CN109251874B - 一种益生菌制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种益生菌制剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及水产养殖领域，公开了一种益生菌制剂及其制备方法和应用。所述益生菌制剂为由芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌和光合菌通过液态发酵制备得到，所述芽孢杆菌由枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌组成，所述乳酸菌由植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌组成，所述酵母菌由产朊假丝酵母和酿酒酵母组成，所述光合菌为沼泽红假单胞菌。该益生菌制剂能够有效降解水产养殖水体中的氨氮、亚硝酸盐，并分解水体有机物，调节水体的pH值，提高水体溶氧量，同时还能够抑制养殖水体中的有害病原菌。此外，当该益生菌制剂还可以改善水产动物肠道微生态环境，调节肠道菌群平衡，抑制有害菌生长，有助于增加营养吸收，提高饲料利用率。
Description
技术领域
本发明属于水产养殖领域，具体涉及一种益生菌制剂及其制备方法和应用。
背景技术
水产动物养殖主要是以利用可养殖的淡水或海水水域，按照养殖水产动物的生物学特性和对水域环境条件的要求，运用水产养殖技术和设施，从事水生经济动物养殖。近年来，随着我国的生活水平、经济条件的不断提高，水产品的供应量也大幅度提升，水产养殖已经受到人们越来越多的关注。然而，在水产养殖过程中也出现了一系列问题，例如，由于过量投饵料、施肥，致使有害微生物、有害藻类快速繁殖，以及出现排泄物与残饵污染，氨氮、亚硝酸盐含量增加，破坏养殖水体微生态平衡，以及各种生活、工业、农业的污水和污染养殖用水导致水质恶化；另一方面，养殖用户为了治疗或预防水产疾病，在养殖过程使用鱼药或抗生素，虽然取得了一定的应急治疗效果，但是却带来诸多问题，如抗药性、药物在水产动物或环境中残留。因此，采用某种无毒无害、绿色环保的产品来调节、改善养殖水体环境显得尤其重要。
采用益生菌群调水不仅具有无污染、无残留、无副作用、成本低等优势，还能够抑制病原微生物繁殖、提高水产动物自身免疫力、维持养殖生态环境平衡，因此益生菌产品已经成为当今研究热点，它是实施水产健康养殖的重要技术手段之一，故深受广大用户喜爱并被广泛接受，是未来养殖业发展的必然趋势。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的以上缺陷，而提供一种新的益生菌制剂及其制备方法和应用。
具体地，本发明提供了一种益生菌制剂，其中，所述益生菌制剂为由芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌和光合菌通过液态发酵制备得到，所述芽孢杆菌由枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌组成，所述乳酸菌由植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌组成，所述酵母菌由产朊假丝酵母和酿酒酵母组成，所述光合菌为沼泽红假单胞菌。
优选地，所述益生菌制剂中芽孢杆菌的活菌个数为3×107CFU/mL-9×107CFU/mL，所述乳酸菌的活菌个数为1×109CFU/mL-9×109CFU/mL，所述酵母菌的活菌个数为1×107CFU/mL-7×107CFU/mL，所述光合菌的活菌个数为4×105CFU/mL-6×105CFU/mL。
优选地，所述芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌的活菌个数为4×107CFU/mL-9×107CFU/mL，纳豆芽孢杆菌的活菌个数为3×107CFU/mL-8×107CFU/mL；所述乳酸菌中植物乳杆菌的活菌个数为2×109CFU/mL-8×109CFU/mL，嗜酸乳杆菌的活菌个数为1×109CFU/mL-8×109CFU/mL，干酪乳杆菌的活菌个数为1×109CFU/mL-5×109CFU/mL；所述酵母菌中产朊假丝酵母的活菌个数为1×107CFU/mL-6×107CFU/mL，酿酒酵母的活菌个数为4×107CFU/mL-6×107CFU/mL；所述光合菌中沼泽红假单胞菌的活菌个数为4×105CFU/mL-6×105CFU/mL。
优选地，所述益生菌制剂的pH值为3.5以下。
本发明还提供了一种益生菌制剂的制备方法，该方法包括将芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌和光合菌进行液态发酵，所述芽孢杆菌由枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌组成，所述乳酸菌由植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌组成，所述酵母菌由产朊假丝酵母和酿酒酵母组成，所述光合菌为沼泽红假单胞菌。
优选地，所述液态发酵的方法包括以下步骤：
