CN107739747B - 一种利用罗伊氏乳杆菌与醋杆菌共发酵高密度生产罗伊特林素的方法 - Google Patents

一种利用罗伊氏乳杆菌与醋杆菌共发酵高密度生产罗伊特林素的方法 Download PDF

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Abstract

一种利用罗伊氏乳杆菌与醋杆菌共发酵高密度生产罗伊特林素的方法，属于微生物发酵领域。其包括以下工艺步骤:对超低温保藏的罗伊氏乳杆菌和醋酸杆菌进行活化处理；将活化好的罗伊氏乳杆菌和醋酸杆菌发酵培养；在摇床培养24小时，测定培养基中葡萄糖和甘油的含量，培养过程中当葡萄糖低于20.0g/L，以及甘油低于10g/L，添加补料液以维持最初浓度。本发明利用两种菌共发酵产生罗伊特林素，使得罗伊特林素能够吸附在微小球结构中，实现罗伊氏乳杆菌和醋酸杆菌高密度发酵，提高罗伊特林素浓度。

Description

一种利用罗伊氏乳杆菌与醋杆菌共发酵高密度生产罗伊特林 素的方法
技术领域
本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种利用罗伊氏乳杆菌与醋杆菌共发酵高密度生产罗伊特林素的方法。
背景技术
罗伊特林素是一种低分子量、pH值中性，水—水溶性物质，具有抗菌和杀虫作用。肠道乳酸杆菌与人体胃肠功能的健康有密切关系。证据证明饮食乳酸菌疗法能预防结肠癌的发生。
此外，由食品和药物管理局（FDA，美国，1989）规定，使用Lactobacillus reuterin作为食物补充剂被认为是安全和健康的。
有研究表明罗伊特林素能使肉品净化与保鲜。证据表明罗伊特林素能够在猪肉表面和火腿冷藏时（7ºC）减少单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌O157:H7的活力。因此罗伊特林素能够作为一种天然的杀菌剂。
醋酸杆菌在发酵时置于摇床震荡培养可以形成微小球结构，能够吸附小分子物质，从而使得所需物质的浓度变大。
本发明利用罗伊氏乳杆菌与醋杆菌共发酵，使得罗伊特林素能够吸附在微小球结构中以实现高密度发酵来产生罗伊特林素，具有很好的市场前景。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种利用罗伊氏乳杆菌与醋杆菌共发酵高密度生产罗伊特林素的方法的技术方案。
所述的一种利用罗伊氏乳杆菌与醋杆菌共发酵高密度生产罗伊特林素的方法，其特征在于包括以下工艺步骤:
1）对超低温保藏的罗伊氏乳杆菌和醋酸杆菌进行活化处理；
2）将活化好的罗伊氏乳杆菌和醋酸杆菌接种于发酵培养基中在37℃恒温摇床中进行24h有氧发酵，所述的发酵培养基含有蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉5.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，葡萄糖40.0g/L，20g/L 甘油，磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，0.035mol/L的磷酸钾缓冲液，灭菌冷却到50 ℃条件下加入体积分数为2％的乙醇；
3）在摇床培养24小时，测定培养基中葡萄糖和甘油的含量，培养过程中当葡萄糖低于20.0g/L，以及甘油低于10g/L ，添加补料液以维持最初浓度，所述的补料液为含有10%葡萄糖和10%甘油的水溶液。
所述的一种利用罗伊氏乳杆菌与醋杆菌共发酵高密度生产罗伊特林素的方法，其特征在于所述的步骤1）中对超低温保藏的罗伊氏乳杆菌和醋酸杆菌进行活化处理具体包括：
从-80℃超低温保藏箱中取出用甘油保藏的罗伊氏乳杆菌，在 MRS 固体培养基上划线，置于 37℃恒温生化培养箱中培养 18-24h 后，利用接种环挑取单菌落接种到 10mLMRS 的液体培养基中，在 37℃恒温生化培养箱中进行 24h 厌氧培养用以活化；
从-80℃超低温保藏箱中取出用甘油保藏的醋酸杆菌，在固体培养基上划线，置于37℃恒温生化培养箱中培养18-24h 后，利用接种环挑取单菌落接种到 10mL的液体培养基中，置于在37℃恒温摇床中进行24h有氧发酵用以活化；所述的固体培养基含有葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，琼脂粉20g/L，灭菌冷却到50 ℃条件下加入体积分数为2％的乙醇；所述的液体培养基含有葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，灭菌冷却到50 ℃条件下加入体积分数为2％的乙醇。
所述的一种利用罗伊氏乳杆菌与醋杆菌共发酵高密度生产罗伊特林素的方法，其特征在于所述的步骤2）中罗伊氏乳杆菌和醋酸杆菌的接种量比为1:2～2:1。
本发明利用两种菌共发酵产生罗伊特林素，使得罗伊特林素能够吸附在微小球结构中，实现了罗伊氏乳杆菌和醋酸杆菌高密度发酵，提高了罗伊特林素浓度。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步说明本发明。
实施例1
1）菌种活化
从-80℃超低温保藏箱中取出用甘油保藏的罗伊氏乳杆菌，在 MRS 固体培养基上划线，置于 37℃恒温生化培养箱中培养 18-24h 后，利用接种环挑取单菌落接种到10mLMRS 的液体培养基中，在 37℃恒温生化培养箱中进行 24h 厌氧培养用以活化。
从-80℃超低温保藏箱中取出用甘油保藏的醋酸杆菌，在固体培养基（葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，琼脂粉20g/L灭菌冷却到50 ℃条件下加入体积分数为2％的乙醇）上划线，置于 37℃恒温生化培养箱中培养18-24h 后，利用接种环挑取单菌落接种到 10mL的液体培养基中（葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，灭菌冷却到50 ℃条件下加入体积分数为2％的乙醇），置于在37℃恒温摇床中进行24h有氧发酵用以活化。
