BR112014012887A2 - lactobacillus brevis produtor de reuterina - Google Patents

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Abstract

lactobacillus brevis produtor de reuterina. a presente invenção refere-se a cepas produtoras e acumuladoras de reuterina de lactobacillus brevis e aos seus usos, em particular para o tratamento ou a prevenção de condições resultantes da infecção por helicobacter pylori (h. pylori). a presente invenção ainda refere-se a uma composição nutricional que compreende uma cepa de lactobacillus.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "LACTOBACILLUS BREVIS PRODUTOR DE REUTERINA".
[001] A presente invenção refere-se a cepas produtoras de reute- rina de Lactobacillus brevis (L. brevis) e aos seus usos, em particular para o tratamento ou a prevenção de infecção por Helicobacter pylori (H. pylori) e condições resultantes disto.
[002] Reuterina (3-hidroxipropionaldeído, 3-HPA) é um composto antimicrobiano que foi inicialmente identificado como produzido por várias cepas de Lactobacillus reuteri (L. reuteri) quando cultivadas sob condições anaeróbicas na presença de glicerol (TALARICO & DOBROGOSZ, Antimicrob Agents Chemother, 33, 674-9, 1989). A conversão de glicerol para reuterina é catalisada por um glicerol desi- dratase dependente de cobalamina (Gld; EC 4.2.1.30), que é compos- ta de três subunidades (C, D e E, ou α, β e γ respectivamente). A exis- tência da via de glicerol desidratase (GDA) também foi relatada em espécies de lactobacilos exceto tais como Lactobacillus collinoides, Lactobacillus brevis, e Lactobacillus hilgardii. Para todas as espécies, a existência desta via parece variar de cepa à cepa, dependendo da presença de um gene que codifica glicerol desidratase ou diol desidra- tase (Cadieux et al., Appl Environ Microbiol, 74, 4645-9, 2008; Sauva- geot et al., FEMS Microbiology Letters, 209, 69-74, , 2002; Claisse and Lonvaud-Funel, Journal of Food Protection, 64, 833-837, 2001). Na maioria das bactérias que metabolizam glicerol através da via de GDA, a reuterina é normalmente um intermediário metabólico que é subse- quentemente reduzido intracelularmente para 1,3-propanodiol, (1,3- PD) que é excretado no meio extracelular. Apenas algumas das cepas que possuem glicerol- ou diol desidratase são capazes de acumular reuterina no meio de cultura. A maioria destas cepas acumuladoras de reuterina pertence à espécie L. reuteri. Entretanto, algumas cepas ca- pazes de acumular reuterina extracelularmente, geralmente em menor grau do que L. reuteri, foram relatadas em outras espécies de lactoba- cilos: Lactobacillus coryniformis (MARTIN et al., Int J Food Microbiol, 104, 267-77, 2005), Lactobacillus collinoides (Garai-Ibabe et al., Inter- national Journal of Food Microbiology 121, 253-261, 2008; Sauvageot et al., International Journal of Food Microbiology, 55, 167-170, 2000), e Lactobacillus hilgardii (Pasteris and Strasser de Saad, J. Agric. Food Chem., 57 (9), 3853-3858, 2009). Mais recentemente, uma cepa de Lactobacillus brevis e uma cepa de Lactobacillus pentosus capazes de acumular reuterina extracelularmente (até concentrações, no entanto, vezes mais baixas do que L. reuteri) foram descritas (Bauer et al., International Journal of Food Microbiology, 137, 28-31, 2010).
[003] Reuterina tem um espectro amplo de atividade antimi- crobiana sobre micro-organismos potencialmente nocivos. A reuterina pode inibir o crescimento de leveduras, fungos, protozoários, e várias bactérias nocivas em concentrações quatro a cinco vezes mais baixas do que aquelas necessárias para inibir o crescimento de bactérias do ácido láctico. Devido a esta atividade antimicrobiana seletiva de reute- rina, que permite que ela destrua uma variedade de micro-organismos patogênicos enquanto não prejudicando as bactérias do ácido láctico benéficas da flora intestinal, foi proposto usá-la para tratar vários trans- tornos digestivos.