(1)原菌种活化：将枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌分别接种到已灭菌的斜面培养基I中好氧培养直至长出菌落，将冷冻保藏的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌分别接种到已灭菌的斜面培养基II中好氧培养直至长出菌落，将产朊假丝酵母和酿酒酵母分别接种到已灭菌的斜面培养基III中好氧培养直至长出菌落，将沼泽红假单胞菌接种到已灭菌的斜面培养基IV中厌氧培养直至长出菌落，得到各自活化斜面菌种；
所述斜面培养基I含有牛肉膏1-5g、蛋白胨5-15g、氯化钠2-8g、琼脂10-30g和蒸馏水1L且pH值为7.2-7.5；所述斜面培养基II含有蛋白胨5-15g、牛肉粉2-8g、酵母粉2-8g、葡萄糖10-30g、吐温80 0.5-2mL、磷酸氢二钾1-5g、乙酸钠2-8g、柠檬酸三铵1-5g、硫酸镁0.1-1g、硫酸锰0.01-0.1g、琼脂粉10-30g和蒸馏水1L且pH值为6.2-6.5；所述斜面培养基III含有葡萄糖10-30g、蛋白胨10-30g、酵母膏5-15g、氯霉素0.05-0.2g、琼脂粉10-30g和蒸馏水1L且pH自然；所述培养基IV含有蛋白胨1-5g、酵母膏1-5g、氯化钙0.1-1g、硫酸镁0.1-1g、琼脂粉10-30g和蒸馏水1L且pH值为6.8-7.0；
(2)一级种子液的制备：分别将由步骤(1)得到的枯草芽孢杆菌斜面菌种和纳豆芽孢杆菌斜面菌种至少部分接种到已灭菌的液体培养基I中，于30-40℃好氧培养20-30h，分别得到各自芽孢杆菌原菌液；分别将由步骤(1)得到的植物乳杆菌斜面菌种、嗜酸乳杆菌斜面菌种和干酪乳杆菌斜面菌种至少部分接种到已灭菌的液体培养基II中，于30-40℃厌氧培养18-30h，分别得到各自乳酸菌原菌液；分别将由步骤(1)得到的产朊假丝酵母斜面菌种和酿酒酵母斜面菌种至少部分接种到已灭菌的液体培养基III中，于28-30℃好氧培养40-50h，分别得到各自酵母菌原菌液；将步骤(1)得到的沼泽红假单胞菌斜面菌种至少部分接种到已灭菌的液体培养基IV中，在钨丝灯照射的条件下，于28-30℃厌氧培养2-4d，得到沼泽红假单胞菌原菌液；
所述液体培养基I含有牛肉膏1-5g、蛋白胨5-15g、氯化钠2-8g和蒸馏水1L且pH值为7.2-7.5；所述液体培养基II含有蛋白胨5-15g、牛肉粉2-8g、酵母粉2-8g、葡萄糖10-30g、吐温80 0.5-2mL、磷酸氢二钾1-5g、乙酸钠2-8g、柠檬酸三铵1-5g、硫酸镁0.1-1g、硫酸锰0.01-0.1g和蒸馏水1L且pH值为6.2-6.5；所述液体培养基III含有葡萄糖10-30g、蛋白胨10-30g、酵母膏5-15g、氯霉素0.05-0.2g和蒸馏水1L且pH值自然；所述液体培养基IV含有蛋白胨1-5g、酵母膏1-5g、氯化钙0.1-1g、硫酸镁0.1-1g和蒸馏水1L且pH值为6.8-7.0；
(3)二级种子液的制备：将步骤(2)得到的植物乳杆菌原菌液、嗜酸乳杆菌原菌液和干酪乳杆菌原菌液各自独立地按0.5-2wt％的接种量接种到已灭菌的同一发酵培养基I中，于30-40℃厌氧培养18-20h，得到复合乳酸菌二级种子液；
(4)益生菌发酵：将枯草芽孢杆菌原菌液、纳豆芽孢杆菌原菌液、产朊假丝酵母原菌液、酿酒酵母原菌液与沼泽红假单胞菌原菌液各自独立地按0.5-2wt‰接种量接入已灭菌的同一发酵培养基II中，于30-40℃有氧发酵18-20h，之后再以5-10wt％的接种量接入所述复合乳酸菌二级种子液，将pH值调节至6.5-7，之后于30-40℃厌氧发酵24-48h；
所述发酵培养基I和第二发酵培养基II的组分相同或不同，且各自独立地含有糖蜜30-50g、酵母膏1-2g、磷酸氢二钾0.2-0.25g、硫酸镁0.2-0.25g、硫酸锰0.05-0.1g和蒸馏水1L且pH值为7.2-7.5。
优选地，步骤(1)中，将所述枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌进行好氧培养的条件各自独立地包括温度为30-40℃，时间为20-50h；将产朊假丝酵母和酿酒酵母进行好氧培养的条件包括温度为28-30℃，时间为30-50h；将沼泽红假单胞菌进行厌氧培养在钨丝灯照射的条件下进行，且温度为28-30℃，时间为30-50h。
优选地，步骤(4)中所述的益生菌发酵在搅拌下进行，且搅拌的转速为200-250r/min。
本发明还提供了由上述方法制备得到的益生菌制剂。
此外，本发明还提供了所述益生菌制剂在改善水体或者池塘底质中的应用。
本发明的发明人经过深入研究之后发现，枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、产朊假丝酵母、酿酒酵母和沼泽红假单胞菌能够起到非常完美的协同配合作用，将这几种益生菌进行液态混合发酵，所得的益生菌制剂能够有效降解水产养殖水体中的氨氮、亚硝酸盐，并分解水体有机物如残饵、排泄物与浮游动物残体等，调节水体的pH值，提高水体溶氧量，同时还能够对养殖水体中的大肠杆菌、沙门氏菌、弧菌等有害菌在一定程度上起到抑制作用。此外，当该益生菌制剂进入水产动物肠道之后，可以改善水产动物肠道微生态环境，调节肠道菌群平衡，抑制有害菌生长，并且该益生菌制剂可以代谢产生多种维生素以及多种蛋白酶和淀粉酶，有助于增加营养吸收，并促进肠道消化吸收，提高饲料利用率。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
