CN109055279A - 一种复合芽孢杆菌制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种复合芽孢杆菌制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及水产养殖领域，具体涉及一种复合芽孢杆菌制剂及其制备方法和应用。所述复合芽孢杆菌制剂为由枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌以及凝结芽孢杆菌在含有碳酸钙的发酵液中进行液态发酵制备得到。本发明提供的复合芽孢杆菌制剂不仅能够快速分解有机物，还可以降解氨氮、亚硝酸盐等有害物质，对池塘的底质与水质同时进行改良，有效维护池塘微生态平衡，预防疾病发生。此外，本发明提供的复合芽孢杆菌制剂中芽孢杆菌活菌数高，具有高活性、抗逆性强、保质期长等优点，且使用时无需活化处理，直接稀释喷洒，可行性非常强。

Description

一种复合芽孢杆菌制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于水产养殖领域，具体涉及一种复合芽孢杆菌制剂及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，我国水产养殖业得到了快速发展，池塘养殖面积与养殖密度不断增大。尤其高密度养殖模式需要在养殖过程中投喂大量饲料，而投喂残饵、粪便、生物体残骸等形成的有机淤泥沉积在池底，会使得养殖水质不断恶化。底质恶化不仅会造成有害菌大量繁殖，而且大面积池塘底质的有机淤泥的氧化分解也会消耗掉池底本来就不多的氧气，导致底部缺氧，并产生大量有害物质，例如氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等，这些都将对水产动物造成危害。
目前对池塘底质改良的方法有三大类：物理法、化学法与生物法。其中，物理法为目前最集中使用的方法，其采用如吸附剂(沸石粉、硅藻土、贝壳粉等)对池塘进行底改。然而，该方法所存在的缺点包括吸附剂用量大，成本高，并且大量吸附剂也会聚集在池底，后续处理麻烦。化学法是通过往池塘中投加化学物质的方法对池塘底质进行改良，该方法存在诸如操作不便、能耗高、对环境存在二次污染的缺陷。而生物法则是利用益生菌(如枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌、硝化反硝化细菌等)分解有机物，该方法不仅能够降低氨氮和亚硝酸盐，而且还能够抑制有害菌的生长繁殖，以达到底改效果，虽然具有高效、安全、绿色环保以及低成本的特点，但同时也存在抗逆性差、活菌数低、保存期短、粉剂产品使用需要活化、步骤繁琐等缺点。
发明内容
本发明的目的是为了克服采用现有方法对池塘底质进行改良时存在的以上缺陷，而提供一种新的复合芽孢杆菌制剂及其制备方法和应用。
本发明的发明人经过深入研究之后发现，一方面，将枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌以及凝结芽孢杆菌这四种特定的芽孢杆菌配合使用，在有氧、低氧和无氧条件下均能够实现有效降解养殖水体底泥中饲料残饵、粪便、生物残骸等有机物，从而改善水质；另一方面，碳酸钙在发酵培养过程中不仅能够调节pH值，使得发酵液的pH值处于芽孢杆菌生长最适pH，促进芽孢杆菌快速增殖，提高活菌数，并且碳酸钙与芽孢杆菌发酵过程中产生的酸反应，形成离子钙，使产品富含离子钙，可预防甲壳动物发生软壳病或者脱壳不遂；再则，碳酸钙表面具有许多微小孔径，芽孢杆菌可以附着上面，碳酸钙的快速直接沉底会导致芽孢杆菌也随着快速沉底，对池塘底质进行改良。基于此，完成了本发明。
具体地，本发明提供了一种复合芽孢杆菌制剂，其中，所述复合芽孢杆菌制剂为由枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌以及凝结芽孢杆菌在含有碳酸钙的发酵液中进行液态发酵制备得到。