[004] Várias cepas de L. reuteri foram consideradas como probió- ticos candidatos, em particular por causa de seus efeitos protetivos contra patógenos tais como Salmonella enterica, Escherichia coli, Clostridium difficile, e Helicobacter pylori (CLEUSIX et al., BMC Micro- biol, 7, 101, 2007; SPINLER et al., Anaerobe, 14, 166-71, 2008; FRANCAVILLA et al., Helicobacter, 13, 127-34, 2008; PCT WO 2004/031368). Estes efeitos foram ligados pelo menos em parte à pro- dução de reuterina.
[005] Entre os micro-organismos patogênicos do trato gastroin-
testinal, Helicobacter pylori foi um foco de interesse crescente nos úl- timos anos. Ela é uma bactéria em forma espiral Gram-negativa que coloniza a camada de muco gástrico humano de mais do que 50 % da população mundial. Embora a maioria dos indivíduos infectados com H. pylori seja assintomática embora seu epitélio gástrico mostre sinal de inflamação, 15 % a 20 % de indivíduos infectados com H. pylori de- senvolverão doenças. H. pylori é o principal agente causativo de úlcera péptica, gastrite ativa crônica, atrofia, metaplasia, displasia, câncer gástrico e linfoma do tecido linfoide associado à mucosa gástrica (MALTE) (ver para revisão (FOX & WANG, J Clin Invest, 117, 60-9, 2007; POLK & PEEK, Nat Rev Cancer, 10, 403-14)).
[006] O tratamento padrão em pacientes infectados com H. pylori é o tratamento com dois antibióticos mais um PPI (inibidor da bomba de prótons), assim chamado terapia tripla. Entretanto, a taxa de erradi- cação de H. pylori a seguir da terapia tripla está caindo por causa da resistência do antibiótico ou complacência deficiente. Além disso, ape- sar de vários ensaios, ainda não existe nenhuma vacina eficaz dispo- nível no mercado.
[007] O uso de probióticos foi proposto como alternativas ou complementos para a terapia tripla para tratar ou prevenir H. pylori. Como indicado acima, estes probióticos incluem em particular L. reute- ri devido em particular às suas propriedades antimicrobianas. Algumas cepas de outras espécies de lactobacilos também foram propostas como potencialmente úteis para o manejo de infecção por H. pylori. Por exemplo, SIMOVA et al. (J Appl Microbiol, 106, 692-701, 2009), divulgam uma cepa de Lactobacillus delbrueckii (BB18) que produz um peptídeo inibitório (bacteriocina) e que inibe fortemente H. pylori. LINSALATA et al. (Helicobacter, 9, 165-72, 2004), estudaram os efei- tos de uma cepa de L. brevis particular (CD2) com uma atividade de arginina desiminase alta sobre a sobrevivência de H. pylori na mucosa gástrica humana. Eles descobriram uma redução da carga de H. pylori intragástrica, e sugeriram que a mesma pode ser devido à atividade de arginina desiminase elevada, que privaria H. pylori de arginina, e inibi- ria seu crescimento e proliferação.
[008] Os inventores isolaram agora uma cepa de Lactobacillus brevis tendo a capacidade de produzir reuterina e acumulá-la em quantidade suficiente para ter atividade antimicrobiana em uma faixa ampla de cepas de H. pylori.
[009] Uma cepa "capaz de acumular reuterina" ou uma cepa "acumuladora de reuterina" é definida aqui como uma cepa que é ca- paz de produzir reuterina e secreta-la extracelularmente.
[0010] Portanto, um objetivo da presente invenção é esta cepa de L. brevis que foi depositada de acordo com o Tratado de Budapeste com o CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, rue du Docteur Roux, Paris) em 3 de Fevereiro de 2011, sob o nú- mero de acesso CNCM I-4431.
[0011] Além de sua capacidade de produzir e acumular reuterina, esta cepa tem as características seguintes: - Morfologia: bactérias baciliformes com coloração homogênea, agru- padas em cadeias pequenas; - Metabolismo: heterofermentativa; - Fermentação dos açúcares seguintes (resultados obtidos em um meio API MRS com tira Api 50 CH a 37 °C por 48 h): L-Arabinose, D- Ribose, D-xilose, D-Glicose, D-Frutose, D-Maltose, D-Melibiose, Glico- nato de Potássio, 5-Cetogluconato de Potássio.