本发明提供的益生菌制剂为由芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌和光合菌通过液态发酵制备得到，所述芽孢杆菌由枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌组成，所述乳酸菌由植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌组成，所述酵母菌由产朊假丝酵母和酿酒酵母组成，所述光合菌为沼泽红假单胞菌。
在本发明中，为了使得所述益生菌制剂具有更优异的改善水质的性能，优选地，所述益生菌制剂中芽孢杆菌的活菌个数为3×107CFU/mL-9×107CFU/mL，所述乳酸菌的活菌个数为1×109CFU/mL-9×109CFU/mL，所述酵母菌的活菌个数为1×107CFU/mL-7×107CFU/mL，所述光合菌的活菌个数为4×105CFU/mL-6×105CFU/mL。其中，所述芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌的活菌个数优选为4×107CFU/mL-9×107CFU/mL，纳豆芽孢杆菌的活菌个数优选为3×107CFU/mL-8×107CFU/mL；所述乳酸菌中植物乳杆菌的活菌个数优选为2×109CFU/mL-8×109CFU/mL，嗜酸乳杆菌的活菌个数优选为1×109CFU/mL-8×109CFU/mL，干酪乳杆菌的活菌个数优选为1×109CFU/mL-5×109CFU/mL；所述酵母菌中产朊假丝酵母的活菌个数优选为1×107CFU/mL-6×107CFU/mL，酿酒酵母的活菌个数优选为4×107CFU/mL-6×107CFU/mL；所述光合菌中沼泽红假单胞菌的活菌个数优选为4×105CFU/mL-6×105CFU/mL。此外，特别优选地，所述益生菌制剂的pH值为3.5以下。
本发明提供的益生菌制剂的制备方法包括将芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌和光合菌进行液态发酵，所述芽孢杆菌由枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌组成，所述乳酸菌由植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌组成，所述酵母菌由产朊假丝酵母和酿酒酵母组成，所述光合菌为沼泽红假单胞菌。
根据本发明的一种优选实施方式，所述液态发酵的方法包括以下步骤：
(1)原菌种活化：将枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌分别接种到已灭菌的斜面培养基I中好氧培养直至长出菌落，将冷冻保藏的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌分别接种到已灭菌的斜面培养基II中好氧培养直至长出菌落，将产朊假丝酵母和酿酒酵母分别接种到已灭菌的斜面培养基III中好氧培养直至长出菌落，将沼泽红假单胞菌接种到已灭菌的斜面培养基IV中厌氧培养直至长出菌落，得到各自活化斜面菌种；
所述斜面培养基I含有牛肉膏1-5g、蛋白胨5-15g、氯化钠2-8g、琼脂10-30g和蒸馏水1L且pH值为7.2-7.5；所述斜面培养基II含有蛋白胨5-15g、牛肉粉2-8g、酵母粉2-8g、葡萄糖10-30g、吐温80 0.5-2mL、磷酸氢二钾1-5g、乙酸钠2-8g、柠檬酸三铵1-5g、硫酸镁0.1-1g、硫酸锰0.01-0.1g、琼脂粉10-30g和蒸馏水1L且pH值为6.2-6.5；所述斜面培养基III含有葡萄糖10-30g、蛋白胨10-30g、酵母膏5-15g、氯霉素0.05-0.2g、琼脂粉10-30g和蒸馏水1L且pH自然；所述培养基IV含有蛋白胨1-5g、酵母膏1-5g、氯化钙0.1-1g、硫酸镁0.1-1g、琼脂粉10-30g和蒸馏水1L且pH值为6.8-7.0；
(2)一级种子液的制备：分别将由步骤(1)得到的枯草芽孢杆菌斜面菌种和纳豆芽孢杆菌斜面菌种至少部分接种到已灭菌的液体培养基I中，于30-40℃好氧培养20-30h，分别得到各自芽孢杆菌原菌液；分别将由步骤(1)得到的植物乳杆菌斜面菌种、嗜酸乳杆菌斜面菌种和干酪乳杆菌斜面菌种至少部分接种到已灭菌的液体培养基II中，于30-40℃厌氧培养18-30h，分别得到各自乳酸菌原菌液；分别将由步骤(1)得到的产朊假丝酵母斜面菌种和酿酒酵母斜面菌种至少部分接种到已灭菌的液体培养基III中，于28-30℃好氧培养40-50h，分别得到各自酵母菌原菌液；将步骤(1)得到的沼泽红假单胞菌斜面菌种至少部分接种到已灭菌的液体培养基IV中，在钨丝灯照射的条件下，于28-30℃厌氧培养2-4d，得到沼泽红假单胞菌原菌液；
所述液体培养基I含有牛肉膏1-5g、蛋白胨5-15g、氯化钠2-8g和蒸馏水1L且pH值为7.2-7.5；所述液体培养基II含有蛋白胨5-15g、牛肉粉2-8g、酵母粉2-8g、葡萄糖10-30g、吐温80 0.5-2mL、磷酸氢二钾1-5g、乙酸钠2-8g、柠檬酸三铵1-5g、硫酸镁0.1-1g、硫酸锰0.01-0.1g和蒸馏水1L且pH值为6.2-6.5；所述液体培养基III含有葡萄糖10-30g、蛋白胨10-30g、酵母膏5-15g、氯霉素0.05-0.2g和蒸馏水1L且pH值自然；所述液体培养基IV含有蛋白胨1-5g、酵母膏1-5g、氯化钙0.1-1g、硫酸镁0.1-1g和蒸馏水1L且pH值为6.8-7.0；
