여 OVA+DEP 처리군에서 OVA-특이-IgE 가 유의하게 증가하였다. 시료인 GCWB1001(1X107, 1X109 cfu), GCWB1085(1X107, 1X109 cfu), GCWB1156(1X107, 1X109 cfu), Synatura 처리군에서 OVA+DEP 처리에 의해서 증가한 OVA-특이-IgE가 유의하게 감소하였다. 따라서, 본 발명의 균주는 염증반응의 지표인 폐 및 전신 알레르기 반응을 감소시킬 수 있다.
3-6) 만성호흡기질환 동물모델에서 본 발명 균주의 폐기능 개선 평가 - BALF에서 cytokine(TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-4, IL-13, MCP-1, IFN-gamma) 측정
마지막 시료 투여 24 시간 후에 urethane(Sigma-Aldrich, UK, USA)을 복강투여(0.020 ㎖/g weight)하여 마취시킨 후 BALF에서 사이토카인(TNF-α, IL-6, IL-1
Figure 112020052031467-pat00004
, IL-4, IL-13, MCP-1, IFN-gamma)의 ELISA kit(R&D system USA)을 이용하여 측정하였다.
정상군과 비교하여 OVA 처리군에서 TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-4, IL-13, MCP-1이 유의하게 증가하였으며, OVA 처리군과 비교하여 OVA+DEP 처리군에서 TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-13, MCP-1가 유의하게 증가하였다. 본 발명의 균주인 GCWB1001(1X107, 1X109 cfu), GCWB1085(1X107, 1X109 cfu), GCWB1156(1X107, 1X109 cfu), Synatura 처리군에서 OVA+DEP 처리에 의해서 증가한 TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-4, IL-13, MCP-1가 유의하게 감소하였다(도 12A ~ 도 12D).
또한, OVA+DEP 처리군에서 IFN-γ의 양이 감소하였으며, GCWB1001(1X107, 1X109 cfu), GCWB1085(1X107, 1X109 cfu), GCWB1156(1X107, 1X109 cfu), Synatura 처리군에서 유의하게 증가하였다(도 12G).
따라서, 본 발명의 균주들은 폐에서의 전염증성 사이토카인은 줄이며, 항염증성 사이토카인을 늘리므로, 폐 조직 내의 염증 반응을 감소시킬 수 있고, 이로 인해 호흡기 질환의 진행을 막을 수 있을 것이다.
3-7) 만성호흡기질환 동물모델에서 본 발명 균주의 폐기능 개선 평가 - 조직학적 검사(H&E 염색)
좌엽 폐조직을 10% formalin에 24 시간 동안 고정시킨 후 paraffin 블럭을 제조하여 4 ㎛ 두께로 절단한 후 H&E 염색을 수행하였다. 광학현미경으로 이미지를 확보한 후 염증(inflammation) 정도를 측정하였다.
정상군과 비교하여 OVA 처리군에서 염증세포 침투가 유의하게 증가하였으며, OVA 처리군과 비교하여 OVA+DEP 처리군에서 염증세포 침투가 유의하게 증가하였다.
본 발명의 균주인 GCWB1001(1X107, 1X109 cfu), GCWB1085(1X107, 1X109 cfu), GCWB1156(1X107, 1X109 cfu), Synatura 처리군에서 OVA+DEP 처리에 의해서 증가한 염증세포들의 침투가 유의성 있게 감소하였다(도 13).
따라서, 본 발명의 균주들은 폐 조직 내의 염증 세포의 침투를 막으므로, 폐 조직 내의 염증 반응을 감소시켜, 호흡기 질환의 진행을 막을 수 있을 것이다.
3-8) 만성호흡기질환 동물모델에서 본 발명 균주의 폐기능 개선 평가 - 조직학적 검사(alcian blue-PAS stain)
본 발명의 균주가 실제 폐 조직 내의 점액질 단백질의 생성을 억제하는지 확인하기 위해 글리코겐과 뮤신을 염색하기 위한 alcian blue-PAS 염색법으로 폐조직을 염색했다.
도 14는 실제 염색한 조직 사진으로 정상군과 비교하여 OVA 처리군에서 폐포에서의 점액질 단백질의 생성이 유의성 있게 증가하였으며, OVA 처리군과 비교하여 OVA+DEP 처리군에서 점액질 단백질의 생성이 유의성 있게 증가하였다. 시료인 GCWB1001(1X107, 1X109 cfu), GCWB1085(1X107, 1X109 cfu), GCWB1156(1X107, 1X109 cfu), Synatura 처리군에서 OVA+DEP 처리에 의해서 증가한 점액질 단백질의 생성이 유의성 있게 감소하였다(도 14).
따라서, 본 발명의 균주는 폐포에서의 점액질을 감소시키므로, 호흡기 질환의 폐섬유증 등으로의 병기 악화를 막을 수 있을 것이다.