[0012] A presente invenção também abrange cepas acumuladoras de reuterina de L. brevis derivadas por mutagênese ou por transforma- ção genética da cepa CNCM I-4431, contanto que elas mantenham as propriedades antimicrobianas e a capacidade de produção de reuteri- na desta cepa precursora. Elas podem ser cepas em que um ou mais dos genes endógenos da cepa CNCM I-4431 foram mutados, por exemplo, de modo a modificar algumas de suas propriedades metabó- licas (por exemplo, a capacidade desta cepa de metabolizar açúcares, sua resistência ao trânsito intestinal, sua resistência à acidez, ou sua pós-acidificação). Elas também podem ser cepas resultantes da trans- formação genética da cepa CNCM I-4431 com um ou mais genes de interesse, tornando possível, por exemplo, conferir características fisio- lógicas adicionais sobre a dita cepa, ou expressar proteínas de inte- resse terapêutico ou de vacina, de modo que seja desejado adminis- trar por meio da dita cepa.
[0013] Estas cepas podem ser obtidas da cepa CNCM I-4431 por meio das técnicas convencionais para mutagênese aleatória ou sítio- dirigida e transformação genética de lactobacilos, tais como aquelas descritas, por exemplo, por Gury et al. (Arch Microbiol., 182, 337-45, 2004) ou por Velez et al. (Appl Environ Microbiol., 73, 3595-3604, 2007), ou por meio da técnica conhecida como "embaralhamento ge- nômico" (Patnaik et al. Nat Biotechnol, 20, 707-12, 2002; Wang Y. et al., J Biotechnol., 129, 510-15, 2007).
[0014] Um assunto da presente invenção também é um método para obter uma cepa acumuladora de reuterina de Lactobacillus brevis, compreendendo uma etapa de mutagênese ou transformação genética da cepa CNCM I-4431.
[0015] As cepas de L. brevis da invenção podem ser usadas para produzir reuterina. Portanto, outro assunto da presente invenção é um método para produzir reuterina compreendendo as etapas de: - cultivar a cepa de L. brevis da invenção como definido acima, preferi- velmente a cepa CNCM I-4431, na presença de glicerol e - recuperar a reuterina produzida pela cultura.
[0016] Um assunto da presente invenção também é uma composi- ção compreendendo uma cepa de L. brevis da invenção, pre-
ferivelmente a cepa CNCM I-4431.
[0017] Na composição da invenção, a dita cepa pode ser usada na forma de bactérias integrais, preferivelmente bactérias vivas.
[0018] As composições da invenção podem estar em qualquer forma adequada para administração, em particular administração oral. Isto inclui, por exemplo, sólidos, semissólidos, líquidos, e pós. Compo- sições líquidas são geralmente preferidas para administração mais fá- cil, por exemplo, como bebidas.
[0019] A composição pode compreender pelo menos 105 cfu, pre- ferivelmente pelo menos 106 cfu, por g de peso seco, de uma cepa de L. brevis da invenção.
[0020] A composição pode compreender ainda outras cepas de bactérias, em particular cepa(s) probiótica(s), tais como cepa(s) de Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus ou Lactococcus.
[0021] A composição pode compreender tipicamente 105 a 1013 unidades formadoras de colônia (cfu), preferivelmente pelo menos 106 cfu, mais preferivelmente pelo menos 107 cfu, ainda mais preferi- velmente pelo menos 108 cfu, e o mais preferivelmente pelo menos 109 cfu por g de peso seco da composição da cepa de L. brevis da inven- ção. No caso de uma composição líquida, esta corresponde geral- mente a 104 a 1012 unidades formadoras de colônia (cfu), preferivel- mente pelo menos 105 cfu, mais preferivelmente pelo menos 106 cfu, ainda mais preferivelmente pelo menos 107 cfu, e o mais preferivel- mente pelo menos 109 cfu/ml.
[0022] A composição pode ser uma composição nutricional, inclu- indo produtos alimentícios, suplementos alimentícios e alimento funci- onal. Um "suplemento alimentício" designa um produto fabricado de compostos usualmente usados em gêneros alimentícios, mas que es- tão na forma de tabletes, pó, cápsulas, poção ou qualquer outra forma usualmente não associada com alimentos, e que tem efeitos benéficos para a saúde de alguém. Um "alimento funcional" é um alimento que também tem efeitos benéficos para a saúde de alguém. Em particular, suplementos alimentícios e alimento funcional podem ter um efeito fi- siológico - protetivo ou curativo - contra uma doença, por exemplo, contra uma doença crônica.