优选地，所述发酵液中还含有锌盐、铁盐和锰盐中的至少一种。
优选地，所述发酵液中同时含有锌盐、铁盐和锰盐，且碳酸钙、锌盐、铁盐和锰盐的重量比为(3-8)：(0.01-0.1)：(0.01-0.1)：(0.01-0.1)。
优选地，所述锌盐为硫酸锌，所述铁盐为硫酸铁，所述锰盐为硫酸盐。
优选地，所述复合芽孢杆菌制剂中枯草芽孢杆菌的活菌个数为5×108CFU/mL-4×109CFU/mL，纳豆芽孢杆菌的活菌个数为2×108CFU/mL-5×108CFU/mL，蜡状芽孢杆菌的活菌个数为2×108CFU/mL-5×109CFU/mL，凝结芽孢杆菌的活菌个数为5×107CFU/mL-6×108CFU/mL。
优选地，所述复合芽孢杆菌制剂的pH值为5-7。
本发明还提供了一种复合芽孢杆菌制剂的制备方法，该方法包括将枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌以及凝结芽孢杆菌在含有碳酸钙的发酵液中进行液态发酵。
优选地，所述液态发酵的方法包括以下步骤：
(1)原菌种活化：将枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌以及凝结芽孢杆菌分别接种到已灭菌的斜面培养基中好氧培养直至长出菌落，分别得到四种活化菌种；培养以上四种芽孢杆菌的斜面培养基的组分相同或不同，且各自独立地含有牛肉膏1-5g、蛋白胨5-15g、氯化钠2-10g、琼脂10-30g以及蒸馏水1L且pH值为7.2-7.5；
(2)一级种子液的制备：分别将步骤(1)得到的四种活化菌种至少部分接种到已灭菌的液体培养基中，之后于35-40℃下好氧培养20-30h，分别得到四种芽孢杆菌原菌液；培养以上四种活化菌种的液体培养基的组分相同或不同，且各自独立地含有牛肉膏1-5g、蛋白胨5-15g、氯化钠2-10g以及蒸馏水1L且pH值为7.2-7.5；
(3)二级种子液的制备：将步骤(2)得到的四种芽孢杆菌原菌液各自独立地按0.5-2wt％的接种量接种到已灭菌的同一发酵液培养基I中，之后于35-40℃下好氧培养20-40h，得到复合芽孢杆菌二级种子液；
(4)益生菌发酵：将步骤(3)得到的复合芽孢杆菌二级种子液按2-10wt％的接种量接种到已灭菌的发酵液培养基II中，之后于35-40℃下好氧培养48-72h，得到复合芽孢杆菌制剂；
所述发酵液培养基I和发酵液培养基II的组分相同或不同，且各自独立地含有葡萄糖20-30g、酵母膏5-8g、碳酸钙3-8g、铁盐0.01-0.1g、锌盐0.01-0.1g、锰盐0.01-0.1g以及蒸馏水1L且pH值为7.2-7.5。
优选地，所述锌盐为硫酸锌，所述铁盐为硫酸铁，所述锰盐为硫酸盐。
优选地，步骤(1)所述好氧培养的条件包括温度为30-40℃，时间为10-30h；步骤(3)-步骤(4)中所述好氧培养均在搅拌下进行，且搅拌的转速各自独立地为150-200r/min；步骤(3)-步骤(4)中所述好氧培养的通氧气量各自独立地为1-2m3/h。
本发明还提供了由上述方法制备得到的复合芽孢杆菌制剂。
此外，本发明还提供了所述复合芽孢杆菌制剂在改善水体或者池塘底质中的应用。
本发明提供的复合芽孢杆菌制剂不仅能够快速分解有机物，还可以降解氨氮、亚硝酸盐等有害物质，能够实现对池塘的底质与水质同时进行改良，有效维护池塘微生态平衡，预防疾病发生。此外，本发明提供的复合芽孢杆菌制剂中芽孢杆菌活菌数高，具有高活性、抗逆性强、保质期长等优点，且使用时无需活化处理，直接稀释喷洒，可行性非常强。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。