(3)二级种子液的制备：将步骤(2)得到的植物乳杆菌原菌液、嗜酸乳杆菌原菌液和干酪乳杆菌原菌液各自独立地按0.5-2wt％的接种量接种到已灭菌的同一发酵培养基I中，于30-40℃厌氧培养18-20h，得到复合乳酸菌二级种子液；
(4)益生菌发酵：将枯草芽孢杆菌原菌液、纳豆芽孢杆菌原菌液、产朊假丝酵母原菌液、酿酒酵母原菌液与沼泽红假单胞菌原菌液各自独立地按0.5-2wt‰接种量接入已灭菌的同一发酵培养基II中，于30-40℃有氧发酵18-20h，之后再以5-10wt％的接种量接入所述复合乳酸菌二级种子液，将pH值调节至6.5-7，之后于30-40℃厌氧发酵24-48h；
所述发酵培养基I和第二发酵培养基II的组分相同或不同，且各自独立地含有糖蜜30-50g、酵母膏1-2g、磷酸氢二钾0.2-0.25g、硫酸镁0.2-0.25g、硫酸锰0.05-0.1g和蒸馏水1L且pH值为7.2-7.5。
如上所述，步骤(1)中，将各芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌和光合菌进行培养的条件只要能够确保长出菌落即可。例如，将所述枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌进行好氧培养的条件可以各自独立地包括温度为30-40℃，时间为20-50h。将产朊假丝酵母和酿酒酵母进行好氧培养的条件可以各自独立地包括温度为28-30℃，时间为30-50h。将沼泽红假单胞菌进行厌氧培养可以在钨丝灯照射的条件下进行，且温度为28-30℃，时间为30-50h。
步骤(2)中，需要分别将各自活化斜面菌种至少部分接种至培养基中进行扩大培养，在具体操作过程中，可以采用接种环分别刮取相应的活化斜面菌种至适量(例如0.5-2L)的培养基中进行培养。
此外，步骤(4)中所述的益生菌发酵可以在搅拌状态下进行，也可以在非搅拌状态下进行，但为了加快益生菌增殖、提高活菌数量，优选地，所述益生菌发酵在搅拌状态下进行，且搅拌的转速为200-250r/min。
本发明还提供了由上述方法制备得到的益生菌制剂。
此外，本发明还提供了所述益生菌制剂在改善水体或者池塘底质中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例和对比例中：
枯草芽孢杆菌源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GIM1.271；纳豆芽孢杆菌源自苏州北纳创联生物技术有限公司，编号为：BNCC 185324；植物乳杆菌源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GIM1.191；嗜酸乳杆菌源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GIM1.208；干酪乳杆菌源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GIM1.204；产朊假丝酵母源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GDM2.148；酿酒酵母源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GIM2.213；沼泽红假单胞菌源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GIM1.167。
实施例1
该实施例用于说明本发明提供的益生菌制剂及其制备方法。
(1)原菌种活化：将在-18℃保藏的各菌种划线斜面活化，其中，枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌分别用斜面培养基I在37℃下好氧培养18h，其中，斜面培养基I的具体配方如下：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂20g和蒸馏水1L，pH值7.2，121℃灭菌20min。将植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌分别用斜面培养基II(MRS培养基培养)在37℃下厌氧静置培养24h，其中，斜面培养基II的具体配方如下：蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、吐温80 1.0mL、磷酸氢二钾2.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、琼脂粉20.0g和蒸馏水1L，pH值6.2，121℃灭菌20min。将产朊假丝酵母和酿酒酵母分别用斜面培养基III在30℃下好氧培养48h，其中，斜面培养基III具体配方如下：葡萄糖20.0g、蛋白胨20g、酵母膏10g、氯霉素0.1g、琼脂粉20.0g和蒸馏水1L，pH自然，115℃灭菌15min。将沼泽红假单胞菌用斜面培养基IV在钨丝灯下光照下，30℃厌氧培养48h，斜面培养基IV的具体配方如下：蛋白胨3g、酵母膏3g、氯化钙0.3g、硫酸镁0.5g、琼脂粉20.0g和蒸馏水1L，pH值6.8，115℃灭菌15min。