3-9) 만성호흡기질환 동물모델에서 본 발명 균주의 폐기능 개선 평가 - caspase 3 활성 및 전체 콜라겐 함량
본 발명의 균주가 실제 폐 조직 내의 세포사멸(apoptosis)이 감소되고, 폐 손상이 호전되는지 확인하기 위해 폐 조직 내의 caspase 3 활성 및 전체 콜라겐 함량을 측정하였다.
도 15에 의하면 정상군과 비교하여 OVA 처리군에서 caspase-3 활성 및 콜라겐 함량이 유의하게 증가하였으며, OVA 처리군과 비교하여 OVA+DEP 처리군에서 caspase-3 activity 및 콜라겐 함량이 유의성 있게 증가하였다. 본 발명의 균주인 GCWB1001(1X107, 1X109 cfu), GCWB1085(1X107, 1X109 cfu), GCWB1156(1X107, 1X109 cfu), Synatura 처리군 모두에서는 OVA+DEP 처리에 의해서 증가한 caspase-3 활성 및 콜라겐 함량이 모두 유의하게 감소하였다(도 15).
따라서, 본 발명의 균주는 세포 사멸 인자를 감소시킬 뿐 아니라, 콜라겐 함량을 감소시켜 호흡기 질환의 병기 악화인 폐섬유증을 막을 수 있을 것이다.
3-10) 만성호흡기질환 동물모델에서 본 발명 균주의 폐기능 개선 평가 - MMP9 활성 분석
BALF(bronchoalveolar lavage fluid)에서 0.2% gelatin이 함유된 10% SDS-PAGE 전기 영동 방법에 의하여 분리된 단백질을 0.25% Coomassie Brilliant Blue G250(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) 염색하여 MMP-9효소 활성을 측정하였다.
도 16에 따르면 정상군과 비교하여 OVA 처리군에서 MMP-9 활성이 유의하게 증가하였으며, OVA 처리군과 비교하여 OVA+DEP 처리군에서 MMP-9 활성이 유의하게 증가하였다. 본 발명의 균주인 GCWB1001(1X109 cfu), GCWB1085(1X109 cfu), GCWB1156(1X109 cfu), Synatura 처리 군에서 OVA+DEP 처리에 의해서 증가한 MMP-9 활성이 유의하게 감소하였다.
따라서, 본 발명의 균주는 폐 조직 내 염증 세포의 침착을 막을 수 있으므로, 폐 조직 내의 염증 및 염증으로 인한 여러 합병증을 막을 수 있을 것이다.
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cgaagaagtg 600 catcggaaac tgggaaactt gagtgcagaa gaggacagtg gaactccatg tgtagcggtg 660 aaatgcgtag atatatggaa gaacaccagt ggcgaaggcg gctgtctggt ctgtaactga 720 cgctgaggct cgaaagtatg ggtagcaaac aggattagat accctggtag tccataccgt 780 aaacgatgaa tgctaagtgt tggagggttt ccgcccttca gtgctgcagc taacgcatta 840 agcattccgc ctggggagta cggccgcaag gctgaaactc aaaggaattg acgggggccc 900 gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagctacgc gaagaacctt accaggtctt 960 gacatactat gcaaatctaa gagattagac gttcccttcg gggacatgga tacaggtggt 1020 gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080 ccttattatc agttgccagc attaagttgg gcactctggt gagactgccg gtgacaaacc 1140 ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg 1200 ctacaatgga tggtacaacg agttgcgaac tcgcgagagt aagctaatct cttaaagcca 1260 ttctcagttc ggattgtagg ctgcaactcg cctacatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg 1320 cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1380 tgagagtttg taacacccaa agtcggtggg gtaacctttt aggaaccagc cgct 1434 <210> 2 <211> 1499 <212> RNA <213> Pediococcus acidilactici <400> 2 ctcaggatga acgctggcgg cgtgcctaat acatgcaagt cgaacgaact tccgttaatt 60 gatcaggacg tgcttgcact gaatgagatt ttaacacgaa gtgagtggcg gacgggtgag 120 taacacgtgg gtaacctgcc cagaagcagg ggataacacc tggaaacaga tgctaatacc 180 gtataacaga gaaaaccgcc tggttttctt ttaaaagatg gctctgctat cacttctgga 240 tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcg atgatgcgta 300 gccgacctga gagggtaatc ggccacattg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 360 aggcagcagt agggaatctt ccacaatgga cgcaagtctg atggagcaac gccgcgtgag 420 tgaagaaggg tttcggctcg taaagctctg ttgttaaaga agaacgtggg tgagagtaac 480 tgttcaccca gtgacggtat ttaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 540 ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg atttattggg cgtaaagcga gcgcaggcgg 600 tcttttaagt ctaatgtgaa agccttcggc tcaaccgaag aagtgcattg gaaactggga 660 gacttgagtg cagaagagga cagtggaact ccatgtgtag cggtgaaatg cgtagatata 720 tggaagaaca ccagtggcga aggcggctgt ctggtctgta actgacgctg aggctcgaaa 780 gcatgggtag cgaacaggat tagataccct ggtagtccat gccgtaaacg atgattacta 840 agtgttggag ggtttccgcc cttcagtgct gcagctaacg cattaagtaa tccgcctggg 900 gagtacgacc gcaaggttga aactcaaaag aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 960 catgtggttt aattcgaagc tacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cttctgccaa 1020 cctaagagat taggcgttcc cttcggggac agaatgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1080 gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaaccctta ttactagttg 1140 ccagcattca gttgggcact ctagtgagac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1200 cgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggatggta 1260 caacgagttg cgaaaccgcg