本发明提供的复合芽孢杆菌制剂为由枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌以及凝结芽孢杆菌在含有碳酸钙的发酵液中进行液态发酵制备得到。需要说明的是，在所述液态发酵的过程中，可能需要采用多次发酵，此时，所述液态发酵在含有碳酸钙的发酵液中进行是指至少最后一次发酵所采用的发酵液中含有碳酸钙。
根据本发明的一种优选实施方式，所述发酵液中还含有锌盐、铁盐和锰盐中的至少一种，此时能够使得到的复合芽孢杆菌制剂中含有锌、铁和锰这三种矿物质元素，这样可以更好地预防甲壳动物发生软壳病或者脱壳不遂。其中，碳酸钙、锌盐、铁盐和锰盐的重量比优选为(3-8)：(0.01-0.1)：(0.01-0.1)：(0.01-0.1)。所述锌盐优选为硫酸锌，所述铁盐优选为硫酸铁，所述锰盐优选为硫酸盐。
根据本发明，为了使得所述复合芽孢杆菌制剂具有更优异的改善水质的性能，优选地，所述复合芽孢杆菌制剂中枯草芽孢杆菌的活菌个数为5×108CFU/mL-4×109CFU/mL，纳豆芽孢杆菌的活菌个数为2×108CFU/mL-5×108CFU/mL，蜡状芽孢杆菌的活菌个数为2×108CFU/mL-5×109CFU/mL，凝结芽孢杆菌的活菌个数为5×107CFU/mL-6×108CFU/mL。此外，特别优选地，所述复合芽孢杆菌制剂的pH值为5-7。
本发明提供的复合芽孢杆菌制剂的制备方法包括将枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌以及凝结芽孢杆菌进行液态发酵，且所述液态发酵所采用的发酵液中含有碳酸钙，优选还含有锌盐、铁盐和锰盐中的至少一种。其中，所述锌盐、铁盐和锰盐的具体种类和用量已经在上文中有所描述，在此不作赘述。
根据本发明的一种优选实施方式，所述液态发酵的方法包括以下步骤：
(1)原菌种活化：将枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌以及凝结芽孢杆菌分别接种到已灭菌的斜面培养基中好氧培养直至长出菌落，分别得到四种活化菌种；培养以上四种芽孢杆菌的斜面培养基的组分相同或不同，且各自独立地含有牛肉膏1-5g、蛋白胨5-15g、氯化钠2-10g、琼脂10-30g以及蒸馏水1L且pH值为7.2-7.5；
(2)一级种子液的制备：分别将步骤(1)得到的四种活化菌种至少部分接种到已灭菌的液体培养基中，之后于35-40℃下好氧培养20-30h，分别得到四种芽孢杆菌原菌液；培养以上四种活化菌种的液体培养基的组分相同或不同，且各自独立地含有牛肉膏1-5g、蛋白胨5-15g、氯化钠2-10g以及蒸馏水1L且pH值为7.2-7.5；
(3)二级种子液的制备：将步骤(2)得到的四种芽孢杆菌原菌液各自独立地按0.5-2wt％的接种量接种到已灭菌的同一发酵液培养基I中，之后于35-40℃下好氧培养20-40h，得到复合芽孢杆菌二级种子液；
(4)益生菌发酵：将步骤(3)得到的复合芽孢杆菌二级种子液按2-10wt％的接种量接种到已灭菌的发酵液培养基II中，之后于35-40℃下好氧培养48-72h，得到复合芽孢杆菌制剂；
所述发酵液培养基I和发酵液培养基II的组分相同或不同，且各自独立地含有葡萄糖20-30g、酵母膏5-8g、碳酸钙3-8g、铁盐0.01-0.1g、锌盐0.01-0.1g、锰盐0.01-0.1g以及蒸馏水1L且pH值为7.2-7.5。
根据本发明，如上所述，步骤(1)中所述好氧培养的条件只要能够确保长出菌落即可，例如可以包括温度为30-40℃，时间为10-30h。步骤(3)-步骤(4)中所述好氧培养可以在搅拌状态下进行，也可以在非搅拌状态下进行，但为了加快以上四种芽孢杆菌的增殖、提高活菌数量，优选地，步骤(3)-步骤(4)中所述好氧培养均在搅拌状态下进行，且搅拌的转速各自独立地为150-200r/min。此外，步骤(3)-步骤(4)中所述好氧培养的通氧气量各自独立地为1-2m3/h。