(2)一级种子液的制备：将枯草芽孢杆菌斜面菌种、纳豆芽孢杆菌斜面菌种、植物乳杆菌斜面菌种、嗜酸乳杆菌斜面菌种、干酪乳杆菌斜面菌种、产朊假丝酵母斜面菌种、酿酒酵母斜面菌种和沼泽红假单胞菌斜面菌种分别单独扩大培养，用接种环分别刮取以上活化斜面菌种至1L液体培养基中培养，培养基除不加琼脂粉外，其他组分以及培养条件同步骤(1)，得到各自的原菌液。
(3)二级种子液的制备：将步骤(2)扩大培养所得的植物乳杆菌原菌液、嗜酸乳杆菌原菌液、干酪乳杆菌原菌液均按1wt％接种量接种至100L发酵液I中，35℃厌氧培养20h，得到复合乳酸菌二级种子液。发酵液I具体配方如下：糖蜜30g、酵母膏1g、磷酸氢二钾0.2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、水1L，pH值7.2，115℃灭菌30min。
(4)益生菌发酵：将步骤(2)扩大培养所得的枯草芽孢杆菌原菌液、纳豆芽孢杆菌原菌液、产朊假丝酵母原菌液、酿酒酵母原菌液与沼泽红假单胞菌原菌液均按1wt‰接种量接入发酵液II中，在35℃下通气有氧发酵18h，搅拌转速250r/min，之后再以8wt％的接种量接入步骤(3)得到的复合乳酸菌二级种子液，调节pH值至6.5，之后于35℃下厌氧发酵48h，此期间的搅拌转速为200r/min。发酵液II具体配方如下：糖蜜30g、酵母膏1g、磷酸氢二钾0.2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、水1L，pH值7.2，115℃灭菌30min。
(5)发酵结束，将发酵所得的液态发酵物(益生菌制剂)直接进行分装与包装，并检测活菌。其中，芽孢杆菌的活菌个数为8.4×107CFU/mL(其中，枯草芽孢杆菌的活菌个数为5.2×107CFU/mL，纳豆芽孢杆菌的活菌个数为3.2×107CFU/mL)，乳酸菌的活菌个数为6.8×109CFU/mL(其中，植物乳杆菌的活菌个数为4.1×109CFU/mL，嗜酸乳杆菌的活菌个数为1.5×109CFU/mL，干酪乳杆菌的活菌个数为1.2×109CFU/mL)，酵母菌的活菌个数为5.6×107CFU/mL(其中，产朊假丝酵母的活菌个数为1.3×107CFU/mL，酿酒酵母的活菌个数为4.3×107CFU/mL)，光合菌的活菌个数为5.3×105CFU/mL，该益生菌制剂的pH值为3.5。
实施例2
该实施例用于说明本发明提供的益生菌制剂及其制备方法。
(1)原菌种活化：将在-18℃保藏的各菌种划线斜面活化，其中，枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌分别用斜面培养基I在37℃下好氧培养18h，其中，斜面培养基I的具体配方如下：牛肉膏1g、蛋白胨5g、氯化钠2g、琼脂10g和蒸馏水1L，pH值7.5，121℃灭菌20min。将植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌分别用斜面培养基II(MRS培养基培养)在37℃下厌氧静置培养24h，其中，斜面培养基II的具体配方如下：蛋白胨5.0g、牛肉粉2.0g、酵母粉2.0g、葡萄糖10.0g、吐温80 0.5mL、磷酸氢二钾1.0g、乙酸钠2.0g、柠檬酸三铵1.0g、硫酸镁0.5g、硫酸锰0.01g、琼脂粉10.0g和蒸馏水1L，pH值6.5，121℃灭菌20min。将产朊假丝酵母和酿酒酵母分别用斜面培养基III在30℃下好氧培养48h，其中，斜面培养基III具体配方如下：葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母膏5g、氯霉素0.05g、琼脂粉10.0g和蒸馏水1L，pH自然，115℃灭菌15min。将沼泽红假单胞菌用斜面培养基IV在钨丝灯下光照下，30℃厌氧培养48h，斜面培养基IV的具体配方如下：蛋白胨1g、酵母膏1g、氯化钙0.1g、硫酸镁0.1g、琼脂粉10.0g和蒸馏水1L，pH值7.0，115℃灭菌15min。
(2)一级种子液的制备：将枯草芽孢杆菌斜面菌种、纳豆芽孢杆菌斜面菌种、植物乳杆菌斜面菌种、嗜酸乳杆菌斜面菌种、干酪乳杆菌斜面菌种、产朊假丝酵母斜面菌种、酿酒酵母斜面菌种和沼泽红假单胞菌斜面菌种分别单独扩大培养，用接种环分别刮取以上活化斜面菌种至1L液体培养基中培养，培养基除不加琼脂粉外，其他组分以及培养条件同步骤(1)，得到各自的原菌液。
(3)二级种子液的制备：将步骤(2)扩大培养所得的植物乳杆菌原菌液、嗜酸乳杆菌原菌液、干酪乳杆菌原菌液均按1wt％接种量接种至100L发酵液I中，35℃厌氧培养20h，得到复合乳酸菌二级种子液。发酵液I具体配方如下：糖蜜40g、酵母膏1.5g、磷酸氢二钾0.2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、水1L，pH值7.5，115℃灭菌30min。
(4)益生菌发酵：将步骤(2)扩大培养所得的枯草芽孢杆菌原菌液、纳豆芽孢杆菌原菌液、产朊假丝酵母原菌液、酿酒酵母原菌液与沼泽红假单胞菌原菌液均按1wt‰接种量接入发酵液II中，在35℃下通气有氧发酵18h，搅拌转速250r/min，之后再以8wt％的接种量接入步骤(3)得到的复合乳酸菌二级种子液，调节pH值至7.0，之后于35℃下厌氧发酵48h，此期间的搅拌转速为200r/min。发酵液II具体配方如下：糖蜜40g、酵母膏1.5kg、磷酸氢二钾0.2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g和水1L，pH值7.5，115℃灭菌30min。