[0023] A composição nutricional de acordo com a invenção tam- bém inclui um alimento para bebê, uma fórmula de leite infantil ou uma fórmula de continuação infantil. Preferivelmente a presente com- posição é um produto nutracêutico ou um farmacêutico, um suple- mento nutricional ou alimento medicinal.
[0024] A composição pode ser um produto lácteo, preferivelmente um produto lácteo fermentado. O produto fermentado pode estar pre- sente na forma de um líquido ou presente na forma de um pó seco ob- tido secando-se o líquido fermentado. Exemplos de produtos lácteos incluem leite fermentado e/ou soro de leite fermentado na forma prepa- rada, agitada ou bebível, queijo e iogurte.
[0025] O produto fermentado também pode ser um vegetal fer- mentado, tal como soja fermentada, cereais e/ou fruitas nas formas set, agitada ou bebível.
[0026] Em uma forma de realização preferida, o produto fer- mentado é um produto fresco. Um produto fresco, que não passou por etapas de tratamento térmico severo, tem a vantagem de que cepas bacterianas presentes estão na forma viva.
[0027] Um assunto da presente invenção também é uma cepa de L. brevis da invenção, preferivelmente a cepa CNCM I-4431, ou uma composição da invenção para o uso como um medicamento. As cepas de L. brevis e composições da invenção são particularmente úteis para tratar ou prevenir uma infecção por H. pylori.
[0028] Um assunto da presente invenção também é o uso de uma cepa de L. brevis da invenção, preferivelmente a cepa CNCM I-4431,
ou uma composição da invenção como um medicamento, ou para a fabricação de um medicamento, preferivelmente um medicamento pa- ra tratar ou prevenir infecção por H. pylori.
[0029] Um assunto da presente invenção também é um método para tratar ou prevenir infecção por H. pylori em um indivíduo em ne- cessidade deste, o dito método compreendendo administrar ao dito indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma cepa de L. brevis da invenção, preferivelmente a cepa CNCM I-4431, ou de uma composição da invenção.
[0030] A presente invenção também abrange um método para a fabricação de um medicamento, preferivelmente um medicamento pa- ra tratar ou prevenir infecção por H. pylori, o dito método compreen- dendo incorporar uma cepa de L. brevis como definido acima, preferi- velmente a cepa CNCM I-4431, em pelo menos uma diluente, carre- gador ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.
[0031] Métodos para diagnosticar uma infecção por H. pylori são conhecidos na técnica. Por via de exemplo, a diagnose de uma infec- ção por H. pylori pode ser feita verificando-se por um teste de anticor- po sanguíneo, um teste de antígeno fecal ou o teste respiratório da ureia marcada com carbono. Ela também pode ser feita por biópsia sob endoscopia, seguido por um teste de urease, um exame histológi- co ou uma cultura microbiana.
[0032] Sintomas ou doenças associados com infecção por H. pylo- ri são em particular dor estomacal, azia, refluxo ácido, dor abdominal, regurgitação, vômito, eructação, flatulência, náusea, esofagite, gastrite tal como gastrite ativa crônica, úlcera péptica, atrofia, metaplasia, dis- plasia, câncer gástrico e linfoma do tecido linfoide associado à mucosa gástrica (MALTE).
[0033] A presente invenção será entendida mais claramente a par- tir da descrição adicional que segue que se refere a exemplos que ilus-
tram as propriedades imunomoduladoras e anti-infecciosas antimicro- bianas da cepa CNCM I-4431 assim como às figuras anexas.
[0034] A Figura 1 mostra os resultados da reação PCR de cepas de Lactobacillus brevis para a sequência de gldC. A faixa superior em 728 bp representa o produto esperado usando os iniciadores específi- cos do gene gldC. A faixa inferior em 201 bp representa o produto es- perado usando os iniciadores específicos do gene 16S rRNA (controle de PCR positivo); Smart: DNA SMART Ladder (Eurogentec); C+: resul- tado de PCR obtido do controle de DNA da cepa positiva para gldC de Lactobacillus reuteri ATCC 55730; I-4431: resultado de PCR obtido do DNA da cepa de L. brevis CNCM I-4431; L. brevis 80: resultado de PCR obtido do DNA da L. brevis 80 C-: resultado de PCR obtido do controle de DNA de uma cepa negativa para gldC de Streptococcus thermophilus; H2O: resultado de PCR obtido de água estéril.