根据本发明，步骤(2)中，需要分别将四种活化菌种至少部分接种至液体培养基中进行扩大培养，在具体操作过程中，可以采用接种环分别刮取相应的活化菌种至适量(例如0.5-2L)的液体培养基中进行培养。
本发明还提供了由上述方法制备得到的复合芽孢杆菌制剂。
此外，本发明还提供了所述复合芽孢杆菌制剂在改善水体或者池塘底质中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例和对比例中：
枯草芽孢杆菌源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GIM1.271；纳豆芽孢杆菌源自苏州北纳创联生物技术有限公司，编号为：BNCC 185324；蜡状芽孢杆菌源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GIM1.199；凝结芽孢杆菌源自广东省微生物菌种保藏中心，编号为：GIM1.646。
实施例1
该实施例用于说明本发明提供的复合芽孢杆菌制剂及其制备方法。
(1)原菌种活化：将在-18℃保藏的各菌种划线斜面活化，其中，枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌以及凝结芽孢杆菌分别用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在37℃下好氧培养18h，其中，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的具体配方如下：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂20g、蒸馏水1L，pH值7.2，121℃灭菌20min。
(2)一级种子液的制备：分别将枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌以及凝结芽孢杆菌斜面菌种用接种环刮取些许接种到已灭菌的1L三角瓶装500mL液体培养基中，于温度36℃，转速180r/min，好氧培养24h，分别得到各自芽孢杆菌原菌液。该液体培养基的具体配方如下：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1L，pH值7.2，121℃灭菌20min。
(3)二级种子液的制备：将各自芽孢杆菌原菌液均按1wt％接种量接种到50L发酵液培养基中培养，培养条件为：温度36℃，转速200r/min，通气量1m3/h，培养时间24h，得到复合芽孢杆菌二级种子液。该发酵液培养基的具体配方如下：葡萄糖20g、酵母膏6g、碳酸钙5g、硫酸铁0.01g、硫酸锌0.01g、硫酸锰0.01g、蒸馏水1L，pH值7.2，121℃灭菌20min。
(4)益生菌发酵：将复合芽孢杆菌二级种子液按5wt％接种量接入1吨发酵液中发酵培养，培养条件为：温度36℃，转速200r/min，通气量1m3/h，培养时间48h。该发酵液培养基的具体配方如下：葡萄糖20g、酵母膏6g、碳酸钙5g、硫酸铁0.01g、硫酸锌0.01g、硫酸锰0.01g、蒸馏水1L，pH值7.2，121℃灭菌20min。发酵结束，将发酵所得的液态发酵物(复合芽孢杆菌制剂)直接进行分装与包装，并检测活菌。其中，枯草芽孢杆菌的活菌个数为6.8×108CFU/mL，纳豆芽孢杆菌的活菌个数为2.4×108CFU/mL，蜡状芽孢杆菌的活菌个数为2.2×109CFU/mL，凝结芽孢杆菌7.5×107CFU/mL，该复合芽孢杆菌制剂的pH值为6.5。
实施例2
该实施例用于说明本发明提供的复合芽孢杆菌制剂及其制备方法。