(5)发酵结束，将发酵所得的液态发酵物(益生菌制剂)直接进行分装与包装，并检测活菌。其中，芽孢杆菌的活菌个数为7.7×107CFU/mL(其中，枯草芽孢杆菌的活菌个数为4.5×107CFU/mL，纳豆芽孢杆菌的活菌个数为3.2×107CFU/mL)，乳酸菌的活菌个数为8.5×109CFU/mL(其中，植物乳杆菌的活菌个数为4.4×109CFU/mL，嗜酸乳杆菌的活菌个数为2.5×109CFU/mL，干酪乳杆菌的活菌个数为1.6×109CFU/mL)，酵母菌的活菌个数为5.1×107CFU/mL(其中，产朊假丝酵母的活菌个数为1.1×107CFU/mL，酿酒酵母的活菌个数为4×107CFU/mL)，光合菌的活菌个数为4.2×105CFU/mL，该益生菌制剂的pH值为3.5。
实施例3
该实施例用于说明本发明提供的益生菌制剂及其制备方法。
(1)原菌种活化：将在-18℃保藏的各菌种划线斜面活化，其中，枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌分别用斜面培养基I在37℃下好氧培养18h，其中，斜面培养基I的具体配方如下：牛肉膏5g、蛋白胨15g、氯化钠8g、琼脂30g和蒸馏水1L，pH值7.3，121℃灭菌20min。将植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌分别用斜面培养基II(MRS培养基培养)在37℃下厌氧静置培养24h，其中，斜面培养基II的具体配方如下：蛋白胨15.0g、牛肉粉8.0g、酵母粉8.0g、葡萄糖30.0g、吐温80 2.0mL、磷酸氢二钾5.0g、乙酸钠8.0g、柠檬酸三铵5.0g、硫酸镁1g、硫酸锰0.1g、琼脂粉30.0g和蒸馏水1L，pH值6.3，121℃灭菌20min。将产朊假丝酵母和酿酒酵母分别用斜面培养基III在30℃下好氧培养48h，其中，斜面培养基III具体配方如下：葡萄糖30.0g、蛋白胨30g、酵母膏15g、氯霉素0.2g、琼脂粉30.0g和蒸馏水1L，pH自然，115℃灭菌15min。将沼泽红假单胞菌用斜面培养基IV在钨丝灯下光照下，30℃厌氧培养48h，斜面培养基IV的具体配方如下：蛋白胨5g、酵母膏5g、氯化钙1g、硫酸镁1g、琼脂粉30.0g和蒸馏水1L，pH值6.9，115℃灭菌15min。
(2)一级种子液的制备：将枯草芽孢杆菌斜面菌种、纳豆芽孢杆菌斜面菌种、植物乳杆菌斜面菌种、嗜酸乳杆菌斜面菌种、干酪乳杆菌斜面菌种、产朊假丝酵母斜面菌种、酿酒酵母斜面菌种和沼泽红假单胞菌斜面菌种分别单独扩大培养，用接种环分别刮取以上活化斜面菌种至1L液体培养基中培养，培养基除不加琼脂粉外，其他组分以及培养条件同步骤(1)，得到各自的原菌液。
(3)二级种子液的制备：将步骤(2)扩大培养所得的植物乳杆菌原菌液、嗜酸乳杆菌原菌液、干酪乳杆菌原菌液均按1wt％接种量接种至100L发酵液I中，35℃厌氧培养20h，得到复合乳酸菌二级种子液。发酵液I具体配方如下：糖蜜50g、酵母膏2g、磷酸氢二钾0.25g、硫酸镁0.25g、硫酸锰0.1g、水1L，pH值7.3，115℃灭菌30min。
(4)益生菌发酵：将步骤(2)扩大培养所得的枯草芽孢杆菌原菌液、纳豆芽孢杆菌原菌液、产朊假丝酵母原菌液、酿酒酵母原菌液与沼泽红假单胞菌原菌液均按1wt‰接种量接入发酵液II中，在35℃下通气有氧发酵18h，搅拌转速250r/min，之后再以8wt％的接种量接入步骤(3)得到的复合乳酸菌二级种子液，调节pH值至6.7，之后于35℃下厌氧发酵48h，此期间的搅拌转速为200r/min。发酵液II具体配方如下：糖蜜50g、酵母膏2g、磷酸氢二钾0.25g、硫酸镁0.25g、硫酸锰0.1g、水1L，pH值7.3，115℃灭菌30min。
(5)发酵结束，将发酵所得的液态发酵物(益生菌制剂)直接进行分装与包装，并检测活菌。其中，芽孢杆菌的活菌个数为8.9×107CFU/mL(其中，枯草芽孢杆菌的活菌个数为5.5×107CFU/mL，纳豆芽孢杆菌的活菌个数为3.4×107CFU/mL)，乳酸菌的活菌个数为8.8×109CFU/mL(其中，植物乳杆菌的活菌个数为4.6×109CFU/mL，嗜酸乳杆菌的活菌个数为2.4×109CFU/mL，干酪乳杆菌的活菌个数为1.8×109CFU/mL)，酵母菌的活菌个数为6.4×107CFU/mL(其中，产朊假丝酵母的活菌个数为2.1×107CFU/mL，酿酒酵母的活菌个数为4.3×107CFU/mL)，光合菌的活菌个数为4.5×105CFU/mL，该益生菌制剂的pH值为3.5。
对比例1
该对比例用于说明参比的益生菌制剂及其制备方法。
按照实施例1的方法制备益生菌制剂，不同的是，该对比例未采用纳豆芽孢杆菌，相应地，益生菌制剂的制备过程不包括纳豆芽孢杆菌活化以及纳豆芽孢杆菌对应的一级种子液的制备步骤，并且在益生菌发酵过程中，将纳豆芽孢杆菌原菌液采用相同重量份的枯草芽孢杆菌原菌液替代，得到参比益生菌制剂。
对比例2
该对比例用于说明参比的益生菌制剂及其制备方法。