[0035] A Figura 2 mostra a quantificação de H. pylori (cepa NTCTC11637) em C. elegans depois da ingestão de H. pylori sozinho (barra preta), de cepa I-4431 de H. pylori + L. brevis cultivada em MRS (barra cinza escura), de cepa I-4431 de H. pylori + L. brevis cultivada em MRS com glicerol (barra branca), ou de H. pylori + MRS com glice- rol.
[0036] Exemplo 1: Inibição in vitro do crescimento de cepas de H. pylori pela cepa de L. brevis CNCM I-4431 Material & Métodos Cepas de Lactobacillus brevis: - L. brevis CNCM I-4431 - L. brevis 80: Uma cepa convencional de L. brevis Cepas de Helicobacter pylori:
[0037] Três etapas de referência de H. pylori foram usadas assim como cinco isolados clínicos.
[0038] Cepas de referência:
- 26695: descrito em Tombs et al. (Nature 388, 539-547, 1997); - HPAG1: descrito em Oh et al. (Proc Natl Acad Sci U S A.,103, 9999 - 10004, 2006); - TN2GF4: isolada no Japão de um paciente com úlcera gástrica e adaptada para Gerbo (cepa descrita em Watanabe, et al. Gastroente- rol 1998; vol 115, páginas 642-648) Isolados clínicos: - CR113 e CR114: cepas isoladas de biópsias de lesões gástricas pré- cancerosas humanas; - Axcan 342 e Axcan 374: cepas isoladas respectivamente de um pa- ciente com gastrite e um paciente com esofagite incluídos no estudo clínico testando uma terapia quádrupla para erradicação de H. pylori (Malfertheiner et al., Lancet, 377, 905-913, 2011). - GC3C: cepa isolada de um paciente com um câncer gástrico. Método:
[0039] Cepas de L. brevis foram cultivadas em Caldo MRS (pH 6,2) por 17 h. As suspensões bacterianas foram neutralizadas no pH 6,8 com uma solução de KOH.
[0040] Cepas de H. pylori foram cultivadas por 48 h em Caldo de Brucela até obter uma turvação equivalente ao padrão Mac Farland 4. As suspensões bacterianas foram difundidas sobre a superfície de placas de Ágar Mueller Hinton suplementadas com 10 % (v/v) de san- gue de ovelha, enriquecido por suplemento Polivitex em 1 % (v/v) (Bi- omerieux) e no mesmo meio com glicerol a uma concentração final de 100 mM para permitir a produção de reuterina.
[0041] Discos de papel estéreis foram aplicados sobre a superfície das placas. Depois, 5 µL da suspensão de L. brevis neutralizada foram aplicados sobre cada disco de papel. As placas foram incubadas a 37 °C sob atmosfera microaerofílica (separador de gás microaerofílico de Ruskin, resultando em 5 % de O2, 10 % de CO2, e 85 % de N2) por 72 h até 96 h.
[0042] Para avaliar o efeito da suspensão de L. brevis sobre o crescimento da cepa de H. pylori, a largura dos anéis de inibição do crescimento em torno dos discos de papel foi medida. Resultados
[0043] Os resultados são mostrados na tabela I abaixo. Tabela I Axcan 342 Axcan 374 TN2GF4 HPAG1 CR113 CR114 GC3C 26695 L. brevis I-4431 30 30 15 15 10 30 11 30 Anel de inibição em mm L. brevis I-4431 0 0 0 0 0 0 0 0 Anel de inibição em mm (sem glicerol L. brevis 80 0 0 0 15 0 0 0 40 Anel de inibição em mm L. brevis 80 0 0 0 0 0 0 0 0 Anel de inibição em mm sem glicerol
[0044] Estes resultados mostram que enquanto L. brevis 80 tem propriedades inibitórias em apenas duas cepas de H. pylori testadas, L. brevis I-4431 inibe o crescimento de 8 das 8 cepas de H. pylori tes- tadas. Estas propriedades inibitórias parecem estar ligadas ao acúmu- lo de reuterina, visto que elas são apenas observadas com culturas de L. brevis cultivadas na presença de glicerol. Exemplo 2: Triagem por PCR do gene gldc Material & Métodos
[0045] A presença em L. brevis CNCM I-4431 do gene que codifica a subunidade grande de glicerol desidratase (GldC) - a enzima res- ponsável pela produção de reuterina - foi testada seguindo o método descrito por Cadieux et al. (2008, citado acima).