(1)原菌种活化：将在-18℃保藏的各菌种划线斜面活化，其中，枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌以及凝结芽孢杆菌分别用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在30℃下好氧培养30h，其中，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的具体配方如下：牛肉膏1g、蛋白胨5g、氯化钠2g、琼脂10g、蒸馏水1L，pH值7.5，121℃灭菌20min。
(2)一级种子液的制备：分别将枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌以及凝结芽孢杆菌斜面菌种用接种环刮取些许接种到已灭菌的1L三角瓶装500mL液体培养基中，于温度40℃，转速180r/min，好氧培养20h，分别得到各自芽孢杆菌原菌液。该液体培养基的具体配方如下：牛肉膏1g、蛋白胨5g、氯化钠2g、蒸馏水1L，pH值7.5，121℃灭菌20min。
(3)二级种子液的制备：将各自芽孢杆菌原菌液均按0.5wt％接种量接种到50L发酵液培养基中培养，培养条件为：温度35℃，转速200r/min，通气量2m3/h，培养时间40h，得到复合芽孢杆菌二级种子液。该发酵液培养基的具体配方如下：葡萄糖30g、酵母膏8g、碳酸钙8g、硫酸铁0.1g、硫酸锌0.1g、硫酸锰0.1g、蒸馏水1L，pH值7.5，121℃灭菌20min。
(4)益生菌发酵：将复合芽孢杆菌二级种子液按2wt％接种量接入1吨发酵液中发酵培养，培养条件为：温度35℃，转速200r/min，通气量2m3/h，培养时间72h。该发酵液培养基的具体配方如下：葡萄糖30g、酵母膏8g、碳酸钙8g、硫酸铁0.1g、硫酸锌0.1g、硫酸锰0.1g、蒸馏水1L，pH值7.5，121℃灭菌20min。发酵结束，将发酵所得的液态发酵物(复合芽孢杆菌制剂)直接进行分装与包装，并检测活菌。其中，枯草芽孢杆菌的活菌个数为1.8×109CFU/mL，纳豆芽孢杆菌的活菌个数为4.6×108CFU/mL，蜡状芽孢杆菌的活菌个数为4.2×109CFU/mL，凝结芽孢杆菌2.1×108CFU/mL，该复合芽孢杆菌制剂的pH值为6.4。
实施例3
该实施例用于说明本发明提供的复合芽孢杆菌制剂及其制备方法。
(1)原菌种活化：将在-18℃保藏的各菌种划线斜面活化，其中，枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌以及凝结芽孢杆菌分别用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基在40℃下好氧培养10h，其中，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基的具体配方如下：牛肉膏5g、蛋白胨15g、氯化钠10g、琼脂30g、蒸馏水1L，pH值7.3，121℃灭菌20min。
(2)一级种子液的制备：分别将枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌以及凝结芽孢杆菌斜面菌种用接种环刮取些许接种到已灭菌的1L三角瓶装500mL液体培养基中，于温度35℃，转速180r/min，好氧培养30h，分别得到各自芽孢杆菌原菌液。该液体培养基的具体配方如下：牛肉膏5g、蛋白胨15、氯化钠10g、蒸馏水1L，pH值7.3，121℃灭菌20min。
(3)二级种子液的制备：将各自芽孢杆菌原菌液均按2wt％接种量接种到50L发酵液培养基中培养，培养条件为：温度40℃，转速200r/min，通气量1.5m3/h，培养时间20h，得到复合芽孢杆菌二级种子液。该发酵液培养基的具体配方如下：葡萄糖25g、酵母膏5g、碳酸钙3g、硫酸铁0.05g、硫酸锌0.05g、硫酸锰0.05g、蒸馏水1L，pH值7.3，121℃灭菌20min。