aggtttagct aatctcttaa aaccattctc agttcggact 1320 gtaggctgca actcgcctac acgaagtcgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1380 cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccatgaga gtttgtaaca 1440 cccaaagccg gtggggtaac cttttaggag ctagccgtct aaggtgggac agatgatta 1499 <210> 3 <211> 1188 <212> RNA <213> Lactobacillus rhamnosus <400> 3 gttgatcggc cacattggga ctgagacacg gcccaaactc ctacgggagg cagcagtagg 60 gaatcttcca caatggacgc aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgagtga agaaggcttt 120 cgggtcgtaa aactctgttg ttggagaaga atggtcggca gagtaactgt tgtcggcgtg 180 acggtatcca accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 240 tggcaagcgt tatccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggttt tttaagtctg 300 atgtgaaagc cctcggctta accgaggaag tgcatcggaa actgggaaac ttgagtgcag 360 aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agatatatgg aagaacacca 420 gtggcgaagg cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg ctcgaaagca tgggtagcga 480 acaggattag ataccctggt agtccatgcc gtaaacgatg aatgctaggt gttggagggt 540 ttccgccctt cagtgccgca gctaacgcat taagcattcc gcctggggag tacgaccgca 600 aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 660 tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatctt ttgatcacct gagagatcag 720 gtttcccctt cgggggcaaa atgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga 780 gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatga ctagttgcca gcatttagtt 840 gggcactcta gtaagactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca 900 tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg 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Claims (25)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 수탁번호 KCCM12699P로 기탁된 Pediococcus acidilactici GCWB1085 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 페이스트화물, 희석물 중 어느 하나를 포함하는 미세먼지에 의한 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 균주는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 16S rRNA를 포함하는 것인, 건강기능성 식품 조성물.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제3항 또는 제4항에 있어서,
    상기 균주는 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 또는 파쇄물인 것인, 건강기능성 식품 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 건강기능성 식품 조성물은 조미제, 감미제, 향미제로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 더 포함하는 것인, 건강기능성 식품 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 건강기능성 식품 조성물은 과립제(granules), 산제(powders), 정제(tablets), 캅셀제(capsules) 중 선택되는 어느 하나인 것인, 건강기능성 식품 조성물.
  10. 삭제
  11. 수탁번호 KCCM12699P로 기탁된 Pediococcus acidilactici GCWB1085 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 페이스트화물, 희석물 중 어느 하나를 포함하는 미세먼지에 의한 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서,
    상기 호흡기 질환은 천식, 기관지 확장증, 특발성폐섬유화증, 만성폐쇄성 폐질환(COPD; chronic obstructive pulmonary disease), 낭포성섬유증, 폐기종, 알레르기 비염, 하기도 감염증, 세기관지염, 급성상기도감염증, 기관지 확장증, 폐렴, 급만성기관지염, 부비강염, 인후염, 편도염 및 후두염으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 미세먼지에 의한 호흡기 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  12. 수탁번호 KCCM12699P로 기탁된 Pediococcus acidilactici GCWB1085 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 페이스트화물, 희석물 중 어느 하나를 포함하는, 진해 또는 거담용 약학적 조성물.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 균주는 분무건조물, 동결건조물, 진공건조물, 드럼건조물, 또는 파쇄물인 것인, 약학적 조성물.
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 약학적 조성물을 약학적으로 허용되는 부형제 또는 담체를 추가로 포함하는 것인, 약학적 조성물.
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 수탁번호 KCCM12699P로 기탁된 Pediococcus acidilactici GCWB1085 균주를 포함하는 미세먼지에 의한 호흡기 질환의 예방 또는 개선용 프로바이오틱스.
  18. 삭제
  19. 제17항에 있어서,
    상기 프로바이오틱스는 1Х101 ~ 1Х1013 CFU/g의 생균 함량을 갖는 것인, 프로바이오틱스.
  20. 삭제
  21. 삭제
  22. 삭제
  23. 제11항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 폐 조직 내 염증 반응을 감소시키는 것인, 약학적 조성물.
  24. 제11항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 알레르기 반응을 감소시키는 것인, 약학적 조성물.
  25. 제11항에 있어서,
    상기 약학적 조성물은 폐섬유화를 억제하는 것인, 약학적 조성물.
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