[0046] Brevemente, o DNA total foi isolado de cada cepa bacteria- na testada.
[0047] Como um controle positivo (C+), a cepa de L. reuterii ATCC 55730 produtora de reuterina foi usada. Como um controle negativo (C-), uma cepa de uma espécie não produtora de reuterina (Strepto- coccus thermophilus) foi usada.
[0048] A amplificação de um fragmento do gene que codifica a su- bunidade grande de Gld (gldC) foi realizada com os iniciadores dege- nerados: GDCRev: GCRGCYTTSATATCTKSAACCAT (SEQ ID NO: 1) e GDCFor: GCMTAYGCWGAAACCATTTCAGTTTA (SEQ ID NO: 2), ambos descritos em Cadieux et al.. O tamanho esperado do fragmento gldC amplificado é de 728 pf.
[0049] Como um controle por reação PCR positivo, um fragmento do gene 16S rRNA também foi amplificado de todas as amostras usando-se os iniciadores eubacterianos: 16SFor: ACTCCTACGGGAGGCAGCAG (SEQ ID NO: 3) e 16SRev: GTATTACCGCGGCTGCTGGCAC (SEQ ID NO: 4), ambos também descritos em Cadieux et al..
[0050] O tamanho esperado do fragmento 16S rRNA amplificado é de 201 pf. Resultados
[0051] Os resultados da reação PCR são mostrados na Figura 1. A cepa L. brevis CNCM I-4431, L. brevis 80 assim como a cepa L. reute- rii ATCC 55730 produtora de reuterina (C+) foram positivas para o produto de 728 bp esperado. Consequentemente, a cepa L. brevis
CNCM I-4431 contém o gene gldC, permitindo que ela produza reute- rina. Exemplo 3: Efeito de infecção por L. brevis CNCM I-4431 por H. pylori sobre o modelo de C. elegans Culturas de L. brevis e H. pylori
[0052] A cepa de L. brevis CNCM I-4431 foi cultivada em Caldo MRS como divulgado no exemplo 1.
[0053] A cepa NCTC11637 (ATCC 43504T) de H. pylori foi cultiva- da em meio BHI (Oxoid) contendo 5 % (v/v) de sangue de cavalo (Oxoid).
[0054] Os sobrenadantes foram separados das células por centri- fugação e neutralizados com NaOH (1 M). Depois, os sobrenadantes foram filtrados (0,22 µm) e adicionados à pelota celular.
[0055] No caso de culturas de H. pylori, meio BHI contendo san- gue de cavalo (Oxoid) foi removido por centrifugação e as células fo- ram lavadas com solução salina.
[0056] As placas de ágar NG usadas para os ensaios de infecção por C. elegans foram preparadas por adição de 100 µL de uma mistura contendo cada cultura LAB a O.D. = 2,22 (incluindo células e sobrena- dante) com as células correspondentes de cepa de H. pylori (O.D. = 0,022). Na condição de referência, os nematódeos não foram alimen- tados com células de H. pylori, LAB onde foram recolocados em sus- pensão em solução salina e adicionados às placas. Ensaios de infecção por C. elegans.
[0057] Os ensaios de infecção foram realizados com a cepa do tipo selvagem de C. elegans (N2). A cepa NCTC11637 de H. pylori foi usada para a infecção com nematódeo. Os experimentos foram inicia- dos com adultos jovens sincronizados (nematódeos de três dias) que foram transferidos para as diferentes condições de cultura: - meio NG + E. coli OP50 (controle).
- meio NG + E. coli OP50 + 100 µL de meio de cultura LAB (controle do meio de cultura). - meio NG + E. coli OP50 + 100 µL (H. pylori NCTC 11637T + LAB).