(4)益生菌发酵：将复合芽孢杆菌二级种子液按10wt％接种量接入1吨发酵液中发酵培养，培养条件为：温度40℃，转速200r/min，通气量1.5m3/h，培养时间50h。该发酵液培养基的具体配方如下：葡萄糖25g、酵母膏5g、碳酸钙3g、硫酸铁0.05g、硫酸锌0.05g、硫酸锰0.05g、蒸馏水1L，pH值7.3，121℃灭菌20min。发酵结束，将发酵所得的液态发酵物(复合芽孢杆菌制剂)直接进行分装与包装，并检测活菌。其中，枯草芽孢杆菌的活菌个数为8.6×108CFU/mL，纳豆芽孢杆菌的活菌个数为3.7×108CFU/mL，蜡状芽孢杆菌的活菌个数为3.5×109CFU/mL，凝结芽孢杆菌1.3×108CFU/mL，该复合芽孢杆菌制剂的pH值为6.1。
实施例4
该实施例用于说明本发明提供的复合芽孢杆菌制剂及其制备方法。
按照实施例1的方法制备复合芽孢杆菌制剂，不同的是，将步骤(3)和步骤(4)所采用的发酵液培养基中的硫酸铁、硫酸锌和硫酸锰均采用相同重量份的碳酸钙替代，得到复合芽孢杆菌制剂。其中，枯草芽孢杆菌的活菌个数为4.3×108CFU/mL，纳豆芽孢杆菌的活菌个数为1.6×107CFU/mL，蜡状芽孢杆菌的活菌个数为8.5×108CFU/mL，凝结芽孢杆菌6.2×106CFU/mL，该复合芽孢杆菌制剂的pH值为5.8。
对比例1
该对比例用于说明参比的复合芽孢杆菌制剂及其制备方法。
按照实施例1的方法制备复合芽孢杆菌制剂，不同的是，将步骤(3)和步骤(4)所采用的发酵液培养基中的碳酸钙均采用相同重量份硫酸铁替代，得到复合芽孢杆菌制剂。
对比例2
该对比例用于说明参比的复合芽孢杆菌制剂及其制备方法。
按照实施例2的方法制备复合芽孢杆菌制剂，不同的是，该对比例未采用纳豆芽孢杆菌，相应地，复合芽孢杆菌制剂的制备过程不包括纳豆芽孢杆菌活化以及纳豆芽孢杆菌对应的一级种子液的制备步骤，并且在二级种子液的制备过程中，将纳豆芽孢杆菌液采用相同重量份的枯草芽孢杆菌液替代，得到复合芽孢杆菌制剂。
对比例3
该对比例用于说明参比的复合芽孢杆菌制剂及其制备方法。
按照实施例2的方法制备复合芽孢杆菌制剂，不同的是，该对比例未采用蜡状芽孢杆菌，相应地，复合芽孢杆菌制剂的制备过程不包括蜡状芽孢杆菌活化以及蜡状芽孢杆菌对应的一级种子液的制备步骤，并且在二级种子液的制备过程中，将蜡状芽孢杆菌液采用相同重量份的枯草芽孢杆菌液替代，得到复合芽孢杆菌制剂。
测试例
测试例用于说明复合芽孢杆菌制剂用于对虾池塘底质改良效果的测试。
试验方法：在某对虾养殖场中，挑选八个养殖水质以及管理模式相同的池塘作为试验，其中四个设置为试验组，另外四个设置为对照组。在四组试验组中分别使用实施例1-实施例4所得的复合芽孢杆菌制剂，1米水深的池塘中复合芽孢杆菌制剂的使用量均为600mL/亩，10倍稀释后直接泼洒。而四组对照组中三组分别使用对比例1-对比例3所得的复合芽孢杆菌制剂，另一组不使用复合芽孢杆菌制剂(为空白对照)。试验时间为5天，在试验期间，八个池塘管理模式一致。5天后取四个池塘水质对氨氮、亚硝酸盐与COD指标进行检测分析，所得结果如表1所示。
表1
从表1的结果可以看出，本发明提供的复合芽孢杆菌制剂不仅能够快速分解有机物，还可以降解氨氮、亚硝酸盐等有害物质，对池塘的底质与水质同时进行改良，有效维护池塘微生态平衡，预防疾病发生。此外，本发明提供的复合芽孢杆菌制剂中芽孢杆菌活菌数高，并且由于芽孢杆菌本身处于休眠状态，因此也具有抗逆性强、保质期长、耐高温、耐酸碱等优点，且使用时无需活化处理，直接稀释喷洒即可，可行性非常强。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种复合芽孢杆菌制剂，其特征在于，所述复合芽孢杆菌制剂为由枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌以及凝结芽孢杆菌在含有碳酸钙的发酵液中进行液态发酵制备得到。