2）菌种摇床共发酵
将活化好的罗伊氏乳杆菌和醋酸杆菌按1%和2%接种量置于发酵培养基中（蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉5.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，葡萄糖40.0g/L，20g/L 甘油，磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，0.035mol/L的磷酸钾缓冲液(23.668g/L氯化钠，0.604g/L氯化钾,0.612g/L磷酸二氢钾，4.180g/L磷酸氢二钾)，灭菌冷却到50℃条件下加入体积分数为2％的乙醇），置于在37℃恒温摇床中进行24h有氧发酵用以发酵产生罗伊特林素和微小球结构。
3）补料
在摇床培养后的24小时，测定培养基中葡萄糖和甘油的含量，当葡萄糖低于20.0g/L，以及甘油低于10g/L ，添加补料液（含有10%葡萄糖和10%甘油的水溶液）以维持最初浓度。
经过24小时发酵，罗伊氏乳杆菌和醋酸杆菌的菌种密度稳定在1010 CFU/mL，罗伊特林素的浓度维持在105ppm（罗伊氏乳杆菌单一发酵产罗伊特林素的浓度为45ppm）。
实施例2
1）菌种活化
从-80℃超低温保藏箱中取出用甘油保藏的罗伊氏乳杆菌，在 MRS 固体培养基上划线，置于 37℃恒温生化培养箱中培养 18-24h 后，利用接种环挑取单菌落接种到10mLMRS 的液体培养基中，在 37℃恒温生化培养箱中进行 24h 厌氧培养用以活化。
从-80℃超低温保藏箱中取出用甘油保藏的醋酸杆菌，在固体培养基（葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，琼脂粉20g/L灭菌冷却到50 ℃条件下加入体积分数为2％的乙醇）上划线，置于 37℃恒温生化培养箱中培养18-24h 后，利用接种环挑取单菌落接种到 10mL的液体培养基中（葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，灭菌冷却到50 ℃条件下加入体积分数为2％的乙醇），置于在37℃恒温摇床中进行24h有氧发酵用以活化。
2）菌种摇床共发酵
将活化好的罗伊氏乳杆菌和醋酸杆菌按2%和1%接种量置于发酵培养基中（蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉5.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，葡萄糖40.0g/L，20g/L 甘油，磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，0.035mol/L的磷酸钾缓冲液(23.668g/L氯化钠，0.604g/L氯化钾,0.612g/L磷酸二氢钾，4.180g/L磷酸氢二钾)，灭菌冷却到50 ℃条件下加入体积分数为2％的乙醇），置于在37℃恒温摇床中进行24h有氧发酵用以发酵产生罗伊特林素和微小球结构。
3）补料
在摇床培养后的24小时后，测定培养基中葡萄糖和甘油的含量，当葡萄糖低于20.0g/L，以及甘油低于10g/L ，添加补料液（葡萄糖20%，甘油5%）以维持最初浓度。
经过24小时发酵，罗伊氏乳杆菌和醋酸杆菌的菌种密度稳定在1010 CFU/mL，罗伊特林素的浓度维持在98ppm（罗伊氏乳杆菌单一发酵产罗伊特林素的浓度为45ppm）。
实施例3
1）菌种活化
从-80℃超低温保藏箱中取出用甘油保藏的罗伊氏乳杆菌，在 MRS 固体培养基上划线，置于 37℃恒温生化培养箱中培养 18-24h 后，利用接种环挑取单菌落接种到10mLMRS 的液体培养基中，在 37℃恒温生化培养箱中进行 24h 厌氧培养用以活化。
从-80℃超低温保藏箱中取出用甘油保藏的醋酸杆菌，在固体培养基（葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，琼脂粉20g/L灭菌冷却到50 ℃条件下加入体积分数为2％的乙醇）上划线，置于 37℃恒温生化培养箱中培养18-24h 后，利用接种环挑取单菌落接种到 10mL的液体培养基中（葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，灭菌冷却到50 ℃条件下加入体积分数为2％的乙醇），置于在37℃恒温摇床中进行24h有氧发酵用以活化。
2）菌种摇床共发酵
将活化好的罗伊氏乳杆菌和醋酸杆菌按1%和1%接种量置于发酵培养基中（蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉5.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，葡萄糖40.0g/L，20g/L 甘油，磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，0.035mol/L的磷酸钾缓冲液(23.668g/L氯化钠，0.604g/L氯化钾,0.612g/L磷酸二氢钾，4.180g/L磷酸氢二钾)，灭菌冷却到50 ℃条件下加入体积分数为2％的乙醇），置于在37℃恒温摇床中进行24h有氧发酵用以发酵产生罗伊特林素和微小球结构。
3）补料
在摇床培养后的24小时后，测定培养基中葡萄糖和甘油的含量，当葡萄糖低于20.0g/L，以及甘油低于10g/L ，添加补料液（葡萄糖10%，甘油15%）以维持最初浓度。
经过24小时发酵，罗伊氏乳杆菌和醋酸杆菌的菌种密度稳定在1010 CFU/mL，罗伊特林素的浓度维持在95ppm（罗伊氏乳杆菌单一发酵产罗伊特林素的浓度为45ppm）。