[0058] Os vermes foram incubados a 25 ºC durante 8 dias, transfe- rindo-os para novas placas a cada dois dias. A sobrevivência da popu- lação de nematódeo foi registrada em cada condição de cultura. De- pois do período de incubação, amostras de 15 vermes por condição foram tomadas, lavando-as com tampão M9 contendo 0,1 % de Triton X-100. Os vermes foram interrompidos usando 0,4 g de pérolas de carbureto de silício e vórtice.
[0059] O DNA dos vermes infectados foi isolado com um kit co- mercial "High Pure PCR Template Preparation Kit" (Roche), seguido por um processo de precipitação e lavagem subsequente com etanol absoluto e acetato de potássio 5 M. Diluições de amostras de DNA fo- ram usadas para quantificar a presença de H. pylori nas amostras por RT-PCR RT-PCR
[0060] Os iniciadores usados neste estudo são dirigidos ao gene vacA (NAYAK & ROSE, J Appl Microbiol, 103, 1931-41, 2007). Eles são nomeados como HpylF (5’ CAA TAG CAA TCA AGT GGC TTT G 3’, SEQ ID NO: 5) e HpylR (5’ GCG CGC TTC CAC ATT AGC 3’; SEQ ID NO: 6). A especificidade foi previamente verificada in silico por fer- ramenta em linha BLAST e in vitro por Q-PCR com cepas da espécie H. pylori, cepas probióticas diferentes e E. coli OP50 usados para ali- mentação de C. elegans (ver o relatório prévio de otimização). O "SYBR® Green PCR Master Mix" (Applied Biosystem) e termociclador StepOne Real-Time (Applied Biosystem) foram usados. A Tabela 2 abaixo resume as condições otimizadas para a reação de H. pylori por Q-PCR.
Tabela 2. Mistura de Reação Mistura Mestre 2x 1x Iniciador forward: 325 nM Iniciador reverso: 325 nM Ciclagem térmica Estágio de retenção 50 ºC 2 min. 95 ºC 10 min. Estágio de ciclagem (x40) 95 ºC 15 s. 60 ºC 1 min.
[0061] O DNA para a curva padrão foi preparado por quantificação de DNA de H. pylori por espectrofotometria (A260). O número dos ge- nomas correspondentes foi calculado como segue: - Número do Genoma = DNA (g) x NA/Mm - Tamanho do genoma de H. pylori = 1,6 Mpb - NA= 6,023 x1023 - Número do Genoma = DNA (g) x 6,023 x 1023/1,6 x 106 x 2 x 309
[0062] A curva padrão foi realizada usando quatro diluições de dez vezes de DNA.
[0063] Os resultados obtidos com a cepa I-4431 cultivada em MRS ou cultivada em MRS + glicerol são mostrados na Figura 2. Estes re- sultados mostram que a cepa CNCM I-4431 reduz a carga de H. pylori NCTC 11637T em C. elegans. A redução da infecção é mais importan- te quando a cepa I-4431 é cultivada em MRS + glicerol, mostrando que pelo menos parte do efeito anti-infeccioso desta cepa resulta da pro- dução de reuterina.

Claims (8)

REIVINDICAÇÕES
1. Cepa de Lactobacillus brevis acumuladora de reuterina, selecionada entre: - a cepa de Lactobacillus brevis CNCM I-4431; - uma cepa de Lactobacillus brevis derivada por mutagêne- se ou por transformação genética da cepa CNCM I-4431;
2. Uso de uma cepa de Lactobacillus brevis como definido na reivindicação 1, para produzir reuterina.
3. Composição que compreende uma cepa de Lactobacillus como definido na reivindicação 1.
4. Composição de acordo com a reivindicação 3, caracteri- zada pelo fato de que a mesma compreende pelo menos 105 cfu, pre- ferivelmente pelo menos 106 cfu, por grama de peso seco, da dita cepa de Lactobacillus brevis.
5. Composição de acordo com a reivindicação 3 ou 4, ca- racterizada pelo fato de que a mesma é uma composição nutricional.
6. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracteri- zada pelo fato de que a mesma é um produto lácteo.
7. Cepa de Lactobacillus brevis de acordo com a reivindica- ção 1 ou composição como definido em qualquer uma das reivindica- ções 3 a 6, para o uso como um medicamento.
8. Cepa de Lactobacillus brevis ou composição para o uso como um medicamento de acordo com a reivindicação 7, caracteriza- da pelo fato de que o dito medicamento é para tratar ou prevenir uma infecção por H. pylori.
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