2.根据权利要求1所述的复合芽孢杆菌制剂，其特征在于，所述发酵液中还含有锌盐、铁盐和锰盐中的至少一种；优选地，所述发酵液中同时含有锌盐、铁盐和锰盐，且碳酸钙、锌盐、铁盐和锰盐的重量比为(3-8)：(0.01-0.1)：(0.01-0.1)：(0.01-0.1)；优选地，所述锌盐为硫酸锌，所述铁盐为硫酸铁，所述锰盐为硫酸盐。
3.根据权利要求1或2所述的复合芽孢杆菌制剂，其特征在于，所述复合芽孢杆菌制剂中枯草芽孢杆菌的活菌个数为5×108CFU/mL-4×109CFU/mL，纳豆芽孢杆菌的活菌个数为2×108CFU/mL-5×108CFU/mL，蜡状芽孢杆菌的活菌个数为2×108CFU/mL-5×109CFU/mL，凝结芽孢杆菌的活菌个数为5×107CFU/mL-6×108CFU/mL。
4.根据权利要求1或2所述的复合芽孢杆菌制剂，其特征在于，所述复合芽孢杆菌制剂的pH值为5-7。
5.一种复合芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括将枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌以及凝结芽孢杆菌在含有碳酸钙的发酵液中进行液态发酵，得到复合芽孢杆菌制剂。
6.根据权利要求5所述的复合芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，所述液态发酵的方法包括以下步骤：
(1)原菌种活化：将枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌以及凝结芽孢杆菌分别接种到已灭菌的斜面培养基中好氧培养直至长出菌落，分别得到四种活化菌种；培养以上四种芽孢杆菌的斜面培养基的组分相同或不同，且各自独立地含有牛肉膏1-5g、蛋白胨5-15g、氯化钠2-10g、琼脂10-30g以及蒸馏水1L且pH值为7.2-7.5；
(2)一级种子液的制备：分别将步骤(1)得到的四种活化菌种至少部分接种到已灭菌的液体培养基中，之后于35-40℃下好氧培养20-30h，分别得到四种芽孢杆菌原菌液；培养以上四种活化菌种的液体培养基的组分相同或不同，且各自独立地含有牛肉膏1-5g、蛋白胨5-15g、氯化钠2-10g以及蒸馏水1L且pH值为7.2-7.5；
(3)二级种子液的制备：将步骤(2)得到的四种芽孢杆菌原菌液各自独立地按0.5-2wt％的接种量接种到已灭菌的同一发酵液培养基I中，之后于35-40℃下好氧培养20-40h，得到复合芽孢杆菌二级种子液；
(4)益生菌发酵：将步骤(3)得到的复合芽孢杆菌二级种子液按2-10wt％的接种量接种到已灭菌的发酵液培养基II中，之后于35-40℃下好氧培养48-72h，得到复合芽孢杆菌制剂；
所述发酵液培养基I和发酵液培养基II的组分相同或不同，且各自独立地含有葡萄糖20-30g、酵母膏5-8g、碳酸钙3-8g、铁盐0.01-0.1g、锌盐0.01-0.1g、锰盐0.01-0.1g以及蒸馏水1L且pH值为7.2-7.5。
7.根据权利要求6所述的复合芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，所述锌盐为硫酸锌，所述铁盐为硫酸铁，所述锰盐为硫酸盐。
8.根据权利要求6所述的复合芽孢杆菌制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述好氧培养的条件包括温度为30-40℃，时间为10-30h；步骤(3)-步骤(4)中所述好氧培养均在搅拌下进行，且搅拌的转速各自独立地为150-200r/min；步骤(3)-步骤(4)中所述好氧培养的通氧气量各自独立地为1-2m3/h。
9.由权利要求5-8中任意一项所述的方法制备得到的复合芽孢杆菌制剂。
10.权利要求1-4和9中任意一项所述的复合芽孢杆菌制剂在改善水体或者池塘底质中的应用。
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