按照实施例1的方法制备益生菌制剂，不同的是，该对比例未采用干酪乳杆菌，相应地，益生菌制剂的制备过程不包括干酪乳杆菌活化以及干酪乳杆菌对应的一级种子液的制备步骤，并且在二级种子液的制备过程中，将干酪乳杆菌原菌液采用相同重量份的植物乳杆菌原菌液替代，得到参比益生菌制剂。
对比例3
该对比例用于说明参比的益生菌制剂及其制备方法。
按照实施例1的方法制备益生菌制剂，不同的是，该对比例未采用酿酒酵母，相应地，益生菌制剂的制备过程不包括酿酒酵母活化以及酿酒酵母对应的一级种子液的制备步骤，并且在益生菌发酵过程中，将酿酒酵母原菌液采用相同重量份的产朊假丝酵母原菌液替代，得到参比益生菌制剂。
对比例4
该对比例用于说明参比的益生菌制剂及其制备方法。
按照实施例1的方法制备益生菌制剂，不同的是，该对比例未采用沼泽红假单胞菌，相应地，益生菌制剂的制备过程不包括沼泽红假单胞菌活化以及沼泽红假单胞菌对应的一级种子液的制备步骤，并且在益生菌发酵过程中，将沼泽红假单胞菌采用相同重量份的枯草芽孢杆菌原菌液替代，得到参比益生菌制剂。
测试例1益生菌制剂的抑菌试验
(1)试验病原菌：大肠杆菌(CMCC44102)、沙门氏菌(CMCC50094)、溶藻弧菌(CICC10889)、副溶血弧菌(CICC 23924)、嗜水气单胞菌(CICC 10868)、铜绿假单胞菌(CICC10351)。
(2)试验益生菌制剂：由实施例1-3得到的益生菌制剂以及由对比例1-4得到的参比益生菌制剂。
(3)测试方法：采用牛津杯抑菌方法，检测抑菌圈大小。具体地，将试验病原菌活化后，用生理盐水稀释至菌浓大约106CFU/mL，吸取0.1mL涂布在平板上，之后将灭菌干燥后的牛津杯放置在平板上面，用移液枪吸取益生菌制剂0.1mL加入牛津杯，冰箱放置2h后，于30℃培养24h。观察测量抑菌圈大小，所得试验结果如表1所示。
表1
测试例2益生菌制剂对水产养殖水质改良试验
试验方法：在某水产养殖场中，挑选七个养殖水产动物相同且水深、面积、放养量以及管理模式一致的池塘作为试验。其中三个设置为试验组，另外四个设置为对照组。在试验组中使用本发明实施例1-实施例3所得的益生菌制剂，1米水深的池塘中益生菌制剂的使用量为600mL/亩。而四组对照组中分别使用对比例1-对比例3所得的参比益生菌制剂，另一组不使用益生菌制剂(为空白对照)。试验时间为5天，在试验期间，七个池塘管理模式一致。5天后对六个池塘水质中的氨氮、亚硝酸盐、溶氧量、COD、pH值与弧菌总数指标进行检测分析，所得结果如表2所示。
表2
注：表2中，氨氮、亚硝酸盐、COD和弧菌的降低率以及溶解氧的提高率均是与空白对照组相比计算得到。
从以上结果可以看出，本发明提供的益生菌制剂能够有效降解水产养殖水体中的氨氮、亚硝酸盐，并分解水体有机物(COD)如残饵、排泄物与浮游动物残体等，调节水体的pH值，提高水体溶氧量，同时还能够抑制养殖水体中的有害病原菌，从而促进养殖环境正常菌群的生长，保持养殖水体生态平衡。综上，本发明提供的益生菌制剂能够调节优化水产养殖的水质，改善养殖水体生态环境，从而促进水产动物健康生长。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (3)
1.一种益生菌制剂在改善水体或者池塘底质中的应用，其特征在于，所述益生菌制剂为由芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌和光合菌通过液态发酵制备得到，所述芽孢杆菌由枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌组成，所述乳酸菌由植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌组成，所述酵母菌由产朊假丝酵母和酿酒酵母组成，所述光合菌为沼泽红假单胞菌；所述益生菌制剂中芽孢杆菌的活菌个数为3×107CFU/mL-9×107CFU/mL，所述乳酸菌的活菌个数为1×109CFU/mL-9×109CFU/mL，所述酵母菌的活菌个数为1×107CFU/mL-7×107CFU/mL，所述光合菌的活菌个数为4×105CFU/mL-6×105CFU/mL；所述芽孢杆菌中枯草芽孢杆菌的活菌个数为4×107CFU/mL-9×107CFU/mL，纳豆芽孢杆菌的活菌个数为3×107CFU/mL-8×107CFU/mL；所述乳酸菌中植物乳杆菌的活菌个数为2×109CFU/mL-8×109CFU/mL，嗜酸乳杆菌的活菌个数为1×109CFU/mL-8×109CFU/mL，干酪乳杆菌的活菌个数为1×109CFU/mL-5×109CFU/mL；所述酵母菌中产朊假丝酵母的活菌个数为1×107CFU/mL-6×107CFU/mL，酿酒酵母的活菌个数为4×107CFU/mL-6×107CFU/mL；所述光合菌中沼泽红假单胞菌的活菌个数为4×105CFU/mL-6×105CFU/mL；所述益生菌制剂的pH值为3.5以下；枯草芽孢杆菌源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GIM1.271；纳豆芽孢杆菌源自苏州北纳创联生物技术有限公司，编号为：BNCC 185324；植物乳杆菌源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GIM1.191；嗜酸乳杆菌源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GIM1.208；干酪乳杆菌源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GIM1.204；产朊假丝酵母源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GDM2.148；酿酒酵母源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GIM2.213；沼泽红假单胞菌源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GIM1.167；