Claims (2)

1.一种利用罗伊氏乳杆菌与醋杆菌共发酵高密度生产罗伊特林素的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：
1）对超低温保藏的罗伊氏乳杆菌和醋酸杆菌进行活化处理；
2）将活化好的罗伊氏乳杆菌和醋酸杆菌接种于发酵培养基中在37℃恒温摇床中进行24h有氧发酵，罗伊氏乳杆菌和醋酸杆菌的接种量比为1:2～2:1，所述的发酵培养基含有蛋白胨10.0g/L，牛肉浸粉5.0g/L，酵母浸粉4.0g/L，葡萄糖40.0g/L，20g/L 甘油，磷酸氢二钾2.0g/L，乙酸钠5.0g/L，柠檬酸三铵2.0g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，0.035mol/L的磷酸钾缓冲液，灭菌冷却到50 ℃条件下加入体积分数为2％的乙醇；
3）在摇床培养24小时，测定培养基中葡萄糖和甘油的含量，培养过程中当葡萄糖低于20.0g/L，以及甘油低于10g/L ，添加补料液以维持最初浓度，所述的补料液为含有10%葡萄糖和10%甘油的水溶液。
2.如权利要求1所述的一种利用罗伊氏乳杆菌与醋杆菌共发酵高密度生产罗伊特林素的方法，其特征在于所述的步骤1）中对超低温保藏的罗伊氏乳杆菌和醋酸杆菌进行活化处理具体包括：
从-80℃超低温保藏箱中取出用甘油保藏的罗伊氏乳杆菌，在 MRS 固体培养基上划线，置于 37℃恒温生化培养箱中培养 18-24h 后，利用接种环挑取单菌落接种到 10mLMRS 的液体培养基中，在 37℃恒温生化培养箱中进行 24h 厌氧培养用以活化；
从-80℃超低温保藏箱中取出用甘油保藏的醋酸杆菌，在固体培养基上划线，置于 37℃恒温生化培养箱中培养18-24h 后，利用接种环挑取单菌落接种到 10mL的液体培养基中，置于在37℃恒温摇床中进行24h有氧发酵用以活化；所述的固体培养基含有葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，琼脂粉20g/L，灭菌冷却到50 ℃条件下加入体积分数为2％的乙醇；所述的液体培养基含有葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，灭菌冷却到50 ℃条件下加入体积分数为2％的乙醇。
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