所述液态发酵的方法包括以下步骤：
(1)原菌种活化：将枯草芽孢杆菌和纳豆芽孢杆菌分别接种到已灭菌的斜面培养基I中好氧培养直至长出菌落，将冷冻保藏的植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌分别接种到已灭菌的斜面培养基II中好氧培养直至长出菌落，将产朊假丝酵母和酿酒酵母分别接种到已灭菌的斜面培养基III中好氧培养直至长出菌落，将沼泽红假单胞菌接种到已灭菌的斜面培养基IV中厌氧培养直至长出菌落，得到各自活化斜面菌种；
所述斜面培养基I含有牛肉膏1-5g、蛋白胨5-15g、氯化钠2-8g、琼脂10-30g和蒸馏水1L且pH值为7.2-7.5；所述斜面培养基II含有蛋白胨5-15g、牛肉粉2-8g、酵母粉2-8g、葡萄糖10-30g、吐温80 0.5-2mL、磷酸氢二钾1-5g、乙酸钠2-8g、柠檬酸三铵1-5g、硫酸镁0.1-1g、硫酸锰0.01-0.1g、琼脂粉10-30g和蒸馏水1L且pH值为6.2-6.5；所述斜面培养基III含有葡萄糖10-30g、蛋白胨10-30g、酵母膏5-15g、氯霉素0.05-0.2g、琼脂粉10-30g和蒸馏水1L且pH自然；所述培养基IV含有蛋白胨1-5g、酵母膏1-5g、氯化钙0.1-1g、硫酸镁0.1-1g、琼脂粉10-30g和蒸馏水1L且pH值为6.8-7.0；
(2)一级种子液的制备：分别将由步骤(1)得到的枯草芽孢杆菌斜面菌种和纳豆芽孢杆菌斜面菌种至少部分接种到已灭菌的液体培养基I中，于30-40℃好氧培养20-30h，分别得到各自芽孢杆菌原菌液；分别将由步骤(1)得到的植物乳杆菌斜面菌种、嗜酸乳杆菌斜面菌种和干酪乳杆菌斜面菌种至少部分接种到已灭菌的液体培养基II中，于30-40℃厌氧培养18-30h，分别得到各自乳酸菌原菌液；分别将由步骤(1)得到的产朊假丝酵母斜面菌种和酿酒酵母斜面菌种至少部分接种到已灭菌的液体培养基III中，于28-30℃好氧培养40-50h，分别得到各自酵母菌原菌液；将步骤(1)得到的沼泽红假单胞菌斜面菌种至少部分接种到已灭菌的液体培养基IV中，在钨丝灯照射的条件下，于28-30℃厌氧培养2-4d，得到沼泽红假单胞菌原菌液；
所述液体培养基I含有牛肉膏1-5g、蛋白胨5-15g、氯化钠2-8g和蒸馏水1L且pH值为7.2-7.5；所述液体培养基II含有蛋白胨5-15g、牛肉粉2-8g、酵母粉2-8g、葡萄糖10-30g、吐温80 0.5-2mL、磷酸氢二钾1-5g、乙酸钠2-8g、柠檬酸三铵1-5g、硫酸镁0.1-1g、硫酸锰0.01-0.1g和蒸馏水1L且pH值为6.2-6.5；所述液体培养基III含有葡萄糖10-30g、蛋白胨10-30g、酵母膏5-15g、氯霉素0.05-0.2g和蒸馏水1L且pH值自然；所述液体培养基IV含有蛋白胨1-5g、酵母膏1-5g、氯化钙0.1-1g、硫酸镁0.1-1g和蒸馏水1L且pH值为6.8-7.0；
(3)二级种子液的制备：将步骤(2)得到的植物乳杆菌原菌液、嗜酸乳杆菌原菌液和干酪乳杆菌原菌液各自独立地按0.5-2wt％的接种量接种到已灭菌的同一发酵培养基I中，于30-40℃厌氧培养18-20h，得到复合乳酸菌二级种子液；
(4)益生菌发酵：将枯草芽孢杆菌原菌液、纳豆芽孢杆菌原菌液、产朊假丝酵母原菌液、酿酒酵母原菌液与沼泽红假单胞菌原菌液各自独立地按0.5-2wt‰接种量接入已灭菌的同一发酵培养基II中，于30-40℃有氧发酵18-20h，之后再以5-10wt％的接种量接入所述复合乳酸菌二级种子液，将pH值调节至6.5-7，之后于30-40℃厌氧发酵24-48h；
所述发酵培养基I和第二发酵培养基II的组分相同或不同，且各自独立地含有糖蜜30-50g、酵母膏1-2g、磷酸氢二钾0.2-0.25g、硫酸镁0.2-0.25g、硫酸锰0.05-0.1g和蒸馏水1L且pH值为7.2-7.5。
2.根据权利要求1所述的益生菌制剂在改善水体或者池塘底质中的应用，其特征在于，步骤(1)中，将所述枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和干酪乳杆菌进行好氧培养的条件各自独立地包括温度为30-40℃，时间为20-50h；将产朊假丝酵母和酿酒酵母进行好氧培养的条件包括温度为28-30℃，时间为30-50h；将沼泽红假单胞菌进行厌氧培养在钨丝灯照射的条件下进行，且温度为28-30℃，时间为30-50h。
3.根据权利要求1所述的益生菌制剂在改善水体或者池塘底质中的应用，其特征在于，步骤(4)中，所述的益生菌发酵在搅拌下进行，且搅拌的转速为200-250r/min。
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